Download Mutaciones del DNAmt asociadas a enfermedades genéticas
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Universidad de Zaragoza Genética de enfermedades mitocondriales Julio Montoya Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER) Universidad de Zaragoza Enfermedades Genéticas Mitocondriales Grupo de trastornos originados por defectos en el sistema de fosforilación oxidativa que conlleva una deficiencia en la producción de ATP. Oxidative phosphorylation system (OXPHOS System) C. I C. II C. III C. IV C. V Total Number subunits > 43 4 11 13 14 > 85 Codified in mtDNA 7 - 1 3 2 13 Herencia de las enfermedades genéticas mitocondriales •Mendeliana.Para genes mitocondriales codificados en el DNA nuclear •Materna Para genes mitocondriales codificados en el DNA mitocondrial Enfermedades originadas por mutaciones en el DNA mitocondrial. Caracteristicas del Sistema Genetico Mitocondrial Mapa genético del mtDNA humano 16.569 pb 1.000-10.000 copias/cel. 37 genes Información compacta Genética Mitocondrial • Herencia Materna • Segregación mitótica • Efecto Umbral • Alta Velocidad de Mutación •Carencia de recombinación Herencia del mtDNA Hae II polymorphism Genética Mitocondrial • Herencia Materna • Segregación mitótica • Efecto Umbral • Alta Velocidad de Mutación •Carencia de recombinación E O Z A B C Genética Mitocondrial • Herencia Materna • Segregación mitótica • Efecto Umbral • Alta Velocidad de Mutación •Carencia de recombinación U M B R A L REPLICACION SEGREGACION % DNA MUTADO 0 20 40 60 80 Enfermedades asociadas a daños en el DNA mitocondrial Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) Síndrome de Leigh Síndrome de NARP Síndrome de MELAS Síndrome de MERRF Oftalmoplejia crónica progresiva externa Síndrome de Kearns-Sayre Síndrome de Pearson Cardiomiopatía Síndromes de depleción Tipo de muestra biológica a analizar • Histología: Biopsia muscular • Actividades enzimáticas: Biopsia muscular • •Genética: Ideal: el tejido mas afectado Mutaciones puntuales de herencia materna: Sangre Deleciones-depleciones: Tejido mas afectado (músculo, hígado,…) Análisis genético Daños en el mtDNA •Mutaciones puntuales en tRNAs, rRNAs y en genes codificantes de proteínas •Deleciones •Depleción Mutaciones mas carácterísticas SÍNDROME DE LEIGH: T8993G, T8993C SÍNDROME NARP: T8993G MELAS: A3243G, tRNALeu MERRF: A8344G NEUROPATÍA OPTICA HEREDITARIA DE LEBER: G3460A, G11778A, G14484A - Mas de 150 descritas, muchas de ellas solo una vez - Herencia materna Síndrome de Leigh • Regresión psicomotora Alteraciones respiratorias • Lesión núcleos de la base • Anatomia Patológica: lesiones espongioformes desmielinización, proliferación vascular y astrocitosis. Variables: Vómitos, rechazo alimento, alteraciones de la deglución. S. Piramidal. S. Extrapiramidal Nistagmus, atrofia óptica. Parálisis Oculomotoras. Hiperproteinorraquia Leucodistrofia. I:2 I:1 S: <5% ? II:1 II:2 S: >95% VC: 87% S : 84% Mutaciones asociadas T8993G ATPasa 6 T8993C ATPasa 6 Universidad de Zaragoza A new pathologic mtDNA mutation in the cytochrome oxidase subunit I, in a child with a very mild phenotype Examination at 13 yo Normocephalia Low weight Growth retardation Pes cavus Moderate mental retardation Anorexia Generalized muscle atrophy Weakness with fatigability to climb stairs EMG: myopathic pattern Lactate Lactate Pyruvate Organic acids CSF Aminoacids Blood CPK LDH Haemogram Laboratory parameters Plasmatic carnitine Hepatic ultrasound scan ECG Audiometric test Hyperintensity caudate nucleus RMI-S EMG Lactate peak in Cortex atrophy fronto-temporaloccipital regions Mitochondrial disease? Myopathic pattern Muscle biopsy Morphological analysis Subsarcolemmal accumulations of mitochondria Atrophic type II fibers Histochemical analysis Most of the muscle fibers: COX-negative Some type I COX-positive fibers Absence of ragged- red fibers (RRF) Hematoxiline-eosine staining Complex IV staining Subsarcolemmal acumulation of mitochondria Respiratory chain activity Specific activity (nmol/min/mg prot) NADH:cyt c oxidoreductase (Complex I+III) Succinate:cyt c oxidoreductase (Complex II+III) Patient Control range 12 (m) 12-56 (m) 6 (85.7%) (m) 6.5 (f) 7-24 (m) 2.4-17 (f) mU/UCS Patient 41 (38.3%) (m) 21 (28.0%) (m) 0.24 (f) Control range 107-560 (m) 75-149 (m) 0.14-1.0 (f) Succinate:DCPIP oxidoreductase (Complex II) 9 (m) 4-10 (m) 31 (93.9%) (m) 33-69 (m) SDH (+PMS) 10 (m) 10-25 (m) 34 (59.6%) (m) 57-239 (m) Decilubiquinol:cyt c oxidoreductase (Complex III) 81 (m) 55-259 (m) 279 (45.7%) (m) 610-1760 (m) Cytochrome oxidase (Complex IV) 26 (44.1%) (m) 33 (f) 59-170 (m) 16-48 (f) Citrate synthase (CS) 290 (m) 27 (f) 71-200 (m) 11-29 (f) Isolated C-IV deficiency 90 (15.3%) (m) 1.22 (84.1%) (f) 590-1300 (m) 1.45-3.13 (f) Multienzymatic deficiency Where to check for mutations? Clinical symptoms: ETC disease ETC: -ETC: multienzymatic deficiency: - mtDNA depletion, deletion - Mitochondrial tRNA mutations -CIV deficiency: - Mutations of CIV genes encoded in mtDNA - Mutations of CIV structural or assembly genes encoded in nDNA Muscle biopsy: No RRF and COX negative fibers: - Mutations of CIV assembly genes encoded in nDNA Molecular-genetic analysis Deletions, mtDNA Depletion Sequencing of CIV genes encoded in mtDNA CO I, COII , CO III subunits CO I G6955A Gly351Asp Not found in more than 4,000 sequences from patients and controls of all around the world Molecular-genetic analysis Whole mtDNA sequence MT-GENE GENETIC VARIANTS MT-RNR m.750A>G (MT-RNR1), m.961T>G (MT-RNR1), m.1438A>G (MT-RNR1) MT-T rCRS MT-ND m.4769A>G (S-p.MT-ND2), m.13759G>A (NS-p.MT-ND5:Ala475Thr) MT-CYB m.15326A>G (NS-p.MT-CYB:Thr194Ala) MT-CO m.6955G>A (NS-p.MT-CO1:Gly351Asp) MT-ATP m.8448T>C (NS-p.MT-ATP8:Met28Thr), m.8860A>G (NS-p.MTATP6:Thr112Ala) MT-DLOOP m.195T>C (MT-DLOOP), m.263A>G (MT-DLOOP), m.309Ci (MT-DLOOP), m.315Ci (MT-DLOOP), m.16265A>C (MT-DLOOP), m.16293A>G (MTDLOOP), m.16311T>C (MT-DLOOP) Haplogroup H11 Requirements to be pathologic… Controls/Haplogroup - 4020 mtDNA pusblished sequences - Haplogrupo H11 Heteroplasmy % of mutation Requirements to be pathologic… G6955A: GGT GAT Gly351Asp (COI) Conservation indexes of different aminoacid positions Mutations Mammals (227) Aves (125) Reptils (50) Amphibia (73) Fishes (322) No Vertebrates (510) Total (1307) % (100) S142F 227 125 50 73 322 411 1208 92.4 L196I 226 125 49 72 321 441 1234 94.4 M273T 227 125 50 73 321 493 1289 98.6 I280T 227 125 50 73 322 502 1299 99.4 G317S 227 124 50 73 322 494 1291 98.8 Media 96.7 G351D 227 125 50 73 322 505 1302 99.6 This change never has described in humans but it has been found in S. cerevisiae and Rhodobacter spheroides and all of them are respiratory deficient mutants Transmitochondrial cybrids BrEt Glc, Pir, Ur TK- TK+ rho0 PEG BrdU Ur - Glc, Pir Daños en el mtDNA •Mutaciones puntuales en tRNAs, rRNAs y en genes codificantes de proteínas •Deleciones •Depleción Enfermedades asociadas a daños en el DNA mitocondrial Oftalmoplejia crónica progresiva externa Síndrome de Kearns-Sayre Síndrome de Pearson Encefalomiopatías Daños en el mtDNA •Mutaciones puntuales en tRNAs, rRNAs y en genes codificantes de proteínas •Deleciones •Depleción Depleciones de mtDNA Músculo Hígado mtDNA 18S rRNA mtDNA/nDNA % depleción 8.8 0.72 89 4.4 0.37 91.5 Secuenciación del gen de la desoxiguanosina kinasa (dGK) y de timidina kinasa (TK2) en pacientes con formas hepatocerebrales y miopáticas del síndrome de depleción del mtDNA, respectivamente. Síndrome de depleción de mtDNA Forma miopática: TK2 Forma hepatocerebral: DGUOK, MPV17, POLG, SUCLG1, PEO1 Forma encefalomiopática: SUCLA 2 Forma cerebrorenal: RRM2B In vitro oöcyte nuclear transplantation Donor oöcyte MELAS oöcyte Enucleate IVF Normal embryo