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MICROBIOLOGIA Y MEDIOS DE CULTIVO
PRACTICAS DE LABORATORIO
Blgo. ALEJANDRO HANS RAMIREZ MUÑOZ
T.M. JACQUELINE BALQUI RIVERA
ICA – PERÚ
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
MICROBIOLOGIA Y MEDIOS
DE CULTIVO
PRACTICAS DE LABORATORIO
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
MICROBIOLOGIA Y
MEDIOS DE CULTIVO
PRACTICAS DE LABORATORIO
EDICIONES CIENTIFICAS JACBARI S.R.Ltda.
Av. Fernando León de Vivero.
Urb. El Carmen C – 12
Ica – Perú.
RUC: 10215479761
Se imprimieron 1000 ejemplares
© Derechos reservados
Primera Edición: Enero de 2004.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
INTRODUCCION
Esta primera edición, tiene como finalidad, al igual que publicaciones similares,
que el estudiante o profesional dedicado a la Microbiología cuente con un pequeño
manual que facilite el trabajo de laboratorio.
Esta edición, ha sido elaborada con algunos conceptos teóricos, hay también
nuevas tablas, gráficos y por supuesto se han agregado nuevos medios de cultivo; por
otro lado hay un reordenamiento de algunas tablas relacionadas con los discos de control
y susceptibilidad antimircrobiana. La presente edición consta de siete capítulos.
En el capítulo I se presentan algunos conceptos básicos de Microbiología Médica,
Microscopía y de la Taxonomía bacteriana. En el capítulo II se da la teoría esencial e
imprescindible para el conocimiento de las bacterias; es decir la estructura, nutrición y
metabolismo bacteriano.
En el capítulo III se desarrolla la teoría y metodología para una correcta
desinfección y esterilización, los agentes físicos y químicos y su acción sobre las
bacterias. En este mismo capítulo se ha comprendido lo más esencial sobre antibióticos,
como son su clasificación y su valoración.
En el capítulo IV se da el fundamento teórico y se desarrollan las técnicas para la
colaboración bacteriana; de la misma manera para la siembra, aislamiento y transplante
de bacterias tanto aerobias como anaerobias. En el capítulo V se da el conocimiento
teórico, clasificación y el correcto uso del material de laboratorio; incluyéndose además
los gráficos de un gran número de estos instrumentos.
En el capítulo VI se desarrolla lo concerniente a las definiciones básicas, métodos
de muestreo, aislamiento e identificación de microorganismos en los alimentos;
incluyéndose la moderna técnica de placa petrifilm.
Finalmente el VII y último capítulo trata de los medios de cultivo, razón de ser del
presente manual. Se desarrolla en cada uno de éstos su fundamento, composición,
preparación e interpretación. Solamente un adecuado empleo de los medios de cultivo
permitirá un correcto diagnóstico bacteriano.
Ica, Septiembre del 2003
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
CONTENIDO
Pág.
Introducción
CAPITULO I. CONCEPTOS E HISTORIA DE LA MICROBIOLOGIA.
Introducción al concepto y contenido de la microbiología…………………..
Desarrollo histórico de la microbiología……………………………………….
Objeto de estudio de la microbiología…………………………………………
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CAPITULO II. MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y
TAXONOMIA BACTERIANA.
Microbiología Médica……………………………………………………………
Microscopía…………………………………………………….........................
Taxonomía bacteriana. Categorías taxonómicas…………..........................
Cepas o clones. Biotipos……………………………………...........................
Nomenclatura de las bacterias…………………………………………………
Patogenicidad y virulencia……………………………………………………...
Métodos inmunológicos en microbiología clínica…………………………….
Métodos moleculares en microbiología clínica……………………………….
Bacterias de interés médico (clasificación según Bergey)..........................
Bacterias de interés industrial………………………………..........................
CAPITULO III. INTRODUCCION A LA PRACTICA MICROBIOLOGICA
El ciclo del diagnóstico………………………………………………………….
Virulencia de los microorganismos…………………………………………….
Toma de muestra………………………………………………………………..
Transporte de muestras………………………………………………………...
Recepción de muestras y observaciones preliminares……………………...
Examen microscópico…………………………………………………………..
Procesamiento de los cultivos………………………………………………….
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Interpretación de los cultivos…………………………………………………...
Informe de resultados………………………………………………………….
Seguridad en el laboratorio…………………………………………………….
Controles de calidad…………………………………………………………….
CAPITULO IV. ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO
BACTERIANO.
Estructura bacteriana. Pared celular…………………………………………..
Bacterias grammpositivas………………………………………………………
Bacterias grammnegativas……………………………………………………..
Bacterias ácido alcohol resistentes………………………….........................
Bacterias sin pared celular…………………………………………………….
Cápsula bacteriana……………………………………………………………...
Flagelo bacteriano……………………………………………..........................
Formas de las bacterias………………………………………………………...
Tamaño de las bacterias………………………………………………………..
Crecimiento bacteriano………………………………………………………….
Nutrición bacteriana……………………………………………………………..
Tipos tróficos de las bacterias………………………………………………….
Condiciones fisicoquímicas que influyen en el crecimiento bacteriano.......
Metabolismo bacteriano………………………………………………………...
Catabolismo o reacciones energéticas……………………...........................
Anabolismo o reacciones biosintéticas………………………………………..
CAPITULO V: EFECTO DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS
BACTERIAS.
Introducción: Efecto de los factores ambientales sobre las
bacterias………………………………………………………………...
Efecto de la Temperatura……………………………………………..
Liofilización……………………………………………………………..
Desecación……………………………………………………………..
Efecto de las radiaciones sobre las bacterias……………………...
Efecto de las ondas sonoras………………………………………….
Efectos de la presión hidrostática……………………………………
Efectos de la presión osmótica……………………………………….
Efectos del pH………………………………………………………….
CAPITULO VI: ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS
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BACTERIAS.
Conceptos generales……………………………………………………………
Desinfectantes y antisépticos…………………………………………………..
Tipos de desinfectantes…………………………………………………………
Quimioterápicos de síntesis y antibióticos.…………………………………...
Qumioterápicos de síntesis…………………………………………………….
Antibióticos……………………………………………………………………….
Resistencia Bacteriana a los antibióticos……………………………………..
Bases genéticas de la resistencia……………………………………………..
Mecanismos bioquímicos……………………………………………………….
CAPITULO VII. COLORACION, SIEMBRA, AISLAMIENTO Y
TRANSPLANTE DE BACTERIAS.
Coloraciones bacterianas……………………………………………………….
Coloración Gram…………………………………………………………………
Coloración Ácidos Resistente (tinción de Ziehl – Neelsen)…………………
Coloración de cápsulas. Métodos de Hiss……………………………………
Siembra, aislamiento y transplante de bacterias…………………................
Aislamiento de bacterias aerobias en placas de Agar………………………
Métodos de siembra o transplante de bacterias aerobias en tubos……….
Aislamiento de microorganismos anaerobios………………………………...
CAPITULO VIII. INSTRUMENTACION, PROCEDIMIENTOS Y TECNICAS
DE LABORATORIO.
Normas de seguridad en el laboratorio de Microbiología…………………..
Material de laboratorio. Material de vidrio y otros……………………………
Equipos de laboratorio………………………………………………................
Limpieza del material de laboratorio y su esterilización…………................
Láminas ilustradas de los instrumentos y equipos de laboratorio………….
CAPITULO IX. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS.
Definiciones.................................................................................................
Tipos de análisis a que pueden someterse los diferentes productos..........
Métodos de muestreo…………………………………………………………...
Preparación y dilución de las muestras de alimentos……………………….
Numeración de microorganismos aerobios, mesófilos viables…................
Numeración de Coliformes. Determinación del Número Mas Probable
(NMP)……………………………………………………………………………..
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Numeración de Coliformes fecales. Determinación del NMP………………
Detección de Salmonella……………………………………………................
Numeración de Staphylococcus aureus coagulasa positivo………………..
Prueba de la Coagulasa………………………………………………………...
Prueba de la Termonucleasa…………………………………………………..
Aislamiento e identificación del Vibrio cholerae……………………………...
Técnica de la placa Petrifilm en recuento de E. coli y Coliformes…………
Técnica de placa Petrifilm para recuento rápido de S. aureus....................
CAPITULO X. MEDIOS DE CULTIVO.
Medios de Cultivo. Preparación, esterilización y conservación…………….
Clasificación de los Medios de Cultivo………………………………………..
Medios de transporte……………………………………………………………
Algunas pruebas en relación con el metabolismo bacteriano……………..
Relación de las bacterias con el oxígeno……………………………………..
Prueba de oxidación – Fermentación de Hugo – Leifson……….................
Bacterias fermentativas…………………………………………………………
Reacciones de la oxidasa………………………………………………………
Reacción de la catalasa………………………………………………………...
Reducción de los Nitratos………………………………………………………
Reacciones del Rojo Metilo y de Voges – Proskauer……………................
Reacciones basadas en el Catabolismo………………………………………
Productos resultantes de los procesos Anabólicos………………………….
Microbiología para pruebas del laboratorio clínico…………………………..
Detección de microorganismos productores de enfermedades……………
Cultivo de sangre………………………………………………………………..
Microbiología para el análisis de agua y aguas residuales.........................
Microbiología para alimentos y bebidas alcohólicas…………………………
Microbiología para productos lácteos…………………………………………
MEDIOS DE CULTIVO
Agar Almidón…………………………………………………………................
Agar Anaeróbico (Brewer)………………………………………………………
Agar Azida Sangre (Agar base con sangre y azida)…………………………
Agar Baird – Parker (Agar selectivo para Estafilococos)……………………
Agar Bismuto Sulfito de Wilson Blair………………………………...............
Agar Brolacin (Agar azul de bromo timol – lactosa – cistina)......................
Agar Brucella...............................................................................................
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Agar Catc (Agar citrato – azida – tween – carbonato base)........................
Agar Citrimide (Agar selectivo para Pseudomonas base)...........................
Agar Chocolate............................................................................................
Agar Citrato de Simmons.............................................................................
Agar Columbia (Agar con colistina y ácido nalidíxico)………………………
Agar Czapek Dox………………………………………………………………..
Agar Desoxicolato Citrato………………………………………………………
Agar DNAsa………………………………………………………………………
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)………………………………………….
Agar Endo………………………………………………………………………...
Agar Extracto de Malta………………………………………………………….
Agar Fenilalanina………………………………………………………………..
Agar Fosfatasa…………………………………………………………………
Agar Gelatina…………………………………………………………..............
Agar Hierro Tres Azucares (TSI)………………………………………………
Agar Lactosa Rojo Fenol……………………………………………...............
Agar Levine (Agar de Levine con eosina y azul de metileno)………………
Agar Lisina Hierro (LIA)…………………………………………………………
Agar Littman (Agar con bilis de buey de Littman)……………………………
Agar Mac Conkey………………………………………………………………..
Agar Manitol Movilidad (M – Mov.)…………………………………………….
Agar Manitol Salado (AMS)…………………………………………...............
Agar de Middlebrook…………………………………………………………….
Agar Mosto……………………………………………………………………….
Agar Mueller Hinton……………………………………………………………..
Agar Mycophil……………………………………………………………………
Agar Nutritivo (AN)………………………………………………………………
Agar Packer (AP)………………………………………………………………..
Agar Papa Dextrosa…………………………………………………................
Agar Plate Count (Agar peptona de caseína – glucosa – extracto de
levadura)…………
Agar para cultivo de Microensayo…………………………………….............
Agar para Enterobactereaceas (HEKTOEN)...............................................
Agar para Salmonella (ÖNÖZ)…………………………………………………
Agar Salmonella – Shigella (ASS)……………………………………………..
Agar Sabouraud (Agar glucosado de Sabouraud)………………….............
Agar Sangre.................................................................................................
Agar Selectivo para Candida (Agar base para Candida con Verde Bromo
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Cresol)....................
Agar Selectivo para Clostridios....................................................................
Agar para Dermatofitos (DTM)....................................................................
Agar Selectivo para Enterococos (Barnes)..................................................
Agar Selectivo para Estreptococos..............................................................
Agar Selectivo para Estafilococos Nº 110 (Chapman)................................
Agar Selectivo para Yersinia.......................................................................
Agar Sulfito..................................................................................................
Agar Thayer – Martin...................................................................................
Agar Tiosulfato – Citrato – Bilis – Sucrosa (TCBS).....................................
Agar Verde Brillante (Kauffman) (Agar verde brillante – rojo de fenol –
lactosa)......................
Agar Violeta Cristal – Rojo Neutro – Bilis (VRVA)…………………..............
Agar Xilosa – Lisina y Desoxicolato (XLD)..................................................
Agua Peptonada…………………………………………………………………
Agua Peptonada Tamponada………………………………………................
Caldo Brila (Caldo verde brillante – bilis – lactosa)………………………….
Caldo Cianuro……………………………………………………………………
Caldo de Enriquecimiento para Salmonella (Rappaport)……………………
Caldo de Enriquecimiento para Vibrio cholerae……………………………..
Caldo Hajna para Gramnegativos…………………………………………….
Caldo Extracto de Malta………………………………………………………...
Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI)………………………………………..
Caldo Lactosado…………………………………………………………………
Caldo Lauril Triptosa…………………………………………………………….
Caldo Malonato………………………………………………………................
Caldo Manitol Salado……………………………………………………………
Caldo Mosto……………………………………………………………………...
Caldo Nitrato……………………………………………………………………..
Caldo Nutritivo……………………………………………………………………
Caldo Peptonado………………………………………………………………...
Caldo Selenito……………………………………………………………………
Caldo Tetrationato Base………………………………………………………..
Caldo Tioglicolato (Medio Alternativo de la USP)……………………………
Caldo Triptosa…………………………………………………………………..
Caldo Urea……………………………………………………………...............
Discos Bactrol (Discos de control y susceptibilidad antimicrobiana)………
Medio Base para Fermentación de Azúcares y Alcoholes………………….
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Medio de Loefler (suero sanguíneo de Loefler)………………………………
Medio de Lowenstein – Jensen para Micobacterias…………………………
Medio de Hugo y Leifson (Medio basal para oxidación y fermentación)…..
Medio Gelatina Tioglicolato…………………………………………................
Medio Kliger Iron Agar (KIA) (Agar hierro dos azúcares)…………………...
Medios Microbiológicos: Agar Micológico, Agar Micológico con bajo pH,
Caldo – Micológico y Caldo Micológico con bajo pH
Medio para Movilidad – Indol – Orinitina……………………………………..
Medio para Movilidad con Infusión de Gelatina………………………………
Medio para Decarboxilasa de Arginina – Lisina – Ornitina………………….
Medio para Prueba de Rojo de Metilo y Voges Proskauer (MR – VP)…….
Medio SIM (Medio para sulfuro, Indol y Movilidad)………………................
Prueba de la Beta – Galactosidasa (ONPG)…………………………………
Prueba de la Citocromo – Oxidasa…………………………………………….
ANEXOS:
Tabla 32: Diferenciación de Enterobacteriaceaes mediante pruebas
bioquímicas………………………………………………………………………
Tabla 33: Pruebas claves para la identificación de las especies con mayor
significado clínico………………………………………………………..
Tabla 34: Identificación presuntiva de los estreptococos………… ……….
Tabla 35: Diferenciación de los cocos grampositivos catalasa negativos..
Tabla 36: Características diferenciales de las especies Neisseria aisladas
frecuentemente………………………………………………………..
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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CAPITULO I
CONCEPTOS E HISTORIADE LA MICROBIOLOGIA.
Introducción al concepto y contenido de la microbiología.
Desarrollo histórico de la microbiología.
Objeto de estudio de la microbiología.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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CONCEPTOS E HISTORIADE LA MICROBIOLOGIA
I.
INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA.
La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de
los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por
debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga
determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los
microorganismos. Precisamente, el origen tardío de la Microbiología con relación a otras
ciencias biológicas, y el reconocimiento de las múltiples actividades desplegadas por los
microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos
y técnicas pertinentes. Con la invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento
despegue de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los
siguientes 150 años su progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos
microbianos, y a los primeros intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el
marco de los "sistemas naturales" de los Reinos Animal y Vegetal.
El asentamiento de la Microbiología como ciencia está estrechamente ligado a una serie de
controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religión
de la época), que se prolongaron hasta finales del siglo XIX. La resolución de estas polémicas
dependió del desarrollo de una serie de estrategias experimentales fiables (esterilización,
cultivos puros, perfeccionamiento de las técnicas microscópicas, etc.), que a su vez dieron
nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constituyó el núcleo aglutinador de la
ciencia microbiológica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el
definitivo abandono de la idea de la generación espontánea, y el triunfo de la teoría germinal
de la enfermedad, representan las conquistas definitivas que dan carta de naturaleza a la joven
Microbiología en el cambio de siglo.
Tras la Edad de Oro de la Bacteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch,
la Microbiología quedó durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,
estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Química, que le
aportaría varios avances metodológicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en
principio minoritaria, dedicada a los estudios básicos centrados con ciertas bacterias del suelo
poseedoras de capacidades metabólicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que
afectan a la nutrición de las plantas, logró hacer ver la ubicuidad ecológica y la extrema
diversidad fisiológica de los microorganismos. De esta forma, se establecía una cabeza de
puente entre la Microbiología y otras ciencias biológicas, que llegó a su momento decisivo
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
cuando se comprobó la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostró, con material y
técnicas microbiológicas que la molécula de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un
íntimo y fértil intercambio entre la Microbiología, la Genética y la Bioquímica, que se plasma en
el nacimiento de la Biología Molecular, base del espectacular auge de la Biología desde
mediados de este siglo.
Por otro lado, el "programa" inicial de la Microbiología (búsqueda de agentes infectivos,
desentrañamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador)
condujeron a la creación de ciencias subsidiarias (Virología, Inmunología) que finalmente
adquirieron su mayoría de edad y una acentuada autonomía.
Por último, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creación de la Microbiología,
mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigación básica, y hoy
muestra una impresionante "hoja de servicios" y una no menos prometedora perspectiva de
expansión a múltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades
infecciosas (higiene, vacunación, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento
económico racional de los múltiples procesos en los que se hallan implicados los
microorganismos (biotecnologías).
Así pues, la sencilla definición con la que se abrió este apartado, escondía todo un cúmulo de
contenidos y objetos de indagación, todos emanados de una peculiar manera de aproximarse a
la porción de realidad que la Microbiología tiene encomendada. En las próximas páginas
ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho rápida referencia.
Realizaremos un recorrido por su el desarrollo de la Microbiología a lo largo de su historia, que
nos permitirá una visión concreta de algunos de sus característicos modos de abordar su
objeto de estudio; finalmente, estaremos en disposición de definir este último, desglosado
como objeto material y formal.
II.
DESARROLLO HISTÓRICO DE LA MICROBIOLOGÍA.
La Microbiología, considerada como una ciencia especializada, no aparece hasta finales del
siglo XIX, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodológicos que
se habían empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una
revisión de ideas y prejuicios seculares sobre la dinámica del mundo vivo.
Siguiendo el ya clásico esquema de Collard (l976), podemos distinguir cuatro etapas o
periodos en el desarrollo de la Microbiología:
a) Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende desde la antigüedad hasta
llegar a los primeros microscopistas.
b) Segundo periodo, de lenta acumulación de observaciones (desde l675 aproximadamente
hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por
Leeuwenhoek (l675).
c) Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo XIX, donde
las figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de cristalizar a la Microbiología como
ciencia experimental bien asentada.
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Ramirez - Balqui
d) Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros días), en el que los
microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiológica, bioquímica, genética,
ecológica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiología, el
surgimiento de disciplinas microbiológicas especializadas (Virología, Inmunología, etc.), y la
estrecha imbricación de las ciencias microbiológicas en el marco general de las Ciencias
Biológicas. A continuación se realiza un breve recorrido histórico de la disciplina
microbiológica, desglosando los períodos 3º y 4º en varios apartados temáticos.
2.1. PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO.
Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debió
aguardar hasta el último tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la
humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las
fermentaciones implicadas en la producción de bebidas alcohólicas, pan y productos
lácteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas.
Diversas fuentes escritas de la antigüedad griega y romana hablan de gérmenes
invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su "De
rerum natura" hace varias alusiones a "semillas de enfermedad". En el Renacimiento
europeo, Girolamo Frascatorius, en su libro "De contagione et contagionis" (1546) dice
que las enfermedades contagiosas se deben a "gérmenes vivos" que pasan de diversas
maneras de un individuo a otro. Estos inicios de explicación que renunciaban a invocar
causas sobrenaturales fueron probablemente catalizados por la introducción en Europa
de la sífilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su
contagio. Pero la "cosa" que se transmite en la enfermedad siguió siendo objeto de
conjeturas durante mucho tiempo.
2.2.
EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS.
Ya en el siglo XIV, con la invención de las primeras lentes para corregir la visión, surgió
una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los
objetos. En el siglo XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física óptica de las
lentes de aumento, pero no encontraron una aplicación inmediata. Se dice que Galileo
hizo algunas observaciones "microscópicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes
montadas en un tubo, pero en cualquier caso está claro que no tuvieron ninguna
repercusión.
La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a Constantijn
Huygens, quien relata que el inglés Cornelis Drebbel tenía en su taller un instrumento
magnificador, que recibió el nombre de microscopium en l625, en la Accademia dei
Lincei, de Roma.
El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante holandés de
tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su pasión por pulir y montar
lentes casi esféricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi llegó a descuidar sus
negocios. Fabricó unos cuatrocientos microscopios simples, con los que llegó a obtener
aumentos de casi 300 diámetros. En 1675 descubrió que en una gota de agua de
estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denominó
"animálculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Microbiología". Durante varias décadas Leeuwenhoek fue comunicando sus
descubrimientos a la Royal Society de Londres a través de una serie de cartas que se
difundieron, en traducción inglesa, en las "Philosophical Transactions". Sus magníficas
dotes de observador le llevaron asimismo a describir protozoos (como Giardia, que
encontró en sus propias heces), la estructura estriada del músculo, la circulación
capilar, a descubrir los espermatozoides y los glóbulos rojos (por lo que también se le
considera el fundador de la Histología animal), así como a detallar diversos aspectos
estructurales de las semillas y embriones de plantas. Leeuwenhoek se percató de la
abundancia y ubicuidad de sus animálculos, observándolos en vinagre, placa dental,
etc.
Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron interés al ser comunicados,
pocos intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. Además, la fabricación de lentes
sencillas de gran aumento era difícil y el manejo de los microscopios simples, bastante
engorroso.
Simultáneamente el inglés Robert Hooke (1635-1703) usando microscopios
compuestos, describió los hongos filamentosos (1667), y descubrió la estructura celular
de las plantas (Micrographia, 1665), acuñando el término célula. Pero el trabajo con
microscopios compuestos aplicados al estudio de los "animálculos" languideció durante
casi 200 años, debido a sus imperfecciones ópticas, hasta que hacia 1830 se
desarrollaron las lentes acromáticas.
2.3.
EL DEBATE SOBRE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA.
La autoridad intelectual de Aristóteles por un lado, y la autoridad moral representada por
la Biblia, por otro, junto con las opiniones de escritores clásicos como Galeno, Plinio y
Lucrecio, a los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura médica
en la Edad Media y Renacimiento, dieron carta de naturaleza a la idea de que algunos
seres vivos podían originarse a partir de materia inanimada, o bien a partir del aire o de
materiales en putrefacción. Esta doctrina de la "generatio spontanea" o abiogénesis, fue
puesta en entredicho por los experimentos de Francesco Redi (1621-1697), quien había
acuñado la expresión "Omne vivum ex ovo" (1668), tras comprobar que los insectos y
nematodos procedían de huevos puestos por animales adultos de su misma especie.
Demostró que si un trozo de carne era cubierto con gasa de forma que las moscas no
podían depositar allí sus huevos, no aparecían "gusanos", que él correctamente
identificó como fases larvarias del insecto. Los descubrimientos de Redi tuvieron el
efecto de desacreditar la teoría de la generación espontánea para los animales y
plantas, pero la reavivaron respecto de los recién descubiertos "animálculos", de modo
que aunque se aceptó la continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no
todos estaban dispuestos a admitir el más amplio "Omne vivum ex vivo" aplicado a los
microorganismos.
Hubo que esperar un siglo más hasta que una serie de naturalistas recomenzaran el
ataque a la teoría preformacionista. Lazzaro Spallanzani (1729-1799) sostuvo una
disputa con J.T. Needham (1713-1781) en la que el primero demostró que los
"infusorios" no aparecían en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas
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Ramirez - Balqui
durante tiempo suficiente a ebullición en frascos herméticamente cerrados, pero volvían
a aparecer si se practicaban agujeros en el recipiente. Sin embargo los
preformacionistas no se daban por vencidos; el mismo Needham, recogiendo una idea
ya expresada por Huygens, amigo de Leeuwenhoek, replicó -con argumentos vitalistas
muy propios de la época- que el calor había destruido la "fuerza vegetativa" de las
infusiones y había cambiado la "cualidad" del aire dentro de los frascos.
Durante el primer tercio del siglo XIX la doctrina de la arquegénesis o generación
espontánea recibió un último refuerzo antes de morir, debido por un lado a razones
extracientíficas (el auge del concepto de transmutación producido por la escuela de la
filosofía de la naturaleza), y por otro al descubrimiento del oxígeno y de su importancia
para la vida, de modo que los experimentos de Spallanzani se interpretaron como que al
calentarse las infusiones, el oxígeno del aire se destruía, y por lo tanto desaparecía la
"fuerza vegetativa" que originaba la aparición de microorganismos.
Theodor Schwann (1810-1882) presentó en 1836 un método seguro para refutar la
teoría abiogénica: calentó maceraciones en frascos a los que se había eliminado
previamente el aire, pero no continuó trabajando en esta línea.
Para complicar más las cosas, la publicación de "Sobre el origen de las especies" por
Darwin en 1859, fue utilizada por algunos preformacionistas para apoyar sus
argumentos. El mismo Haeckel, en una fecha tan tardía como 1866, se mostraba
escéptico ante las pruebas aportadas por Pasteur.
Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que asestó el golpe definitivo y zanjó
la cuestión a favor de la teoría biogénica. En un informe a la Académie des Sciences de
París, en 1860 ("Expériences rélatives aux générations dites spontanées") y en escritos
posteriores comunica sus sencillos y elegantes experimentos: calentó infusiones en
matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el cuello, haciéndolo largo, estrecho y
sinuoso, y dejándolo sin cerrar, de modo que el contenido estuviera en contacto con el
aire; tras esta operación demostró que el líquido no desarrollaba microorganismos, con
lo que eliminó la posibilidad de que un "aire alterado" fuera la causa de la no aparición
de gérmenes. Antes bien, comprobó que los gérmenes del aire quedaban retenidos a su
paso por el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no alcanzaban el interior del
recipiente donde se encontraba la infusión, quedando ésta estéril indefinidamente. Sólo
si se rompía el cuello lateral o si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de
líquido a la porción de cuello, los gérmenes podían contaminar la infusión y originar un
rápido crecimiento.
En 1861 Pasteur publica otro informe en el que explica cómo se pueden capturar los
"cuerpos organizados" del aire con ayuda de un tubo provisto de un tapón de algodón
como filtro, y la manera de recuperarlos para su observación microscópica. De esta
forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abría la
Edad de Oro del estudio científico de las formas de vida no observables a simple vista.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Los últimos escépticos quedaron silenciados cuando en 1877 John Tyndall (1820-1893)
aplicó su sistema de esterilización por calentamiento discontinuo (hoy conocida
precisamente como tindalización), que evidenció la existencia de formas microbianas de
reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco más tarde por Ferdinand
Cohn al descubrir las esporas bacterianas.
2.4.
EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS.
Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiológica fue el
establecimiento de la relación que une ciertas transformaciones químicas que se dan en
las infusiones con el crecimiento de los gérmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour
en 1836, y Schwann y Kützing en 1837 habían sugerido que las levaduras eran las
causantes de la fermentación alcohólica por la que el azúcar pasa a alcohol etílico y
dióxido de carbono, pero se encontraron con la crítica adversa de los grandes químicos
de la época (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, había realizado importantes
confirmaciones a la "teoría mineral" sobre la nutrición de las plantas, enfrentándose a la
"teoría del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas
heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas
microscópicas, se suponía que los procesos de fermentación y putrefacción se debían a
fenómenos químicos de descomposición y muerte encuadrables en el marco de la
teoría mineral de la fisiología vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se
podía explicar en términos de química y física retrasó por algún tiempo la adscripción de
estos fenómenos a células vivas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades ópticas de los
cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen orgánico)
quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostró que los
agentes de la fermentación láctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema
que había surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentación
alcohólica se vio sustituida por una indeseable fermentación láctica. Este fue el inicio de
una larga serie de estudios que habría de durar hasta 1876, en los que Pasteur
identificó distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos
fermentativos. Así, en 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a
ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus Études sur le vin resume sus hallazgos al
respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones
prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes
biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad
en industrias y destilerías.
Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la
presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo cual
desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer.
Acuñó los términos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la
vida en presencia y en ausencia de oxígeno.
24
Ramirez - Balqui
Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las distintas
implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos orgánicos en
presencia y en ausencia de oxígeno, demostrando que, en el segundo caso el
rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder
realizarse la degradación total de las correspondientes sustancias.
Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897 Buchner
obtuvo, a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que era capaz de
realizar la misma transformación de "fermentación" que las células vivas. Este
descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad
la confluencia de los enfoques químico y biológico: las fermentaciones eran procesos
químicos catalizados por enzimas presentes dentro de células vivas, que podían ser
estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioquímica, nacida como una rama de
la química fisiológica, que se venía especializando en la enzimología, encontró una
alianza fructífera y duradera con la joven Microbiología.
2.5.
LOS AVANCES TÉCNICOS.
La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo XIX, mantenía que
los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las
condiciones ambientales. A estas ideas se oponían frontalmente investigadores como
Koch, Pasteur y Cohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia
morfológica y fisiológica de cada tipo de microorganismo (monomorfismo). El
pleomorfismo había surgido como una explicación a la gran variedad de formas y
actividades que aparecían en un simple frasco de infusión, pero ya Pasteur, en sus
estudios sobre la fermentación, se había percatado de que los cultivos que aparecían
podían considerarse como una sucesión de distintas poblaciones de microorganismos
predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior
composición de la comunidad microbiana. La solución definitiva a esta cuestión
dependía, de nuevo, de un desarrollo técnico, que a su vez iba a suministrar una de las
herramientas características de la nueva ciencia: los métodos de cultivo puro.
Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el micólogo Brefeld, quien logró aislar
esporas de hongos y cultivarlas sobre medios sólidos a base de gelatina. Por su menor
tamaño, este método se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurrió a un
método basado en diluciones: Lister, en 1878 realizó diluciones secuenciales de cultivos
mixtos, hasta lograr muestras en las que existía una sola célula. Pero la técnica era
larga y tediosa y, además, normalmente sólo se lograban aislar células del tipo
bacteriano más abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvió para
confirmar la naturaleza "particulada" de los agentes de las fermentaciones.
Por aquella época Koch buscaba con ahínco métodos más sencillos de cultivo puro,
indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patógenas. Primero
(y quizá de forma un tanto casual) empleó rodajas de patata como sustrato sólido
nutritivo sobre el que se podían desarrollar colonias macroscópicas de bacterias que
presentaban morfología característica, que Koch interpretó como resultantes del
crecimiento a partir de células individuales. Pero enseguida recurrió a compactar el
25
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
típico caldo de cultivo a partir de carne (diseñado por Loeffler) añadiéndole gelatina
(1881). El medio sólido así logrado era transparente, lo que permitía visualizar
fácilmente los rasgos coloniales, y contenía los nutrientes adecuados para el
crecimiento de una amplia gama de bacterias. Éstas eran inoculadas en la superficie del
medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la técnica de siembra
en estría. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por
determinados microorganismos, y de tener un bajo punto de fusión; ambos problemas
se solventaron cuando en 1882 el médico alemán Walter Hesse, siguiendo una
sugerencia de su mujer Fanny, introdujo el agar-agar (polisacárido extraído de algas
rojas) como nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la
trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera
propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1887 Petri, un
ayudante de Koch, sustituyó las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas con campanas,
usadas hasta entonces para los cultivos sólidos, por un sistema manejable de placas de
cristal planas, que se conoce como cajas de Petri.
El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las
investigaciones llevadas a cabo por Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros
años del siglo XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoquímicos y
poseedoras de características fisiológicas distintivas (quimioautótrofas, fijadoras de
nitrógeno, etc.). Estos medios, donde se aplica a pequeña escala el principio de
selección natural, se diseñan de forma que su composición química definida favorezca
sólo el crecimiento de ciertos tipos fisiológicos de microorganismos, únicos capaces de
usar ciertos nutrientes del medio.
Otra importante aportación a este "período de cultivo" dentro del desarrollo de la
Microbiología surgió del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta algún
rasgo bioquímico o metabólico, lo que contribuye a la identificación microbiana. Fue
Würtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH, incorporados en los
medios, lo cual permitía revelar la producción de acidificaciones por fermentación en
ciertas bacterias.
Mientras tanto, en la ciudad de Jena se había creado una atmósfera de progreso donde
confluían grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger o Abbé interaccionando con
una pujante editorial especializada en Biología y Medicina (Gustav Fischer) y con una
poderosa industria óptica y química. Estas influencias recíprocas se plasmaron en
numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la
estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria óptica de Abbé y
Zeiss, que se mantenía en conexión con la compañía vidriera Schott, pudo satisfacer la
necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes
acromáticas y una iluminación inferior provista de condensador. El mismo Abbé
desarrolló en 1878 el objetivo de inmersión en aceite. Por otro lado, la industria química
BASF, que por aquella época se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos
colorantes, suministró al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que
teñían las bacterias permitiendo su fácil visualización al microscopio en frotis de tejidos
infectados. En 1875 Carl Weigert tiñó bacterias con pirocarmín, un colorante que ya
26
Ramirez - Balqui
venía siendo usado desde hacía unos años en estudios zoológicos. En años sucesivos
se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal.
En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su método de ácido-alcohol resistencia para
teñir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el patólogo danés Christian Gram establece
una tinción de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en función de sus
reacción diferencial de tinción y que, como se vería mucho más tarde, reflejaba la
existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890
Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su técnica de impregnación
argéntica. Como veremos más adelante, la misma industria de colorantes alemana
previa a la primera guerra mundial fue decisiva también para los comienzos de la
quimioterapia.
Estas innovaciones técnicas (métodos de cultivo, microscopía y tinciones) fueron
fundamentales (junto con los sistemas de esterilización abordados en el anterior
apartado) para la consolidación de la Microbiología como ciencia, permitiendo eliminar
las grandes dosis de especulación que hasta entonces habían predominado.
2.6.
EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES.
Durante el siglo XIX la atención de muchos naturalistas se había dirigido hacia las
diversas formas de animales y plantas que vivían como parásitos de otros organismos.
Este interés se redobló tras la publicación de los libros de Darwin, estudiándose las
numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos parásitos habían adquirido en su
peculiar estilo de vida. Sin embargo, la adjudicación de propiedades de parásitos a los
microorganismos vino del campo médico y veterinario, al revalorizarse las ideas sobre el
origen germinal de las enfermedades infecciosas.
En 1835 Agostino Bassi (1773-1856) demostró que cierta enfermedad del gusano de
seda (mal di segno), que había hecho su aparición en Lombardía, se debía a un hongo
(Botrytis bassiana). Cuatro años más tarde J.L. Schönlein descubrió la asociación de un
hongo con una enfermedad humana de la piel. En 1840 Henle, de la escuela fisiológica
de Johannes Müller, planteó la teoría de que las enfermedades infecciosas están
causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmación de estas ideas tuvo
que esperar a que la intervención de Pasteur demostrara la existencia de
microorganismos específicos responsables de enfermedades.
Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa (pebrina) comenzó a
diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcanzando
finalmente a China y Japón. A instancias de su maestro Jean Baptiste Dumas, Pasteur
aceptó el reto de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba
dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se
había enfrentado con un problema de patología. Es más que probable que Pasteur viera
aquí la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones
podían tener una extensión hacia los procesos fisiológicos del hombre y de los
animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea
de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente extraño, creyendo
durante los dos primeros años que se trataba de alteraciones meramente fisiológicas.
27
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Tras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le
obligaba a repasar continuamente los experimentos y las conclusiones extraídas,
inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un
corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo
Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de
medidas de control, ésta comienza a remitir de modo espectacular.
La intervención de bacterias como agentes específicos en la producción de
enfermedades fue descubierta a raíz de una serie de investigaciones sobre el carbunco
o ántrax, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. C.
Davaine, entre 1863 y 1868, encontró que en la sangre de vacas afectadas aparecían
grandes cantidades de microorganismos a los que llamó bacteridios; además, logró
inducir la enfermedad experimentalmente en vacas sanas, inoculándoles muestras de
sangre infectada. En 1872 el médico alemán C.J. Eberth consiguió aislar los bacilos
filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910), que
había sido alumno de Henle, quien con su reciente técnica de cultivo puro logró, en
1876, el primer aislamiento y propagación in vitro del bacilo del ántrax (Bacillus
anthracis), consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas,
fijadas y teñidas con azul de metileno. Más tarde (1881), Koch y sus colaboradores
confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos, y más
resistentes que éstos a una variedad de agentes. Pero más fundamental fue su
demostración de que la enfermedad se podía transmitir sucesivamente a ratones sanos
inoculándoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios
líquidos.
Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue
llevado a una ulterior perfección en 1882, con la publicación de "Die Äthiologie der
Tuberkulose", donde se comunica por primera vez la aplicación de los criterios que
Henle había postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de
Koch, son los siguientes:
a) El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos.
b) El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro.
c) La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe
provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.
d) El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma
experimental.
Fue asimismo Koch quien demostró el principio de especificidad biológica del agente
infeccioso: cada enfermedad infecciosa específica está causada por un tipo de bacteria
diferente. Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la Microbiología
Médica sobre firmes bases científicas.
Durante las dos décadas siguientes la Microbiología experimentó una auténtica edad de
oro, en la que se aislaron y caracterizaron muchas bacterias patógenas. La Alemania
del Reich, que a la sazón se había convertido en una potencia política y militar, se
28
Ramirez - Balqui
decidió a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de Koch, dada su enorme
importancia social y económica, creando un Instituto de investigación, siendo Koch su
director en el Departamento de Salud. De esta forma, en la Escuela Alemana se
aislaron los agentes productores del cólera asiático (Koch, 1883), de la difteria (Loeffler,
1884), del tétanos (Nicolaier, 1885 y Kitasato, 1889), de la neumonía (Fraenkel, 1886),
de la meningitis (Weichselbaun, 1887), de la peste (Yersin, 1894), de la sífilis
(Schaudinn y Hoffman, 1905), etc. Igualmente se pudieron desentrañar los ciclos
infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia
colonial se encontró en ultramar: malaria (Schaudinn, 1901-1903), enfermedad del
sueño (Koch, 1906), peste vacuna africana (debida al inglés Bruce, 1895-1897), etc.
2.7.
DESARROLLO DE LA ASEPSIA, QUIMIOTERAPIA Y NTIBIOTERAPIA.
Los avances de las técnicas quirúrgicas hacia mediados del siglo XIX, impulsados por la
introducción de la anestesia, trajeron consigo una gran incidencia de complicaciones
post-operatorias derivadas de infecciones. Un joven médico británico, Joseph Lister
(1827-1912), que había leído atentamente los trabajos de Pasteur, y que creía que
estas infecciones se debían a gérmenes presentes en el aire, comprobó que la
aplicación de compuestos como el fenol o el bicloruro de mercurio en el lavado del
instrumental quirúrgico, de las manos y de las heridas, disminuía notablemente la
frecuencia de infecciones post-quirúrgicas y puerperales.
Más tarde, Paul Ehrlich (1854-1919), que había venido empleando distintas sustancias
para teñir células y microorganismos, y que conocía bien el efecto de tinción selectiva
de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a células
animales, concibió la posibilidad de que algunos de los compuestos de síntesis que la
industria química estaba produciendo pudieran actuar como "balas mágicas" que fueran
tóxicas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibió un
programa racional de síntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de éstas en
infecciones experimentales. Trabajando en el laboratorio de Koch, probó
sistemáticamente derivados del atoxilo (un compuesto que ya Thompson, en 1905,
había mostrado como eficaz contra la tripanosomiasis), y en 1909 informó de que el
compuesto 606 (salvarsán) era efectivo contra la sífilis. Aunque el salvarsán presentaba
algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el único agente disponible contra
enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvió para ilustrar brillantemente la
validez del enfoque de la llamada quimioterapia (término acuñado por el mismo Ehrlich),
de modo que encauzó toda la investigación posterior.
En 1927 Gerhard Domagk, en conexión con la poderosa compañía química I.G.
Farbenindustrie, inició un ambicioso proyecto de búsqueda de nuevos agentes
quimioterápicos, siguiendo el esquema de Ehrlich; en 1932-1935 descubre la acción del
rojo de prontosilo frente a neumococos hemolíticos dentro del hospedador, pero señala
que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in vitro. La explicación la
suministra el matrimonio Tréfouël, del Instituto Pasteur, al descubrir que la actividad
antibacteriana depende de la conversión por el hospedador en sulfanilamida. El
mecanismo de acción de las sulfamidas (inhibición competitiva con el ácido paraaminobenzoico) fue dilucidado por el estadounidense Donald D. Woods. Las
29
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
investigaciones de éste encaminaron a la industria farmacéutica hacia la síntesis de
análogos de metabolitos esenciales, introduciendo un enfoque más racional frente a la
época anterior, más empírica.
En 1874, el médico inglés W. Roberts había descrito las propiedades antibióticas de
ciertos cultivos de hongos (Penicillium glaucum) contra las bacterias, e introdujo en
Microbiología el concepto de antagonismo. Otros investigadores de finales del siglo XIX
realizaron observaciones similares, pero fue Fleming quien, en 1929, logró expresar
ideas claras sobre el tema, al atribuir a una sustancia química concreta (la penicilina) la
acción inhibidora sobre bacterias producida por el hongo Penicillium notatum. Fleming
desarrolló un ensayo crudo para determinar la potencia de la sustancia en sus filtrados,
pudiendo seguir su producción a lo largo del tiempo de cultivo, y mostrando que no
todas las especies bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las
dificultades técnicas para su extracción, junto al hecho de que el interés de la época aún
estaba centrado sobre las sulfamidas, impidieron una pronta purificación de la
penicilina, que no llegó hasta los trabajos de Chain y Florey (1940), comprobándose
entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre todo de Grampositivas, y la ausencia de efectos tóxicos para el hospedador.
Inmediatamente comenzó una búsqueda sistemática de microorganismos del suelo que
mostraran actividades antibióticas. En 1944 A. Schatz y S. Waksman descubren la
estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, siendo el primer ejemplo de
antibiótico de amplio espectro. Los diez años que siguieron al término de la segundad
guerra mundial vieron la descripción de 96 antibióticos distintos producidos por 57
especies de microorganismos, principalmente Actinomicetos.
En la década de los 60 se abrió una nueva fase en la era de los antibióticos al
obtenerse compuestos semisintéticos por modificación química de antibióticos
naturales, paliándose los problemas de resistencia bacteriana a drogas que habían
empezado a aparecer, disminuyéndose en muchos casos los efectos secundarios, y
ampliándose el espectro de acción.
Aparte de la revolución que supusieron en el campo de la aplicación clínica, los
antibióticos ha permitido notables avances en el desentrañamiento de determinados
aspectos de arquitectura y función moleculares de las células susceptibles (paredes
celulares microbianas, ribosomas, síntesis proteica, etc.).
2.8.
30
AUGE DE LA MICROBIOLOGÍA GENERAL.
Gran parte de los avances en Microbiología descritos hasta ahora se debieron a la
necesidad de resolver problemas prácticos. Pero hacia finales del siglo XIX una serie de
investigadores -algunos de ellos procedentes de áreas más clásicas de la Historia
Natural- desarrollaron importantes estudios básicos que fueron revelando una enorme
variedad de microorganismos y sus actividades metabólicas, así como su papel crucial
en ciclos biogeoquímicos, sus relaciones con procesos de nutrición vegetal, etc.
Ramirez - Balqui
El descubrimiento de la quimioautotrofía, obra del gran microbiólogo ruso Sergei
Winogradsky (1856-1953), obligó a revisar los conceptos previos, procedentes de la
Fisiología Vegetal, de que el crecimiento autotrófico dependía de la presencia de
clorofila. Winogradsky había comenzado investigando las bacterias del hierro
descubiertas por Cohn en 1875, observando que podían crecer en medios minerales,
por lo que supuso que obtenían su energía de la oxidación de sales ferrosas a férricas
(1888). En 1889, combinando técnicas de observación secuencial de cultivos
microscópicos con ensayos microquímicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa,
Thiothrix), infirió que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrógeno hasta azufre
elemental (acumulando éste como gránulos), y luego hasta ácido sulfúrico, obteniendo
de este modo su energía. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del
concepto de litotrofía. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofía llegó cuando al año
siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes,
demostrando de manera clara que la energía obtenida de la oxidación del amonio o del
nitrito era usada para fijar CO2 (1889-1890). Más tarde el mismo Winogradsky extendió
la demostración a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el
gel de sílice. La explicación del proceso de oxidación de los compuestos de azufre no
llegó hasta los estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades
metabólicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que
oxidan hidrógeno o metano (Söhngen, 1906).
El químico Berthelot había señalado (1885) que los microorganismos del suelo podían
incorporar nitrógeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el
primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrógeno atmosférico (Clostridium
pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (1890), siendo el
holandés Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria
aerobia fijadora de vida libre (1901). Más tarde Beijerinck demostró por métodos
químicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrógeno de la atmósfera mientras
crece (1908). La importancia de la fijación de nitrógeno para la nutrición vegetal llegó
con los estudios sobre bacterias formadoras de nódulos en las raíces de las
leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes,
realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, habían indicado que las
leguminosas asimilaban nitrógeno de la atmósfera. En 1866 Voronin descubrió las
bacterias de los nódulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostró
que los nódulos parecían inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y
Ward (1887) usó bacterias procedentes de nódulos machacados para inocular semillas,
logrando la producción de nódulos en suelo estéril, y describiendo en un bello trabajo el
proceso de infección, con su producción de "hifas" (cordón de infección). Tras la
introducción del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el
primero en describir los nódulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta
y bacterias. Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador
Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estación Experimental de
Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en Berlín, en 1886, y
publicados en un artículo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural
de las leguminosas con la presencia de sus nódulos radicales, señalando que estos
nódulos se inducían por microorganismos específicos; de este modo lograron una
31
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
brillante síntesis de las observaciones microbiológicas y químicas. El mismo año de
1888 Beijerinck logró el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares (a las que bautizó
como Bacillus radicicola), observando que no reducían nitrógeno en vida libre; más
tarde (1890) aportó la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de
nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiriéndose de esta forma
la facultad de fijar nitrógeno en su asociación con la raíz de la planta. Irónicamente el
nombre definitivo para las bacterias de los nódulos de leguminosas (Rhizobium) fue
propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se había negado a reconocer los
resultados de Hellriegel y Willfahrt, y que había oscilado en sus opiniones, desde
suponer que la fijación de nitrógeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer
que las estructuras nodulares observadas a microcopio (bacteroides) eran gránulos de
reserva (incluidas las que él mismo observó en plantas no leguminosas de los géneros
Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en su honor -Frankia); incluso
cuando se convenció de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o
mixomicetes), pensaba que éstas sólo estimulaban a que las plantas fijaran nitrógeno
en sus hojas; su "conversión" (y aún así incompleta y con reticencias) no llegó hasta
1892. El aislamiento de los bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relación
entre su formación y la fijación de nitrógeno (Nobbe y Hiltner, 1893) completó esta
primera oleada de investigación sobre este tema que tanta trascendencia presentaba
para la Agronomía. Estos estudios están en la base de todos los ulteriores trabajos de
Microbiología Agrícola, de modo que esta especialidad fue incorporada tempranamente
a los laboratorios científicos y estaciones experimentales.
Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte
para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad
Técnica de Delft, fue continuada por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este último el
"padre" de la escuela norteamericana desde su establecimiento en California, ya que
formó a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La
escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructífera "colonia" en la
ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continuó el trabajo emprendido junto a
van Niel en Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando
contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la
variedad de las bacterias fotosintéticas, los tipos de organismos litotróficos, y
profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiológicos de las bacterias
recién descubiertas. Como dice T.D. Brock en una recensión de Kluyver (1961) "los
hombres de la escuela de Delft de Microbiología General fueron pioneros en una época
en la que la mayoría de los investigadores estaban demasiado fascinados por
problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por
microorganismos quimiosintéticos o fotosintéticos, o por aquellos que muestran
fermentaciones inusuales...". Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de
ciencia básica ha sido extraordinariamente fértil, y aparte de la profundización en la
unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud
de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias biológicas.
2.9.
32
DESARROLLO DE LA INMUNOLOGÍA.
Ramirez - Balqui
La inmunología es, en la actualidad, una ciencia autónoma y madura, pero sus orígenes
han estado estrechamente ligados a la Microbiología. Su objeto consiste en el estudio
de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasión por
microorganismos o partículas extraños, aunque su interés se ha volcado especialmente
sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de
especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como nopropios, así como de su neutralización y degradación.
Como tantas otras ciencias, la Inmunología presenta un prolongado período precientífico, de observaciones y aproximaciones meramente empíricas. La resistencia a
ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la
antigüedad; el historiador griego Tucídides (464-404 a.C.) narra que en una epidemia
acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por
aquellos que habían sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que
éstos no volverían a ser contagiados. Igualmente, en la antigua China se había
observado que las personas que en su niñez habían padecido la viruela no la adquirían
más adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo XI a. C., fueron los primeros en
intentar una aplicación de estas observaciones que indicaban la inducción de un estado
protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la inhalación de polvo de
escaras de viruela provocaba un ataque suave que confería resistencia ante infecciones
posteriores. Una modificación fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por Pylarini
y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaña por Lady Mary Wortley Montagu, esposa
del embajador inglés en Constantinopla, tras una serie inicial de pruebas sobre
"voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de prácticas no llegaron a arraigar
ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la
posibilidad de transmisión de otras enfermedades.
El primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el
médico inglés Edward Jenner (1749-1823), tras su constatación de que los vaqueros
que habían adquirido la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que sólo
producía pústulas en las manos) no eran atacados por la grave y deformante viruela
humana. En mayo de 1796 inoculó a un niño fluido procedente de las pústulas
vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una
pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la
enfermedad. Jenner publicó sus resultados en 1798 ("An enquiry into the causes and
effects of the variolae vaccinae..."), pronosticando que la aplicación de su método podría
llegar a erradicar la viruela. Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar
estudios clínicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de la
necesidad de contar con controles fiables.
La falta de conocimiento, en aquella época, de las bases microbiológicas de las
enfermedades infecciosas retrasó en casi un siglo la continuación de los estudios de
Jenner, aunque ciertos autores, como Turenne, en su libro "La syphilization" (1878)
lograron articular propuestas teóricas de cierto interés.
33
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
El primer abordaje plenamente científico de problemas inmunológicos se debió, de
nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (más tarde
conocida como Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de
cultivos viejos, poco virulentos, las protegía de contraer la enfermedad cuando
posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se
obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue precisamente
Pasteur quien dio carta de naturaleza al término vacuna, en honor del trabajo pionero de
Jenner. En los años siguientes Pasteur abordó la inmunización artificial para otras
enfermedades; concretamente, estableció de forma clara que cultivos de Bacillus
anthracis atenuados por incubación a 45ºC conferían inmunidad a ovejas expuestas a
contagio por carbunco. Una famosa demostración pública de la bondad del método de
Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Fort, el dos de junio de 1881, cuando ante un gentío
expectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no
inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. Años después,
abordaría la inmunización contra la rabia, enfermedad de la que se desconocía el
agente causal. Pasteur observó que éste perdía virulencia cuando se mantenían al aire
durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos
extractos se podían emplear eficazmente como vacunas. Realizó la primera vacunación
antirrábica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el niño Joseph Meister, que había
sido mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo
que valió a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su método
de inmunización, que abría perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas
enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creación del Instituto
Pasteur, que muy pronto reunió a un selecto grupo de científicos, que enfocarían sus
esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biológicas. A su
vez, los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los métodos
serologicos de Pasteur, lo que les permitió producir y conservar más fácilmente sueros
tipificados contra la peste porcina.
A finales del siglo XIX existían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biológicos
de las respuestas inmunes. Por un lado, el zoólogo ruso Ilya Ilich Mechnikov (18451916), que había realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y
pulgas de agua, estableció, a partir de 1883, su "Teoría de los fagocitos", tras estudiar
fenómenos de englobamiento de partículas extrañas por los leucocitos de conejo y de
humanos. Informó que existían fenómenos de eliminación de agentes patógenos por
medio de "células devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra
el carbunco, y explicó la inmunización como una "habituación" del hospedador a la
fagocitosis. Más tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugnó la idea de que los
fagocitos segregan enzimas específicos, análogos a los "fermentos" digestivos (1900).
Esta teoría de los fagocitos constituyó el núcleo de la teoría de la inmunidad celular, de
modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa
inmune del organismo.
Por otro lado, la escuela alemana de Koch hacía hincapié en la importancia de los
mecanisnos humorales. Emil von Behring (1854-1917) y Shibasaburo Kitasato (18561931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del tétanos y de la difteria,
34
Ramirez - Balqui
observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (más tarde conocidas como
anticuerpos) que tendían a neutralizar las toxinas de forma específica, y evidenciaron
que el suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una
dosis letal de la toxina correspondiente (1890). La intervención de Ehrlich permitió
obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para
conferir una protección eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para
cuantificar la "antitoxina" presente en suero. Ehrlich dirigió desde 1896 el Instituto
Estatal para la Investigación y Comprobación de Sueros, en Steglitz, cerca de Berlín, y,
a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental,
en Frankfurt. Durante este último periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante
obra científica, en la que va ahondando en la comprensión de la inmunidad humoral. En
1900 da a luz su "Teoría de las cadenas laterales", en la que formula una explicación de
la formación y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base química para la
interacción de éstos con los antígenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez,
en 1897, una reacción antígeno-anticuerpo, al observar el enturbiamiento de un filtrado
bacteriano al mezclarlo con un suero inmune específico (Antisuero). En 1898 Jules
Bordet (1870-1961) descubre otro componente sérico relacionado con la respuesta
inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo, por su
termolabilidad e inespecificidad. (Más tarde se impondría el nombre de complemento,
propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarrolló, en 1901, el primer sistema
diagnóstico para la detección de anticuerpos, basado en la fijación del complemento, y
que inició una larga andadura, que llega a nuestros días.
La conciliación de las dos teorías se debió a Almorth Wrigth y Stewart R. Douglas,
quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de
animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la
capacidad fagocítica de los leucocitos.
El área de la inmunopatología inicia su andadura con la descripción del fenómeno de
anafilaxia producido por introducción en un animal de un suero de una especie distinta
(Portier y Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abriría la posibilidad de métodos
de serodiagnóstico, con aplicaciones múltiples en Medicina, Zoología, y otras ciencias
biológicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenómemo de
hipersensibilidad) tiene relación directa con la producción de anticuerpos contra el suero
inyectado, introduciendo el término de alergia para referirse a la reactividad
inmunológica alterada.
La inmunoquímica cobra un gran impulso en las primeras décadas del siglo XX con los
trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribución de importancia había
sido la descripción, mediante reacciones de aglutinación, del sistema de antígenos
naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboración
con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su
transmisión hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estímulo para avanzar en el
desentrañamiento de la especificidad química de los antígenos que determinan la
formación de anticuerpos. Landsteiner estudió sistemáticamente las características de
inmunogenicidad y especificidad de reacción de antígenos con anticuerpos, valiéndose
35
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
de la modificación química de antígenos, denominando haptenos a aquellos grupos
químicos que por sí mismos no desencadenan formación de anticuerpos, pero sí lo
hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras.
La cuestión de las reacciones antígeno-anticuerpo se convirtió en otra polémica entre
escuelas hasta finales de los años 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenían que
estas reacciones tienen una base puramente química, Bordet y sus discípulos las
explicaban como fenómenos físicos de reacciones entre coloides. La resolución del
debate debió aguardar hasta finales de los años 30, al incorporarse avances técnicos
como la electroforesis, la cromatografía en papel, la ultracentrifugación y el microscopio
electrónico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por
disociación de precipitados. Tiselius (1939) demostró que los anticuerpos constituyen la
fracción gamma-globulínica del suero. Veinte años después R.R. Porter y G.M. Edelman
establecen la estructura de las inmunoglobulinas. Durante este lapso de tiempo se
descubre que la síntesis de anticuerpos ocurre en las células plasmáticas, aunque éstas
no son puestas en relación aún con los linfocitos; durante muchos años se siguió
creyendo que los linfocitos eran células pasivas, sin función inmune. Por aquella época
se describe, también, la diversidad de inmunoglobulinas, llegándose al establecimiento
de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los múltiples experimentos sobre
timectomía en ratones neonatos y sobre bursectomía en aves, así como los de
reconstitución de animales irradiados, con timocitos y células de la medula ósea, y que
permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y
B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente.
Una importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo XX fue la
obtención de vacunas. Se lograron toxoides inmunogénicos a partir de toxinas
bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetánico (Eisler y
Lowenstein, 1915) y toxoide diftérico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna
BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium
tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin. La utilización de coadyuvantes se inicia en
1916, por LeMoignic y Piroy.
La inmunogenética nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisión
hereditaria de los cuatro grupos sanguíneos principales, basándose en el análisis
estadístico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y
Levène (1927) de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones
sanguíneas interespecíficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antígenos
sanguíneos, explicables según unos 300 alelos múltiples.
Una contribución esencial a las ideas sobre el mecanismo de formación de los
anticuerpos la realizó el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su
teoría de la selección clonal; ésta argumenta que cada linfocito B sintetiza un único tipo
de anticuerpo, específico para cada antígeno (determinante antigénico), de modo que la
unión del antígeno causa la proliferación clonal del linfocito B, con la consecuente
síntesis incrementada de anticuerpos específicos. Igualmente, Burnet lanzó una
hipótesis sobre el mecanismo subyacente a la auto-tolerancia inmunológica, que fue
36
Ramirez - Balqui
confirmada experimentalmente por Peter Medawar. Más recientemente Niels Jerne ha
realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teoría de la selección clonal,
proponiendo un modelo de regulación inmune conocido como teoría de las redes
idiotípicas.
Los avances en Inmunología durante los últimos años han sido espectaculares,
consolidando a ésta como ciencia independiente, con su conjunto propio de
paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiológico. Entre los
hitos recientes hay que citar la técnica de producción de anticuerpos monoclonales a
partir de hibridomas, desarrollada originalmente por César Milstein y Georges Kohler en
1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el
desentrañamiento de los fenómenos de reorganización genética responsables de la
expresión de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa.
2.10. ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGÍA.
La Virología ha sido la ciencia microbiológica de origen más tardío, habiendo surgido
como resultado del hallazgo de enfermedades infecciosas en las que la demostración
de implicación de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales
disponibles a finales del siglo XIX. La euforia que se vivía en los ámbitos científicos y
médicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias patógenas, se plasmó
en el prejuicio de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas
enfermedades se debía a una técnica inapropiada o mal aplicada.
El botánico ruso Dimitri Iwanovski había observado (1892) que la enfermedad del
mosaico del tabaco podía ser reproducida experimentalmente usando el fluido que
atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenían a las bacterias, pero
siendo incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandonó la
investigación. Pocos años más tarde (1898), y probablemente sin tener noticias del
trabajo de Iwanovski, Beijerink realizó experimentos similares con el mismo sistema, y
en otro rasgo de su genio, enfrentándose a los conceptos de la época, avanzó la idea
de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, según su expresión), debía de
incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproducción. Este tipo
de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en
principio "virus filtrables", quedando más tarde su denominación simplemente como
virus. Aquel mismo año de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al
comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901
Reed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y
Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su
técnica de multiplicación de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous
aísla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1911).
Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no
alcanzó la elegancia y claridad del desarrollado poco más tarde por el canadiense Félix
d'Hérelle (1917); fue éste quien acuñó el término bacteriófago, y supuso correctamente
que el fenómeno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre
las bacterias. Aunque su esperanza en la aplicación de los fagos como elementos
37
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
bactericidas para uso médico no pudo satisfacerse, la contribución de los virus
bacterianos al avance de la genética y biología moleculares ha sido decisiva: de hecho,
los primeros estudios cuantitativos sobre replicación virásica se realizaron sobre fagos
de Escherichia coli, lo que suministró modelos aplicables a otros virus, incluidos los de
animales. En 1925 Bordet y Bal describen por primera vez el fenómeno de lisogenia,
pero las relaciones entre los ciclos lítico y lisogénico de los fagos no fueron aclaradas
hasta los estudios de André Lwoff (1950).
La primera visualización de un virus se debe a las observaciones a microscopio
ultravioleta del bacteriólogo inglés Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera
fotografía de un virus a microscopio electrónico. Pero los avances más significativos en
el estudio de la composición y estructura de los virus se inician con la purificación y
cristalización, por Wendell M. Stanley, del virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935),
aplicando procedimientos típicos de la cristalización de enzimas. Inicialmente Stanley
comprobó que el TMV contenía gran proporción de proteína, pero poco más tarde
detecta, además, la presencia de ácido nucleico. A partir de aquí, la Virología entra en
una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y
genetistas, en un esfuerzo interdisciplinario que da origen a la moderna Biología
Molecular.
Un importante avance metodológico para el estudio de los virus animales se debió a
Enders, Weller y Robbins (1949), al desarrollar por primera vez un método para la
multiplicación virásica sobre cultivos de tejidos de mamíferos, técnica que fue
perfeccionada más tarde por el equipo de Renato Dulbecco.
Los recientes progresos en las numerosas técnicas de biología molecular han
propiciado una auténtica explosión de descubrimientos sobre la biología de los virus y
de sus células hospedadoras; baste citar la replicación del genomio de ARN de los
retrovirus por reversotranscripción a ADN, los fenómenos de transformación oncogénica
virásica y su aplicación a los estudios generales del cáncer, el diseño de vacunas
recombinantes por manipulación in vitro de genomios virásicos, la próxima aplicación
clínica de la primeras terapias génicas en humanos recurriendo a vectores virásicos,
etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología existente ha permitido la
rápida identificación y caracterización del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que
se está traduciendo en una intensa y racional búsqueda de procedimientos para
prevenir y eliminar la inesperada epidemia de SIDA.
En años recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas,
subvirásicas: T.O. Diener describió en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos
en plantas, a los que llamó viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que
determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas
aparentemente desprovistas de material genético, a las que bautizó como priones.
2.11. RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGÍA Y OTRAS CIENCIAS BIOLÓGICAS.
El auge de la microbiología desde finales del siglo XIX se plasmó, entre otras cosas, en
el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que
38
Ramirez - Balqui
suministró un enorme volumen de nuevo material biológico sobre el que trabajar,
aplicándose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales
más antiguas; así, había que crear un marco taxonómico (con sus normas de
nomenclatura) para encuadrar a los organismos recién descubiertos, era factible
desarrollar trabajos sobre morfología y fisiología comparadas, sobre variabilidad y
herencia, evolución, ecología, etc. De este modo la joven Microbiología fue objeto, en
pocos años, de la utilización, a un ritmo acelerado, de los métodos taxonómicos y
experimentales que habían ido surgiendo y madurando desde el siglo XVIII en los
ámbitos de la "Historia Natural" clásica.
Los avances de Taxonomía Microbiana, vale la pena reseñar aquí los esfuerzos
tempranos para lograr un clasificación bacteriana por parte de Cohn (1875) y Migula
(1894), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres
morfológicos. Pero hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo
de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres
bioquímicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de rasgos morfológicos,
bioquímicos, patogénicos y de tinción (Buchanan, 1915). El sistema de taxonomía
bacteriana adquirió un nuevo impulso a partir de la 1ª edición del "Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology" (1923), y de las propuestas de Kluyver y van Niel
("Prospects for a natural system of classification of bacteria", 1936). En cuanto a la
nomenclatura, no fue hasta 1958 en que cuajó un Código Internacional de
Nomenclatura Bacteriológica, aunque ya se venía aplicando desde hacía tiempo el
procedimiento tipológico para los microorganismos, con criterios similares a los de la
Zoología y la Botánica.
El establecimiento de relaciones taxonómicas precisó el recurso a métodos cada vez
más amplios y afinados de análisis genético, estructural o fisiológico. En un apartado
anterior ya vimos las conexiones tempranas entre la Bioquímica y la Microbiología a
propósito del descubrimiento de la base enzimática de las fermentaciones, lo cual abrió
el camino para dilucidar el metabolismo energético microbiano, y para demostrar su
similitud química con rutas metabólicas de organismos superiores. Otro paso importante
en la percepción de la unidad bioquímica del mundo vivo deriva del descubrimiento de
las vitaminas (término acuñado por Funk en 1911), al establecerse que determinados
factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran químicamente
similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de
compuestos representa precursores biosintéticos de coenzimas del metabolismo
celular. Así pues, este tipo de investigaciones sentó claramente la idea de la unidad
química de los seres vivos, independientemente de su encuadre taxonómico, y encauzó
una buena parte de los trabajos bioquímicos hacia los microorganismos, dadas sus
cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio.
En cuanto a las conexiones de la Microbiología con la Genética, ya Beijerink, en 1900,
tras analizar la teoría de la mutación de De Vries, había predicho que los
microoganismos podrían convertirse en objetos de investigación más adecuados que
los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras conexiones entre ambas ciencias
arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo XX, de determinar la
39
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
sexualidad de los hongos con fines taxonómicos. En 1905 Maire demostró la existencia
de meiosis en la formación de ascosporas, y Claussen (1907) evidenció fusión de
núcleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los años 30 había
recogido un gran volumen de información sobre procesos sexuales en Basidiomicetos.
El sueco Lindegren (1936) realiza las primeras cartografías genéticas en cromosomas
de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan; este
último, propugnador de la "teoría de los genes" (1926), confiaba desde hacía años en
ampliar sus éxitos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la genética microbiana.
En 1941, otros dos discípulos de Morgan, Beadle y Tatum, aíslan mutantes auxotróficos
de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioquímica de la herencia, y
convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta línea de
investigación.
Las estrategias diseñadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrück
(1943) a cultivos bacterianos, investigando la aparición de mutaciones espontáneas
resientes a fagos o estreptomicina. La conexión de estos experimentos con las
observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformación del neumococo, llevó a
Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el "principio transformante" portador de
la información genética es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra bioquímicamente
la transmisión genética mediante ADN en Escherichia coli, y en 1952 Alfred Hershey y
Martha Chase, en experimentos con componentes marcados de fagos, ponen un
elegante colofón a la confirmación de la función del ADN, con lo que se derribaba el
antiguo y asentado "paradigma de las proteínas" que hasta mediados de siglo intentaba
explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiología experimental se sitúa en
pleno centro del nacimiento de la Genética molecular, de la mano de los avances
paralelos en Bioquímica (análisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice
Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble hélice del ADN, etc.),
dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la "edad de oro" de la Biología
Molecular.
III. INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA.
El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos apartados: objeto material y
objeto formal.
3.1.
40
OBJETO MATERIAL: LOS MICROORGANISMOS
La Microbiología es la ciencia que se ocupa del estudio de los microorganismos, es
decir, de aquellos organismos demasiado pequeños para poder ser observados a
simple vista, y cuya visualización requiere el empleo del microscopio. Esta definición
implica que el objeto material de la Microbiología viene delimitado por el tamaño de los
seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos
estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus,
viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los
protozoos y parte de las algas y de los hongos. De esta manera la Microbiología se
distingue de otras disciplinas (como la Zoología y la Botánica) que se centran en grupos
de seres vivos definidos por conceptos biológicos homogéneos, ya que su objeto de
indagación se asienta sobre un criterio artificial que obliga a incluir entidades sin más
Ramirez - Balqui
relación en común que su pequeño tamaño, y a excluir a diversos organismos
macroscópicos muy emparentados con otros microscópicos.
A pesar de esto (o incluso debido a ello), la Microbiología permanece como una
disciplina perfectamente asentada y diferenciada, que deriva su coherencia interna del
tipo de metodologías ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamaño se sitúa por
debajo del límite de resolución del ojo humano, aportando un conjunto específico de
conceptos que han enriquecido la moderna Biología.
Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamaño microscópico
dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, bien sea acelular o
celular, y en este último caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos,
coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciación en tejidos u órganos, y que necesitan
para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Bajo
esta denominación se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades
subcelulares.
3.1.1. MICROORGANISMOS CELULARES.
Comprenden todos los procariotas y los microorganismos eucarióticos (los
protozoos, los mohos mucosos, los hongos y las algas microscópicas).
3.1.2. VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS.
Otro tipo de objetos de estudio de la microbiología son las entidades no celulares,
que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida,
cuentan con individualidad y entidad biológica, y caen de lleno en el dominio de
esta ciencia.
Los virus son entidades no celulares de muy pequeño tamaño (normalmente
inferior al del más pequeño procariota), por lo que debe de recurrirse al
microscopio electrónico para su visualización. Son agentes infectivos de
naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporación
al protoplasma vivo para que su material genético sea replicado por medio de su
asociación más o menos completa con las actividades celulares normales, y que
pueden transmitirse de una célula a otra. Cada tipo de virus consta de una sola
clase de ácido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para codificar
varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones enzimáticas,
mientras que otras son estructurales, disponiéndose éstas en cada partícula
virásica (virión) alrededor del material genético formando una estructura regular
(cápsida); en algunos virus existe, además, una envuelta externa de tipo
membranoso, derivada en parte de la célula en la que se desarrolló el virión
(bicapa lipídica procedente de membranas celulares) y en parte de origen virásico
(proteínas).
En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la
maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicación de su ácido nucleico y de
obtención de energía. Esto les obliga a un modo de vida (sic) parasitario
41
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el virión pierde su integridad,
y normalmente queda reducido a su material genético, que al superponer su
información a la de la célula hospedadora, logra ser expresado y replicado,
produciéndose eventualmente la formación de nuevos viriones que pueden
reiniciar el ciclo.
Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvirásicas,
descubiertas en 1967 por T.O. Diener en plantas. Están constituidos
exclusivamente por una pequeña molécula circular de ARN de una sola hebra,
que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un extenso, pero
no total, emparejamiento intracatenario de bases por zonas de homología interna.
Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejanza con los intrones
autocatalíticos de clase I, por lo que podrían representar secuencias intercaladas
que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles
de su modo de multiplicación, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma,
existiendo pruebas de la implicación de la ARN polimerasa II en su replicación, por
un modelo de círculo rodante que genera concatémeros lineares. Esta replicación
parece requerir secuencias conservadas hacia la porción central del viroide. Los
viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones
patológicas. El mecanismo de patogenia no está aclarado, pero se sabe que
muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quizá podrían interferir; sin
embargo, no existen indicios de que alteren la expresión génica (una de las
hipótesis sugeridas); cada molécula de viroide contiene uno o dos dominios
conservados que modulan la virulencia.
En 1986 se descubrió que el agente de la hepatitis delta humana posee un
genomio de ARN de tipo viroide, aunque requiere para su transmisión (pero no
para su replicación) la colaboración del virus de la hepatitis B, empaquetándose
en partículas similares a las de este virus. A diferencia de los viroides vegetales,
posee capacidad codificadora de algunas proteínas.
Los ARNs satélites son pequeñas moléculas de tamaño similar al de los viroides
de plantas (330-400 bases), que son empaquetados en cápsidas de determinadas
cepas de virus (con cuyos genomios no muestran homologías). Se replican sólo
en presencia del virus colaborador específico, modificando (aumentando o
disminuyendo) los efectos patógenos de éste.
Los virusoides constituyen un grupo de ARNs satélites no infectivos, presentes
en el interior de la cápsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los
viroides, replicándose exclusivamente junto a su virus colaborador.
Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original,
descubiertas por Stanley Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades
degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos (por ejemplo, el "scrapie"
o prurito de ovejas y cabras, la encefalitis espongiforme bovina), incluyendo los
humanos (kuru, síndrome de Gerstmann-Straüssler, enfermedad de Creutzfeldt-
42
Ramirez - Balqui
Jakob). Se definen como pequeñas partículas proteicas infectivas que resisten la
inactivación por agentes que modifican ácidos nucleicos, y que contienen como
componente mayoritario (si no único) una isoforma anómala de una proteína
celular. Tanto la versión celular normal (PrPC) como la patógena (PrPSc en el caso
del "scrapie") son glicoproteínas codificadas por el mismo gen cromosómico,
teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las características
distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos
oligosacáridos que adquieren por procesamiento post-traduccional.
A diferencia de los virus, los priones no contienen ácido nucleico y están
codificados por un gen celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva
síntesis poseen moléculas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no
necesariamente la secuencia de la molécula del PrP que causó la infección previa.
Se desconoce su mecanismo de multiplicación, y para discernir entre las diversas
hipótesis propuestas quizá haya que dilucidar la función del producto normal y su
posible conversión a la isoforma patógena infectiva.
Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de las enfermedades
por priones son simultáneamente infectivas y genéticas, una situación insólita en
la Patología humana, habiéndose demostrado una relación entre un alelo
dominante del PrP y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El gen del prión (Prn-p)
está ligado genéticamente a un gen autosómico (Prn-i) que condiciona en parte
los largos tiempos de incubación hasta el desarrollo del síndrome.
3.2.
OBJETO FORMAL.
Todos los aspectos y enfoques desde los que se pueden estudiar los microorganismos
conforman lo que denominamos objeto formal de la Microbiología: características
estructurales, fisiológicas, bioquímicas, genéticas, taxonómicas, ecológicas, etc., que
conforman el núcleo general o cuerpo básico de conocimientos de esta ciencia. Por otro
lado, la Microbiología también se ocupa de las distintas actividades microbianas en
relación con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias
perjudiciales (y en este caso estudia los nichos ecológicos de los correspondientes
agentes, sus modos de transmisión, los diversos aspectos de la microbiota patógena en
sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de éste, así como los
métodos desarrollados para combatirlos y controlarlos), como de las que reportan
beneficios (ocupándose del estudio de los procesos microbianos que suponen la
obtención de materias primas o elaboradas, y de su modificación y mejora racional con
vistas a su imbricación en los flujos productivos de las sociedades).
Finalmente, la Microbiología ha de ocuparse de todas las técnicas y metodologías
destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos, es decir,
de todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia empírica.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
CAPITULO II
MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y
TAXONOMIA BACTERIANA.
Microbiología Médica
Microscopía
Taxonomía bacteriana. Categorías taxonómicas
Cepas o clones. Biotipos
Nomenclatura de las bacterias
Patogenicidad y Virulencia
Métodos inmunológicos en microbiología clínica
Métodos moleculares en microbiología clínica
Bacterias de interés médico (clasificación según Bergey)
Bacterias de interés industrial
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y TAXONOMIA
BACTERIANA
I.
MICROBIOLOGIA
En general, las bacterias son organismos unicelulares, desprovistos de clorofila que pueden
vivir libres o bien agruparse.
Su tamaño varia entre 0.2 y 3 micras de diámetro. Aunque son verdaderas células, su
estructura presenta rasgos especiales:
a) Por ser procarióticas carecen de núcleo diferenciado. El citiplasma presenta un solo
cromosoma en forma de anillo (ADN circular).
b) Una pared rígida (pared bacteriana) rodea la membrana plasmática. La composición
química de la pared bacteriana varía en los distintos grupos de bacterias y se refleja en la
capacidad de retener o no determinados colorantes. Según esto, las bacterias se clasifican
en grampositivas o gramnegativas. Además, ciertas bacterias presentan una capa viscosa
formada por azúcares complejos sobre la pared bacteriana que es lo que llamamos
cápsula.
c) Algunas bacterias son inmóviles; otras se desplazan mediante la utilización de cilios o
flegelos.
d) No presentan mitocondrias, aunque por tratarse de seres vivos, también respiran.
Según su forma o morfología reciben distintos nombres bacilos, con forma de bastón; vibrio,
semejantes a una coma; o parecidos a un sacacorchos, como los espirilos.
Por último, los cocos son de forma redondeada y pueden agruparse por parejas (diplococos),
en cadena (estreptococos) o de modo irregular (estafilococos).
En el mundo de las bacterias, las formas de alimentación son muy variadas. Algunas viven en
el suelo y, partiendo de sustancias inorgánicas, son capaces de sintetizar su propio alimento;
presentan, por tanto, nutrición autótrofa.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Dentro de este grupo podemos distinguir las que realizan la fotosíntesis, si bien se trata de un
proceso algo distinto del que tiene lugar en las plantas; poseen variedades únicas de clorofila
(bacterioclorofila), y las que aprovechan la energía de ciertas reacciones químicas (y no la del
sol) para construir sus propias sustancias. Entre ésta última, llamadas quimiotrofas, se
encuentran:
 Las bacterias sulfurosas, que adsorben azúcar (o ácido sulfhídrico) y lo combinan con
oxígeno.
 Las bacterias ferricas, que viven en aguas dulces o saladas en las que existe hierro en
disolución; absorben estos compuestos y los combina con el oxígeno.
 Las bacterias hidrógenas, que combinan hidrógeno y oxígeno dando agua como
subproducto de su actividad.
 Las bacterias nitrificantes, que oxidan ciertos compuestos nitrogenados.
 Estos cuatros tipos de bacterias aprovechan la energía que se libera en las reacciones
descritas.
Sin embargo, la mayoría de las bacterias dependen de otros seres vivos para alimentarse.
Estas bacterias, heterótrofas, pueden ser saprofitas y vivir a expensas de la materia orgánica
en descomposición, los parásitos si viven sobre o dentro de animales o vegetales vivos, o
simbióticas cuando se asocian a otros organismos para obtener ambos un beneficio mutuo.
Las bacterias viven en todo tipo de medios: en el agua, en la tierra y en los seres vivos. En este
último caso pueden tener efectos benéficos para el organismo en el que se encuentran, como
sucede por ejemplo con unas bacterias del intestino del hombre, que producen una sustancia
muy importante: la vitamina K..
En muchos casos las bacterias producen enfermedades cuando se hallan presentes en los
animales y en las plantas. En tal caso reciben el nombre de bacterias patógenas.
Las "insignificantes" bacterias han producido grandes epidemias a lo largo de la historia, como
lo es el caso de la peste o el cólera. Pero también son responsables de enfermedades muy
comunes entre nosotros, tales como el canto o las anginas.
La reproducción más típica en las bacterias es la asexual, multiplicándose por simple escisión
o bipartición.
Este proceso es enormemente eficaz porque, en condiciones apropiadas, pueden llegar a
dividirse cada veinte minutos. A las seis o sietes horas, una sólo bacteria puede dar lugar a un
millón de descendiente. No cabe duda, que son los organismos vivos más abundantes sobre la
tierra.
Por su simplicidad ante organismos más complejos, las bacterias son muy utilizadas en la
investigación bioquímica y genética.
Algunos bacilos tienen la propiedad de formar estructuras de resistencia o esporas cuando las
condiciones se vuelven adversas.
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Ramirez - Balqui
Los mecanismos parasexuales mediante los cuales realizan intercambios de material genético
son:
 La conjugación: hay una bacteria donadora y otra receptora.
 La transducción; el agente transmisor es un virus que transporta fragmentos de la última
bacteria que ha parasitado.
 La transformación: una bacteria introduce fragmentos de ADN que hay libres en el medio.
En la conjugación, una célula donadora emite un apéndice tubular llamado pili o fimbria que
comunica su citoplasma con el de la célula receptora. Por esto puente puede pasar una porción
del cromosoma donador.
II.
MICROSCOPIA.
Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una
imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El
microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos
separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.
El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información.
La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen,
la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.
Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con
longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y
con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo,
pero no puede aumentar la resolución.
Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en
factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de
la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.
2.1. TIPOS DE MICROSCOPIOS
Microscopio de campo claro – Es descendiente de los disponibles a partir de 1800.
Compuestos por:
Fuente luminosa que ilumina la muestra.
Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra.
Platina sobre la cual se coloca la muestra.
Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra.
Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este
tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este
no produce un nivel útil de contraste.
Microscopio de contraste de fase – Permite observar células sin colorear y resulta
especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas
partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por
regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase
con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras
longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y
del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y
produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen
corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen
corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan
para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el
microscopio de interferencia diferencial.
Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las
estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está
equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta.
En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual
aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia
el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un
proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de
polvo llega hasta la retina del ojo y las hacen visibles.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo
oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede
detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro,
debido al contraste creado.
Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas
en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.
Microscopio de fluorescencia – Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda
que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz
ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A
y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su
aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la
detección de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración
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Ramirez - Balqui
inmunocitoquímica. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en
un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos
sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en
neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos
mineralizados.
Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir
luz monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo
permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta
el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento analítico.
Microscopio de barrido confocal – Se usa para estudiar la estructura de los materiales
biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y,
en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge
del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un
sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo
punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este
rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un
monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar
imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la
imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen.
Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del
espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.
Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta
depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz
ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una
resolución de 0,1 m. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del
funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en
fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la
luz ultravioleta puede dañar la retina.
El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados
aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede
obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada
célula.
Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple modificación del
microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de
luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el
objetivo y el observador.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación
se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada.
La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz
polarizada se denomina birrefringencia.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides
de las células intersticiales testiculares.
2.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA.
Dentro de los microscopios electrónicos tenemos el de barrido y el de transmisión.
La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos esta en que la longitud
de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución.
Microscopio electrónico de transmisión – La óptica es muy similar al óptico pero se
diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible.
Este microscopio se basa en los siguientes principios:
Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (cátodo).
 Un ánodo, hacia el cual son atraídos los electrones.
 Una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de
aceleración entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la haz.
 El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que las
lentes de vidrio de un microscopio óptico.
El condensador forma el haz y modifica el diámetro del haz que incide en el plano del
espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio
de un objetivo y se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final
se visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra que han
sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o
esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales
pesados durante la preparación del espécimen aparecen oscuras. Se coloca una placa
fotográfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con
la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla.
Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio óptico pero
requieren métodos más finos.
Los preparados la restricción que tienen es que en cada paso se trabaja con
especimenes de magnitud 3-4 órdenes menores o más finos que los utilizados para el
microscopio óptico. Debido a la gran resolución de estos microscopios electrónicos la
calidad de la fijación, es decir el grado de preservación de la estructura subcelular debe
ser la mejor posible.
La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de
transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un
buffer y de una fijación con tetróxido de osmio.
52
Ramirez - Balqui
Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas de tejido
no mayores de 1 mm3.
El proceso de deshidratación es idéntico al empleado en la microscopia óptica.
El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos
especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante.
Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los cortes
preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150 nm.
Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde
el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de líquido, se recuperan y se
colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plástico. Estas rejillas tienen 50400 orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados.
Por lo general, la coloración de los cortes para microscopio electrónico de transmisión
se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad,
tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los
tejidos durante la fijación o la deshidratación o al sumergir las muestras en soluciones
de tales iones después del corte. El teróxido de osmio que se emplea de rutina en el
fijador se une a los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual agrega
densidad a la membrana.
A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la
deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones
celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de uranilo y
citrato de plomo se usa rutinariamente para teñir los cortes antes de observarlos con
microscopio electrónico de transmisión.
La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para
microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de
membranas.
El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del
tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un
crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados
centígrados.
Microscopio electrónico de barrido – Se asemeja más que al microscopio electrónico de
transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la microscopia electrónica. Para
analizar la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecación de
punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco
de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos
mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las
características estructurales del mineral.
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a
través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones reflejados desde la
superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por
uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en una
televisión.
Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta de video.
Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la
catodoluminiscencia de las moléculas del tejido por debajo de la superficie y los
electrones de Auger emitidos en la superficie.
Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico de
transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis por rayos X con sonda
electrónica.
Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el
haz de bombardea el corte histológico, y mediante analizadores apropiados se
construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos que
tienen número atómico mayor de 12, en concentración suficiente para producir rayos X
en cantidad tal que se pueda analizar.
III. TAXONOMIA BACTERIANA. CATEGORIAS TAXONOMICAS.
En el caso de las bacterias, el concepto de especie, un grupo de organismos que pueden
reproducirse entre ellos y dar descendencia fértil, no es apropiado, pues su reproducción es
asexual. En microbiología se dice que una especie está formada por un conjunto de
poblaciones clonales, o cepas, que se parecen mucho entre ellas y se pueden diferenciar de
otros grupos de bacterias.
La clasificación, de las bacterias se hace principalmente basándose en propiedades
bioquímicas, fisiológicas y ecológicas, como por ejemplo ser aeróbicas, anaeróbicas o aerobias
facultativas.
Para clasificar una bacteria, primero hay que aislarla para obtener un cultivo puro. Esto se
consigue distribuyendo la muestra, de manera que al sembrar las bacterias se desarrollen
separadamente y se pueda aislar un clon en concreto. Después este se ha de sembrar en
diferentes medios de cultivo, convenientemente preparados para realizar diferentes pruebas y
observar el tipo de crecimiento que se produce en ellos, por ejemplo ver si puede degradar la
lactosa o no, etc.
Niveles Taxonómicos:
Taxonomía.- Conjunto de técnicas y procedimientos para ordenar y agrupar a los seres vivos
en grupos afines o taxones.
Sistemática.- Se encarga de agrupar a los seres vivos de acuerdo a criterios de semejanzas y
diferencias y relaciones evolutivas. Establece árboles genealógicos:
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Ramirez - Balqui
Reino
Phylum
Clase
Orden
Familia
Género
Especie
Reino.Phylum.Clase.Orden.Familia.Género.Especie.-
Conjunto de phyla
Conjunto de clase
Conjunto de órdenes similares.
Conjunto de familias relacionadas
Reúne a los géneros con grandes semejanzas.
Conjunto de especies muy cercanas entre sí.
Es la unidad fundamental de clasificación y se define como conjunto de
organismos que poseen antepasados comunes anatómicos o fisiológicos
similares.
Robert Whittaker, biólogo estadounidense, propuso que los seres vivos se pueden clasificar en
cinco reinos:
Reino mineral, incluye a organismos unicelulares, procariontes, algunos de ellos forman
colonias, su reproducción es por bipartición, habitan en todos los lugares conocidos. La
mayoría son heterótrofos aunque algunos utilicen luz solar o bien energía que prende durante
los procesos de descomposición de compuestos orgánicos o inorgánicos.
Bacterias (importancia)
a) cocos Estafilococos:- Estreptococos:
b) Bacilos lactobacilos
c) Espirilos
Existen así mismo bacterias que son importantes para todos los seres vivos llamadas que son
fijadoras del N2 nitrógeno.
IV. CEPAS O CLONES
V. NOMENCLATURA.
VI. BACTERIAS DE INTERES MEDICO
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
VII. MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSRIAL.
7.1. CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS
Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo característico del
hombre su afán por ordenar esa gran variedad de organismos. Con esa necesidad de
ordenamiento surge la Taxonomía como la ciencia de la clasificación, nomenclatura e
identificación. La Clasificación es algo creado por el hombre. Consecuencia de esta
artificialidad es la controversia que existe desde mediados del siglo XVIII sobre las
divisiones que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenzó con Linneo siendo
una sencilla división de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido haciéndose
cada vez más complejo al pasar por distintas modificaciones hasta llegar a nuestros días
con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y con la sospecha de que no será la
última, ya que los conocimientos de que se dispone son cada vez mayores, así como las
posibilidades de aumentar esos conocimientos.
Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, ordenó a todos los seres vivos en dos
Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos
móviles y heterótrofos; y el Reino Plantae que incluía a los vegetales, individuos
inmóviles, autótrofos y fotosintéticos. Según el esquema de los dos reinos, los protozoos
se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de microorganismos en el Reino Plantae.
Sin embargo, esta clasificación encontró pronto dificultades ya que existían numerosos
microorganismos que poseían características intermedias que no permitían su clara
adscripción a uno de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un
tercer reino, el Reino Protista, para reordenar todos los seres vivos con organización
biológica sencilla ya fueran unicelulares, cenocíticos o multicelulares, pero todos ellos
carentes de especialización tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las
funciones propias y específicas que los tejidos de organismos superiores, animales y
plantas, tenían encomendadas. Según Haeckel, el Reino Protista incluiría bacterias,
algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fué cuestionada a
medida que se obtenía más información acerca de la estructura interna de los
microorganismos debido a los avances en microscopía electrónica.
En 1937 Chatton dividió el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos según
tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron así los términos eucariota para definir
organismos con células nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los
animales y plantas; y procariota para agrupar células sin membrana nuclear, como es el
caso de las bacterias. La dicotomía eucariota-procariota fue utilizada por los taxónomos
como una característica filogenética de primera magnitud.
Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos
procariotas constituyeron un grupo taxonómico filogenéticamente independiente. El más
aceptado de todos ellos fue el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de
clasificación de los seres vivos basado en los dos niveles de organización celular y las
56
Ramirez - Balqui
tres formas principales de nutrición (fotosíntesis, absorción e ingestión) que dieron lugar a
los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas
fotosintéticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos). En el
esquema de Whittaker los microorganismos quedaron incluidos en los Reinos Monera
(bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras).
Hasta este momento se utilizaron características morfológicas y fisiológicas hasta que el
desarrollo de la biología molecular permitió utilizar los constituyentes moleculares como
nuevos criterios clasificatorios.
Así, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprobó que, a través
de la secuenciación de esta molécula, los procariotas quedaban divididos en dos grupos.
El primero de ellos incluye las bacterias más comunes, aisladas en su mayoría del
cuerpo, suelo y agua denominándose eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias
que producen metano (metanógenas), ciertas bacterias del azufre que pueden crecer en
ambientes muy ácidos y calientes (termófilas extremas) y bacterias que viven en
ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron arqueobacterias.
En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxón superior a Reino que denominó Dominio
(Dominio → Reino → División → Clase → Orden → Familia → Género → Especie).
Todos los seres vivos se agruparían en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los
cuales, dos son exclusivamente microbianos y están compuestos únicamente por células
procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero (Eukarya),
formado por eucariotas, incluiría entre otros los Reinos Protista, Plantae, Animalia y
Fungi.
7.2. CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES.
Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que
suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño
tamaño de la célula microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a
volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite,
por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en
las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su
vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana
extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo
20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son
muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre
el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en
presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen
una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas
permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita
el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer
una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de
nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen
en nutrientes baratos.
Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar
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Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a
gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca
rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El
microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo
disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser
patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la
facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es
dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para
esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias
filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias
unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar.
7.3. DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES.
Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como
máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100000 descritas en la
Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por
elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros
métodos.
a). Levaduras
Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de
pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día
sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que
se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y
alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la
lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del
suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico.
Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de
digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación
de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras levaduras y
hongos, como los derivados fenólicos.
b). Hongos filamentosos.
Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino
también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la
degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad
enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro
lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y
pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre.
Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización
industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación
de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso,
shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales
(amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos
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Ramirez - Balqui
(penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las
setas.
c). Bacterias.
Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido
acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido
acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina,
polimixina), proteasas e insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar
Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y
butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los
géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium
glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra
mojada se debe a compuestos volátiles (geosmina) producido por Streptomyces
aunque su principal importancia radica en la producción de antibióticos como
anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.
59
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
60
Ramirez - Balqui
CAPITULO III
INTRODUCCION A LA PRACTICA MICROBIOLOGICA
Conceptos básicos.
Clases de nutrientes.
Medios de cultivo.
Metabolismo energético
Captación de energía en las bacterias quimiotrofas.
Captación de energía en las bacterias fototrofas: Fotofosforilación.
Obtención de energía en Halobacterium.
El oxígeno y el metabolismo bacteriano.
61
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
CAPITULO IV
ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO
BACTERIANO
Conceptos básicos.
Clases de nutrientes.
Medios de cultivo.
Metabolismo energético
Captación de energía en las bacterias quimiotrofas.
Captación de energía en las bacterias fototrofas: Fotofosforilación.
Obtención de energía en Halobacterium.
El oxígeno y el metabolismo bacteriano.
63
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
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Ramirez - Balqui
ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO
I.
NUTRICION BACTERIANA. CONCEPTOS BÁSICOS
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las
sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y
se requieren para dos objetivos:
 fines energéticos (reacciones de mantenimiento);
 fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).
Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía
procedente del medio ambiente. En el capítulo anterior vimos los principales modos de
captación y obtención de energía existentes en las bacterias.
El estudio de la nutrición microbiana se puede desglosar en varios apartados: así, podemos
considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos, e incluso podemos
abordar los aspectos ambientales (en cuyo caso entramos dentro del campo de la
Ecofisiología). Igualmente podemos estudiar la aplicación práctica de la nutrición bacteriana,
que se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manejar los microorganismos
en el laboratorio.
Es importante tener claros desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas
relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de
ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de
materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos "clasificaciones" de tipos de
nutrición:
Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden
dividir en:
 litotrofas: son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2 S0, NH3,
NO2-, Fe, etc.).
 organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos,
proteínas, alcoholes...).
Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de
crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:
 autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas.
Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una
fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO2.
 heterótrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C
pueden ser captados en forma inorgánica).
65
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Otros conceptos:
 autotrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica
como fuente de carbono.
 Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litotrofo (obtienen energía de
compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su
metabolismo biosintético.
Sean autotrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos
químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como:
 macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y
 micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)
En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias
orgánicas y/o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir
macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no
se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos
papeles.
El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de
nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás
elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar
amplia gama de fuentes orgánicas de carbono.
A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición muy
distintos, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de
carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar
más de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos
alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas
de carbono consiste en glucosa.
En los heterótrofos-organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy
distinto del material celular -CH2O-) entran simultáneamente a:
 metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO 2, o en CO2 junto con
otras sustancias no totalmente oxidadas);
 metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).
Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las
bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H 2O, CO2, N2,
NO3--, NH3, SO4=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy
interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en
procariotas.
Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautotrofos (o
quimiolitoautotrofos): obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas
66
Ramirez - Balqui
sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgánicas, por
lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales.
Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar de
los medios ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.
II.
CLASES DE NUTRIENTES
Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:
 universales: agua, CO2, fosfatos y sales minerales;
 particulares;
 factores de crecimiento.
2.1. NUTRIENTES UNIVERSALES.
El agua
Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se
pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para
crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:
 el principal constituyente del protoplasto bacteriano;
 el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;
 un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones
bioquímicas).
Las fuentes de agua pueden ser:
 endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;
 exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las
membranas.
Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:
 Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben
(respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas
inasequibles a la bacteria.
 Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas
de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del
microorganismo.
La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o
potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como
aw 
Ps
Pw
Donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW es la
presión parcial de vapor del agua destilada.
¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la
humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al
67
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la a W =
humedad relativa/100).
Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99.
 Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a
1.
 Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales,
tienen aW de alrededor de 0.995.
 Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980.
 Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de
0.950.
 En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir
a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en
medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones
arriba citadas:
 bacterias halófilas extremas, como la arqueobacteria Halobacterium, que habita
lagunas hipersalinas;
 bacterias (y sobre todo, ciertos microorganismos eucarióticos como levaduras)
sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares
El CO2
El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:
 Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente
de energía la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas
sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos).
 Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los
electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía:
CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O (D G'0<0)
 Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de
electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas
rutas anabólicas y catabólicas.
El origen del CO2 puede ser:
 endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente
orgánica de carbono;
 exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.
Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero
algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aíslan por primera vez, requieren
atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna
enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen
adaptarse a crecer a tensiones normales.
68
Ramirez - Balqui
Fósforo
Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánico o inorgánico. Las bacterias que
pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen
absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los
fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gramnegativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina).
El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos,
pero aparece también en coenzimas y en proteínas.
Sales minerales
Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl --) y de cationes para la célula.
Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente
+
++
++
++
grandes: K , Mg , Ca , Fe .
El ión potasio (K+):
 interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan
en la síntesis de proteínas.
 En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.
El ión magnesio (Mg++):
 estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;
 como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de
grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir
la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera.
 Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas.
El ión calcio (Ca++):
 es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.
El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++) suele estar acomplejado en la
naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas,
denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro (p.ej., hidroxamtas y
enterobactina). El hierro
 participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como
citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S);
 interviene como cofactor en ciertas enzimas.
Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las
bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los
que también se denomina como micronutrientes o elementos traza.
 El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al
Mg++.
 El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si
suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co ++
libre).
69
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
 El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARNpolimerasas.
 El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la
asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el
complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.
 El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.
2.2. NUTRIENTES PARTICULARES.
Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del
tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren
todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos,
dependiendo de sus capacidades biosintéticas.
Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:
 el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las
proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en
algunas coenzimas);
 el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA.
¿En qué formas químicas entran N y S a las bacterias?
La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en
forma combinada inorgánica oxidada:
 como NO3--, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitritoreductasas asimilatorias.
 como SO4=. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y
finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la
incorporación del S.
Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida:
 de N inorgánico: amonio (NH4+)
 de S inorgánico: sulfuros (S=, SH-)
 de N orgánico: aminoácidos, péptidos
 de S orgánico: cisteína.
Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno
también pueden usar nitratos.
2.2.1. FIJACIÓN DE NITRÓGENO.
La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en
estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N 2), que procede de
microorganismos desnitrificantes. Sin embargo, esta gran reserva sólo puede
servir de fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias
fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha
evolucionado en eucariotas. (Lo más a que ha llegado la evolución es a
seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariotas diazotrofos
y ciertos eucariotas).
70
Ramirez - Balqui
La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular
en amoniaco, según la siguiente ecuación:
N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP → 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi)
Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado
nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:
 Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y
molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este
componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad
existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S9-homocitrato)
 Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee átomos de Fe
acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se
denomina a veces ferroproteína).
Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior:
 Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al
menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el
dinitrógeno (N = N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de
disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de
activación para transferirle 6 electrones.
 Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) "se pierden" en
reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este "despilfarro",
pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático.
Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina,
que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada
dos electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasareductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (componente I), y le
transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, ésta transfiere
los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de
amoniaco. (El centro activo es FeMoCo).
Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad
al oxígeno, de modo que queda rápida e irreversiblemente inactivado por este
gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a
bacterias anaerobias, ya que, como veremos en la sección de taxonomía, la
evolución ha "inventado" distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en
fijadores aerobios.
Debido a lo "caro" que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este
proceso esté regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de
fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos):
 la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado;
 ante N combinado, se reprime la transcripción de los genes codificadores
de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif).
La nitrogenasa es una enzima relativamente "inespecífica", ya que puede reducir
otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (N = C-) y
71
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
acetileno (HC = CH). La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método
más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del
acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa.
2.3. FACTORES DE CRECIMIENTO.
Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña
cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función
plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser
coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar
por sí mismas, al carecer de parte o toda de una ruta biosintética.
Ejemplos:
 las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus
medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.
 Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.
En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por
algunas bacterias:
Factor o vitamina
p-aminobenzoico (PABA)
Acido fólico
Biotina
Cobalamina (vitamina B12)
Niacina (ácido nicotínico)
Riboflavina
Ácido pantoténico
Tiamina (vitamina B1)
Complejo B6 (piridoxal,
piridoxamina)
Grupo
Vitamina
K,
quinonas
I.
72
Funciones principales
Precursor del ácido fólico
Metabolismo
de
compuestos
C 1,
transferencia de grupos metilo.
Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2
Reducción y transferencia de compuestos
C1; síntesis de desoxirribosa
Precursor del NAD; transferencia de
electrones en reacciones redox
Precursor de FAD y FMN
Precursor de la CoA
Descarboxilaciones; transcetolasas.
Transformaciones
de
aminoácidos
y
cetoácidos
Transportadores de electrones (ubiquinonas,
menaquinonas, etc.)
MEDIOS DE CULTIVO
El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el
laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos
requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que
cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la
cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están
acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos de
medios de cultivo.
Ramirez - Balqui
Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide
en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el
crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden
clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos:
1).
Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que
son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:
Ejemplos:
 Digeridos crudos de extracto de carne
 Digeridos de extracto de levadura
 Digeridos de peptona de carne o de soja
 Digeridos de caseína (de la leche).
Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido
químicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento
bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta
pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales,
disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la
que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos,
sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control
nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de
los distintos nutrientes.
2).
Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades
concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La
composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos
cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades
biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores
posibilidades biosintéticas.
3).
En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores,
denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y
cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.
Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos
elaborar dos tipos de "versiones", según su estado aparente:
 medios líquidos (por ejemplo, los dos de la tabla)
 medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva
un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución.
En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante
incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya
que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas
bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.
73
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del
cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas
en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto
de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las
interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria).
El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los
100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas.
Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un
gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.
Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al
igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de
clases prácticas:
Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de
microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que
incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero
permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el
crecimiento de bacterias Gram-positivas.
Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos
de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del
medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de
una sustancia indicadora presente en el medio.
Ejemplos:
 en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias
producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por
fermentación de ciertas fuentes de carbono.
 El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual
revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias.
Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.
P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno manejará en la segunda tanda de prácticas.
Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias,
lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.
Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal,
y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son
agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las
Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat
natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.
74
Ramirez - Balqui
En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de
Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos.
Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos
orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo
intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia
de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida
por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como
fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado,
excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el
indicador rojo neutro vira a amarillo.
II.
METABOLISMO ENERGÉTICO.
El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que permiten el crecimiento de un
organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creación de nuevas células). El
metabolismo de la célula comprende dos grandes tipos de reacciones:
1. reacciones de mantenimiento, que suministran
a. energía
b. poder reductor
c. precursores metabólicos
2. reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y poder reductor procedente de
las reacciones de mantenimiento.
Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en
procesos de:
 biosíntesis (anabolismo)
 transporte activo
 translocación de proteínas a través de la membrana citoplásmica
 movimiento flagelar
 bioluminiscencia
En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservación intracelular de energía ocurre
principalmente por medio de la síntesis de ATP:
ADP3- + H+ + PO4H2-
→ ATP4- + H2O
La hidrólisis de ATP hasta ADP y P genera una variación de energía libre ∆Go'= -31 kJ (-7,3
kcal). La síntesis de ATP a partir de ADP y P requiere una ∆Go' de +31 kJ. Los métodos
usados por las bacterias para generar este ATP son principalmente:
 fosforilación a nivel de sustrato;
 fosforilación oxidativa;
 fotofosforilación (durante la fotosíntesis).
Cada uno de estos procesos implica uno o varios pasos de reacciones redox exergónicas,
pero la manera en que esas reacciones exergónicas se acoplan a la síntesis de ATP varía
entre la fosforilación a nivel de sustrato y las otras dos.
75
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
En esta reacción se libera energía libre, cuyo valor viene expresado por la fórmula:
∆G0'= - n · F · ∆E0'
n
= nº de electrones transferidos
F
= constante de Faraday = 96,6 kJ·volt-1·equivalentes--1
∆E0' es la diferencia entre los potenciales de reducción del donador (pareja D/DH 2) y del
aceptor (pareja A/AH2).
Una reacción redox exergónica de este tipo se puede acoplar a la consecución de trabajo útil:
 formación de un compuesto rico en energía;
 formación de un gradiente de concentración y/o de carga eléctrica a ambos lados de una
membrana.
Ambos tipos de trabajo se pueden usar en la síntesis de ATP.
Por lo tanto, los seres vivos, para poder obtener su moneda energética (principalmente ATP),
han de captar alguna fuente de energía externa, del medio ambiente. Veamos, pues, cuáles
son los tipos de energía que captan las bacterias y los correspondientes tipos de
metabolismos energéticos:
1. Si la energía procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda
de la luz visible): bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser:
a. fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas;
b. fotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas.
2. Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de
óxido-reducción: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser:
a. quimiolitotrofas: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas;
b. quimiorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas.
Veamos ahora lo que diferencia a grandes rasgos a la fosforilación a nivel de sustrato respecto
de la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación:
A) La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias
quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un
coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una
gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato,
para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía).
Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP.
Las fosforilaciones a nivel de sustrato se caracterizan por lo siguiente:
 son procesos escalares (es decir, no influye su situación espacial dentro de la célula);
 son series de reacciones bioquímicas en las que la transferencia de un grupo químico
(ej., el fosfato) se cataliza por enzimas solubles (en el citoplasma);
 existen intermediarios metabólicos (antes de llegar al ATP) en los que el fosfato está
unido covalentemente.
76
Ramirez - Balqui
B) En cambio, tanto la fosforilación oxidativa como la fotofosforilación son procesos
caracterizados por:
 ser vectoriales (orientados en el espacio);
 estar ligados a membrana;
 implicar una secuencia ordenada de transportadores de electrones que sufren
oxidaciones y reducciones reversibles (cadena transportadora de electrones, c.t.e.).
 no hay intermediarios covalentes ricos en energía, sino que la transferencia de energía
se realiza por medio de un gradiente electroquímico de protones (y, en algunos
casos, de cationes). Este gradiente de protones se puede emplear a su vez para:
o síntesis de ATP,
o transporte de nutrientes,
o translocación de proteínas fuera del protoplasto,
o movimiento flagelar.
III. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS QUIMIOTROFAS.
En los organismos quimiotrofos, la captación de energía consiste esencialmente en la
oxidación de un sustrato reducido (orgánico en quimiorganotrofos e inorgánico en
quimiolitotrofos) con una reducción concomitante de un aceptor de electrones (que a su vez
puede ser orgánico o inorgánico), y todo ello acoplado a un sistema de fosforilación del ADP,
que se convierte en ATP.
3.1. FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO. FERMENTACIONES.
Recordemos aquí lo dicho anteriormente: La fosforilación a nivel de sustrato es un
sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de
electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un
intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario
experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato
(siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta
energía al ADP, que pasa a ATP.
gliceraldehido-3-P → 1,3-difosfoglicérico → 3-fosfoglicérico
La fosforilación a nivel de sustrato está acoplada a un proceso metabólico denominado
fermentación. Durante la fermentación, el sustrato orgánico reducido (DH 2) es
catabolizado, de modo que como acabamos de ver, se produce ATP. Este catabolismo
genera, además:
 equivalentes de reducción (en forma de NADH y otros cofactores reducidos), e
 intermediarios oxidados de la ruta catabólica.
Pues bien, es característico de las fermentaciones que los equivalentes de reducción
reaccionen con uno de esos intermediarios (A), que de este modo se reduce a AH 2
(producto de la fermentación), regenerándose el cofactor en forma oxidada (NAD +)
para el siguiente ciclo.
77
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
El rendimiento de las fermentaciones, expresado como variación de energía libre, es
bajo. En la fermentación homoláctica se producen 2 moles de ATP por cada mol de
glucosa consumido (frente a los 28 moles de ATP/mol de glucosa en la respiración
aerobia). Esto significa que para que el microorganismo crezca en estas condiciones,
degrada grandes cantidades de sustrato fermentable.
Las fermentaciones se dan en determinados microorganismos quimiorganotrofos, que
pueden ser anaerobios obligados o anaerobios facultativos (cuando crecen en ausencia
de O2).
Hay una gran variedad de fermentaciones microbianas, y cada tipo libera uno o varios
productos de fermentación característicos. Algunos ejemplos:
Fermentación láctica
Fermentación alcohólica
Fermentación ácida-mixta
Fermentación butilénglicólica
Fermentación aceto-butírica
Lactato
etanol, CO2
etanol, succinato,
lactato, CO2, H2
butilénglicol, CO2
acetato, acetona,
etanol, CO2, H2
acetato,
formiato,
butirato,
butanol,
3.2. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES.
Respiración es la obtención de energía por oxidación de sustratos orgánicos (en
quimiorganotrofas) o inorgánicos (quimiolitotrofas), pero los coenzimas reducidos (ej.,
NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la
fermentación), sino a través de una cadena transportadora de electrones.
 Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia;
 Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.
En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor
potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos
enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones,
cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este
proceso como fosforilación oxidativa.
Esquema y balance de la fosforilación oxidativa
Como el alumno seguramente sabrá, el mecanismo de la fosforilación oxidativa se suele
explicar en base a la teoría quimiosmótica de Mitchell (1961 y años siguientes).
Recordemos que la c.t.e. está formada por una serie ordenada de moléculas
transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplásmica (y en sus
invaginaciones), moléculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles:
DH2 + A
78
→ AH2 + D
Ramirez - Balqui
El alumno conocerá por la asignatura de Bioquímica los principales tipos de componentes
de las c.t.e. respiratorias
 flavoproteínas (Fp), dotadas de grupos FAD o FMN
 proteínas no hémicas de Fe-S
 quinonas:
o ubiquinona (UQ)
o menaquinona (MQ), más frecuente en bacterias Gram-positivas.
 citocromos (proteínas hémicas con Fe quelado).
Observar que algunos de estos transportadores transportan átomos de H (o sea,
protones y electrones), mientras que otros transportan únicamente electrones.
La situación de los transportadores dentro de la membrana es asimétrica, lo que
condiciona que el transporte sea un proceso vectorial (es decir, tiene un sentido
determinado), de modo que los H salen hacia afuera y los electrones tienden a entrar al
interior.
Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e.
(llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la
salida de protones al exterior de la membrana citoplásmica (concretamente, en los puntos
donde confluyen un transportador de H y otro de electrones). Es decir, existe una
translocación de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en
la c.t.e.
Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones
translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente.
Por lo tanto, se crea un gradiente electroquímico de protones, compuesto de gradiente
osmótico de esos iones H+ (∆pH) y un gradiente de carga eléctrica (∆). Este gradiente
es una forma de energía potencial que puede realizar trabajo.
El valor de este gradiente electroquímico de protones o fuerza protón motriz (f.p.m.) es:
∆p = ∆ –Z · ∆H (expresado en milivoltios, mV),
Donde Z = 2,3 R · T/F, siendo R = constante de los gases, T = temperatura absoluta, F =
constante de Faraday
Como ya dijimos, esta ∆p (f.p.m.) es capaz de realizar trabajo, bajo la forma de:
 transporte activo
 alimentar el motor flagelar
 síntesis de ATP.
Veamos, pues, cómo se produce esta síntesis de ATP a partir del gradiente de
protones:
 La síntesis de ATP ocurre gracias al complejo ATP-asa, funcionando como ATPsintetasa. Este complejo consta de varios polipéptidos que conforman dos porciones:
79
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
la hidrofóbica BF0, inserta en la membrana citoplásmica, y la BF1 a modo de tallo que
se proyecta hacia el interior celular.
 La porción BF0 forma un canal a través de la membrana, por donde pueden pasar H +
desde el exterior al interior, y agua desde dentro hacia afuera.
 La porción BF1 es la parte enzimáticamente activa del complejo.
Esencialmente, el mecanismo consiste en que la disipación del gradiente de protones a
través de BF0 suministra la energía para la síntesis de ATP por parte de la BF 1. La
reacción se puede expresar así:
2H+ (ext) + ADP (int) + P (int)
→ 2H+ (int) + ATP (int) + H2O (ext)
El balance final del funcionamiento de la c.t.e. es:
DH2(int) + A(int) + ADP(int) + P(int) → D(int) + AH2 + ATP(int) + H2O (ext)
El esquema anterior hace referencia al funcionamiento de una cadena transportadora con
un solo bucle translocador de protones. Pero en la realidad las c.t.e. suelen poseer más
de uno de estos bucles.
 Véase en la Fig. la c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al
de las mitocondrias, donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la
variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de
ATP.
 Véase también la c.t.e. de E. coli, cuando usa el O2 como aceptor final de electrones.
En esta cadena podemos constatar algo relativamente frecuente en las cadenas
bacterianas:
En los quimiolitotrofos, la c.t.e. respiratoria funciona en los dos sentidos:
 en su sentido "normal", ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede
electrones, que llegan a la c.t.e., que crea un gradiente de protones, cuya disipación a
través de ATP-asa genera ATP;
 pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el
CO2 (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH 2O]. Este NADPH lo
logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la c.t.e., usando para
ello como energía parte del potencial de protones generado por el flujo normal.
Cadenas de electrones ramificadas:
Muchas cadenas respiratorias aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo
a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograr
flexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan
rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para
minimizar los efectos nocivos de otros.
 Por ejemplo, cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrógeno, usa
una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el
80
Ramirez - Balqui
rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que entre oxígeno al citoplasma,
con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivación por oxígeno.
Mecanismo de la ATP-sintasa dependiente de protones
En los años recientes se está avanzando en el mecanismo de la ATP-sintasa (con
concesión de premio Nobel de Química 1997 a tres biólogos que han contribuido en este
aspecto):
 F0 es un complejo integral de membrana, que transloca los protones. Está compuesto
de {a, b2, c10}. F1 constituye la porción intracitoplasmática, dotada de los sitios
catalíticos. Su composición se puede expresar como {3, 3, , , ). Ambas porciones
están unidas entre sí por enlaces iónicos e hidrófobos.
 Al parecer, la translocación de unos 4 protones a través de F0 está acoplada, por
medio de grandes cambios conformacionales, a la síntesis de una molécula de ATP en
las subunidades  de la F1, por un notable mecanismo de catálisis rotacional:
 El que los 4 protones entren por F0 parece que induce un cambio conformacional en la
subunidad  de F1, que a su vez obliga a girar al F1, con una síntesis de ATP.
Las ATP-asas de membrana pueden funcionar también en sentido inverso al de síntesis,
es decir, como ATP-hidrolasas: se produce hidrólisis de ATP y extrusión de protones al
exterior. Por lo tanto, en este sentido de funcionamiento, se genera un gradiente de
protones a expensas de gasto de ATP intracelular. Esto muestra una vez más que el ATP
y el gradiente de protones se pueden considerar como formas diferentes e
interconvertibles de energía celular.
Las ATP-asas productoras de gradientes de protones existen en bacterias no
respiratorias, que carecen de c.t.e., como por ejemplo, las bacterias anaerobias del ácido
láctico. Estas bacterias obtienen su ATP por fosforilación a nivel de sustrato, en sus
procesos de fermentación, y a su vez, parte del ATP lo convierten, por las ATP-asas
hidrolíticas, en una fuerza protón-motriz que se usa para transporte de nutrientes y para
alimentar al motor flagelar.
Respiraciones anaeróbicas
Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor
diferente del oxígeno (respiración anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos
reducidos (A → AH2) son:
 NO3-- → N2
 SO42- → SH2
 fumarato → succinato
 CO2 → CH4
 Fe3+ → Fe2+
Con estos aceptores se obtiene menos energía que con el oxígeno, porque la pareja
O2/H2O es más oxidante que las otras.
El uso de nitratos, sulfatos y CO2 como aceptores finales de electrones (y no como
material a incorporar al metabolismo plástico) se denomina metabolismo disimilativo (o
81
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
desasimilativo). Para distinguirlo del asimilativo. El producto reducido se excreta al
ambiente de la bacteria.
El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificación, y ocurre por medio de una serie
de fases donde el N va cambiando su estado de oxidación:
NO3-- → NO2- (nitrito) → NO (óxido nítrico) → N2O (óx. nitroso) → N2 (dinitrógeno)
Hasta la llegada de las actividades industriales humanas, todo el dinitrógeno de la
atmósfera procedía de estos procesos desnitrificantes.
El uso de sulfato como aceptor de electrones sólo lo hacen las bacterias
sulfatorredutoras, por una ruta especial en la que el sulfato primero tiene que activarse
con ATP (formando la adenosina-fosfo-sulfato, APS). La mayoría son quimiorganotrofos,
pero algunos pueden usar H2 donador de electrones (quimiolitotrofos).
Las arqueobacterias metanogénicas son los únicos seres vivos capaces de obtener
energía acoplando la oxidación del hidrógeno molecular con el uso de CO 2 como aceptor
de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos):
4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
Tipos de quimiolitotrofos
Insistamos en el hecho de que la capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa
a partir de donadores inorgánicos de electrones sólo ha evolucionado en ciertos grupos
de procariotas. Cada grupo fisiológico usa un tipo de donador inorgánico:
 bacterias de hidrógeno (H2)
 bacterias del hierro (Fe2+)
20
 bacterias del azufre (S , S ).
 bacterias nitrificantes, con dos subtipos diferentes: las oxidadoras de amoniaco
(llamadas nitrosas) y las oxidadoras del nitrito (llamadas nítricas).
En general, el mecanismo de generación de ATP es similar al de quimioorganotrofas
respiradoras. Los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico)
pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final, que suele ser el
oxígeno.
Pero a excepción del H2, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un
potencial de oxidación E0' menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos
donadores inorgánicos sólo puede generar energía, pero no poder reductor de modo
directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del
gradiente electroquímico creado se emplea en hacer que electrones viajen por la c.t.e. (o
una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD.
82
Ramirez - Balqui
IV. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN
Los organismos fotosintéticos usan energía de la luz para convertir el CO2 en material celular,
según la fórmula general:
2 H2A + CO2
energía
de
luz
(hv)

[CH2O] + H2O + 2 A
 En Oxifotobacterias, algas y plantas verdes, H2A = H2O, como agente reductor. Por lo tanto,
al oxidarse se genera O2.
 En Anoxifotobacterias el reductor exógeno ("H2A") puede ser H2, S=, S2O3-, etc.
Tenemos, pues, dos modalidades de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Como
veremos, en ambas pueden existir dos versiones de un mecanismo de obtención de energía a
partir de la luz visible: fotofosforilación cíclica y acíclica.
En la fotofosforilación cíclica (FFC) no existe aporte de un agente reductor externo ni de
agente oxidante externo.
 Su única función es transformar la energía de la luz en un gradiente de protones (f.p.m.),
que a su vez puede convertirse en ATP.
 No se originan equivalentes de reducción (NADPH), y por lo tanto, no hay fijación de CO2.
En cambio, en la fotofosforilación acíclica (FFA) un donador exógeno de electrones (H2A)
servirá para que, por acción de la luz, se produzcan equivalentes de reducción (NADPH, o
NADH), que a su vez se usarán para la reducción (asimilación) de CO2 hasta materia orgánica.
Al igual que en la cíclica, se produce gradiente de protones, convertible en ATP.
4.1. COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO.
 Fotosistemas: Catalizan la conversión de la energía de la luz, capturada en
moléculas excitadas de clorofila o bacterioclorofila en una forma útil de energía. Están
constituidos por complejo antena y centro de reacción.
 Cadenas transportadoras de electrones: Estas cadenas están ligadas de forma
estrecha al centro de reacción, y crean una f.p.m.
Antes de describir el funcionamiento del aparato fotosintético, describamos brevemente
las principales moléculas implicadas:
A) Clorofilas y bacterioclorofilas. Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg++
pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción.
Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del
complejo antena. Típicamente son 4 moléculas, de las cuales dos están asociadas a
proteínas, de modo que en este estado actúan como "trampas" para los cuantos de
luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que
se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su
estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E0' negativo, por lo que
entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fácilmente.
83
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
B) Carotenoides. Forman parte del complejo antena. Sus funciones son:
 protección contra los efectos potencialmente perjudiciales derivados de la
interacción entre la luz y el oxígeno;
 como pigmentos antena, captadores de luz (aunque menos eficientes que otros).
C) En las Oxifotobacterias, existe, además un conjunto de ficobiliproteínas,
organizadas en complejos supramoleculares denominados ficobilisomas,
dispuestos (como ya vimos en el tema 8) en la superficie de los tilacoides.
Las principales ficobiliproteínas son ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina, y
constituyen el complejo antena en las Cianobacterias.
D) Feofitinas y bacteriofeofitinas. Son similares a las respectivas (bacteria) clorofilas,
++
excepto que no están queladas con Mg . Actúan como aceptores inmediatos del
electrón que pierde cada (bacterio) clorofila del centro de reacción.
E) Otros componentes. En el mismo centro de reacción se encuentran los primeros
componentes de la c.t.e. fotosintética: quinonas especiales acomplejadas con Fe.
Por lo demás, las c.t.e. fotosintéticas contienen moléculas de tipos parecidos a las ya
estudiadas en las c.t.e. respiratorias: quinonas, citocromos y ferroproteínas no
hémicas.
4.2. FUNCIONAMIENTO DE UN FOTOSISTEMA.
Para estudiar el funcionamiento, hagámonos una idea de cómo están organizados los
principales componentes que acabamos de citar dentro del aparato fotosintético:
Complejo antena
Es un conjunto de pigmentos captadores de luz, en gran número (desde unos 50 hasta
miles). Sobre ellos incide la luz solar, de manera que se van transfiriendo la energía de
unos a otros, en paquetes (excitones), pero sin oxidarse, en un fenómeno conocido como
resonancia inductiva.
El complejo antena actúa como un "embudo", captando energía lumínica, y canalizándola
hacia el centro de reacción, donde como veremos enseguida, esta energía podrá ser
convertida a una forma útil.
Centro de reacción (C.R.).
Para hacernos una idea concreta de un centro de reacción, mostraremos uno de los
mejor estudiados: el de la anoxifotobacteria purpúrea Rhodopseudomonas viridis (el
primero en desentrañarse a nivel molecular, en el año 1985, mediante técnicas de
difracción de rayos X).
 posee 4 bacterioclorofilas, de las cuales dos (denominadas P870) son las
fotoquímicamente activas, debido a su asociación con tres proteínas del centro de
reacción (denominadas L, M y H). Todo el conjunto se encuentra en la bicapa lipídica.
 2 bacteriofeofitinas
 2 ubiquinonas y un Fe, que constituyen el complejo Q·Fe.
84
Ramirez - Balqui
Antes de dar una visión más detallada, veamos un pequeño resumen del modo de
funcionamiento del centro de reacción:
 Llega un cuanto de luz al par de bacterioclorofilas especiales. La bacterioclorofila
(Bcfla.) se excita (Bclfla*);
 la Bclfla* excitada se oxida (pierde un electrón) → Bclfla+;
 el electrón es captado rápidamente por el aceptor inmediato (la bacteriofeofitina), que
a su vez lo pasa a la quinona cercana.
 En todo este proceso se va produciendo una separación de cargas, porque el
electrón va quedando cada vez más separado de la Bclfla+ oxidada. El electrón pasará
a otra quinona situada fuera del C.R., convirtiéndose en un electrón de alta energía.
Veamos en detalle la secuencia de transferencias en el centro de reacción.
1. Cada Bclfla. especial (P870 en el ejemplo que estamos estudiando), tras excitarse
(pasar Bclfla*), se oxida (pierde electrón), pasando a Bclfla+.
2. El electrón pasa a una Blcfla. "normal" (P800, no asociada a proteínas).
3. El electrón original de cada una de las dos Blcflas. especiales es recogido por las
bacteriofeofitinas.
4. Los dos electrones (uno por feofitina) pasan a una ubiquinona (QA) estrechamente
ligada al centro de reacción (la quinona se reduce: QAH). Observar que se ha originado
una separación de cargas, de modo que se ha formado una especie de "agujero"
cargado positivamente: las bacterioclorofilas con carga positiva tienen ahora una alta
afinidad por electrones.
5. La Bclfla+. captura un electrón de un citocromo cercano (cit c2, ligado al centro de
reacción). Normalmente este citocromo es un donador débil de electrones, pero ahora
los cede, debido al intenso "agujero" de carga positiva representado por las Bclflas +.
6. Mientras tanto, el electrón de la QA pasa a una segunda ubiquinona del centro de
reacción (QB).
7. El electrón abandona el centro de reacción y pasa a otra quinona, que se encuentra
libre en la bicapa lipídica. Esta quinona, una vez reducida, es un buen reductor
(donador de electrones). El electrón pasa a la c.t.e. (con citocromos b-c).
8. El funcionamiento de esta c.t.e. provoca una translocación de protones fuera de la
membrana, o sea, un potencial electroquímico de protones o f.p.m., cuya disipación a
favor de las ATP-asas se traduce en producción de ATP (fotofosforilación).
4.3. TIPOS DE FOTOFOSFORILACIÓN.
Fotofosforilación cíclica
En la FFC, la (bacterio) clorofila del centro de reacción (fotosistema I) sirve tanto como
donador primario de electrones como aceptor final de electrones procedentes de una
c.t.e.
Los electrones no pueden salir del ciclo. Cuando los electrones pasan por la confluencia
entre una quinona y un complejo de citocromos se produce translocación de protones al
exterior, lo que supone ∆p, que a su vez se puede convertir en ATP.
85
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Como los electrones no pueden salir del ciclo, no se crea poder reductor. Por lo tanto,
este poder reductor ha de venir de otra fuente, y no del funcionamiento del fotosistema.
(Fuente química, que permite un flujo invertido de electrones).
Fotofosforilación acíclica
En Anoxifotobacterias: FFA anoxigénica
El fotosistema I (FSI) se excita y la Bclfla. Se oxida (Bclfla+). Los electrones cedidos por el
C.R. sirven para reducir (junto con protones) al NAD (P)+ hasta NAD (P)H + H+ (es decir,
se crea poder reductor).
Ahora bien, ¿cómo se regenera la bacterioclorofila, es decir, cómo se reduce la Bclfla+
oxidada? En la FFA existe un donador exógeno de electrones distinto del H2O: SH2, S0,
H2, ciertos compuestos orgánicos. Dicho donador cede electrones al C.R. a través de una
c.t.e., que como es habitual, crea un potencial ∆p (f.p.m.) convertible en ATP.
En Oxifotobacterias, al igual que en algas verdes y plantas superiores: FFA
oxigénica
Estos organismos usan H2O como donador exógeno de electrones; la FFA es más
compleja, ya que el H2O requiere un elevado potencial de reducción para poder extraerle
los electrones, y el FSI no es un oxidante suficientemente fuerte como para captar
electrones directamente del agua.
La manera de resolver este problema es acoplar un fotosistema adicional (FSII), dotado
de un E0' más alto que el FSI, y que funciona en paralelo con éste.
 El FSI se activa y se oxida por la luz, transfiriendo los electrones a una ferredoxina,
que a su vez los cede al NADP+, para generar poder reductor (NADPH + H+).
 Ahora bien, como hemos dicho, el FSI+ no puede regenerarse directamente por el
agua, sino que recibe los electrones desde el FSII, a través de una c.t.e. (por
supuesto, con creación de ∆p y por lo tanto, ATP).
Esta c.t.e. consta de la serie de transportadores siguiente:
PQ (plastoquinona) ─ citocromo b·f ─ PC (plastocianina)
 El FSII se excita por la luz (y como acabamos de decir, envía los electrones al FSI vía
c.t.e.). Este FSII+ sí puede regenerarse extrayendo los electrones del H2O,
desprendiéndose O2.
En resumen, el FSI+ actúa como un aceptor final de electrones procedentes del FSII. A su
vez, el FSII+ (oxidado) se reduce directamente por el agua (merced a un complejo
enzimático que contiene Mn, llamado complejo lítico del agua o "reloj oxidante del agua").
V. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN HALOBACTERIUM.
Algunas arqueobacterias halófilas (p. ej., Halobacterium) presentan una capacidad de síntesis
de ATP mediada por la luz, pero sin implicación de clorofilas ni fijación de CO 2. Cuando estas
bacterias se encuentran en condiciones de baja aireación (bajas tensiones de O 2), sintetizan
86
Ramirez - Balqui
una cromoproteína especial llamada bacteriorrodopsina, que forma "parches" de color púrpura
en sus membranas citoplásmicas.
La bacteriorrodopsina consta de:
 porción proteica: bacteriopsina, que forma 7 hélices  atravesando la membrana;
 grupo cromóforo: retinal (el mismo de la rodopsina retiniana de los vertebrados). El retinal
es un carotenoide C20 que puede absorber la luz y catalizar la transferencia de protones a
través de la membrana. Se encuentra unido como una base de Schiff a una determinada
lisina de la bacteriopsina.
El retinal, como base de Schiff (con una carga positiva), tiene en principio la configuración 13cis. Esta forma del retinal absorbe un cuanto de luz de  = 565 nm, de lo que resulta un
bombeo de un protón fuera de la membrana. Para regenerar la base de Schiff, la forma neutra
anterior pasa conformación todo-trans, capta un protón y pasa a la forma protonada 13-cis.
El funcionamiento del sistema crea, pues, un gradiente de protones, cuya disipación a favor de
ATP-asas de membrana es convertido a ATP. Obsérvese que funciona como una bomba de
protones, que saca H+ al exterior.
VI. EL OXÍGENO Y EL METABOLISMO BACTERIANO.
6.1. REACCIONES MEDIADAS POR FLAVOPROTEÍNAS.
Aparte de las bacterias que usan O2 como aceptor terminal de electrones de sus c.t.e.
respiratorias, todos los procariotas presentan algunos enzimas que pueden reaccionar
directamente con este oxígeno. De estos enzimas, los más típicos son las
flavoproteínas, que se pueden autooxidar en presencia de O2, dando inevitablemente
peróxido de hidrógeno (H2O2), que es un compuesto muy tóxico; también se pueden
generar pequeñas cantidades de otro producto tóxico, el radical superóxido (O2 -). Por lo
tanto, no es de extrañar que en bacterias haya evolucionado un arsenal de enzimas para
detoxificar estas sustancias:
Protección respecto de los peróxidos:
En muchas bacterias aerobias existe el enzima catalasa:
H2O2
catalasa

H2O + 2 O2
Algunos anaerobios aerotolerantes producen peroxidasa, capaz de eliminar cualquier
peróxido, incluyendo el de hidrógeno. Las peroxidasas catalizan la oxigenación de
compuestos orgánicos por el peróxido de hidrógeno, que pasa a agua:
H2O2 + NADH + H+
peroxidasa


2 H2O + NAD+
Protección respecto del superóxido:
El radical superóxido se produce por:
 acción de oxidasas;
87
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
 autooxidación de quinonas, ferredoxinas y flavoproteínas.
Este radical es muy tóxico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias
aerotolerantes presentan el enzima superóxido dismutasa (SOD), que cataliza la
conversión del superóxido en oxígeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se
destruye por los mecanismos que acabamos de ver:
2 O2
-
+ 2 H+
SOD


O2 + H2O2
6.2. RELACIONES DE LAS BACTERIAS CON EL OXÍGENO.
Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de
peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias
según sus relaciones con el oxígeno:
Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas
ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química.
Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica
(del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como
microaerófilas.
 Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas).
 Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas
fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales).
Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido
a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen
metabolismo estrictamente fermentativo.
 Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa,
peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes
del oxígeno.(Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias
metanogénicas).
 Anaerobias aerotolerantes (aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un
metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen
enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como
Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios
indiferentes.
 Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o
anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de
electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.
88
Ramirez - Balqui
CAPITULO V
EFECTO DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS
BACTERIAS
Introducción: Efecto de los factores ambientales sobre las bacterias.
Efecto de la Temperatura.
Liofilización
Desecación
Efecto de las radiaciones sobre las bacterias
Efecto de las ondas sonoras
Efectos de la presión hidrostática
Efectos de la presión osmótica
Efectos del pH
89
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
90
Ramirez - Balqui
ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO
I.
INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LAS BACTERIAS.
Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, las células procarióticas sufren los
cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los
organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de años, las bacterias han venido
estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente
creando numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida
existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procarióticas. Desafiando
a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida "normal", encontramos extraordinarios
seres vivos unicelulares viviendo a pH muy ácidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y
salinas, o reproduciéndose a temperaturas de más de 100ºC y a grandes presiones...En este
capítulo y en el siguiente veremos algunas de estas notables adaptaciones.
Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en función de su fondo
genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticas condiciones ideales (óptimas).
Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores
ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que
1. modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de
dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;
2. condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitat naturales;
3. permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de
parámetros para:
a. la mutagénesis,
b. la esterilización y desinfección,
c. la quimioterapia.
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así,
unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio
ser neutras o beneficiosas para otra.
Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los
efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden
simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de
reproducción.
Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:
AGENTES FÍSICOS
AGENTES QUÍMICOS
91
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Temperatura
Desecación
Radiaciones
Ondas sonoras
Presión hidrostática
Presión osmótica
II.
Desinfectantes y antisépticos.
Quimioterápicos de síntesis
Antibióticos
EFECTO DE LA TEMPERATURA
2.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO
La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que condicionan
el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos.
La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de
generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se
mantienen constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en
función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos
llamados temperaturas cardinales:
 Temperatura mínima: por debajo de ella no hay crecimiento.
 Temperatura máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento.
 Temperatura óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo).
El margen entre la temperatura mínima y la máxima se suele llamar margen de
crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.
La temperatura mínima se puede explicar en función de:
 un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos
de transporte de nutrientes y el gradiente de protones;
 un aumento de la viscosidad del citoplasma;
 un debilitamiento de los enlaces hidrófobos de las proteínas (debido a cambios
físicos en la estructura del agua de solvatación) que provoca inactivación de enzimas
alostéricos y de actividad funcional de los ribosomas. En muchos casos los
polisomas no se ensamblan.
Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando
proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, debido a que las
reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su óptimo. En
dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su máxima tasa posible.
A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce
un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura
máxima. Dicha temperatura refleja:
 desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales;
 colapsamiento de la membrana citoplásmica;
 lisis térmica de la bacteria.
92
Ramirez - Balqui
Obsérvese en el gráfico que la temperatura óptima está más cerca de la máxima que
de la mínima.
Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo
que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperatura
máxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera.
Según el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se
pueden establecer tres tipos principales:
1.
psicrófilas o criófilas: crecen a partir de entre -5 a 5oC.
a. Las llamadas psicrófilas obligadas tienen t0 óptima a 15-18oC y t0 máxima
a19-22oC, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas
vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antártida es lo que
pudiéramos llamar un psicrófilo extremo: tiene su óptimo de crecimiento en
4ºC, y es incapaz de crecer a 14ºC.
b. Las psicrófilas facultativas (también llamadas psicrotrofas) presentan t0
óptima en torno a los 20-30oC y máximas a los 35oC.
2.
Las mesófilas presentan t0 mínimas a los 10-15oC, óptimas a los 25-40oC y
máximas entre 35 y 47oC. La mayor parte de las bacterias (incluyendo las
patógenas) pertenecen a esta categoría.
3.
Las termófilas presentan mínimos a 25oC, óptimos a 50-75oC y máximos entre
80 y 105oC. Dentro de esta categoría se suele distinguir las termófilas extremas
(hipertermófilas), que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100 oC, y
que taxonómicamente pertenecen al dominio de las Archaea.
a. Las termófilas estrictas (o estenotermófilas), con óptimos por encima de los
o
80ºC son de hecho incapaces de crecer a menos de 37 C, como las citadas
arqueas (Ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus
fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su óptimo nada
menos que a 105ºC y puede llegar a aguantar 113ºC, y parece detiene su
metabolismo (por "frío") a la "agradable" temperatura de 90ºC (!)
b. Las termófilas facultativas (o euritermófilas) pueden crecer a menos de 37 oC,
como p. Ej. Thermus aquaticus.
Veamos brevemente unos cuantos casos de bacterias (y algún microorganismo
eucariótico) adaptado a medios con temperaturas extremas, y sus respectivas
adaptaciones a dichas condiciones:
Ejemplos de medios permanentemente fríos son la mayor parte de las aguas
oceánicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las
profundidades alcanzan sólo 1-2oC por encima de cero) y las áreas
permanentemente heladas del Ártico y de la Antártida.
93
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
En los medios helados existen pequeñas bolsas o microcavidades de agua
líquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no
bacteriano muy característico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis),
que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de montaña a mitad de
la estación estival.
Los psicrotrofos (psicrófilos facultativos) son más abundantes, ya que están
adaptados a soportar grandes oscilaciones térmicas, y en verano pueden crecer
a unos 30oC-40ºC.
Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y
hortalizas) que se guardan en frigoríficos, alterando las cualidades
organolépticas e incluso, echándolos a perder (una experiencia que casi todos
hemos tenido).
Las principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos exhibidas por estos
microorganismos son:
 enzimas más resistentes al frío;
 sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas;
 los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de ácidos
grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados); ello supone que
la membrana sigue en su estado semifluido, evitándose su congelación.
Los hábitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima
de 45-50oC) están restringidas a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente
relacionadas con fenómenos volcánicos:
 fuentes termales volcánicas terrestres (en zonas de EE UU, Japón, Nueva
Zelanda e Islandia);
 fuentes termales submarinas: los llamados "humeros" (fumarolas
hidrotermales) asociados a las grandes dorsales oceánicas);
 fumarolas.
Como ejemplo "clásico", muy conocido por documentales de divulgación,
recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe
la mayor concentración mundial de fuentes volcánicas, con géiseres que emiten
a más de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones
de +/- 1 ó 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullición. El riachuelo
que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera
un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes
comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. Allí fue
donde T.D. Brock descubrió la eubacteria termófila Thermus aquaticus, de la que
se extrae la ADN polimerasa termorresistente empleada en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Recientemente se está recurriendo a usar la
polimerasa de una arquea hipertermófila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy
bien a 100ºC.
94
Ramirez - Balqui
Si confeccionamos una tabla donde se agrupen distintos seres vivos en función
de las temperaturas máximas a las que pueden vivir comprobaremos (Fig.1) que
los procariotas, como conjunto aguantan más que los eucariotas. Dentro de los
procariotas, las bacterias no fotosintéticas crecen a mayores temperaturas que
las fotosintéticas. Obsérvese que existen bacterias con óptimos a 55, 70 e
incluso 100oC (el asombroso Pyrodictium crece a 110oC). Como ya dijimos, el
"récord" de termofilia lo tienen ciertas arqueobacterias (como la que acabamos
de citar), y crecen a esas temperaturas a gran velocidad (tiempos de generación
g del orden de 1-7 horas).
Se han aislado bacterias termófilas en medios artificiales, como calentadores de
agua domésticos e industriales.
Las principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas en células
vegetativas bacterianas son:
 enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy
hidrófobo;
 ribosomas termorresistentes;
 membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces
hidrofóbicos más fuertes.
 En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse
en ésteres de ácidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de
hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace éter es más resistente). Algunas,
además, en vez de la típica bicapa lípídica, exhiben una monocapa
bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse "cola con cola" dos
C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes
ambientales.
2.2.
EFECTO LETAL DEL CALOR.
Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan
sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias
dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio
idóneo. La muerte por calor es una función exponencial de primer orden:
dN
 - KT .N
dt
O sea, y como se puede constatar en el gráfico adjunto, la acción del calor supone la
muerte de una fracción constante (KT) de la población sobreviviente en cada momento.
La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la
muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura
esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la
membrana).
95
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
En la práctica podemos encontrarnos con gráficos distintos al anterior, debidos a
desviaciones respecto de esta cinética:
¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una
suspensión bacteriana? Aquí algunos parámetros utilizados:
 tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las
bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura;
 tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la
densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor
D);
 punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en
un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10
min.).
Ejemplos
punto térmico mortal
55oC
60oC
120oC
Especies
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Endosporas de especies muy resistentes de Bacillus.
Estos tres parámetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en
las de fabricación de conservas, centrales lecheras, etc.
Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura
y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento térmico, lograremos
inactivación parcial de la población microbiana (es decir, queda una fracción de
células viables) o bien esterilización (inactivación total).
En general, entendemos por esterilización todo tratamiento de un material con un
agente físico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o químico (como
veremos en el capítulo 19) que acarrea la eliminación de toda forma de vida en él. Una
vez estéril, el material sigue estéril indefinidamente con tal de que esté encerrado en un
compartimiento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente
exterior.
Centrándonos de nuevo en el calor, la inactivación parcial o la esterilización se pueden
lograr por calor húmedo o por calor seco.
La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización de proteínas y a
la fusión de lípidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces débiles,
sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos C = O y H2-N . Estos enlaces se
rompen más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua),
debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.
96
Ramirez - Balqui
2.2.1. Calor húmedo
Por lo tanto, la inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que
la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones
de inactivación total por calor húmedo:
Microorganismo
La mayoría de células vegetativas, de bacterias,
levaduras y hongos
bacilo tuberculoso
bacilo tuberculoso
bacilo tuberculoso
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis
La mayoría de esporas de bacterias patógenas
esporas del patógeno Clostridium botulinum
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos
esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos
Condiciones
80oC, 5-10 min.
58oC, 30 min.
59oC, 20 min.
65oC, 2 min.
60oC, 60 min.
100oC, pocos min.
100oC, 5,5 horas
100oC, muchas horas
120oC, 15 minutos
Veamos los métodos principales de lograr esterilización de materiales por calor
húmedo:
Autoclave (introducido por Chamberland en 1884).- Es un aparato que permite
calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición
del agua (sin que ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un
compartimiento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la
atmosférica. (El funcionamiento del autoclave será oportunamente explicado en
clases prácticas). Los parámetros de esterilización suelen ser: temperatura 121oC
y 10-15 min. Como se puede deducir, estos parámetros vienen fijados por la
resistencia de las esporas de especies saprofitas (ver última línea de la tabla
anterior), que son las formas de vida que más aguantan el calor sin perder
viabilidad.
(Hay que tener en cuenta que, en la práctica, a veces hay que emplear
condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volúmenes de
líquido, habrá que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min., ya que el centro del
recipiente donde va el líquido tarda más en alcanzar la temperatura de
esterilización. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a
115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en
estas ocasiones, el tiempo también es mayor: 30 min).
La acción rápida del calor húmedo depende en buena parte del alto valor de calor
latente del agua (540 cal·g-1); ello hace que los objetos más fríos (como las
muestras a esterilizar) se calienten rápidamente por condensación de agua en su
superficie.
Tindalización (nombre en honor de John Tyndall).- Es un método de esterilización
fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a más de 100oC.
97
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 ó 4) de dos fases
sucesivas cada uno:
a. en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100oC,
durante 1 ó 2 horas;
b. en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37oC durante 24
horas.
Durante las fases de tipo a) mueren todas las células vegetativas de la muestra,
pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar.
Durante las fases de tipo b) se produce la germinación de las esporas activadas
en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirán las células
vegetativas procedentes de la germinación en la fase anterior; y así
sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningún
microorganismo en la muestra.
Como se puede ver, este método es bastante engorroso y consumidor de tiempo,
por lo que en los últimos años ha sido reemplazado por otro método de
esterilización, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilización por
filtración. Consiste de hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro
de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un
tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana (diámetro de poro =0,22 mm).
Aplicaciones principales del calor húmedo:
1. En la práctica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de
medios de cultivo y soluciones.
2. En la esterilización de material quirúrgico.
3. En la esterilización o inactivación parcial, en las industrias alimentarias
(conservas, leche y derivados).
En la industria conservera se emplean los parámetros ya estudiados de punto
térmico mortal y tiempo térmico mortal; este último permite elegir la temperatura
que altera menos las cualidades del material a conservar.
El tiempo térmico mortal varía según:
 el tipo de material: normalmente, los materiales ácidos (tomates, frutas)
requieren menos tiempo que los neutros (como el maíz o las alubias).
 la concentración de azúcares, proteínas o grasas: una mayor concentración de
este tipo de sustancias supone emplear más temperatura y/o más tiempo.
 la concentración de sales: puede obligar a aumentar o disminuir los valores de
tiempo y temperatura, dependiendo del tipo de microorganismos.
En la industria láctea se emplean como métodos de esterilización el autoclave o la
llamada uperización.
La uperización consiste en un tratamiento de calor húmedo donde se emplean
temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. Ej.: 135-150oC durante
98
Ramirez - Balqui
1-2 seg.).- Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede
bastar eliminar los posibles microorganismos patógenos que pueden contaminarla,
y que son más sensibles al calor que los saprófitos inofensivos. Con esta
inactivación parcial de la población microbiana de la leche logramos que ésta se
conserve durante unos días, sin alterar apenas sus cualidades organolépticas y
nutricionales. He aquí los procedimientos más habituales para conseguir esto:
La pasteurización (en honor a Pasteur, que la introdujo en los años 1860)
consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfría y
envasa rápidamente.La pasteurización instantánea (también conocida por sus siglas en inglés HTST,
de high temperature-short time) se logra calentando a 72oC durante sólo 15
segundos, tras de lo cual la muestra se enfría rápidamente. Esta técnica es la más
usada actualmente, ya que:
 mata más rápidamente;
 mata mejor organismos más resistentes;
 altera menos el sabor;
 actúa en flujos continuos (y permite procesar grandes volúmenes de leche).
Tras la pasteurización, el número de bacterias viables desciende un 97-99%. Los
potenciales patógenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo
tuberculoso, Streptococcus, etc.) son eliminados fácilmente.
La pasteurización también se emplea para la preparación de vacunas a base de
microorganismos inactivados por el calor.
2.2.2. Calor seco:
Como ya dijimos, la esterilización por calor seco necesita recurrir a mayores
temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la
rotura de puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la
fusión de membranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor
seco son los daños por oxidación y el provocar un aumento de la concentración de
electrolitos.
Aplicaciones del calor seco:
1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170oC durante
2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al
calor: material de vidrio y metálico, aceites y jaleas, etc.
2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metálicas de siembra, con las
que se inoculan las bacterias.
3. Incineración de materiales de desecho.
2.3.
EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS.
Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) no son útiles para la
esterilización, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación (p.
99
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
ej., especies patógenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas
es, sobre todo, bacteriostático, sin contar aquellos organismos psicrófilos o psicrotrofos.
Los efectos de someter una suspensión bacteriana a temperaturas menores de 0oC
dependen de:
 el medio donde están suspendidas las bacterias;
 el modo en que se realice la congelación y una ulterior descongelación.
2.3.1. Congelación de la suspensión en un medio habitual.
Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelación del medio,
el citoplasma queda en sobrefusión (sin congelar) entre -1 y -10oC. Pero como la
tensión de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una
tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser:
 por pérdida de agua de la célula (cuando la congelación se efectúa
lentamente), o bien
 por cristalización de agua en el interior (cuando la congelación se realiza
rápidamente).
En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo
que supone que la solución del citoplasma puede llegar a saturarse, con
precipitación de sales. Ello conlleva varias consecuencias:
 los cristales de sales y la alta concentración de electrolitos provocan la
desnaturalización de proteínas y daños a la membrana, de modo que
pueden salir componentes del citoplasma (fosfato, ribosa, péptidos y
nucleótidos, procedentes de la actuación de ribonucleasas y peptidasas
latentes).
 Otro efecto de menor importancia es el daño mecánico a la pared celular y a
la membrana provocada por los cristales de hielo.
En general, el enfriamiento rápido es más lesivo que el lento, existiendo una
velocidad óptima. Cuando una bacteria se enfría rápidamente a -35oC se producen
cristales de hielo que provocan daños cuando la muestra se descongela.
Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la
descongelación, y el número de ciclos de congelación-descongelación. La
descongelación lenta es más letal que la rápida, ya que aumenta el volumen de
cristales de hielo.
El grado de muerte por congelación se puede desglosar en dos componentes:
1. El efecto inmediato: muertes que ocurren al congelarse la muestra;
2. El efecto de almacenamiento, consistente en la lenta pérdida de viabilidad
debida al tiempo que permanecen las bacterias sobrevivientes en estado
congelado, y que depende de la temperatura a la que se mantenga la muestra.
Aplicaciones de la congelación:
100
Ramirez - Balqui
La congelación se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas
durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de
maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cómo se
efectúa tanto la descongelación como la descongelación. Una vez congeladas, las
bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre
que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutéctico.
 en nieve carbónica (CO2 sólido), a -78oC;
 en nitrógeno líquido, a -180oC.
Por ello, este método es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante
largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbónica o nitrógeno
líquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos
enseguida, hay métodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras
microbianas durante largos periodos de tiempo.
2.3.2. Congelación en presencia de sustancias que evitan daños a las bacterias.
Para preservar aún mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a añadir a
la suspensión ciertas sustancias, como por ejemplo:
 Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la
solidificación amorfa y vítrea, en lugar de la cristalización, evitando así la
formación de zonas intracelulares con alta concentración de sales: glicerina,
sacarosa, lactosa, dimetilsulfóxido (DMSO).
 Materiales ricos en proteína: leche, suero, extracto de carne.
 Proteínas purificadas (p. Ej., la albúmina).
 Determinadas macromoléculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.
La suspensión bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas
sustancias a -25 a -30oC, en congelador.
III. LIOFILIZACION.
La liofilización es la desecación al vacío de una muestra previamente congelada. Aplicada a
bacterias, es uno de los métodos que mantiene por más tiempo la viabilidad bacteriana (varios
años). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (véase epígrafe
anterior), se congela sobre nieve carbónica (-78oC), y se conecta a una bomba de vacío, que
provoca la desecación. La eliminación de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la
viabilidad de ésta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente,
hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos años después.
IV. EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS
La desecación al aire (sin vacío) mata a las células vegetativas bacterianas, pero no a las
endosporas. La sensibilidad a la desecación varía de una especie a otra.
Ejemplos:
 Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia
de luz), de ahí que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos.
101
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio

En cambio, el vibrión colérico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de sólo dos
horas.
Las causas de la muerte son, principalmente:
 el aumento de concentración intracelular de sales, lo que conlleva efectos tóxicos y
desnaturalizantes de proteínas;
 daños por oxidación.
La mayor eficacia de la desecación al aire se logra con 50% de humedad relativa.
V. EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS.
5.1. CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLÉCULAS.
Se puede definir la radiación como la propagación de energía por el espacio. Los
principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:
radiación electromagnética
Radiación infrarroja (IR)
Radiación visible
Ultravioleta (UV)
Rayos x
Rayos 
Rayos cósmicos
 (longitudes de onda, en nm)
800-106
380-800
13,6-380
0.14-13.6
0.001-0.14
< 0.001
La radiación particulada, con carga y masa consiste en:
 rayos  (núcleos de He).
 rayos  (electrones).
Como se recordará, la radiación electromagnética presenta un doble aspecto: ondulatorio
y cuántico (paquetes discretos de energía, cuantos o quanta).
Cuando una molécula absorbe la energía de un cuanto de radiación electromagnética, se
pueden producir una serie de cambios en los niveles energéticos de algunos de sus
átomos.
La energía de un cuanto (E) está inversamente relacionada con su longitud de onda ( ,
en nm), según la ecuación de Planck:
E  h.
c
λ
Siendo h = constante de Planck (6.62·10-27 erg·seg-1) y c = velocidad de la luz (2.99·1017
nm·seg-1)
Teniendo en cuenta los valores de las constantes y la equivalencia 1 eV =1.59·10-12 erg,
la ecuación de Planck se puede expresar como:
102
Ramirez - Balqui
E
1240 (En eV)
λ
Sustituyendo  por sus valores concretos correspondientes a distintos tipos de
radiaciones electromagnéticas, se calculan fácilmente los respectivos rangos de energía:
Rayos x: 9000-91 eV
Luz UV: 91-3.3 eV
Visible: 3.3-1.5 eV
Fuentes de radiaciones:
Las fuentes naturales nos llegan desde el espacio: radiaciones de la luz solar (visible +
UV) y los rayos cósmicos. Sin embargo, la capa de ozono de la alta atmósfera sirve de
pantalla, evitando que lleguen a la biosfera las longitudes de onda del ultravioleta de
menos de 190 nm, que son las más energéticas.
Los UV generados artificialmente son apantallados por material de vidrio.
Los rayos cósmicos tampoco llegan a la superficie terrestre.
Las principales fuentes artificiales de radiaciones (aparte de las visibles) son:
 máquinas de rayos X;
 radioisótopos (como el Co-60);
 reactores nucleares;
 aceleradores de partículas.
5.2. CLASES DE EFECTOS DE LAS RADIACIONES.
El número de cuantos absorbidos por un sistema biológico es proporcional al producto
de: duración de la radiación por la intensidad de la radiación y por el coeficiente de
absorción del material.
Los efectos derivados de la absorción de esa radiación dependen de:
 la energía de la radiación absorbida;
 la naturaleza del material.
Hagamos un tratamiento del tema en función de que la radiación provoque o no
ionizaciones en el material, lo cual depende de la energía de los cuantos:
1) Si la energía es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los
rayos ..
El fotón de gran energía incide sobre el átomo, provocando la expulsión de un electrón
de gran energía (fotoelectrón), y quedando el átomo en forma ionizada (cargado
positivamente). El electrón expulsado suele tener energía suficiente para originar una
nueva ionización, de la cual surge otro electrón de alta energía, etc. produciéndose
una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energía, hasta que ésta
se disipa en el material: el último electrón de la cadena es captado por otro átomo o
103
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
molécula, que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman
pares de iones (uno positivo y otro negativo).
A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrónicas
ulteriores, que dan pie a cambios químicos en el sistema que se había sometido a la
irradiación.
2) Si la energía es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del átomo o
molécula pasan transitoriamente (de 10-8 a 10-10 segundos) a un nivel energético
superior (entonces se habla de que el átomo o molécula están excitados), pero
enseguida dicho electrón vuelve al estado energético inicial.
En su regreso a su nivel energético previo, el electrón puede dar origen a una variedad
de fenómenos:
 fluorescencia: emisión de energía a una longitud de onda mayor que la del fotón
incidente;
 fotosensibilización: la energía se transfiere a otra molécula;
 reacciones fotoquímicas: se origina un cambio químico;
 emisión de calor: la energía simplemente se disipa en colisiones entre moléculas.
La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoquímicas, aparte de calor. Pero
la radiación infrarroja sólo conduce a disipación de calor, si bien ciertas bacterias
fotosintéticas anoxigénicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosíntesis.
5.3. EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES.
Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen de la dosis de exposición, o sea, de
la cantidad de radiación a que se somete un material. Se suele medir en unidades
Roentgen (R):
-1
1 R = energía de absorción de 83 erg·g de aire.
Por otro lado, la dosis de absorción es la fracción de la dosis de exposición que
realmente se absorbe por el sistema biológico (es decir, es la dosis biológicamente
efectiva). Se suele medir en rads:
1 rad = energía de absorción de 100 erg·g-1 de aire.
En la práctica, la unidad que se emplea en Biología es el megarad (Mrad), equivalente a
un millón de rads, y que es el rango de la dosis requerida para esterilizaciones. También
se emplea el Gray (1Gy equivale a 100 rads).
En general, los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantes que los
seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reducción decimal (D10) para las endosporas
de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las células vegetativas de la
bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre específico) es de 2.200 Gy. Otras
especies más "normales" poseen una dosis de reducción decimal en torno a 200-600 Gy.
Compare estos datos con el valor de sólo 10 Gy como dosis letal para humanos.
104
Ramirez - Balqui
Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos x, los rayos  y los
radioisótopos, como el Co60 o el Cs137.
Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, así
como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación,
mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis.
1.
Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiación ionizante sobre alguna
molécula esencial para la vida. Los estudios cuantitativos demuestran que debe de
existir una molécula vital única que, al ser alterada, provoca la muerte (teoría del
golpe único). Esta molécula debe ser el ADN (ya que obviamente es absolutamente
esencial y suministra una sola copia de la mayoría de los genes bacterianos), y no
las proteínas, de las que existen muchas copias en la célula, y que podrían
regenerarse. Los daños al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y
entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse.
2.
Efecto mutagénico: deriva de la producción de daños menores al ADN que pueden
repararse por mecanismos propensos a error.
3.
Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el más importante, y deriva de la
radiolisis del agua que provoca la aparición de radicales hidroxilo (OH-) e hidrógeno
naciente (H+). El hidrógeno naciente o radical H libre es un potente reductor, y el
radical hidroxilo es un potente oxidante. El radical hidroxilo reacciona fácilmente con
macromoléculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo
cual se traduce en efectos de letalidad. Si, además, la bacteria está expuesta al
oxígeno mientras se la está irradiando, el efecto es aún más intenso, debido a que el
O2 reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de
autooxidación, muy destructivas, y promoviendo la formación de peróxidos y
epóxidos, asimismo letales:
H + O2 → HO2
2 HO2- → H2O2 + O2
Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilización de:
 material farmacéutico;
 material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas
desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc.);
 alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por
parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento).
La dosis de esterilización por radiación se suele establecer en 12 veces la dosis de
reducción decimal (12 D10) requerida frente a las endosporas de Clostridium botulinum.
Debido al gran poder penetrante de las radiaciones hay que mantener unas normas y
controles de seguridad muy estrictos en su manipulación: planchas protectoras de plomo
y revisiones periódicas de los manipuladores.
105
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
5.4. EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA.
La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de onda.
Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas
moléculas biológicas:
 Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm,
debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los
enlaces peptídicos.
 El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5
de las bases púricas y pirimidínicas.
Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las
moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas
genéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de
macromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos
para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas.
Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad,
ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se
pueden volver a sintetizar.
En cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales
primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción
biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).
5.4.1. FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV.
Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de
alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina):
a. dímeros de pirimidina (anillo ciclobutano)
b. fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)
c. hidratos de pirimidina.
Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células
vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también
se producen T-C y C-C. Se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas
adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de
ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la
doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases
complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de
replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración.
A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas de las
dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que
igualmente afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de daños
reviste menos significación biológica.
106
Ramirez - Balqui
El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el
capítulo 12, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de
deshidratación, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes.
Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas
dosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de
transiciones T = A a C = G.
5.4.2. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS.
Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los
seres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados
para enfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los
principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así:
1. Mecanismos prerreplicativos:
a. reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación
directa del daño en sí.
b. reparación por escisión y resíntesis.
2. Mecanismos posreplicativos:
a. reparación por recombinación.
b. reparación inducible de emergencia (SOS).
A) Reparación fotoenzimática
Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima
fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las
fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción
que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas
enzimas poseen dos grupos prostéticos coloreados (cromóforos):
 flavina reducida (FADH2)
 una pterina.
Mecanismo
1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa
reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo
enzima-sustrato [E-S].
2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz ( = 300500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de
pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.
Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación,
no está claro cuál es su papel exacto.
No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la
fotorreparación está muy extendida entre eucariotas.
107
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
B) Reparación por escisión-resíntesis.
La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por un
complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como
correndonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es
decir, no se actúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas
se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco
resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.
Mecanismo:
1. Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la
UvrB (Uvr [A2B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía
de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla
localmente la doble hélice.
2. Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr [A2BC],
es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca
del dímero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el
dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster "a la izquierda" del dímero (o sea,
hacia el lado 5') respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º
enlace fosfodiéster "a la derecha" (en dirección 3' del dímero). Por lo tanto,
se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que
incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la
escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes.
4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es
ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II
(codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para
rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5'--->3'), tomando como molde
la cadena intacta, y usando como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que
se había generado en la fase anterior.
5. Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración
del enlace fosfodiéster del lado 5').
C) Reparación por recombinación.
Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente
replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como
molde, con un dímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y "salta" unos
1000 nucleótidos más adelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un
gran hueco o mella de unos 1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada
mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparación por
recombinación general, recurriendo a la proteína RecA, que verifica una
recombinación con la hebra parental homóloga intacta.
Mecanismo:
1. Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena
sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.
108
Ramirez - Balqui
2. La proteína RecA promueve emparejamiento homólogo de la cadena
sencilla a la que recubre con la doble cadena "hermana" intacta.
3. Se produce un intercambio recíproco de cadenas.
4. El extremo 3'-OH libre de la cadena dañada (que merced al intercambio
recíproco está ahora emparejada con la cadena complementaria
procedente de la doble hélice "hermana") sirve de cebador a la ADNpolimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena
complementaria intacta del dúplex.
5. Ligación e isomerización espontáneas, que produce la llamada "estructura
de Holliday", una figura en "X" donde hay dos sobrecruzamientos
("crossing-over") que mantienen unidos entre sí a los dos duplex.
6. Resolución de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y
religaciones, lo cual genera dos dobles hélices ininterrumpidas. Como se
ve en la figura, uno de estos dúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otro
es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contiene ADN de nueva
síntesis.
Como se puede ver, el mecanismo de reparación por recombinación no repara
por sí mismo la lesión en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa,
evitando que se detenga la replicación del cromosoma. Al final del proceso el
dímero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendrá una oportunidad de ser
reparado por algún otro mecanismo, como el de escisión-resíntesis.
D) Reparación de emergencia (SOS) propensa a error.
Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados
agentes químicos que dañan severamente el ADN, o que interfieren
seriamente con la replicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación
que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los
daños; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que
es inducible y que calificamos como de emergencia, ya que tiende a
salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutaciones con
frecuencia elevada (y por eso lo llamamos también propenso a error).
El sistema SOS en realidad consiste en una serie de funciones "de
emergencia" ante estrés, una de las cuales es este tipo de reparación de ADN
propenso a error. Otras funciones del sistema SOS son:
 Inducción de varios profagos (lo veremos en la sección de Virología, al
tratar el fago l).
 Retraso en la formación del tabique transversal, por lo que las células se
alargan anormalmente. (El significado adaptativo de esta respuesta de
inhibición de la septación parece ser el impedir la segregación de ADN sin
reparar a la célula hija, lo que podría ocasionarle la muerte).
 Desconexión de la respiración.
 Incremento de la degradación de proteínas.
Descripción del sistema en una célula normal (no sometida a daños al ADN):
109
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la
proteína LexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión
autógena), así como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión
no es total, sino que se da un nivel basal de producción de los polipéptidos
correspondientes a estos genes. Así, por ejemplo, el nivel de proteína RecA
es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinación, y los
niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños daños en el ADN.
Descripción del sistema en una célula severamente dañada:
Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere
con su replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla
(c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de
situación de emergencia para la proteína RecA: dicha proteína se une a esas
regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy específica
(para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La proteína
RecA* (activada como proteasa) induce la proteólisis del represor LexA
(rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia la mitad de la molécula).
Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta como para seguir
reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes
(llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos
niveles, de modo que:
 Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia
de la reparación por recombinación;
 Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone
mejorar la reparación por escisión-resíntesis;
 Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la
mutagénesis. Pero) por qué aumenta la mutagénesis? El mecanismo
exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos
dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos
de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de
emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases
incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error).
Hay dos hipótesis principales sobre este respecto:
1. Los genes umuD,C codificarían una nueva polimerasa de emergencia con
menor fiabilidad de copia que las polimerasas habituales;
2. O bien, los productos de umuDC modificarían alguna polimerasa normal
(como la ADN-Pol-III) de manera que ésta "relajaría" su capacidad
correctora de pruebas (exonucleasa 3' → 5'), de modo que ante ausencia
de molde, o ante un molde afectado por el daño colocaría nucleótidos "al
azar", lo que sería la base de las frecuentes mutaciones.
Hay pruebas que favorecen a esta segunda hipótesis.
De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación "límite", pero
a costa de adquirir frecuentes mutaciones.
110
Ramirez - Balqui
5.4.3. APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV.
La luz UV se puede producir artificialmente en lámparas de vapor de mercurio de
baja presión, que emiten el 90% de su radiación a 254 nm. La unidad de energía
de radiación se mide en watts / (seg·cm2).
Por ejemplo, una lámpara de 15 watios emite una energía de 38m watts·cm -2seg.1
, a una muestra situada a 1 metro de la lámpara.
La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La dosis
letal para células vegetativas suele estar entre 1800 y 6500  watt·cm-2, pero las
endosporas requieren 10 veces más dosis.
El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene
poco poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada
por el cristal y penetra poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente
es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de desinfección en salas
de hospitales y de laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz
UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran
obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las
correspondientes bases genéticas).
5.5. EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE.
A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energía, y además, sus cuantos no tienen
efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sería de esperar, en principio, que este
tipo de radiación tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible
puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilización
fotodinámica.
5.5.1. Sensibilización fotodinámica natural.
La luz visible de fuerte intensidad (p. Ej., exposición a pleno sol) es capaz de
matar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas,
porfirinas, citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10 6
-10-8 seg., tras lo cual reemiten la energía a otras moléculas, originando
fotooxidaciones en residuos His y Trp de las proteínas y en las bases de los
ácidos nucleicos. También se puede generar oxígeno singlete ( 1O2), que es un
radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la célula con rapidez.
Así pues, en la práctica de laboratorio habitual, no es conveniente exponer las
bacterias en cultivo a la luz, sino que habrán de cultivarse en oscuridad (salvo el
cultivo de las bacterias fototrofas).
Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea)
poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos
efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno
singlete y la reenvían al estado basal, no excitado).
111
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
5.5.2. Sensibilización fotodinámica artificial:
Si a una suspensión de bacterias añadimos ciertos pigmentos artificiales
fluorescentes (colorantes), como el rosa de Bengala, el azul de metileno, la
eosina, etc., la energía del visible absorbida por dichos pigmentos no la reemiten
como fluorescencia, sino que provoca cambios en proteínas y ácidos nucleicos.
Esto conduce a efectos de esterilización, sobre todo por desnaturalización de
proteínas.
VI. EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS.
Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias entre los 9
kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitúan las ondas supersónicas
(hasta los 200 Kc/seg.) y las ultrasónicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg.). Estos tipos de
ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las ultrasónicas) tienen el efecto de
desintegrar las células.
El fundamento de esta acción es el siguiente: el paso del sonido a través de un líquido
produce cambios de presión alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que a grandes
frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 m de diámetro
(fenómeno de cavitación). Dichas cavidades van aumentando de tamaño y terminan
colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta 1000
atmósferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son:
 la célula se desintegra;
 si existe oxígeno en el líquido de suspensión, se forman peróxidos (como el H 2O2);
 despolimerización de macromoléculas;
 cortes en ambas hebras del ADN.
Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones sonoras. En
general, son más sensibles las Gram-negativas y más resistentes las Gram-positivas. Sin
embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que sobrevivan
algunos individuos, por lo que este método no tiene utilidad para la esterilización.
El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada "sonicación" o
disrupción ultrasónica de células para obtener extractos celulares, en investigaciones
bioquímicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de ultrasonidos o
"sonicador", que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100 Kc/seg.
VII. EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA.
La mayor parte de las especies bacterianas de hábitats continentales no pueden crecer (e
incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm2). Ello se debe a los
siguientes efectos adversos:
 aumento de la viscosidad del citoplasma;
 disminución de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos;
 (posiblemente) interferencia en procesos de transporte a nivel de membrana;
 (posiblemente) interferencia en la biosíntesis de proteínas;
112
Ramirez - Balqui
 interferencia en la división celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin
producción de tabique transversal (crecimiento sin división celular).
Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas presiones
(barotolerantes y barófilas, respectivamente):
Bacterias barotolerantes:
Crecen a la presión atmosférica, pero aguantan hasta unas 500 atmósferas. Su hábitat son las
aguas oceánicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad.
Bacterias barófilas:
Crecen óptimamente a más de 400 atmósferas. Podemos distinguir entre barófilas moderadas
(facultativas) y barófilas extremas (obligadas):
Las barófilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presión atmosférica,
aunque su óptimo está a unas 400 atmósferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000
metros.
Las barófilas extremas presentan óptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de
600-700 atmósferas), y son incapaces de crecer a presión atmosférica. Se han llegado a
aislar a más de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la
temperatura del agua es de sólo 2-3oC, suelen ser simultáneamente criófilas. Este tipo de
bacterias está empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que
hay que cultivarlas en cámaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones
que requieren.
Aplicación práctica de las altas presiones a bacterias barosensibles:
La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente como prensa
francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes presiones y brusca
descompresiones, lo que logra la rotura mecánica de las bacterias, con objeto (al igual que la
sonicación) de obtener extractos libres de células.
VIII. EFECTOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA.
Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en
medios tanto hipotónicos como hipertónicos, debido a la protección de una pared celular rígida
y a la membrana citoplásmica semipermeable.
Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la
del entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. La presión de turgor es relativamente
constante porque la membrana citoplásmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta
presión de turgor permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentración de solutos
en su entorno (dentro de ciertos límites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos
responder a continuación): ¿cómo logra la bacteria ajustar su osmolaridad interna a esos
cambios exteriores?.
113
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
A) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce
todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la
membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva.
Recordemos que las bacterias Gram-negativas poseen dos compartimentos acuosos: el
citoplasma y el periplasma. Como se dijo oportunamente, en el periplasma existe un
oligosacárido especial, derivado de la membrana (el MDO, consistente en 6-10 unidades
de -D-glucosa unidas por enlaces  (1 → 2), y con residuos de fosforilcolina y fosfatidiletanolamina), que interviene en regular la osmolaridad. Sus grupos negativos están
contrarrestados por contraiones positivos, que igualmente colaboran en la regulación
osmótica.
En un medio con baja osmolaridad (p. Ej., aguas fecales) aumenta la concentración del
MDO, lo cual supone un aumento de la osmolaridad del periplasma, que presiona contra el
peptidoglucano. De esta manera la presión de turgor del protoplasto se transmite al
periplasma y de él al peptidoglucano, que es la estructura más resistente.
B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las
bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la
osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del
ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la
concentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado
genéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles
mecanismos:
 bombeando iones al interior;
 sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa;
 bombeando sustancias osmoprotectoras.
+
1.
En el caso de los iones, el ión bombeado suele ser el potasio (K ), por un sistema de
antiporte K+/H+. Ahora bien, para que no se desequilibre la fuerza iónica, la entrada de
K+ suele ir en paralelo con una salida de otros cationes, que suelen ser poliaminas
(como la putrescina). Se ha propuesto que existe un sistema de antiporte K+/putrescina
que en ciertas bacterias tiende a mantener la fuerza iónica mientras aumenta la
tonicidad interior, como sistema para compensar la alta tonicidad del medio. La señal
que desencadena el transporte de iones potasio es directamente la presión de turgor
de la membrana y no la osmolaridad externa.
2.
Como ejemplos de síntesis de solutos orgánicos compatibles y osmóticamente activos
tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa.
Muchas bacterias Gram-negativas sintetizan glutamato ante grandes concentraciones
extracelulares de iones Na+. El mecanismo es el siguiente: al añadir grandes cantidades de
Na+, se produce un eflujo (salida) de H+ al exterior de la célula, lo que supone la
alcalinización del citoplasma. En estas condiciones se activa la enzima glutamatodeshidrogenasa (GDH), que sintetiza grandes cantidades de glutamato, que funciona como
soluto compatible que equilibra la osmolaridad del medio.
114
Ramirez - Balqui
En ciertas enterobacterias lo que ocurre es una inhibición del uso metabólico del
glutamato, por lo que este se acumula.
Igualmente se da una acumulación de trehalosa por inducción de una ruta biosintética e
inhibición de la ruta catabólica.
La ectoína es un derivado cíclico de la prolina, sintetizado como soluto compatible por
ciertas anoxifotobacterias purpúreas.
Ahora bien, si el medio es muy hipertónico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar
la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retracción de la membrana
citoplásmica. La pérdida de agua puede suponer la deshidratación del citoplasma, lo que
conlleva la detención del crecimiento.
 En Gram-positivas se produce una plasmolisis auténtica (retracción de la membrana
citoplásmica respecto de la pared rígida suprayacente)
 En Gram-negativas no existe auténtica plasmolisis, ya que la pared celular y la
membrana citoplásmica se retraen al mismo tiempo. Las bacterias entéricas crecen
lentamente por encima de 0.65M de NaCl.
3.
Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la máxima
teórica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores.
La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usándolos como solutos
compatibles.
Ejemplos de osmoprotectores:
 Prolina (p. ej. en Salmonella typhimurium y Staphilococcus aureus)
 Betaína (glicínbetaína), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y
en algunas Gram-positivas).
 Colina (en Escherichia coli).
 Ectoína en enterobacterias.
Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero mejora si al
medio se añade 1mM de prolina. Un método normal de aislar S.aureus es comprobar el
crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en presencia de prolina.
Algunas bacterias han desarrollado evolutivamente sistemas inducibles de transporte de
estas sustancias, muy eficaces para garantizar su utilización como solutos compatibles. Es
el caso de la colina en E. coli, que una vez introducida se metaboliza hasta el auténtico
soluto compatible, la glicínbetaína.
Algunas bacterias patógenas, al destruir tejidos de su hospedador, provocan la liberación
de sustancias, algunas de las cuales les sirven como osmoprotectores ante la alta
osmolaridad de los fluidos corporales.
Otro mecanismo de control ante variaciones de presión osmótica presente en algunas
bacterias Gram-negativas, es la variación en la proporción de porinas de membrana
externa.
115
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en
general se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los
halófilos.
Uno de los ejemplos de microorganismos sacarófilos no es una bacteria, sino las
levaduras, que viven en jugos vegetales, néctares, zumos, etc. Utilizan como solutos
compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc.
Entre los organismos halófilos, podemos distinguir los halófilos moderados y los halófilos
extremos o hiperhalófilos.
Halófilos moderados: suelen ser bacterias marinas que viven en 3.5% de NaCl, y que ven
inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halófilos
moderados tienen requerimientos concretos de una aw equivalente a la de agua de mar,
+
+
así como concentraciones determinadas de iones Na . El papel jugado por este Na es:
 mantenimiento de los sistemas de membrana citoplásmica y transporte;
 estabilización de la pared celular;
 requerimiento por parte de muchas enzimas.
Halófilos extremos (hiperhalófilos), representados paradigmáticamente por las arqueas
de la familia Halobacteriaceae (halobacterias), que viven en (y de hecho requieren)
concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto
compatible el K+, concentrándolo a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma
queda prácticamente saturado con él (4 a 7 M). Esta gran concentración de potasio es
esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas, enzimas y sistemas de
transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas requieren altas
concentraciones de cloruro sódico.
Dejando aparte las bacterias halófilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por
ejemplo, S. aureus), pero la inmensa mayoría de los procariotas viven a valores de
actividad de agua de 0.98. Por ello, un método que ya se conocía empíricamente en la
antigüedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o añadirles
grandes cantidades de azúcar (como en las mermeladas).
IX. EFECTO DEL pH.
La mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio,
manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante.
Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es
siempre 7.6 o muy cercano a ese valor.
Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, éstas se pueden clasificar
en:
 Neutrófilas, si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8.
 Acidófilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
 Alcalófilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.
116
Ramirez - Balqui
La mayor parte de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilas modifican el pH
del medio, y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias
fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a
partir de desaminación de aminoácidos.
Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH
(alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y
al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplásmico cae rápidamente hasta 5
o menos, la bacteria puede morir.
Uno de los mecanismos que, al menos en neutrófilos parece controlar el pH interior es un
sistema de antiporte H+/K+: a pH ácidos, el interior celular puede quedar en principio más
alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De
esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para
establecer una fuerza protón motriz que les suministre energía.
Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una
respuesta de tolerancia a ácidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones
(expulsan protones al exterior) y chaperonas (proteínas celadoras) para corregir las proteínas
desnaturalizadas.
Existen algunos notables procariotas cuyo pH óptimo es muy bajo (acidófilos extremos u
obligados): Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las
arqueas del género Sulfolobus tienen su óptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH
al oxidar sulfuros hasta ácido sulfúrico. (Sulfolobus es un notable ejemplo de procariota
extremófilo: su hábitat son fuentes termales ácidas y solfataras: es un termoacidófilo). De
hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad
de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran.
Las especies alcalófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo,
Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos carbonatados y
lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim gregoryi).
117
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
118
Ramirez - Balqui
CAPITULO VI
ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS
BACTERIAS
Conceptos generales.
Desinfectantes y antisépticos.
Tipos de desinfectantes.
Quimioterápicos de síntesis y antibióticos. Introducción.
Quimioterápicos de síntesis
Antibióticos
Resistencia bactriana a los antibióticos
Bases genéticas de la resistencia
Mecanismos bioquímicos implicados en la resistencia a antibióticos
119
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
120
Ramirez - Balqui
ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS
BACTERIAS
I.
CONCEPTOS GENERALES
Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo
ejercer dos tipos de efectos diferentes:
 bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;
 bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.
En general, si no sólo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos,
hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para
una misma sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro
microbicida depende muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo
durante el que actúa.
¿Cómo podemos saber que un microorganismo está "muerto"? El único criterio válido es la
pérdida irreversible de la capacidad de división celular, es decir, de la pérdida de viabilidad, y
se suele comprobar empleando técnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no
crecen en medios sólidos adecuados). (Pero ni siquiera esto es garantía de que una bacteria
"no viable" está "muerta": hay bacterias viables pero no cultivables. Como se ve, demostrar que
una bacteria está "muerta" es algo bastante complicado).
Antes de proceder al estudio de las diversas moléculas que pueden afectar el crecimiento y/o
la viabilidad de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas.
 Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivación total de todas las
formas de vida microbiana (o sea, su "muerte" o pérdida irreversible de su viabilidad).
(También existen agentes físicos esterilizantes, como ya vimos en los dos capítulos
anteriores).
 Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo químicos)
antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un
material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos,
por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes.
 Agentes antisépticos son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis
o putrefacción de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica
hacia los tejidos vivos donde se aplican.
 Quimioterápicos son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática,
con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administración a un
organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto
tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del
organismo.
121
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
II.
DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS
Como se recordará cuando tratamos el tema del calor como agentes esterilizante, la muerte de
una población bacteriana se podía representar como una curva exponencial, expresión de la
cinética de primer orden. Este tipo de cinética también es aplicable a la muerte microbiana
cuando se aplica un agente químico a una concentración suficientemente alta:
Sin embargo, cuando se aplican menores concentraciones del agente, se pueden encontrar
cinéticas diferentes, expresables como curvas sigmoidales:
Como se ve, hay un margen en el que la curva sigue una cinética de primer orden, pero dicha
cinética no se puede extrapolar: obsérvese que a tiempos prolongados la curva se hace casi
paralela al eje de abscisas, lo cual indica que queda una fracción de células viables.
2.1.
FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE
Concentración del agente y tiempo de actuación
La concentración para obtener un determinado efecto, así como el rango de
concentraciones en que se puede demostrar un determinado efecto, dependen de:
 tipo químico del desinfectante,
 tipo de microorganismos a eliminar,
 método de ensayo del efecto.
Existe una estrecha relación entre la concentración del agente y el tiempo necesario
para matar una determinada fracción de la población bacteriana, según la siguiente
expresión:
c n . t  K
Donde C es la concentración del agente, n es el coeficiente de dilución (una constante),
y t es el tiempo de actuación.
Esta ecuación nos dice qué relación existe entre la variación de la concentración del
agente y el tiempo para matar una fracción de la población microbiana.
Por ejemplo:
 los fenoles poseen un coeficiente de dilución n = 5 ó 6; ello implica que aun
pequeños cambios en la concentración provocan cambios muy acentuados en el
tiempo para lograr un mismo efecto: así, si reducimos la concentración de fenol
desde un valor dado a su mitad, necesitamos emplear 64 veces más de tiempo para
conseguir matar una misma proporción de bacterias.
 En cambio, los hipocloritos (constituyentes de las lejías) tienen coeficiente n = 1, lo
que se refleja en que pequeños cambios en la concentración requieren pequeños
cambios en el tiempo de aplicación.
Finalmente, y refiriéndonos al tiempo, no todas las bacterias mueren al mismo tiempo, ni
siquiera cuando se aplica un exceso del agente (repásense los gráficos anteriores).
122
Ramirez - Balqui
pH.
El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionización
del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a
través de las membranas biológicas, y por lo tanto son más efectivos.
 los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a pH ácidos;
 los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos.
Temperatura
Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes.
Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte. Pero
con el fenol, la subida de 10 grados representa multiplicar por 5 o por 8 la eficacia.
Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población
microbiana
 Según la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor
que otras bacterias;
 Según la fase de cultivo;
 Dependiendo de la presencia de cápsulas o de esporas (suelen conferir más
resistencia);
 Número de microorganismos iniciales.
Presencia de materiales extraños
La existencia de materia orgánica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus)
afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los
hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto que pueden llegar a
hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante.
Los principales mecanismos por los que se pierde actividad son:
 adsorción (o sea, absorción superficial) del desinfectante a coloides de proteínas;
 formación de complejos inertes o poco activos;
 unión de grupos activos del desinfectante a proteínas extrañas.
Ejemplos:
 los agentes mercuriales se inhiben por sustancias que lleven grupos sulfhidrilo (-SH).
 las sales cuaternarias de amonio se inhiben en presencia de jabones y lípidos.
Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este
factor, determinando previamente el gasto de materia orgánica inerte, o calculando la
potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgánica.
2.2.
DETERMINACION (EVALUACION) DE LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE.
La determinación de la actividad desinfectante de un determinado agente es necesaria
para conocer su posible eficacia. El método primario que se viene empleando desde
hace muchos años es comparar la potencia del compuesto a ensayar con la de un
desinfectante-tipo o estándar, que por motivos históricos es el fenol.
123
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Coeficiente fenol o coeficiente fenólico: consiste en la siguiente relación.
máxima dilución del desinfectante que mata a un microorganismoen 10 min,pero no en 5 min.
máxima dilución del fenol que mata a ese microorganismoen 10 min,pero no en 5 min.
En los EEUU, la Administración Federal de Alimentos y Medicamentos (F.D.A.= Food
and Drug Administration) emplea un test oficial para desinfectantes en condiciones
normalizadas, usando una serie de cepas bacterianas concretas, cuya susceptibilidad al
fenol se conoce exactamente:
 una cepa concreta de Salmonella typhimurium
 una cepa de Staphylococcus aureus
 una cepa de Pseudomonas aeruginosa
El método consiste, en esencia, en lo siguiente:
1. un cultivo de una de estas cepas se diluye 10 veces (1/10) en sucesivas diluciones
del desinfectante problema, y se dejan a 20 minutos;
2. de cada una de las diluciones se siembran alícuotas, a los 5 y a los 10 minutos, en
placas de Petri provista con un medio de cultivo adecuado;
3. se determina el coeficiente fenol según la fórmula que hemos expuesto;
4. una vez determinado, se recomienda usar concentraciones 5 veces superiores a las
indicadas por el coeficiente fenol.
Limitaciones de este método:
 El coeficiente fenol sólo es indicativo cuantitativamente en desinfectantes
químicamente similares al fenol, y que tengan coeficientes de dilución (n) parecidos.
 Aun cuando conozcamos el coeficiente fenol de un compuesto, su valor indicativo se
limita a las diluciones que se hayan empleado en la determinación.
 Hay que atender a las condiciones de valoración, ya que como dijimos antes, la
presencia de materia orgánica supone una merma del poder real de desinfección.
Para solucionar algunos de estos inconvenientes se han puesto a punto otros métodos
de valoración:
Prueba de la concentración equivalente
Consiste en determinar la concentración del desinfectante a ensayar que ejerce el
mismo efecto sobre la bacteria de referencia que otra concentración de un
desinfectante-tipo (estándar).
Determinación de la toxicidad del desinfectante
Como se comentó anteriormente, no todos los agentes esterilizantes son aptos como
desinfectantes de tejidos, ya que pueden presentar efectos tóxicos. Por ello, siempre
que se intenta introducir el uso de un nuevo compuesto desinfectante, hay que evaluar
su potencial tóxico, mediante el llamado índice de toxicidad, que es el cociente entre el
poder desinfectante y el poder tóxico
124
Ramirez - Balqui
III. TIPOS DE DESINFECTANTES.
Se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de acción:
A) AGENTES QUE DAÑAN LA MEMBRANA.
1). Detergentes.
a). acatiónicos
b). aniónicos
c). no iónicos
2). Compuestos fenólicos.
a). fenol
b). cresoles
c). difenilos halogenados
d). alquilésteres del para-hidroxibenzoico
e). aceites esenciales de plantas
3). Alcoholes.
a). etanol
b). isopropanol
B) AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS.
1). Ácidos y bases fuertes
2). Ácidos orgánicos no disociables
C) AGENTES MODIFICADORES DE GRUPOS FUNCIONALES.
1). Metales pesados
a). mercuriales
b). compuestos de plata
c). compuestos de cobre
2). Agentes oxidantes
a). halógenos
b). agua oxigenada
c). permanganato potásico
d). ácido peracético
3). Colorantes
a). derivados de la anilina
b). derivados de la acridina (flavinas)
4). Agentes alquilantes
a). formaldehido
b). glutaraldehido
c). óxido de etileno
d). -propionil-lactona
125
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
3.1.
AGENTES QUE DAÑAN LA MEMBRANA CELULAR.
Los solventes orgánicos (fenoles, alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos
(detergentes) dañan la integridad estructural de la membrana (es decir, la disposición
ordenada de lípidos y proteínas), de modo que interfieren con su función, ejerciendo un
efecto neto de
 Interferencia con procesos de transporte y metabolismo energético;
 Salida de pequeñas moléculas de la célula.
3.1.1. Detergentes (desinfectantes tensioactivos o surfactantes).
Los detergentes sintéticos, al igual que los jabones, contienen una porción
hidrofóbica (normalmente una larga cadena lipófila) y una porción hidrófila (un
grupo polar), lo cual les permite formar micelas en solución acuosa, así como
formar capas que cubren y solubilizan moléculas hidrófobas.
Según sea la porción hidrófila, los detergentes se pueden clasificar en:
Detergentes iónicos:
 detergentes catiónicos (grupo activo con carga positiva)
 detergentes aniónicos (grupo activo con carga negativa)
Detergentes no iónicos (no suelen tener actividad antimicrobiana).
3.1.1.1. Detergentes catiónicos.
Son los detergentes más potentes en cuanto a su actividad desinfectante,
siendo activos contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los
principales son los llamados compuestos de amonio cuaternario:
Sales de amonio cuaternario, sobre todo aquellas que van como
cloruros o bromuros. Su fórmula general se puede representar así:
Los cuatro sustituyentes (R1 a R4) del N son cadenas de hidrocarburos
variados. Las sales de amonio cuaternario más activas son aquellas que
tienen tres grupos alquílicos cortos y un grupo alquílico largo: cloruro de
cetilpiridinio, cloruro de benzalconio.
Mecanismo de acción: La porción hidrófoba penetra en las membranas,
mientras que el grupo polar catiónico se asocia con los fosfatos de los
fosfolípidos, provocando alteraciones en dichas membranas, reflejadas en
la pérdida de su semipermeabilidad, con salida de metabolitos de N y P
desde el citosol. Es entonces cuando el detergente puede entrar al interior
celular, con un efecto secundario de desnaturalización de proteínas. Su
actividad se mejora a pH alcalino.
Son rápidamente bactericidas a concentraciones muy bajas (del orden de
una parte por millón, 1 ppm), siempre que en el material a tratar no exista
materia orgánica.
126
Ramirez - Balqui
Usos, ventajas e inconvenientes: Tienen baja toxicidad, por lo que se
pueden emplear como desinfectantes y antisépticos de la piel. Se
emplean igualmente en la desinfección de material de industrias
alimentarias.Su actividad se ve neutralizada por jabones y fosfolípidos,
precipitando en su presencia.
3.1.1.2. Detergentes aniónicos.
Con grupos carboxilo como porción hidrófila:
 jabones
 saponinas
 sales biliares
 ácidos grasos disociables
Con grupos sulfato como porción hidrófila:
 dodecilsulfato sódico (SDS), también llamado laurilsulfato sódico
 sulfonato de alquilbenceno
Mecanismo: Provocan una gran disrupción de membranas, con efectos
de lisis. Son activos sobre todo a pH ácido, preferentemente sobre
bacterias Gram-positivas, pero poco sobre Gram-negativas, ya que éstas
quedan más protegidas por la barrera del lipopolisacárido de la membrana
externa.
Usos: Cuando los detergentes aniónicos se combinan con ácidos, se
logran desinfectantes sanitarios muy potentes (debido al efecto sinérgico
de ambos componentes) y de rápida actuación (unos 30 segundos).
3.1.1.3. Detergentes no iónicos.
No tienen actividad antimicrobiana, pero algunos tienen empleo en otros
campos de la Microbiología: los ésteres del ácido oleico (bajo nombres
comerciales como CarbowaxJ, Tween-80J) pueden adicionarse a medios
de cultivo para evitar la formación de grumos y favorecer el crecimiento
disperso de ciertas bacterias (como Mycobacterium tuberculosis); además
el oleico puede estimular el crecimiento.
3.1.2. Fenoles.
Son rápidamente bactericidas a bajas concentraciones, causando:
 daños a membranas, con pérdida de constituyentes citoplásmicos;
 inactivación irreversible de oxidasas y deshidrogenasas de membrana;
 desnaturalización de proteínas.
Tienen baja solubilidad en agua, por lo que se emplean en fórmulas que incluyen
agentes emulsificadores (jabones) que, además, aumentan su actividad.
127
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
3.1.2.1. Fenol.
El fenol o ácido carbólico, históricamente uno de los primeros
desinfectantes en usarse, sólo se emplea en la actualidad como patrón
para ensayar el poder desinfectante de otros compuestos.
A partir del fenol se pueden lograr desinfectantes con mayor actividad
antibacteriana y con menor toxicidad sustituyendo hidrógenos del anillo
bencénico por radicales alquílicos o por halógenos. Hé aquí algunos
ejemplos:
3.1.2.2. Cresoles.
Son los alquil-fenoles. El radical alquílico puede estar en posición orto,
meta o para, dando respectivamente el orto-cresol, el meta-cresol y el paracresol. Normalmente se emplea la mezcla de los tres, denominada
tricresol.
Se obtienen por destilación del alquiltrán de carbón, y se emplean como
emulsiones de jabón verde bajo los nombres comerciales de Lysol J y
Creolín J.
Se usan como desinfectantes de material de desecho bacteriológico y
como desinfectantes de la piel.
3.1.2.3. Difenilos halogenados.
El hexaclorofeno (hexacloro-orto-difenilmetano) es bacteriostático a bajas
concentraciones (sobre todo contra cocos Gram-positivos), incluso
incorporado en jabones, pasta de dientes y cosméticos.
Algunas marcas comerciales incluían hace unos años este compuesto,
hasta que se comprobó que su absorción por la piel, sobre todo inflamada,
puede causar neurotoxicidad e incluso, toxicidad sistémica, por lo que en la
actualidad ha dejado de usarse.
3.1.2.4. Alquilésteres del para-hidroxibenzoico.
Actúan de forma similar a los alquilfenoles, pero no son tóxicos, debido a
que al ser ingeridos, se hidrolizan rápidamente, dando el inocuo parahidroxibenzoato.
Se emplean como
farmacéuticos.
conservantes
de
alimentos
y
de
productos
3.1.2.5. Ciertos aceites esenciales de origen vegetal.
Desde la antigüedad, y de modo empírico, se vienen usando algunos
aceites esenciales de plantas aromáticas como conservantes y
antisépticos, ya que como se ha podido comprobar, contienen varios
compuestos fenólicos:
128
Ramirez - Balqui
 el timol (de Thymus, los tomillos);
 el eugenol se emplea en odontología como antiséptico.
3.1.3. Alcoholes.
Los alcoholes desorganizan las bicapas lipídicas penetrando en la región
hidrocarbonada de los lípidos. No afectan a las endosporas, por lo que no son
esterilizantes. Su acción desinfectante mejora conforme aumenta la longitud de la
cadena alifática de los alcoholes, hasta aquellos con 8 a 10 átomos de carbono
(C8-C10), ya que los alcoholes de cadenas más largas de C 10 tienen una baja
solubilidad en agua.
3.1.3.1. Etanol (CH3-CH2OH).
Se emplea en desinfección de la piel antes de inyecciones cutáneas, así
como en desinfección de los termómetros clínicos, siempre que se deje el
tiempo suficiente de contacto. Es más efectivo en soluciones acuosas entre
50-70%, ya que para su mejor acción se implica la intervención del agua. A
100% de pureza es poco efectivo.
3.1.3.2. Isopropanol.
Es menos volátil y más efectivo que el etanol. Se emplea igualmente en
desinfección de termómetros. Sin embargo, su efecto tóxico (narcótico) es
mayor y más duradero que aquel.
3.2.
AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS.
3.2.1. Ácidos y álcalis fuertes.
Son activamente bactericidas, debido a sus grupos H+ y OH- disociados,
respectivamente. En principio, su actividad es proporcional al grado de
disociación, pero algunos hidróxidos son más potentes de lo sugerido por su
mero grado de disociación, debido a la acción tóxica directa que puede ejercer el
catión metálico.
Existen ciertas especies bacterianas que resisten relativamente bien la acción de
bases fuertes. Tal es el caso del bacilo tuberculoso. Esto se aprovecha para
aislarlo y purificarlo: se licúa un esputo de enfermo sospechoso en una solución
1M de sosa (NaOH) y se deja 30 minutos antes de sembrar. Bajo estas
condiciones, prácticamente sólo sobrevive el Mycobacterium tuberculosis.
3.2.2. Ácidos orgánicos.
Los ácidos orgánicos, que son poco disociables, ejercen sus efectos en cuanto a
moléculas intactas (sin disociar), que penetran a la célula.
El ácido benzoico y el ácido sórbico se usan ampliamente como conservantes
alimentarios.
Ciertos ácidos (como el acético, láctico, propiónico) aparecen en alimentos
fermentados, actuando como conservantes naturales. Estos mismos, así como el
129
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
cítrico se pueden añadir a otros tipos de alimentos, para prolongar el periodo de
posible almacenamiento de los productos.
3.2.3. El ácido bórico se ha usado como conservante (a veces ilegal) de alimentos,
así como en oftalmología.
3.3.
AGENTES MODIFICANTES DE GRUPOS FUNCIONALES DE PROTEINAS Y DE
ACIDOS NUCLEICOS.
Esta amplia clase de agentes se caracteriza, en general, por los siguientes efectos:
 alteran grupos que forman parte de los centros activos de enzimas y otras proteínas;
 alteran grupos funcionales de ácidos nucleicos, componentes de pared y de
membrana.
Como ya vimos en la clasificación de agentes desinfectantes, dentro de este grupo se
distinguen a su vez:
1. metales pesados
2. agentes oxidantes
3. tinturas de colorantes
4. agentes alquilantes
3.3.1. Metales pesados.
Las sales solubles de Hg, As, Ag, Cu, etc., "envenenan" la actividad enzimática
formando mercáptidos con los grupos -SH de la cisteína. También interaccionan
con -NH2, -COOH y radicales fosfato.
Los más efectivos son los derivados del mercurio y de la plata (actúan a menos
de 1 ppm).
3.3.1.1. Mercuriales. Se vienen usando desde antiguo en Medicina.
Cloruro de mercurio (HgCl2). En solución al 0,1% fue muy usado como
desinfectante potente, pero es muy tóxico, y apenas se emplea en la
actualidad.
Compuestos orgánicos de mercurio (como el Mercurocromo, la
Mercromina, el Mertiolato): No son totalmente fiables como
desinfectantes y presentan cierta (aunque baja) toxicidad, pero se
emplean mucho como antisépticos de la piel y de heridas.
Sales de fenilmercurio. Son potentes inhibidores no sólo de bacterias,
sino de levaduras, hongos y algas. Se usan especialmente en el control
de posibles contaminantes microbianos (p. ej., bacterias oportunistas del
género Pseudomonas) en productos farmacéuticos, cosméticos y
oftalmológicos.
130
Ramirez - Balqui
3.3.1.2. Compuestos de plata.
Bien sea en forma de sales solubles, o en preparaciones coloidales, los
compuestos de plata se usan ampliamente como antisépticos, aunque
están restringidos, al tener efectos irritantes y cáusticos.
Nitrato de plata (AgNO3). Es muy bactericida frente al gonococo
(Neisseria gonorrhoeae), y por ello se usa habitualmente para prevenir la
oftalmia gonocócica del recién nacido.
Coloides orgánicos de plata. En ellos los iones Ag+ se van liberando
lentamente. Tienen efectos bacteriostáticos, y encuentran su principal
aplicación en oftalmología.
Cremas de nitrato de plata y sulfodiazina de plata. Usadas para el
tratamiento de quemaduras, han reducido notablemente la mortalidad
derivada de las grandes quemaduras.
3.3.1.3. Sales y compuestos de cobre.
No tienen aplicación en Bacteriología Médica, pero se emplean en
Agricultura para el control de hongos y algas.
3.3.2. Agentes oxidantes.
Los efectos de los agentes oxidantes que se tratan a continuación son la
inactivación de proteínas enzimáticas (convirtiendo los radicales -SH en
disulfuros -S-S-). Además, los más potentes también atacan radicales amino, el
grupo indol (presente en el triptófano), y la tirosina.
3.3.2.1. Halógenos.
Son bactericidas muy útiles y muy potentes. El iodo no tiene parangón
como desinfectante de la piel, y el cloro no tiene igual en el tratamiento
de aguas.
Yodo: Aparte de su efecto oxidante, se combina irreversiblemente con
residuos de tirosina de las proteínas. Sus principales presentaciones son
la tintura de iodo y los iodóforos.
Tintura de iodo: es una mezcla de 2% de I2 + 2% de IK en alcohol de
70%. Su máximo efecto bactericida lo tiene a pH<6. Es un magnífico
antiséptico de la piel, de hecho el mejor de los conocidos, pero tiene un
efecto doloroso y cáustico en heridas abiertas.
Iodóforos: son mezclas de iodo con agentes tensioactivos
(detergentes), en los que éstos actúan como portadores del iodo, al que
van liberando lentamente, sin provocar irritación. También se emplean
en desinfección de instalaciones de industrias alimentarias.
131
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Cloro. El cloro fue uno de los primeros antisépticos en usarse (antes de
conocerse su mecanismo, e incluso antes de que se supiera el auténtico
papel de los microorganismos en las enfermedades infecciosas). Holmes
(Boston, 1835) y Semmelweiss (Viena, 1847) lo introdujeron en la
práctica de los médicos y matronas para impedir la transmisión de la
sepsis puerperal, que era contagiada de mujer a mujer por las manos de
los doctores y de las parteras, y que era una notable causa de
mortalidad de mujeres durante muchos siglos.
El cloro se presenta bajo las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y
cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberación de cloro libre
(Cl2); a su vez, el Cl2 reacciona con el agua para dar ácido hipocloroso,
que a pH ácido o neutro es un oxidante fuerte:
Cl2 + H2O → ClOH + H+ + Cl(ClO)2Ca + H2O → Ca++ + H2O + 2 ClO(ClO)2Ca + 2H2O → Ca(OH)2 + 2 ClOH
La disociación del ácido hipocloroso depende del pH (se realiza a pH<7)
ClOH → H+ + ClOCloro gaseoso: a 1-3 ppm se usa en la cloración de aguas para bebida
y de aguas de piscinas. Su actividad se ve muy influida (mermada) por la
presencia de materia orgánica; por ello, se suele determinar la demanda
de cloro del agua a tratar. Descontada dicha demanda, el cloro gaseoso
mata rápidamente (15-30 segundos) a sólo 1 ppm.
Soluciones de hipocloritos: hipocloritos de sodio, de calcio o de litio. A
200 ppm de cloro se usan ampliamente, ya como líquidos (lejías), o en
polvo, en industrias alimentarias y lácteas (para desinfectar el
equipamiento y maquinaria que ha de entrar en contacto con los
alimentos a procesar), en restaurantes, hoteles, hospitales, etc.
3.3.2.2. Agua oxigenada.
El peróxido de hidrógeno (H2O2), en solución al 3%, se usó en otro
tiempo como desinfectante, pero está actualmente en desuso, debido a
que algunas bacterias son resistentes, por la posesión de catalasas y
peroxidasas. Además, en desinfección de heridas abiertas su efecto es
muy pobre, porque el agua oxigenada es descompuesta por la catalasa
tisular.
Se emplea en la desinfección de lentillas blandas, dejando tiempo
suficiente de actuación. También, en desinfección de superficies inertes
y equipos quirúrgicos.
132
Ramirez - Balqui
3.3.2.3. Permanganato potásico (K3MnO4).
Al 1%, se usa como antiséptico uretral.
3.3.2.4. Acido peracético (CH3-CO-O-OH).
Es un fuerte agente oxidante. En forma de vapor se usa en la
esterilización de cámaras de cría de animales libres de gérmenes.
3.3.3. Tinturas de colorantes básicos.
Algunos colorantes derivados de la destilación del alquitrán de carbón, sobre
todo los trifenilmetanos y las acridinas, no sólo tiñen las bacterias (recuérdense
las prácticas), sino que también actúan como antibacterianos, incluso a
pequeñas concentraciones. Los colorantes básicos son los más efectivos.
En general, su mecanismo depende de su afinidad hacia los grupos fosfato
(ácidos) presentes en las nucleoproteínas.
Encuentran su uso como antisépticos de lesiones dermatológicas, infecciones de
la piel y pequeñas heridas.
Su principal inconveniente es que muchos de ellos se inactivan en presencia de
suero y otras proteínas.
3.3.3.1. Colorantes de trifenilmetano:
Son derivados de la anilina. Entre ellos se encuentran el verde brillante,
el verde malaquita, el violeta de genciana, el violeta cristal y la fuchsina
básica.
Son muy selectivos hacia bacterias Gram-positivas, sobre las que son
efectivos a sólo 0,2-2 ppm. En cambio, las Gram-negativas suelen ser
resistentes, debido a su membrana externa.
El efecto antibacteriano se debe a la pseudobase, que es más lipófila
que el respectivo catión, y bajo esa forma accede al interior celular,
donde se une a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos.
3.3.3.2. Colorantes derivados de la acridina (llamados flavinas, por su color
amarillento -Lat: flavus-).
Los ejemplos típicos son la acriflavina, la proflavina y la tripoflavina.
Interfieren en la biosíntesis de ácidos nucleicos (intercalándose en la
doble hélice del ADN) y proteínas. Son bactericidas y bacteriostáticos
sobre una gran diversidad de bacterias.
A diferencia de las anilinas, ejercen su acción también en presencia de
materiales como suero, pus, etc.
Su uso principal es la antisepsia de heridas.
133
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
3.3.4. Agentes alquilantes.
Son agentes esterilizantes, activos tanto sobre células vegetativas como sobre
esporas, que ejercen su efecto letal por su acción alquilante de proteínas y
ácidos nucleicos.
3.3.4.1. Formaldehido (HCHO).
La alquilación la produce reemplazando hidrógenos lábiles de ciertos
grupos químicos (-NH2, -OH, -COOH y -SH), produciendo:

hidroximetilaciones

condensaciones (entrecruzamientos).
Usos comerciales:

como gas, en la descontaminación de habitaciones;

como formalina (solución acuosa al 35%);

como paraformaldehido (polímero sólido de 91-99% de pureza).
La formalina se emplea para preservar tejidos, en líquidos de
embalsamamiento, y al 0,2-0,4% en la preparación de vacunas de virus.
3.3.4.2. Glutaraldehído.
Es menos tóxico y más potente que el formaldehído, y no se afecta por
materiales con proteínas. Cada vez se emplea más como esterilizante
frío de instrumental quirúrgico. Es el único recomendado para esterilizar
equipamiento de terapia respiratoria.
3.3.4.3. Oxido de etileno.
Tiene un efecto similar al del formaldehído: Sustituciones y
entrecruzamientos irreversibles en grupos amino, sulfhidrilo, etc., de
proteínas. También reacciona con grupos fosfato y anillos nitrogenados
de los ácidos nucleicos.
Es un agente empleado como esterilizante gaseoso, aunque es de
acción lenta. Se emplea cuando no se puede recurrir a la esterilización
por calor: esterilización de material de plástico, drogas, ciertos productos
biológicos, equipamiento electrónico. La operación se realiza en
cámaras parecidas al autoclave. Sin embargo, es un método caro y
exhibe ciertos riesgos: presenta acción vesicante y toxicidad para el
hombre (mutágeno y carcinógeno).
3.3.4.4. -propionil-lactona.
Es 25 veces más activa que el formaldehído. Actúa como gas en
presencia de 80-90% de humedad relativa, aunque es poco penetrante.
IV. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS Y ANTIBIÓTICOS. INTRODUCCIÓN
Los quimioterápicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o
microbiostática) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un
134
Ramirez - Balqui
organismo por la vía adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los
tejidos.
Recordemos aquí esta página notable de la historia de la Microbiología:
1900-15
Ehrlich concibe la idea de usar compuestos químicos de
síntesis
como
"balas
mágicas"
selectivas
hacia
microorganismos, pero inofensivas para las personas o
animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsán es
efectivo contra la sífilis. Acuña el término "quimioterapia".
1932-35
Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la acción
del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el
neumococo y otros estreptococos in vivo.
1940
Woods descubre el mecanismo de acción de las sulfamidas.
Estamos en plena "Edad de oro de la Quimioterapia de
síntesis".
1929
Fleming descubre la penicilina, el primer antibiótico natural,
pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria
farmacéutica se muestra "indiferente".
1940
Chain y Florey purifican la penicilina.
1944
Waksman, un microbiólogo de suelos, ha iniciado una
búsqueda de microorganismos productores de antibióticos.
Descubre la estreptomicina. Comienza la época dorada de los
antibióticos (quimioterápicos naturales), y la búsqueda racional
rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de
Actinomicetos, otras bacterias y hongos.
V. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS
5.1. INHIBIDORES EN LA RUTA DE BIOSINTESIS DEL TETRAHIDROFOLATO (THF).
La ruta biosintética del ácido tetrahidrofólico está ilustrada en la Fig.1. El THF es lo que
se denomina habitualmente "donador de unidades de 1 átomo de carbono", y los seres
vivos lo requieren en ciertas rutas biosintéticas:
 biosíntesis de los aminoácidos Met, Gly. Además, las Eubacterias lo necesitan para el
grupo formilo del fMet-ARNt (el ARN transferente que incorpora la formil-metionina al
comienzo de la proteína).
 Biosíntesis de las purinas y pirimidinas, y sobre todo del dTMP.
 Biosíntesis del pantoténico.
Como veremos a continuación, sobre algunos pasos de esta ruta actúa una serie de
agentes quimioterápicos, muchos de ellos con gran importancia clínica.
5.1.1. SULFAMIDAS (SULFONAMIDAS).
Como ya hemos comentado, su descubrimiento y la comprobación de su acción
quimioterápica, marcaron el comienzo de la Quimioterapia con criterios racionales.
Despertaron gran interés cuando se mostró que su mecanismo de acción depende
del hecho de que funcionan como análogos de metabolitos, actuando como
inhibidores competitivos respecto de cierta enzima.
135
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Domagk (1935), siguiendo la estela de Ehrlich, descubre que el Rojo de Prontosilo
confiere protección a ratones inoculados experimentalmente con estreptococos.
Sin embargo, se vio que este mismo compuesto no inhibía a los mismos
estreptococos in vitro, es decir, en tubo de ensayo o en placas de Petri. ¿Cuál era
la razón de este disimilar comportamiento de esta sustancia in vivo e in vitro? La
explicación la encontró el matrimonio Tréfouël (que a la sazón trabajaba en el
Instituto Pasteur): el metabolismo de los ratones rompe el Rojo de Prontosilo, que
por sí mismo es inactivo contra las bacterias, generando el compuesto activo (con
actividad antibacteriana): la sulfanilamida (para-aminobencenosulfonamida).
A partir de la sulfanilamida se sintetizaron desde entonces gran número de
derivados por sustitución de uno de los hidrógenos del grupo sulfonamida,
formando estos derivados la llamada familia de las sulfamidas.
Ejemplos:
 sulfapiridina (por unión del grupo piridina)
 sulfatiazol (con el grupo tiazol)
 sulfadiazina (con el grupo pirimidina)
 sulfaguanidina.
Lo que tienen en común las sulfamidas con actividad antibacteriana es:
 tener libre el grupo amino en para (o, como le ocurre al rojo de Prontosilo, que
quede libre en el organismo hospedador como consecuencia de algún
procesamiento metabólico);
 grupo sulfona (-SO2-) unido al anillo bencénico;
La sustitución del grupo amido unido a la sulfona, aunque no modifica
sustancialmente la actividad antibacteriana, puede suponer una serie de ventajas
de tipo farmacológico:
 disminuir la toxicidad hacia el organismo hospedador;
 aumentar su solubilidad en agua;
 mejorar la absorción del compuesto por el intestino (lo que permite
administración vía oral);
 mayor persistencia de la sulfamida en el organismo (excreción más lenta), lo
que permite dar menos dosis para lograr el mismo efecto.
La introducción de las sulfamidas en los años 40 supuso un gran éxito en el
tratamiento de enfermedades provocadas por cocos Gram-positivos (infecciones
estreptocócicas y neumonías por el neumococo). Aunque la "época dorada de las
sulfamidas" ya ha pasado (debido sobre todo al ulterior descubrimiento de
antibióticos naturales), hoy día siguen empleándose en el tratamiento de
infecciones de las vías urinarias, algunas formas de meningitis, y en Veterinaria.
136
Ramirez - Balqui
Mecanismo de acción de las sulfamidas (descubierto por Woods y cols. en
1940):
Las sulfamidas tienen un efecto bacteriostático. Su acción antibacteriana se
debe al hecho de que funcionan como análogos estructurales del ácido paraaminobenzoico (PABA), inhibiendo competitivamente por el acceso a la enzima
dihidropteroil-sintetasa.
 Como se puede ver, la dihidropteroil-sintetasa cataliza la condensación del
PABA con el 2-amino,4-hidroxi, 6-hidroximetil dihidropteroil-pirofosfato, que
lleva a la síntesis de ácido dihidropteroico (una de las fases intermedias de la
síntesis del tetrahidrofólico -THF). En la figura se puede apreciar que el PABA y
las sulfamidas son muy parecidas. De hecho, la sulfamida es usada por la
enzima como un sustrato alternativo al PABA. En este caso, la enzima
cataliza una reacción que genera un producto que no puede actuar como
intermediario en los siguientes pasos de la ruta de síntesis del THF.
 Los microorganismos son sensibles a las sulfamidas porque sus necesidades
de THF las han de satisfacer sintetizándolo a partir de PABA usando la ruta de
la que estamos hablando. Sin embargo, los animales son resistentes, debido a
que carecen de esta ruta, y en cambio, se aprovisionan de fólico directamente
en su dieta. Pero áun más: en teoría el ácido fólico de la dieta del organismo
hospedador podría anular el efecto terapéutico si fuera captado por la bacteria,
pero en la realidad esto no ocurre, porque el fólico no puede entra a la célula
bacteriana.
El notable éxito terapéutico de las sulfamidas, junto con el desentrañamiento de
su mecanismo de acción, condujo durante los años 40 y 50 a una gran línea de
investigación consistente en sintetizar compuestos que fueran análogos de
factores bacterianos de crecimiento, con la esperanza de "diseñar"
racionalmente nuevos quimioterápicos. Sin embargo, el gran esfuerzo de
búsqueda no rindió apenas frutos. Y la razón hay que buscarla de nuevo en la
excepcional confluencia de hechos que acabamos de citar para las sulfamidas
y que hacen que las sulfamidas funcionan tan bien: inhibición competitiva,
presencia de la ruta en bacterias pero ausencia en animales, la no entrada del
fólico en bacterias pero sí en las células animales. Esta "suerte" no ha
acompañado cuando se ha investigado el posible potencial de análogos de
otros metabolitos.
5.1.2. SULFONAS.
Son derivados de la dapsona (4,4'-diamino-difenilsulfona). Aunque no se usa
contra infecciones normales, ha encontrado una importante aplicación en el
tratamiento de la lepra (producida por Mycobacterium leprae); de hecho es el
quimioterápico de elección para esta enfermedad. Probablemente su mecanismo
de acción esté basado en actuar como competidor del PABA.
5.1.3. PARA-AMINOSALICILICO (PAS).
Es uno de los agentes que se emplean para el tratamiento de la tuberculosis
(provocada por Mycobacterium tuberculosis). Alcanza el interior de los monocitos
137
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
y macrófagos, que son las células donde penetra el bacilo tuberculoso (que es un
parásito intracelular)
Al igual que el PAS, las sulfonas parecen actuar como competidores del PABA,
pero se desconoce la razón por la que estos dos compuestos sean tan específicos
de las especies patógenas de Mycobacterium.
5.1.4. INHIBIDORES DE LA DIHIDROFOLATO-REDUCTASA (DHFR).
El último paso en la síntesis del THF es la reducción del dihidrofólico (DHF),
catalizado por la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Esta reacción es inhibida por dos
quimioterápicos:
 el metotrexato, que al ser tóxico no encuentra aplicación clínica;
 el trimetoprím, que tiene un uso clínico, sobre todo en terapia sinérgica junto
con el sulfometoxazol (una sulfamida). Este doble quimioterápico se emplea
contra infecciones urinarias recurrentes, bronquitis crónicas por neumococos, y
algunas infecciones de Salmonella y Shigella.
Tienen efectos bactericidas, con alta afinidad hacia la enzima DHFR bacteriana,
pero baja hacia la DHTR de animales. Esto deriva del hecho de que, aunque la
mayor parte de los seres vivos tienen DHFR, la enzima bacteriana difiere en
estructura respecto de la de mamíferos.
Existen inhibidores específicos de las versiones de la DHFR de ciertos protozoos
parásitos: así por ejemplo, la pirimetamina y el proguanil se usan contra
Plasmodium, el agente de la malaria. Incluso el metotrexato se puede emplear en
el tratamiento de ciertos cánceres.
5.2. ISONIAZIDA.
Es la hidrazida del ácido isonicotínico (también conocida por sus iniciales inglesas, INH).
Como se puede ver, es un análogo estructural de dos vitaminas: la nicotinamida y el
piridoxal.
e incluso
intracelularmente, lo que permite su empleo contra las especies patógenas de
Mycobacterium, y en general contra bacterias ácido-alcohol resistentes (Nocardia,
Corynebacterium).
Mecanismo de acción: Ejerce varios efectos, probablemente debido a mecanismos
pleiotrópicos (relacionados entre sí):
 interferencia -por mecanismo aún desconocido- con la biosíntesis de la pared celular
de las bacterias AAR, que conduce a desorganizar los ácidos micólicos;
 actuación como antimetabolito de nicotinamida y piridoxal;
 activación de la NAD-asa, lo que conduce a reducir el "pool" de NAD.
138
Ramirez - Balqui
5.3. QUINOLONAS.
El ácido nalidíxico (4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetizó en 1962, y encontró su aplicación
en el tratamiento de infecciones por Gram-negativas del tracto urinario, donde se
concentra.
Recientemente se han sintetizado las llamadas fluoroquinolonas, como por ejemplo el
ciprofloxacín. Presentan 600 veces más actividad que el nalidíxico, y actualmente se
recetan frecuentemente como quimioterápicos de amplio espectro.
Mecanismo de acción: Las quinolonas bloquean la ADN-girasa, uniéndose a la
subunidad de tipo A. Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de
topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen superenrollamiento negativo
en la doble hélice del ADN. La ADN-girasa está constituida por dos subunidades de tipo A
y dos de tipo B (A2B2); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la
doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energía
para la reacción.
El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que ésta queda "congelada" en la
fase en que el ADN está unido al enzima. Ello provoca la acumulación de roturas de
doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria.
En la sección 3.5 de este capítulo (sobre antibióticos que inhiben el metabolismo de los
ácidos nucleicos) veremos algunos que actúan sobre las subunidades de tipo A.
5.4. NITROFURANOS.
Los nitrofuranos, como por ejemplo la nitrofurantoína, tienen efecto contra Gram-positivas
y Gram-negativas, sobre todo en la orina, siendo poco efectivos en otros fluidos
corporales.
5.5. 5-FLUOROCITOSINA (FLUCITOSINA, 5FC).
Es un análogo estructural de la citosina, interfiriendo con la síntesis de ADN y ARN. Su
aplicación es como antifúngico, sobre todo contra infecciones por algunas levaduras.
VI. ANTIBIÓTICOS.
Los antibióticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres
vivos (antibióticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibióticos
semisintéticos), que a pequeñas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas
o microbiostáticos), tras ser administrados por vía adecuada a un organismo receptor.
La mayor parte de los antibióticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos
procariotas (actinomicetos, Bacillus, etc.) o eucariotas (hongos de los géneros Penicillium,
Cephalosporium, etc.).
Se conocen unos 5 000 antibióticos distintos, y cada año se descubre unos 300 nuevos. Su
importancia económica se pone de manifiesto al pensar en las 100.000 TM de antibióticos
producidas al año, por un valor equivalente a 400.000 millones de pesetas.
139
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
La mayor parte de los antibióticos comerciales se emplean para tratar enfermedades de
etiología bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos
presentan actividad antitumoral.
Desde el punto de vista químico, se clasifican en grandes familias:
 antibióticos que contienen carbohidratos;
 lactonas macrocíclicas;
 quinonas y compuestos relacionados;
 antibióticos peptídicos y con aminoácidos;
 heterociclos del N;
 heterociclos del O;
 aromáticos;
 alifáticos;
 etc.
La mayoría de los antibióticos son moléculas complejas, con regiones hidrofóbicas que facilitan
el transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos de los cuales mejoran la
interacción de la molécula con su diana macromolecular.
Para estudiarlos es más útil agrupar a los antibióticos no por clases según su naturaleza
química, sino en función de las "dianas" sobre las que actúan y con las que interfieren:
A) antibióticos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular
B) antibióticos que actúan sobre la membrana celular
C) antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas
D) antibióticos que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos.
Los antibióticos más abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas
de la biosíntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la función del
ribosoma.
6.1. INHIBIDORES DE LA BIOSINTESIS DE LA PARED CELULAR BACTERIANA.
6.1.1. FOSFOMICINA (FOSFONOMICINA).
Este antibiótico de estructura muy simple está producido por Streptomyces fradiae. Su
acción inhibitoria es ejercida a nivel de la primera reacción de la síntesis del PG, a saber,
impidiendo la condensación reductora del UDP-NAG con el PEP para dar UDP-NAM. Ello
lo logra uniéndose con la enzima transferasa correspondiente, inactivándola.
Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado
aplicación en la clínica (se empleó en España, pero no está admitido en los EE UU).
6.1.2. CICLOSERINA.
Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibiótico muestra cierto parecido
estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que actúa como inhibidor
competitivo de las dos reacciones secuenciales de la síntesis del PG donde
aparece la D-ala:
140
Ramirez - Balqui
 inhibe la racemasa que cataliza la conversión de L-ala en D-ala;
 inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para dar el
dipéptido D-ala-D-ala).
La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos
enzimas.
Es un antibiótico de amplio espectro, pero apenas se emplea clínicamente, debido
a su neurotoxicidad. Se recurre a él sólo para tratar ciertos casos de tuberculosis,
en combinación con otros antibióticos.
6.1.3. VANCOMICINA.
Es un glucopéptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rápida
e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapéptido del
precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana
citoplásmica), de modo que inhibe la reacción de transglucosidación.
Es un antibiótico de espectro estrecho, bactericida frente a muchas bacterias
Gram-positivas. Recientemente se está usando frente a infecciones severas de
Staphylococcus aureus y de Streptococcus pneumoniae que sean resistentes a
otros antibióticos. Es la droga de elección ante colitis asociadas a antibióticos
ocasionadas por Clostridium difficile.
6.1.4. RISTOCETINA.
Es un antibiótico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual
que la vancomicina inhibe la transglucosidación, siendo activo frente a Grampositivas.
6.1.5. BACITRACINA-A.
Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ahí su nombre), es un
antibiótico polipeptídico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos
Gram-positivos así como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado tóxico
(sobre todo nefrotóxico) como para ser administrado sistémicamente, pero tiene
uso tópico (p. ej., en cirugía del colon).
Su mecanismo de acción estriba en que se une al pirofosfato del undecaprenil-PP, e impide su regeneración hasta undecaprenil-P por la fosfatasa específica; por
lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosintético del PG.
6.1.6. ANTIBIOTICOS -LACTAMICOS.
Todos los antibióticos de este grupo contienen un anillo característico: el anillo lactámico.
Todos los subgrupos de -lactámicos se pueden considerar derivados de un
núcleo químico en el que, además del anillo lactámico puede existir un heterociclo
conjugado:
141
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Núcleo
Penám
Cefén
Carbapenem
Oxacefén
Clavám
Monobactam
Ejemplos
Penicilinas
Cefalosporinas
Tienamicina
Moxalactam
Clavulánico
aztreonám
PENICILINAS
Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros antibióticos naturales en
descubrirse, pero en general, todos los ß-lactámicos tienen el mismo mecanismo
de acción. Nos concentraremos en estudiar las penicilinas.
El grupo común a todas las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA),
que en realidad es un dipéptido ciclado por condensación de L-cys y D-val, que
genera el anillo ß-lactámico (anillo A) y el anillo tiazolidínico (anillo B). Las
penicilinas se pueden considerar derivadas del 6-APA, sustituyendo el hidroxilo (OH) del grupo carboxilo por un radical acilo (R). Este radical acilo es variable de
unas penicilinas a otras. La variación se puede lograr de dos maneras principales:
 modificando el medio de cultivo donde se hace crecer la cepa del hongo
Penicillium.
 por transformaciones químicas "in vitro", lo que genera las llamadas penicilinas
semisintéticas.
La penicilina natural, purificada por primera vez en los años 40, es la penicilina-G
(o benzil-penicilina), en la que el radical acilo es el grupo bencilo (fenilacético).
Esta penicilina presenta una serie de limitaciones e inconvenientes:
 tiene un espectro estrecho: actúa frente a estreptococos del grupo A y otros
cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayoría de bacterias Gramnegativas.
 Es sensible a ácidos, por lo que no puede ser administrada vía oral (se inactiva
a su paso por el estómago).
 Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas por muchas
bacterias.
 Se elimina rápidamente por la orina (no permanece mucho tiempo en el
organismo receptor).
 En algunos individuos puede provocar respuestas de hipersensibilidad (alergia
a la penicilina).
Para solventar estos problemas se fueron "creando" variantes de esta penicilina
que mejoraban algunas de sus cualidades. Por ejemplo, manipulando el medio de
cultivo del hongo se pudo lograr la llamada penicilina-V (fenoximetil-penicilina),
que es más resistente a bajos pH. Sin embargo, las más recientes generaciones
de penicilinas son semisintéticas. Para obtenerlas se partir del núcleo del 6-APA.
142
Ramirez - Balqui
El 6-APA se puede obtener de dos modos distintos:
 cultivando el hongo en medio carente de ácidos grasos (lo que evita la adición
de radical acilo);
 o bien partiendo de penicilina G, y digiriéndola con amidasas específicas que
producen el 6-APA.
Una vez obtenido el 6-APA, éste se hace reaccionar químicamente con un
compuesto carboxílico. Dependiendo del compuesto en cuestión, se obtiene una
amplia variedad de penicilinas semisintéticas, con propiedades mejoradas:
 con más amplio espectro de acción;
 con más tiempo de permanencia en suero y fluidos corporales;
 con resistencia a penicilinasas y en general -lactamasas;
 resistentes pH ácido, y por lo tanto susceptibles de ser administradas vía oral.
Estas penicilinas semisintéticas se pueden englobar en tres grupos principales:
1). resistentes a penicilinasas.Se usan sobre todo frente a cocos Grampositivos (Staphylococcus aureus, S. epidermidis).
2). De espectro ampliado. Permiten un uso efectivo frente a muchas bacterias
Gram-negativas (Haemophilus influenzae, E. coli, Proteus, Salmonella,
Shigella, etc.).
Dentro de este grupo, destacamos las "aminopenicilinas", como la ampicilina,
o la amoxicilina: el grupo -NH2 del radical acilo permite que estas penicilinas
puedan atravesar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas.
Resisten los ácidos, pero desgraciadamente sólo tienen la mitad de actividad
contra Gram-positivas, y algunas son inactivadas por -lactamasas.
3).
Penicilinas anti-Pseudomonas. La carbenicilina y la piperacilina se usan
frente a Pseudomonas, un patógeno oportunista muy peligroso cuando
coloniza grandes quemaduras, heridas quirúrgicas, etc.
Mecanismo de acción de las penicilinas y otros antibióticos -lactámicos:
Todas las penicilinas (incluidas las semisintéticas), son bactericidas sobre
bacterias en crecimiento, y poseen el mismo mecanismo: Inhiben el sistema
enzimático implicado en la reacción de transpeptidación del peptidoglucano
naciente, o sea que impiden los entrecruzamientos entre cadenas de PG. Ello
origina:
 acumulación de precursores del PG, sin ensamblar;
 activación de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que
hidrilozan el PG maduro de la bacteria; si la bacteria se encuentra en un medio
hipotónico, termina lisándose.
 En Gram-positivas, además, se produce desorganización de los ácidos teicoicos
y lipoteicoicos. (De hecho, parece que en este tipo de bacterias son estos ácidos
los que regulan de algún modo a las autolisinas).
143
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Por lo tanto, la acción bactericida y lítica de las penicilinas depende de que la
bacteria se encuentre creciendo en un medio hipotónico. Cuando la bacteria no
está creciendo, no está haciendo renovación ("turnover") de su pared celular, lo que
implica que la penicilina no tiene "diana" sobre la que actuar; por lo tanto, en estas
condiciones la bacteria puede sobrevivir.
Esta es la base de las "recaídas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado
por terminado el tratamiento de un paciente con un antibiótico ß-lactámico.
Una visión más en profundidad del mecanismo de acción:
Las penicilinas tienen como dianas a una serie de autolisinas llamadas proteínas
de unión a la penicilina (PBPs). Como ya vimos en el apartado 5 del capítulo 6,
las PBPs son proteínas implicadas en las últimas fases de la síntesis y maduración
del PG. Veamos en la siguiente tabla las funciones de las PBPs de E. coli, y los
efectos sobre cada una al añadir penicilina.
PBPs con actividad
transglucosidasa y
transpeptidasa:
PBP 1a y PBP 1b
PBP 2
PBP 3
PBPs con actividad
D-D
carboxipeptidasa
(endopeptidasa)
PBP 4, PBP 5, PBP
6
función natural
acción penicilina
Elongación
del
cilindro
celular
Condiciona la forma de la
célula
Formación
del
septo
transversal
Función natural
lisis rápida
Eliminan la D-ala terminal
delpentapéptido
(maduración PG)
no letal
la célula se redondea y
muere
Filamentación y muerte
acción penicilina
Así pues, las PBPs 1 a 3 son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las
penicilinas que explican la actividad bactericida. Se ha propuesto que el grupo -CON- del anillo ß-lactámico funciona como un análogo estructural del sustrato de las
transpeptidasas implicadas en la reacción de entrecruzamiento (transpeptidación)
entre el péptido del PG naciente y el del PG aceptor. La penicilina se combina con
el sitio activo de la transpeptidasa, dando un complejo enzima-penicilina (peniciloiltranspeptidasa) inactivo y bastante estable.
-LACTÁMICOS
BASADOS
EN
EL
NÚCLEO
DEL
ÁCIDO
7AMINOCEFALOSPORÁNICO
El núcleo cefém es el ácido 7-aminocefalosporánico. Existen dos tipos de lactámicos naturales (y sus derivados semisintéticos) basados en este núcleo:
 cefalosporinas, producidas por hongos del género Cephalosporium;
144
Ramirez - Balqui
 cefamicinas, producidas por ciertas especies del actinomiceto Streptomyces.
Desde un punto de vista biosintético, derivan de los dos mismos aminoácidos que
las penicilinas, pero aquí, uno de los metilos (-CH3) de la valina se incorpora al
anillo en vez de quedar fuera, haciendo que el anillo B sea el anillo dihidrotiazina.
La cefalosporina natural tiene poca actividad, pero sustituyendo artificialmente R 1 y
R2 se obtienen derivados semisintéticos muy activo. Como es habitual con muchos
antibióticos de uso clínico, a lo largo de los años la industria farmacéutica ha ido
"creando" sucesivas "generaciones" de estos compuestos, con aplicaciones y
ventajas diferentes:
Las cefalosporinas se introdujeron en principio para uso en pacientes alérgicos a las
penicilinas. Algunas de ellas combinan la ventaja de tener un amplio espectro
(incluyendo bacterias difíciles de tratar, como Haemophilus) y el de ser resistentes a
las -lactamasas de muchas bacterias Gram-negativas.
MONOBACTÁMICOS
Tienen un núcleo monocíclico (sólo el anilo -lactámico). El derivado semisintético
aztreonam se puede usar contra bacterias Gram-negativas aerobias (estrictas o
facultativas) como Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas y Enterobacterias.
Su espectro de acción estrecho es útil, ya que su administración vía oral "respeta"
mejor la flora intestinal autóctona del paciente.
CARBEPÉNICOS
Se basan en el núcleo del carbapeném. Ejemplos son las tienamicinas (como el
imipeném). Poseen un espectro muy amplio, con actividad intensa contra casi todas
las bacterias de interés médico, incluyendo resistentes a otros antibióticos ßlactámicos: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacteroides,
Haemophilus, Neisseria, etc.
INHIBIDORES DE LA -LACTAMASA
Un ejemplo típico es el ácido clavulánico (una oxa--lactama): tiene poca actividad
como antibiótico, pero se une a las -lactamasas, inactivándolas
irreversiblemente. Actualmente los médicos lo recetan con frecuencia en
combinación con alguna ampicilina (una aminopenicilina, como vimos): la mezcla
ampicilina + clavulánico tiene efectos sinérgicos (se potencian el uno al otro). El
clavulánico pasa fácilmente a través de porinas al espacio periplásmico de muchas
bacterias Gram-negativas, donde se acumula, y allí inactiva a las -lactamasas;
mientras tanto, la ampicilina, "salvada" de la inactivación de las lactamasas, puede
ejercer su efecto bactericida (por bloqueo de la transpeptidación del PG).
6.2. ANTIBIOTICOS QUE ACTUAN SOBRE LA MEMBRANA CELULAR.
A diferencia de los antibióticos que actúan a nivel de pared, los que interfieren con la
membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo
145
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
esté o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de
procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan más o menos tóxicos para
los mamíferos y, en general, han encontrado escasa aplicación clínica.
6.2.1. ANTIBIOTICOS POLIPEPTIDICOS.
Son antibióticos producidos por especies de Bacillus durante las primeras fases de
la esporulación. Se trata de moléculas con aminoácidos en configuraciones L y D,
y con presencia de ciertos aminoácidos "raros" (no proteinogenéticos). Algunos de
estos antibióticos son polipéptidos cíclicos. Su síntesis no se realiza en los
ribosomas, sino que se produce por una secuencia de reacciones enzimáticas que
nada tienen que ver con el proceso de traducción de los mensajeros genéticos.
Suelen ser antibióticos de efecto bactericida. Su mecanismo consiste en que se
unen a la cara externa de la membrana citoplásmica (y, además, a la membrana
externa de las bacterias Gram-negativas), alterando su estructura y su
permeabilidad osmótica; ello condiciona la inhibición de procesos básicos de la
membrana, así como la salida de metabolitos del citoplasma.
POLIMIXINAS
Producidas por Bacillus polymyxa, son decapéptidos cíclicos con aminoácidos en
L y D, y con abundancia del "raro" L-diaminobutírico (L-DAB), y que llevan unido
una cadena alifática C8 (el 6-metil-octanoico).
Su actividad está restringida a Gram-negativas: el anillo peptídico, que está
cargado positivamente, se une electrostáticamente con los grupos negativos de la
membrana externa, desplazando a los cationes Mg++ y otros que estabilizan dicha
membrana; al mismo tiempo, la "cola" hidrofóbica (la cadena alifática) del
antibiótico se introduce entre las cadenas de ácidos grasos de la membrana. El
efecto neto de todo ello es que se desorganiza la estructura y la función de la
membrana externa.
Presentan toxicidad para organismos superiores (sobre todo nefrotoxicidad), por lo
que su empleo parenteral se reserva para infecciones severas de Pseudomonas.
Pero es apto para uso tópico.
TIROCIDINA-A Y GRAMICIDINA-S
Producidas por Bacillus brevis, son antibióticos plenamente cíclicos, con efectos
similares a la polimixina.
6.2.2. IONOFOROS.
Los antibióticos ionóforos actúan aumentando grandemente la permeabilidad de la
membrana hacia iones inorgánicos específicos. Forman canales que atraviesan la
membrana, dejando un hueco central que permite el paso de cationes concretos,
lo que se traduce en una disipación de los gradientes electroquímicos a
ambos lados de la membrana (destruyendo, por tanto, la capacidad de obtención
de energía de las bacterias).
146
Ramirez - Balqui
VALINOMICINA
Es un depsipéptido cíclico, formado por la ciclación de tres unidades del siguiente
módulo:
D-hidroxibutírico-D-valina-Lactato-L-valina
Como se puede comprobar, se trata de una cadena de  -aminoácidos y  hidroxiácidos alternantes, conectados por enlaces peptídicos y enlaces éster. Las
cadenas alifáticas se disponen hacia afuera del anillo, mientras que los grupos
carboxilo se colocan hacia adentro, dejando un canal hidrófilo que permite el libre
paso de K+, lo que desacopla los mecanismos de obtención de energía a nivel de
membrana.
GRAMICIDINA A
Es un antibiótico a base de aminoácidos alternantes en configuraciones D y L, que
forma una estructura helicoidal. Disipa iones K+, así como Na+ e H+. La
configuración permite al antibiótico formar una especie de cilindro donde la cadena
sigue una hélice que está estabilizada por puentes de H casi paralelos al eje del
cilindro, dejando un canal central de 0.4 nm de diámetro, y con las cadenas
laterales de los aminoácidos dirigidas hacia auera, formando una especie de vaina
hidrófoba. Esto permite que la molécula se inserte a través de la membrana,
dejando un canal por el que pueden pasar iones, con la consiguiente destrucción
del gradiente electroquímico.
6.2.3. ANTIBIOTICOS POLIÉNICOS.
Son de tipo macrólido (o sea, un gran anillo provisto un enlace lactónico); este tipo
de antibióticos se caracteriza por poseer una porción flexible hidroxilada y otra
porción más rígida, a base de dobles enlaces conjugados.
La anfotericina B (producida por Streptomyces nodosus) y la nistatina (por S.
nursei) contienen, además, el aminoazúcar llamado micosamina.
Inhiben selectivamente las membranas que contienen esteroles: por lo tanto,
actúan sobre microorganismos eucarióticos (hongos, levaduras), pero no sobre los
procarióticos, a excepción de los micoplasmas. Parece que son bastante
específicos hacia el ergosterol (muy abundante en hongos), pero debido al
parecido de éste con el colesterol, tienen cierta toxicidad hacia los animales
superiores (su margen de seguridad terapéutica es muy estrecho).
Estos antibióticos tienen forma de bastón rígido (debido a la configuración todo trans de los dobles enlaces conjugados). Una de las superficies de este cilindro es
hidrófoba (la de los dobles enlaces), y la superficie opuesta es hidrófila (la que es
rica en hidroxilos). En un extremo del bastón, la micosamina y el carboxilo forman
una zona altamente polar. Los modelos fisicoquímicos revelan que 10 moléculas
del antibiótico se agregan entre sí, con los ejes de sus respectivos bastones
paralelos entre sí y perpendiculares a la membrana (atravesándola), de modo que
147
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
dejan un canal central de uno 0,7 nm de diámetro, y con los grupos polares hacia
afuera. Esta estructura permite el paso libre de iones, así como el que se escapen
metabolitos (como la glucosa) desde la célula al exterior.
6.3. ANTIBIOTICOS QUE INTERFIEREN EN LA BIOSINTESIS DE PROTEINAS.
Se recomienda al alumno repasar, siquiera sea en esquema, el proceso de síntesis de
proteínas, con sus fases de iniciación, elongación y terminación).
Los antibióticos que interfieren en la síntesis de proteínas son muy variados y
abundantes, y la mayoría de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los
que se unen a proteínas ribosómicas y/o a alguno de los ARN ribosómicos. Nosotros
vamos a detenernos principalmente en aquellos antibióticos que afectan a la elongación
de la cadena naciente del polipéptido. Obviamente, los más útiles son aquellos que tienen
efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procarióticos, pero no sobre los 80S
eucarióticos. Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento de la
elongación de la cadena polipeptídica, podemos agruparlos según la fase concreta de la
elongación sobre la que actúan:
1. inhibición del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del
ribosoma;
2. introducción de errores en la lectura de los ARNm;
3. inhibición de la reacción de formación del enlace peptídico;
4. inhibición de la traslocación del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.
5. bloqueo de los factores de elongación.
6.3.1. INHIBIDORES DE LA FASE INICIAL DE LA ELONGACION (O SEA, DEL
RECONOCIMIENTO Y ENTRADA DEL aa-ARNt AL SITIO "A" DEL
RIBOSOMA).
TETRACICLINAS
Son antibióticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gramnegativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por
distintas especies de Streptomyces. Actúan como bacteriostáticos, siempre y
cuando las bacterias estén en crecimiento activo. Como se puede ver por su
espectro, son útiles incluso contra bacterias que viven como parásitos
intracelulares (como las Rickettsias), debido a que su carácter hidrofóbico
facilita su difusión a través de membranas.
Mecanismo de acción: Provocan que la unión del aa-ARNt al sitio A del
ribosoma sea inestable y esté distorsionada, con lo cual se evita la elongación
de la cadena. In vitro actúan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S.
Entonces, ¿por qué in vivo sólo inhiben a las bacterias? La explicación está en el
hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma
"suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad
30S, se une a las proteínas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el
efecto que hemos descrito en el párrafo anterior.
Efectos secundarios:
148
Ramirez - Balqui
 Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la
flora autóctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintéticas evitan
este problema.
 Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daños a huesos y dientes, y
tiñendo los dientes de amarillo en los niños.
6.3.2. INDUCTORES DE ERRORES EN LA LECTURA DEL ARNm.
AMINOGLUCÓSIDOS.
Es un grupo amplio y variado de antibióticos producidos por diversas especies de
Streptomyces. Como se puede ver en las figuras, todos tienen en común varios
rasgos químicos:
 son muy polares, policatiónicos;
 presentan un anillo de aminociclitol (un ciclohexitol o inositol con grupo amino);
 uno o más azúcares, incluyendo al menos un aminoazúcar (aparte del
aminociclitol). Así, por ejemplo, la estreptomicina contiene como aminociclitol la
llamada estreptidina, mientras que otros aminoglucósidos presentan la 2desoxiestreptamina).
Ejemplos de
aminoglucósidos
de uso clínico
Estreptomicina
Kanamicina
Amikacinas
Neomicina
Gentamicina
bacteria productora
Streptomyces griseus
S. kanamyceticus
(derivados semisintéticos de la kanamicina)
S. fradiae
Micromonospora purpurea
Los aminoglucósidos son antibióticos bactericidas de amplio espectro. Sus
propiedades farmacocinéticas se deben al carácter polar del policatión:
 mala absorción vía oral (hay que administrarlos vía parenteral);
 penetran poco en el fluido cerebroespinal;
 se excretan rápidamente por la orina.
Por otro lado, en algunos individuos pueden ocasionar reacciones adversas:
parálisis neuromuscular, ototoxicidad (pueden llegar a provocar sorderas) y
nefrotoxicidad. Su margen de dosis terapéutica es estrecho, por lo que su uso
debe limitarse frente a infecciones ocasionadas por bacterias resistentes a otros
antibióticos.
Mecanismo de acción: Como veremos enseguida, su mecanismo no se limita a lo
que dice el presente epígrafe (inducir errores en la lectura del mensajero), sino
que tienen efectos pleiotrópicos (múltiples), que se influyen entre sí. El mecanismo
lo podemos desglosar en varias fases:
1. Unas pocas moléculas del antibiótico entran a la bacteria, probablemente
aprovechando pequeñas imperfecciones de la membrana en crecimiento;
149
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
2. estas moléculas se unen a los polisomas, es decir, los polirribosomas que
están traduciendo el ARNm (p. ej., la estreptomicina se une al ARNr 16S de la
subunidad 30S). Allí provocan errores en la lectura del ARNm, al distorsionar
la estructura del ribosoma. Concretamente, el efecto aquí es que los codones
del ARNm se emparejan con ARNt cargados "erróneos", en los que sólo 2 de
las 3 bases del anticodón corresponden correctamente con las del codón.
3. Por lo tanto, la bacteria comienza a sintetizar proteínas defectuosas;
algunas de ellas son proteínas de membrana, que al incorporarse a la bicapa
lipídica, introducen imperfecciones en su funcionamiento y estructura. Se van
formando cada vez más "canales", correspondientes a defectos en esa
membrana;
4. a través de los nuevos "canales" e imperfecciones de la membrana, entran
cada vez más moléculas del antibiótico, con lo cual todo el proceso se acelera
y retroalimenta positivamente, de modo autocatalítico.
El efecto final es bactericida:
 se detiene finalmente la síntesis de proteínas;
 se producen daños irreversibles a las membranas.
Cada aminoglucósido se une a una zona distinta de la subunidad 30S del
ribosoma, por lo que no suelen darse reacciones cruzadas de resistencia entre
distintos antibióticos de este grupo.
La mayoría de los aminoglucósidos se une a varios sitios a la vez, dentro de la
subunidad 30S, por lo que la aparición espontánea de mutaciones de resistencia a
ellos suele ser baja. Una excepción a esto es el caso de la estreptomicina.
Efectos de la estreptomicina:
Diana de la estreptomicina: La estreptomicina ejerce su efecto antibiótico
uniéndose a una zona concreta del ARNr 16S del ribosoma eubacteriano.
Mutación de resistencia a la estreptomicina: Con relativa frecuencia (10-9
/célula y división) surge en la población bacteriana una mutación espontánea que
convierte a la bacteria afectada en resistente a la estreptomicina (fenotipo Str R);
esta mutación afecta al gen strA, que codifica la proteína S12 de la subunidad
pequeña del ribosoma. El efecto de la mutación es alterar la proteína S12 de
modo que el ribosoma que contenga esa proteína mutante evita la unión de la
estreptomicina con el ARNr 16S (de algún modo, la S12 mutante "tapa" la vía de
acceso del antibiótico a su diana molecular).
Supresión fenotípica de mutaciones puntuales: Como veremos en la sección
de Genética Bacteriana (cap.23), uno de los tipos de mutaciones se denomina
puntual, porque transforma un par de bases en otro distinto; ello puede suponer
alterar el sentido del codón afectado (el codón mutante puede codificar un
aminoácido distinto al original, o incluso puede ser uno de los tres codones de
parada de traducción), lo cual puede conducir a que la proteína mutante
respectiva deje de ser funcional.
150
Ramirez - Balqui
Pues bien, cuando una bacteria que posee una mutación puntual que inactiva una
determinada proteína (fenotipo mutante) se pone en un medio con estreptomicina
u otro antibiótico aminoglucósido, con cierta frecuencia la lectura errónea del
ARNm del gen mutante ("erróneo") conduce a que la proteína sea funcional,
generándose un fenotipo silvestre. A este fenómeno se le denomina supresión
fenotípica (en este caso inducida por estos antibióticos), para distinguirlo de la
supresión genotípica, que como veremos oportunamente, regenera el fenotipo
pero por medio de cambios en el genomio.
Este efecto depende de la porción del anillo aminociclitol de la molécula del
aminoglucósido, y su mecanismo es a nivel del sistema secundario de corrección
de errores de lectura que tiene el ribosoma ("corrección de pruebas").
Mutantes dependendientes de la estreptomicina: Existe una mutación alélica
de la StrR (es decir, que afecta al mismo gen), pero que en vez de dar fenotipo de
resistencia al antibiótico produce un fenotipo por el que la bacteria depende de la
estreptomicina para poder crecer (!). Esta mutación (denotada Strd) tiene unos
efectos muy específicos de supresión fenotípica condicionada:
 la proteína ribosómica mutante S12, en ausencia de estreptomicina, hace que
el ribosoma traduzca introduciendo frecuentes errores (hay ambigüedades en la
lectura de los mensajeros); por lo tanto, en ausencia de este antibiótico, la
bacteria no crece.
 Si a la bacteria se le suministra el antibiótico, éste compensa fenotípicamente
el efecto de la mutación de la proteína S12, de modo que ahora los
ribosomas pueden efectuar correctamente la traducción de los ARNm (se
reactivan los ribosomas para su funcionalidad normal).
6.3.3. ANTIBIOTICOS INHIBIDORES DE LA FORMACION DEL ENLACE PEPTIDICO.
Se trata de un grupo variado y heterogéneo de agentes antibacterianos que
interfieren con el centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma.
Cloranfenicol (antes llamado cloromicetina)
Antiguamente la industria lo obtenía a partir de Streptomyces venezuelae, pero
actualmente es más barato fabricarlo por síntesis química. Es un bacteriostático
de amplio espectro. Se absorbe bien vía oral y penetra bien en todos los tejidos,
incluyendo cerebro y líquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a
meningitis ocasionadas por Haemophilus influenzae, así como tratamiento de
fiebres tifoideas y anaerobios Gram-negativos.
Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresión
de médula ósea (aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en países de
Occidente, aunque se receta demasiado en el Tercer Mundo.
Mecanismo de acción: Se une a varios lugares de la subunidad 50S, entre los
cuales el más importante es la proteína L16, que forma parte del centro peptidil-
151
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del
ARNt, en el sitio A.
El cloranfenicol ha sido muy útil en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza
los polisomas rápidamente.
Lincomicina y clindamicina.
La lincomicina está producida por Streptomyces lincolniensis, y la clindamicina es
un derivado clorado del anterior, mucho más eficaz y con mejor absorción
intestinal. Son útiles para tratar infecciones donde no pueda aplicarse penicilina, y
contra anaerobios como Bacteroides.
Mecanismo de acción: Se une a la subunidad 50S del ribosoma procariótico,
bloqueando la formación del enlace peptídico. Parece que esto lo logra
interfiriendo con la colocación adecuada del aa-ARNt en el sitio A, y del pp-ARNt
en el sitio P. Hace que se desorganicen los polisomas, disociándose en sus
subunidades 30S y 50S.
Algunos macrólidos como la carbomicina
La carbomicina (producida por Streptomyces halstedii) y otros macrólidos se unen
a la proteína L4 de la subunidad 50S, inhibiendo la formación del enlace peptídico.
6.3.4. INHIBIDORES DE LA TRANSLOCACION.
El representante más típico es otro macrólido, la eritromicina. (Actualmente se
usan mucho en clínica dos derivados semisintéticos de ella: la roxitromicina y la
claritromicina). Producida por Streptomyces erithraeus), es un agente
bacteriostático que se administra en infecciones de vías respiratorias
ocasionadas por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila (legionelosis),
Corynebacterium dyphteriae (difteria) y Bordetella pertussis (tosferina).
Mecanismo de acción: Se une a la proteína L15, que forma parte del centro
peptidil-transferasa.
Bloquea
el
paso
de
translocación
interfiriendo
específicamente con la liberación del ARNt desacilado, es decir, impide que el
ARNt "descargado" (una vez que ha cumplido su misión al transferirse el péptido
naciente al aa-ARNt del sitio A) salga del sitio P; por lo tanto, el pp-ARNt cargado
y situado en el sitio A no puede translocarse al sitio P, y se produce la parada de
la síntesis de proteinas.
6.3.5. INHIBIDORES DE LOS FACTORES DE ELONGACION.
Tiostreptón
Es un antibiótico policíclico muy grande, producido por ciertas especies de
Streptomyces. Se une a la subunidad 50S, concretamente a la proteína L11 y a
una zona concreta del ARNr 23S, impidiendo la unión de los factores de
elongación EFTu y EFG.
152
Ramirez - Balqui
Ácido fusídico
Es un derivado esteroideo producido por hongos del género Fusarium, usado
contra estafilococos resistentes a -lactámicos. Se une al factor de elongación
EFG, inhibiendo la liberación del complejo EFG-GDP, por lo que el pp-ARNt queda
fijado en el sitio P, lo cual impide que se pueda unir el complejo ternario EFTuGTP-ARNt.
Kirromicina y pulvomicina
Se unen al factor EFTu. La kirromicina bloquea la liberación del complejo binario
EFTu-GDP; la pulvomicina bloquea la adición de aa-ARNt al EFTu para formar el
complejo ternario.
En resumen de este apartado, existen antibióticos que afectan prácticamente
cualquier aspecto de la función del ribosoma. Muchos de ellos, aparte del interés
clínico que puedan tener, han sido muy útiles para desentrañar diversos aspectos
de la estructura y función del ribosoma.
6.4. ANTIBIÓTICOS QUE INTERFIEREN EN LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS.
6.4.1. INHIBIDORES DE LA FUNCION DEL ADN.
Pocos de los antibióticos que interfieren con las funciones del ADN son útiles en
clínica, ya que no pueden discriminar entre ADN de procariotas y eucariotas. Sin
embargo, han sido muy valiosos para estudiar diversos aspectos de la biología
molecular del ADN
Actinomicina-D (Dactinomicina)
Observar en la figura que su grupo cromóforo tiene tres anillos y es planar; de
cada anillo de los extremos sale una lactona pentapeptídica. Esta estructura es
importante para entender su mecanismo de acción:
El hecho de tener tres anillos conjugados en un plano le permite intercalarse
entre pares de bases adyacentes de la doble hélice del ADN, mientras que las
dos L-treoninas establecen puentes de H con guaninas del ADN adyacentes al
sitio de intercalación del antibiótico. De esta forma inhibe la replicación del ADN
y su transcripción a ARNm.
Mitomicina C
Al entrar a la célula es convertida a su forma hidroquinona, que es muy reactiva,
funcionando como un agente alquilante bifuncional que origina
entrecruzamientos entre las dos hebras del ADN. Las consecuencias de ello
son:
 las dos hebras no pueden separarse durante el intento de replicación, por lo
que ésta se detiene.
 A continuación el ADN entrecruzado es atacado y destruido por las nucleasas
de la propia célula.
153
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Novobiocina y coumermicina
Se unen a la subunidad B de las ADN girasas bacterianas, impidiendo el
superenrollamiento negativo del ADN al competir por el sitio de unión de esta
subunidad al ATP.
6.4.2. INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION.
Las ARN polimerasas de virus, de bacterias y de mamíferos difieren mucho entre
sí, por lo que los tipo de antibióticos que las afecten suelen ser bastante
selectivos. Recuérdese que las ARN polimerasas eubacterianas constan de un
núcleo {a2'} y que requieren el factor  para la iniciación de la transcripción.
Rifampicinas
Son antibióticos producidos por Streptomyces mediterranei, con buena actividad
contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Se han
usado en clínica moléculas naturales (como la rifampicina) así como derivados
semisintéticos (como la rifampina). Constan de un anillo cromóforo aromático
atravesado por un largo puente de naturaleza alifática.
Su mecanismo de acción estriba en la inhibición del inicio de la transcripción,
uniéndose de modo no covalente a la subunidad ß de la ARN polimerasa
eubacteriana.
Estreptolidigina
Se une también a la subunidad ß de la ARN polimerasa, pero su efecto es inhibir
la fase de elongación de la transcripción.
VII. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIOTICOS
La síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han
supuesto en este siglo una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades
infecciosas. Sin embargo, la extrema versatilidad y adaptabilidad de los microorganismos ha
impedido que la victoria humana sobre las bacterias patógenas haya sido total: muchas
bacterias han ido desarrollando en los últimos decenios mecanismos que las protegen frente a
muchos fármacos.
Ya el mismo Paul Ehrlich, al introducir por primera vez la quimioterapia en protozoos, se dio
cuenta (1907) de que algunas cepas desarrollaban resistencia a la droga durante el curso del
tratamiento.
Tras el optimismo inicial que acompañó a los éxitos de la introducción de las sulfamidas y
penicilinas (años 40 y 50), se constató igualmente un fenómeno de surgimiento de resistencias
bacterianas a estas drogas. Si bien la quimioterapia ha doblegado las grandes epidemias
bacterianas del pasado, las enfermedades infecciosas siguen con nosotros, constituyendo un
serio problema.
De hecho, desde la introducción de la antibioterapia en todo el mundo, estamos realizando un
gigantesco "experimento" de intervención genética en los seres vivos más abundantes del
154
Ramirez - Balqui
planeta: las bacterias. Estamos "sufriendo" la verdad de la supervivencia darwiniana de los
más aptos, ya que la presión selectiva que representa la aplicación a gran escala de los
quimioterápicos ha permitido la diseminación de cepas microbianas con mecanismos de
resistencia que, en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico.
 Al cabo de 6 años de introducir la penicilina G, la frecuencia de cepas de Staphylococcus
aureus resistentes en los hospitales ingleses pasó de menos del 10% a un 60%.
Actualmente el valor ronda el 90%.
 Con los nuevos ß-lactámicos también han empezado a surgir cepas bacterianas resistentes,
aunque aún con frecuencia relativamente baja.
 Actualmente existen problemas de tratamiento con las enterobacterias, e incluso con el
gonococo y el meningococo, que tradicionalmente habían sido muy sensibles a las
penicilinas.
 Recientemente se ha dado la voz de alarma por la diseminación de cepas de bacilo
tuberculoso resistentes a los quimioterápicos de elección a los que eran sensibles. La
capacidad de las bacterias de desarrollar resistencias constituye una seria amenaza al
futuro uso de los antibióticos, y hace que se tengan que invertir grandes sumas de dinero y
esfuerzos de investigación adicionales para intentar hacer frente al problema. Algunos
autores han comparado este problema con el episodio de Alicia en el País de las Maravillas
en el que la Reina Roja tenía que correr cada vez más deprisa para quedarse en el mismo
sitio.
Sin embargo, algunos quimioterápicos de última generación han vuelto a levantar esperanzas:
las fluoroquinolonas están manteniendo e incluso incrementando su efectividad. Por otro lado,
hay que pensar en un dato de tipo evolutivo: la mayor parte de las especies bacterianas han
sido seleccionadas de modo natural con fenotipos sensibles a antibióticos; los cambios
genéticos mutacionales que las convierten en resistentes puede que disminuyan su adaptación
a otros factores ecológicos, de modo que probablemente la presión de los antibióticos en
realidad conduzca en muchos casos a un equilibrio entre cepas sensibles y cepas resistentes.
De hecho se ha comprobado un descenso en la frecuencia de cepas resistentes a los
antibióticos que se introdujeron hace más tiempo, lo que quizá indique que para ellos se está
alcanzando dicho equilibrio.
Aclaraciones de nomenclatura:
 llamamos cepa insensible a aquella cuyo fenotipo silvestre le permite "resistir" de modo
natural a un determinado antibiótico. La base de esta insensibilidad suele ser alguna
estructura de la bacteria que actúa como barrera (como por ejemplo, la membrana externa
de Gram-negativas, que dificulta el paso de muchos agentes antibacterianos).
 Llamamos cepa resistente a una variante surgida por cambios genéticos a partir de un
fenotipo silvestre originalmente sensible.
VIII. BASES GENÉTICAS DE LA RESISTENCIA
Una de las aplicaciones prácticas más interesantes de los avances realizados en las últimas
décadas en el campo de la Genética Bacteriana ha sido comprender los mecanismos genéticomoleculares de la resistencia a antibióticos, lo que está permitiendo un "ataque" más racional a
155
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
este problema clínico. Una cepa bacteriana puede volverse resistente a un antibiótico por dos
tipos principales de mecanismos:
1). mutación en un gen cromosómico;
2). introducción de un plásmido R de resistencia. Este segundo mecanismo supone el
problema más serio, ya que:
a. está muy extendido;
b. puede conferir resistencia a varios antibióticos a la vez;
c. a diferencia del mecanismo mutacional, no suele suponer una desventaja adaptativa (no
disminuye la tasa de crecimiento de la bacteria ni le hace perder sus propiedades de
virulencia).
8.1.
SELECCION DE MUTANTES RESISTENTES.
Las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin intervención
de procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones bacterianas
espontáneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias dentro del
rango de 10--5 a 10--10 por célula y división.
En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una
cepa sensible a un antibiótico se pone en contacto con ese antibiótico, al cabo del
tiempo se comprueba que todo el cultivo consta de bacterias resistentes.
Esta es precisamente la base genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas
resistentes a antibióticos: el fármaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles,
pero no afecta a los pocos individuos que por mutación espontánea hayan adquirido un
alelo resistente; estos individuos se multiplican, de modo que al final son los más
prevalentes.
El conocimiento de la frecuencia de aparición de mutación a resistencia a un
quimioterápico o antibiótico en una determinada especie bacteriana, así como el sitio de
acción de dicho fármaco, son factores importantes para una aproximación racional a la
quimioterapia.
Así por ejemplo, el bacilo tuberculoso produce frecuentemente lesiones en el pulmón,
donde se concentran enormes cantidades de la bacteria. Aquí, la quimioterapia con un
solo agente no da éxito, ya que aunque ese agente mate a casi todos los individuos de
esta especie bacteriana, no afectará a la pequeña subpoblación que posea el alelo
resistente; estos pocos individuos sobrevivirían a este tratamiento, y recolonizarían el
resto del pulmón, por lo que la infección persistiría. Así pues, en este tipo de casos hay
que tratar con varios quimioterápicos simultáneamente (la probabilidad de resistencias
múltiples basadas en mutaciones espontáneas equivale al producto de las
probabilidades individuales).
8.2.
156
RESISTENCIA POR INTERCAMBIO GENÉTICO.
La principal amenaza al éxito de la quimioterapia está representada por la transmisión
genética de plásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R).
Ramirez - Balqui
Veamos un poco de historia: en los años 50, poco después de la introducción de los
primeros antibióticos, se detectó en Japón un espectacular aumento de pacientes de
disentería bacilar resistentes al tratamiento con varios de estos antibióticos. Las cepas
de Shigella dysenteriae aisladas de estos pacientes poseían el fenotipo SuR, StrR, CmR,
TetR. Se comprobó que los genes correspondientes a esas resistencias formaban parte
de un gran plásmido. Los plásmidos de este tipo se denominan plásmidos R. Pero aún
más: los mismos pacientes tenían en sus intestinos cepas de Escherichia coli (que
como sabemos ya, es un simple comensal que forma parte de nuestra flora endógena)
que eran igualmente resistentes a esos antibióticos. Ello sugería que este tipo de
plásmidos se podía transferir de unas especies a otras. La explicación estribaba en un
fenómeno de intercambio dependiente de contactos célula-célula, llamado
conjugación.
En resumidas cuentas, se descubrió que existen plásmidos R capaces de diseminarse
por conjugación no sólo entre células de la misma especie, sino entre especies
distintas, incluyendo bacterias patógenas.
Al poco tiempo comenzaron a aparecer en Occidente cepas patógenas resistentes a
uno o varios antibióticos. Actualmente las cepas con resistencias múltiples codificadas
por plásmidos son muy abundantes en todo el mundo, lo que complica (y a veces
desaconseja) la quimioterapia.
Existen plásmidos R de distintos grupos de incompatibilidad. Son abundantes en
Pseudomonas y en Enterobacterias, desde donde pueden ser transferidos a una amplia
gama de bacterias Gram-negativas (plásmidos promiscuos).
Aparte de los plásmidos R conjugativos existen otros no conjugativos, que sin embargo
pueden ser transferidos entre distintas bacterias por otros medios:
 los plásmidos no conjugativos movilizables pueden ser transferidos por otro plásmido
conjugativo compatible residente en la misma célula.
 por transducción (mediante bacteriófagos);
 por transformación (ADN desnudo del plásmido puede ser captado por una bacteria
sensible receptora;).
Ventajas adaptativas de los plásmidos R:
Los plásmidos R han evolucionado en respuesta a presiones selectivas ambientales
(antibióticos usados por los humanos o inhibidores presentes en los medios naturales de
las bacterias).
1). Son capaces de conferir varias resistencias simultáneamente a las bacterias que los
adquieran.
2). Tienen capacidad de diseminarse epidémicamente de modo "horizontal" (es decir,
entre células distintas de la misma especie o -en el caso de los promiscuos- distintas
especies).
3). Están constituidos por "módulos" móviles (transposones), de modo que tienen
flexibilidad para adquirir nuevos módulos a partir de otras especies.
4). Economía: cuando no existe presión selectiva, pueden perderse de la mayor parte de
las bacterias de una determinada población (curación espontánea), pero su modo de
157
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
transmisión "epidémica" los capacita para diseminarse rápidamente a la mayoría de
la población cuando la ocasión lo requiere (cuando vuelve la presión selectiva).
5). No tienen apenas efectos negativos sobre los demás caracteres de la bacteria
(incluyendo, en las patógenas, su poder virulento).
6). Muchos de ellos responden a mayores concentraciones del antibiótico aumentando
su número de copias (amplificación del número de copias en los plásmidos de control
relajado.
Otro ejemplo de esta facultad de diseminación y evolución lo tenemos en que desde que
los hospitales hacen uso frecuente de detergentes catiónicos como desinfectante, ha
crecido la proporción de cepas de Staphylococcus resistentes a dichos agentes.
Como se puede comprender, el estudio epidemiológico de los plásmidos R reviste
actualmente un gran interés de cara a la salud pública. Este tipo de estudios recurre
principalmente a dos tipos de enfoques:
 por detección de grupos de incompatibilidad (algo complejo);
 por análisis de restricción y comparación de mapas físicos (más fácil y rápido).
IX. MECANISMOS BIOQUIMICOS IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS.
Los principales mecanismos se pueden agrupar de la siguiente manera:
1. Disminución de la permeabilidad hacia el antibiótico.
2. Inactivación enzimática del antibiótico
3. Modificación química de la diana sobre la que actúa el antibiótico
4. Síntesis de una enzima resistente.
9.1. DISMINUCION DE LA PERMEABILIDAD CELULAR HACIA EL ANTIBIOTICO.
Modificación de una barrera preexistente
Como ya sabemos, la membrana externa de Gram-negativas supone una barrera natural
que hace que muchas bacterias de este grupo sean insensibles a varios antibióticos (p.
ej., la vancomicina y la bacitracina no pueden atravesar las porinas).
No todas las bacterias Gram-negativas son igualmente impermeables a los mismos
antibióticos:
 Entre las menos impermeables están Haemophilus y Neisseria, que dejan pasar a
numerosos ß-lactámicos.
 Las Enterobacterias suelen ser intermedias.
 Las bacterias del gén. Pseudomonas son insensibles a la mayoría de antibióticos lactámicos, porque no pueden pasar a través de la membrana externa. Se han aislado
mutantes que se han vuelto resistentes a los -lactámicos de última generación: el
cambio ha afectado a una determinada porina que ahora no deja pasar a estos nuevos
antibióticos.
En otros casos, la resistencia se debe a alteraciones en la cápsula: algunos neumococos
resistentes a estreptomicina y eritromicina dependen de este tipo de mecanismo.
158
Ramirez - Balqui
Mecanismo de extrusión activa del antibiótico
El ejemplo más típico estriba en la resistencia a las tetraciclinas desarrollada por muchas
bacterias. Como sabemos, el efecto inhibidor de las tetraciclinas depende de la
acumulación activa de este tipo de antibióticos por parte de las bacterias. Pues bien,
ciertos plásmidos R poseen transposones (como el Tn10 o el Tn1721) que codifican un
sistema para "bombear" tetraciclina desde el interior bacteriano hacia el exterior, en
contra del gradiente de concentración.
Igualmente se conocen resistencias a sulfamidas dependientes de un mecanismo
específico de impermeabilidad.
Alteración del mecanismo de transporte del antibiótico
Cuando el antibiótico accede al interior bacteriano por algún mecanismo de transporte
específico, una mutación que afecte a dicho sistema de transporte supondrá una mayor
resistencia al antibiótico. Por ejemplo, en E. coli la cicloserina entra aprovechando el
sistema de transporte de la valina o la glicocola. Determinados mutantes incapaces de
transportar estos aminoácidos son resistentes a la cicloserina.
9.2. INACTIVACION ENZIMATICA DEL ANTIBIOTICO.
Este tipo de mecanismo depende en muchos casos de plásmidos R. Los ejemplos típicos
son las resistencias a -lactámicos, la resistencia al cloranfenicol y las resistencias a
aminoglucósidos.
Resistencia a -lactámicos por acción de -lactamasas
Como ya sabemos, ciertas bacterias producen penicilinasa (-lactamasa), capaz de
abrir el anillo -lactámico de la penicilina para dar ácido peniciloico, que carece de
actividad antibacteriana. Lo mismo ocurre con las cefalosporinas, donde la -lactamasa
(cefalosporinasa) genera un producto inestable inactivo que se descompone
rápidamente. Sin embargo, la naturaleza de la cadena lateral (grupo acilo, R) influye
notablemente en la susceptibilidad de rotura del anillo -lactámico por las lactamasas.
-lactamasas codificadas por cromosoma y de bajo nivel (-lactamasas de tipo
TEM).
Están muy distribuidas entre bacterias Gram-negativas, y confieren resistencia a
cefalosporinas y penicilinas. La base de la resistencia en muchos casos es la siguiente:
cuando se expone la bacteria al -lactámico durante mucho tiempo, pueden
seleccionarse determinadas mutaciones en genes cromosómicos que codifican proteínas
parecidas de tipo PBP, de modo que adquieren un fuerte promotor que permite su
expresión a alto nivel. Este tipo de -lactamasa es excretada al medio, donde inactiva al
antibiótico.
-lactamasas de origen plasmídico.
En la Gram-positiva Staphylococcus aureus existen cuatro variantes, responsables del
espectacular aumento de cepas resistentes de esta especie surgidas en los años 50. Se
trata de enzimas inducibles: el gen que codifica la -lactamasa se induce por pequeñas
cantidades de penicilina o cefalosporina, y se producen enormes cantidades del
159
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
antibiótico, que se excreta, de modo que inactiva al ß-lactámico en el entorno de la
bacteria. El gen responsable es portado por plásmidos de tipo R (que llevan genes de
resistencia para otros antibióticos).
En las Gram-negativas se han descubierto unos 20 tipos de -lactamasas de codificación
plasmídica. Suelen ser enzimas de síntesis constitutiva que se expresan a bajos niveles,
y cuya localización es periplásmica; esta localización permite que el antibiótico sea
inactivado antes de que llegue a la membrana citoplásmica, donde se localizan las
proteínas diana de los -lactámicos. Algunas de ellas vienen codificadas por genes
plasmídicos que forman parte de transposones (p. ej., el Tn1 o el Tn4).
¿Cuál es el origen de las -lactamasas?
Aunque la prevalencia de cepas (sobre todo patógenas) resistentes a -lactámicos es un
fenómeno que se "disparó" desde los años 50 con el uso masivo de estos antibióticos,
está claro que la resistencia debía de existir previamente al uso humano de los
antibióticos. La aplicación clínica a gran escala (incluyendo el abuso) de las penicilinas y
cefalosporinas sólo ha permitido que veamos en acción un caso "acelarado" de evolución
bacteriana, donde las cepas más aptas han sobrevivido y se han multiplicado, y en el
que, merced a los procesos de intercambio genético y a la construcción "modular"
(transposones) de muchos plásmidos R, las entidadess genéticas responsbles se han
diseminado de unas especies bacterianas a otras. Se supone que en la Naturaleza (p. ej.,
en los suelos), ciertas cepas bacterianas, antes de la aparición de la Quimioterapia,
poseían ya mecanismos para destruir los -lactámicos segregados por hongos con los
que coexistían.
Profundizando más en el tema, parece que las propias -lactamasas proceden
evolutivamente (por mutaciones sucesivas) de alguno de los genes que originalmente
codificaban algunas de las "autolisinas" (PBPs) que intervienen en la maduración del
peptidoglucano. Es decir, las -lactamasas serían formas modificadas de las mismas
dianas (p. ej., las transpeptidasas) sobre las que actúan los -lactámicos.
Como sabemos, los -lactámicos forman complejos covalentes estables con algunas de
las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien,
existen indicios de que las -lactamasas serían unas "autolisinas" evolucionadas que en
vez de formar complejos estables con los -lactámicos, se habrían especializado en
cortar el anillo lactámico (dando peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa
original.
Resistencia al cloranfenicol
La resistencia al cloranfenicol suele deberse a una enzima inactivante de dicho
antibiótico, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), que normalmente está
codificada por genes plasmídicos. Uno de los genes de CAT de Gram-negativas más
estudiados forma parte del transposón Tn9.
La CAT convierte el cloranfenicol en su derivado 3-acetoxi, usando el acetil-CoA; a
continuación una reacción química (no catalizada por enzima) hace que el grupo acetoxi
160
Ramirez - Balqui
pase a la posición 1; finalmente ocurre una segunda acetilación catalizada
enzimáticamente, que genera el producto final, 1,3-diacetoxi-cloranfenicol. Los derivados
mono o diacetilados del cloranfenicol son inactivos como antibióticos.
Resistencia a ciertos aminoglucósidos
Como ya vimos en el capítulo anterior, los aminoglucósidos son un grupo amplio y
abundante de antibióticos, por lo que no es sorprendente que las bacterias hayan
evolucionado distintos mecanismos para inactivarlos; se pueden agrupar en tres tipos:
 Fosforilación
 Adenilación
 Acetilación
Las fosforilaciones y adenilaciones se dan sobre grupos -OH susceptibles, mientras que
las acetilaciones recaen sobre determinados grupos -NH2.
La modificación enzimática de los aminoglucósidos ocurre en el espacio periplásmico o
en la membrana citoplásmica, y produce un doble efecto:
 el antibiótico modificado covalentemente ya no puede usar el mecanismo de transporte
facilitado a través de la membrana; por lo tanto, accede en menor cantidad al
citoplasma;
 el compuesto modificado ya no puede afectar al ribosoma, por lo que no ejecuta
acción inhibitoria sobre el crecimiento de la bacteria.
9.3. MODIFICACION QUIMICA DE LA DIANA DEL ANTIBIOTICO.
Resistencia a la estreptomicina
Este mecanismo ya fue comentado en la mutación cromosómica strA produce una
proteína ribosómica S12 alterada que impide la unión de la estreptomicina.
Resistencia a la eritromicina
Ciertos plásmidos de cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus codifican una
metilasa de ARN inducida por la presencia de eritromicina: esta enzima modifica por
metilación un determinado nucleótido del ARNr 23S de la subunidad grande del
ribosoma. Concretamente introduce dos metilos en el N de una determinada adenina,
usando S-adenosilmetionina (SAM) como donador. Esto produce un cambio
conformacional en el ribosoma que disminuye su afinidad hacia la eritromicina y hacia la
lincomicina (resistencia cruzada a los dos antibióticos).
El mecanismo genético subyacente al carácter inducible de la metilasa es muy
interesante; en lugar de un mecanismo a nivel transcripcional, como es habitual en las
bacterias, se trata de un mecanismo de regulación traduccional: en las bacterias en
ausencia de eritromicina el ARNm de la enzima posee una estructura secundaria que
evita su traducción por los ribosomas, pero en presencia de eritromicina este ARNm
cambia de conformación y puede ser leído, produciéndose la metilasa que inactivará la
diana del antibiótico.
161
Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio
Resistencia a las rifampicinas
Como ya sabemos por el cap. 20, las rifampicinas actúan uniéndose a la subunidad  de
la ARN polimerasa eubacteriana. La resistencia a estos antibióticos depende de una
mutación cromosómica que altera dicha subunidad, haciéndola insensible a estos
inhibidores.
Resistencia a las quinolonas, novobiocina y coumermicina
Las mutaciones cromosómicas que interesan a la subunidad A de la ADN-girasa
bacteriana producen resistencia al ácido nalidíxico. Sin embargo, las quinolonas de última
generación (fluoroquinolonas como el ciprofloxacino) no se ven afectadas, quizá debido a
la enorme potencia de estos quimioterápicos.
Las mutaciones cromosómicas que afectan a la subunidad B de la girasa rinden
resistencia a la novobiocina y a la coumermicina
9.4. SINTESIS DE UNA NUEVA ENZIMA RESISTENTE.
Resistencia a sulfamidas
Determinados plásmidos R portan genes de resistencia a sulfamidas (SuR), que codifican
una dihidropteroico sintetasa muy resistente a la acción de estos quimioterápicos, debido
a que tienen una afinidad 10 000 veces menor que la enzima normal codificada por el
cromosoma.
Resistencia a trimetoprim
Muchos plásmidos R llevan un gen que codifica una dihidrofolatorreductasa (DHFR) muy
resistente al trimetoprim.
Resistencia a meticilina
En muchos hospitales medran cepas muy peligrosas de Staphylococcus aureus
resistentes al -lactámico meticilina. Estas cepas producen una forma especial de
proteína PBP2 (la llamada PBP2a) que posee una baja afinidad por los -lactámicos,
incluyendo la meticilina. Parece que el gen codificador correspondiente reside en un
transposón.
162
Ramirez - Balqui
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