Download universidad de guayaquil - Facultad de Ciencias Naturales
Document related concepts
Transcript
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES ESCUELA DE BIOLOGIA “CINÉTICA DE CRECIMIENTO Y ACTIVIDAD ENZIMATICA DE Agrobacterium sp. AISLADA DE LAS LAGUNAS DE ECUASAL” JOSÉ DAVID VILLALTA PASTUZO ASESOR: BLGO. JAIME SANTOS PROFESOR: DR. CARLOS GARCÍA RIZZO GUAYAQUIL -2012- ÍNDICE Página RESUMEN Abstract 1 1. INTRODUCCIÓN 2 2. ANTECEDENTES 3 3. JUSTIFICACIÓN 4 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general 4.2 Objetivos específicos 5 5. METODOLOGÍA 5.1 Área de muestreo 5.2 Material biológico 5.3 Aislamiento 5.4 Tinción de Gram 5.5 Identificación bioquímica 5.6 Cinética de crecimiento 5.7 Producción enzimática 5.8 Actividad enzimática a distintas salinidades 6. RESULTADOS 6.1 Aislamiento 6.2 Tinción de Gram 6.3 Pruebas bioquímicas 6.4 Cinética de crecimiento 6.5 Actividad enzimática 6.6 Actividad enzimática a 104ppt y 156ppt 7. DISCUSIÓN 8. CONCLUSIÓN 6-8 9-19 222222222222222222222222222222222222222222222222222222 20 21 9. BIBLIOGRAFÍA 222222222222222222222222222222222222222222222222222 22-23 RESUMEN Se determinó la influencia de la salinidad en la cinética de crecimiento y en la actividad enzimática de Agrobacterium sp., esta bacteria fue aislada de las piscinas de sal de ECUASAL. La identificación fue realizada utilizando pruebas bioquímicas y se obtuvo en la cinética de crecimiento una µ de 13-15 h-1, y un td de 1.2 a 1.5 horas. Así mismo, se determinó que en la concentración de 104ppt la bacteria alcanza a las 24 horas 32 500 000 cel/mL y la salinidad influye en su crecimiento disminuyendo su reproducción; también se observó que Agrobacterium sp. es productora de proteasas y caseinasas y que a una concentración de sales de 104ppt y temperatura de 30°C su producción de proteasas disminuye, mientras que a 156ppt no produce la enzima luego de cinco días. Palabras clave: Agrobacterium sp., cinética de crecimiento, proteasas, caseinasas. ABSTRACT Was determined the influence of salinity on growth kinetics and enzyme activity in Agrobacterium sp. this bacterium was isolated from ECUASAL pools salt. The identification was made using biochemical tests and obtained a velocity growth of 13-15 h-1, and td of 1.2 to 1.5 hours. Furthermore was determined that the bacteria reaches 32 500 000 cells/mL with 104ppt of salt concentration during 24 hours and that salinity can affect his reproduction; Furthermore saw that Agrobacterium sp. Has the capacity for protease and caseinasas production and that the salt concentration of 104ppt and temperature of 30°C decreases the production of proteases, while to 156ppt there not producing the enzyme after five days. Keywords: Agrobacterium sp., Growth kinetics, proteases, caseinasas. 1. INTRODUCCIÓN Las lagunas de ECUASAL, están ubicadas en la provincia de Santa Elena con sus estaciones Salinas y Pacoa. Son de origen artificial; se encuentran a menos de 200 m de la línea costera y fueron creadas con el fin de extraer sal del mar para su comercialización. La temperatura ambiental a lo largo del año fluctúa entre los 22ºC en época seca entre junio y noviembre, y una máxima de 33ºC en la época lluviosa entre diciembre y mayo (6). Los microorganismos halófilos han desarrollado complejos procesos de adaptación que les han permitido hacer frente a las condiciones extremas que caracterizan a los ambientes salinos. Uno de los más importantes mecanismos de adaptación que han desarrollado estos microorganismos es la acumulación intracelular de solutos u osmolitos compatibles, los cuales no interactúan con el metabolismo celular, por lo que su función es puramente osmótica (7). Las bacterias halófilas extremas son organismos que viven en ambientes naturales donde la concentraciones salinas son extremadamente altas (5 molar o 25% NaCl). Las bacterias halófilas requieren grandes cantidades de sales para su crecimiento ya que el Na+ estabiliza sus paredes celulares, ribosomas y enzimas (4). Estas bacterias halófilas producen una serie de enzimas, las enzimas habituales tienen ciertas limitaciones, en cambio las enzimas de organismos extremófilos (extremoenzimas) empiezan a funcionar justo en el punto donde las enzimas comunes lo dejan de hacer ya que estas son capaces de actuar a valores extremos de temperatura, pH y salinidad (9). Los estudios acerca de organismos extremófilos son muy recientes por lo que existe la necesidad de investigar estos organismos; existen enzimas específicas que se producen solo bajo las condiciones extremas a las cuales estas bacterias extremófilas se desarrollan, por lo anterior mencionado se requieren métodos de determinación para saber cuáles son las enzimas que producen y bajo qué condiciones. Las bacterias halófilas son las más deseadas en la industria debido a su gran capacidad de producción y resistencia a condiciones de estrés, mediante la determinación de la cinética se espera obtener la resistencia de esta a los diferentes grados de salinidad, como se desarrolla y que ventajas o desventajas presenta con este cambio, en el Ecuador se tienen zonas hipersalinas por lo cual el conocer la capacidad de las bacterias existentes en estas zonas nos darán una idea de cómo podemos explotar este recurso. La presente investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología en la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil. 2. ANTECEDENTES Cuervo R. y Durán J. (2010) establecieron la cinética de crecimiento para Agrobacterium tumefaciens con una etapa de adaptación de una hora y alcanzó su etapa exponencial a las tres horas la cual duro dos horas hasta llegar a un número final de 7,8 * 108 células por mL. Sánchez et. al. (2004), obtienen cinco cepas que fueron seleccionadas por presentar los mejores halos de actividad estas fueron evaluadas a su vez por su crecimiento y producción de proteasas a diferentes concentraciones de NaCl, rangos de temperatura y pH; las cepas fueron evaluadas por su actividad proteolítica específica sobre la caseína, siendo la cepa CM48 (Pseudomonas sp.) la que presentó la mejor actividad específica (17,38 U/mg) a las 72 horas, y seguidas por las cepas CM45 (Alcaligenes sp.) (12,09 U/mg) y tres cepas de Aeromonas sp. (CM43, CM44 y CM46) con valores de 12,02; 10,07 y 10,10 U/mg respectivamente. Mendoza et. al. (2000) determinaron a partir de cepas halófilas que la frecuencia de producción de caseinasas es 62,74%, Tween-esterasa 57,84%, 52,94% de amilasa, gelatinasa 38,23%, 33,3% de DNasa, 5,43% agarasa y lecitinasa 90,0%. Narváez Terán y Verónica Elizabeth (2007) obtuvieron que Agrobacterium sp. está presente en las lagunas de ECUASAL y que a partir de las 24 horas de incubación tuvo un incremento mayor del halo de producción de proteasa por cada hora. 3. JUSTIFICACIÓN El conocer la actividad enzimática de Agrobacterium sp. salina, contribuirá en el conocimiento científico ya que los estudios previamente realizados se basan en la capacidad de esta bacteria para introducir sus genes a las plantas y su uso para modificaciones genéticas. Al encontrarla en un ambiente hipersalino su capacidad de producción de enzimas o biopolímeros se hace explotable industrialmente, ya que sus propiedades fisiológicas permiten que mantengan una alta productividad a condiciones de estrés, no así otros organismos que no funcionan a una mayor condición de estrés. La bacteria Agrobacterium sp. siendo una cepa nativa nos indicaría la diferencia con cepas de otros lugares del mundo, debido al ambiente diferente en que se desarrolla, cada organismo se adapta de manera distinta dependiendo del ambiente. Debido a las razones arriba señaladas es necesaria la ejecución de esta investigación para lograr obtener conocimiento de las capacidades de Agrobacterium sp. y los beneficios que se puedan obtener, también nos ayudará determinar su capacidad como halófila extrema o halotolerante, teniendo así una estimación de sus reacciones frente a las variables de salinidad. 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Determinar la influencia de la salinidad en la cinética de crecimiento y en la actividad enzimática de Agrobacterium sp. 4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Establecer la cinética de crecimiento de Agrobacterium sp. a diferentes grados de salinidad. Caracterizar la producción enzimática de Agrobacterium sp. Evaluar la actividad enzimática de Agrobacterium sp. a diferentes grados de salinidad. 5. METODOLOGÍA 5.1 Área de muestreo Los sitios de muestreo seleccionados fueron las estaciones Pacoa y Salinas en las piscinas de ECUASAL, las características para la selección de las piscinas fueron: color, etapa de formación de sal en la que se encontraban (cristalizadoras y evaporadoras), para la toma de muestras de suelo se usaron nucleadores previamente esterilizados y se los introdujo a una profundidad de 15 cm estas muestras se transportaron en fundas ziploc para luego llevarlas a la hielera, fueron colectadas en total seis muestras de seis diferentes piscinas. También se tomaron muestras de agua de las piscinas cristalizadoras, las que fueron transportadas en una hielera a 4°C al Laboratorio de Biotecnología en la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Guayaquil. 5.2 Material biológico Agrobacterium es un género de bacilos pequeños y cortos Gram-negativos que son típicamente móviles por medio de 1 a 4 flagelos. Presenta una temperatura óptima de crecimiento entre 25 ° C y 30° C, es encontrado en el suelo, en las raíces de las plantas en el suelo o en los tallos de las plantas donde produce hipertrofia, y en ocasiones de fuentes marinas (1). 5.3 Aislamiento Para el aislamiento de Agrobacterium sp. se suspendió 20 g del suelo de los nucleadores en 100 mL de agua de las salinas filtrada y esterilizada, se procedió a tomar una alícuota de 100 µL de la suspensión, para ser sembradas por desgaste en placa, el medio de cultivo que se usó es TSA (Tryptic Soy Agar) el que fue suplementado con la solución de sales 30% (p/v) descrita por Rodríguez –Valera, F. (1993) para obtener una salinidad final de 70ppt (partes por mil) y luego se envió a incubación a 30°C. El medio de cultivo específico para aislamiento fue Agrobacterium médium el cual se suplementó con la solución de sales 30% (p/v) para obtener una salinidad final de 70ppt. Se seleccionaran las colonias aisladas en TSA para ser inoculadas en el medio Agrobacterium por el método de desgaste en placa luego se incubaron a 30°C y se procedió a realizar varios desgastes en placas hasta obtener colonias puras. 5.4 Tinción de Gram Una vez que las colonias de Agrobacterium sp. se encontraron aisladas, se tomó una muestra de estas colonias con el aza de platino y se realizó un frotis, la muestra fue fijada al calor y se le agregó violeta de genciana durante cinco minutos, luego se lavó con agua destilada, se cubrió la placa con lugol de Gram durante un minuto, se lavó la placa con agua destilada y luego con alcohol al 75% por cinco segundos y se lavó con agua destilada, se le agregó safranina durante cinco minutos y se la retiro con agua destilada, se dejó secar la placa y se observó al microscopio. 5.5 Identificación bioquímica Para la identificación de Agrobacterium sp. se realizaron pruebas bioquímicas basadas en las reacciones descritas por Cowan ST. (1974). las pruebas realizadas fueron: Ureasa. Oxido-Fermentación. Crecimiento en agar Mc Conkey. Hidrólisis del tween 80. Citrato de Simmons. Hidrólisis del almidón. Amoniun Salt Medium (etanol 0.5%). Amoniun Salt Medium (inositol 0.5%). Licuefacción de la gelatina. Todas las pruebas fueron ajustadas a la salinidad de crecimiento de la bacteria (70ppt). 5.6 Cinética de crecimiento Para la cinética de crecimiento se preparó el medio TSB (Tryptic Soy Broth) suplementado con agua de las salinas para obtener tres concentraciones: 104ppt, 156ppt y 208ppt. Se realizaron cuatro réplicas de cada concentración con un volumen final de 50ml cada uno, los medios fueron dispensados en fiolas y esterilizados en autoclave a 121°C y 1 atm. durante 15 minutos. Para cada concentración se inocularon tres replicas y una se usó como control, (sin inoculo), como contenido inicial se estableció un número de 622,000 cel/mL de Agrobacterium sp. para todas las concentraciones y estas se incubaron a 30°C. Para el conteo celular se usó la cámara de Petroff-Hausser, una vez realizado el conteo inicial de todos los ensayos se procedió a realizar el conteo cada 12 horas hasta que la bacteria presente una disminución en el número de células por mililitro en todas las concentraciones. Obtenidos los datos del conteo se realizaron los gráficos de regresión respectivos para determinar las etapas en la cinética de cada una de las réplicas de Agrobacterium sp. y poder determinar la µ (velocidad específica de crecimiento), td (tiempo de duplicación) y la diferencia entre los tratamientos a distintas concentraciones de sales. 5.7 Producción enzimática Se procedió a caracterizar las enzimas producidas por la bacteria considerando a cuatro tipos de sustratos caseína, proteína, almidón y lípidos; los medios de cultivo a utilizar para la producción de las enzimas fueron: Medio caseinasa Starch Agar con almidón soluble al 1% Agar con leche descremada al 1% Lipasa médium tween 80 al 1% Estos medios fueron ajustados a la salinidad requerida para el crecimiento de la bacteria, los medios fueron esterilizados en autoclave a 121°C y 1 atm. durante 15 minutos. Se preparó cinco placas de cada medio, de las cuales cuatro fueron inoculadas con Agrobacterium sp. y una fue usada como control (sin inóculo) la siembra de las colonias se realizó con un asa de platino en el centro de la placa, estas se incubaron a 30°C durante cinco días. Se mantuvo una medición diaria del crecimiento del halo o la bacteria para determinar la enzima extracelular de mayor producción. Para observar el halo enzimático en las placas de proteína, caseína y lípidos se lo realizó a simple vista ya que estos son translucidos, en el caso del almidón se le agregó lugol al 50% para poder distinguir el halo. 5.8 Actividad enzimática a distintas salinidades Al determinarse la enzima de mayor producción por Agrobacterium sp. se procedió a preparar el medio con el sustrato respectivo, a concentraciones de sales diferentes 104ppt y 156ppt; se realizó para cada concentración cinco placas de las cuales una se usó como control (sin inoculo) y las otras cuatro fueron inoculadas en el centro de la placa, estos medios se incubaron a 30°C y se procedió a la medición diaria de los halos enzimáticos con un calibrador durante cinco días. 6. RESULTADOS 6.1 Aislamiento Se logró aislar la bacteria de las muestras de suelo de las salinas de ECUASAL presentando características morfológicas (Tabla1) (Fig. 1) que indicaron la semejanza al género Agrobacterium por lo que se procedió a la realización de las pruebas bioquímicas Tabla 1. Características morfológicas de Agrobacterium sp. Características Color Textura Bordes Forma (Colonia) Consistencia Forma(Bacteria) Salinidad del medio Agrobacterium sp. Blanco Lisa Irregulares Redondas Viscosa Bacilos 60 ppt Figura 1. Crecimiento en medio Agrobacterium 6.2 Tinción de Gram La bacteria se tornó de color rojo luego de realizada esta tinción lo que indica que es una bacteria Gram negativa. Figura 2. Tinción de Gram en Agrobacterium sp. 6.3 Pruebas bioquímicas Las diferentes pruebas realizadas (Tabla2) (Fig.3) dieron como resultado positivo para el género Agrobacterium por lo cual se la consideró a la cepa completamente aislada, las reacciones presentadas en las pruebas por la bacteria se compararon con lo descrito por Cowan ST. 1974. para este género. Tabla 2. Resultados de las pruebas bioquímicas para Agrobacterium sp. PRUEBA BIOQUÍMICA RESULTADOS Ureasa - Oxido-Fermentación + Crecimiento en agar Mc Conkey - Hidrólisis del tween 80 + Citrato de Simmons + Hidrólisis del almidón - Amoniun Salt Medium (etanol 0.5%) - Amoniun Salt Medium (inositol 0.5%) - Licuefacción de la gelatina - Figura 3. Pruebas bioquímicas realizadas para Agrobacterium sp. A) Mc Conkey B) Gelatina C) Almidón D) Oxido-Fermentación E) ASM etanol F) Citrato de Simmons G) ASM inositol 6.4 Cinética de crecimiento Todos los ensayos iniciaron con un número de bacterias de 622 000 cel/mL, el conteo fue realizado cada 12 horas y se obtuvieron los datos presentados en las tablas 3,4 y 5. Tabla 3. Número de bacterias a 104ppt. 28/08/2012 28/08/2012 29/08/2012 29/08/2012 30/08/2012 30/08/2012 31/08/2012 31/08/2012 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72h 84h R1 622000 11550000 31500000 27000000 20050000 11600000 34833333 26000000 R2 622000 11850000 33500000 18000000 21300000 14400000 14950000 20350000 R3 622000 10650000 32500000 22500000 19900000 12450000 14010000 10600000 Tabla 4. Número de bacterias a 156ppt. 28/08/2012 28/08/2012 29/08/2012 29/08/2012 30/08/2012 30/08/2012 31/08/2012 31/08/2012 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72h 84h R1 622000 3500000 5350000 7650000 4366666 7300000 7080000 7850000 R2 622000 3100000 5500000 7200000 3766666 3083333 4750000 6650000 R3 622000 3200000 5100000 7350000 5000000 6550000 3766666 5416666 Tabla 5. Número de bacterias a 208ppt. 28/08/2012 28/08/2012 29/08/2012 29/08/2012 30/08/2012 30/08/2012 31/08/2012 31/08/2012 01/09/2012 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72h 84h 96h R1 622000 1350000 1550000 3400000 3300000 6500000 6775000 10683333 6850000 R2 622000 1300000 2200000 2800000 5800000 6550000 7125000 11583333 9200000 R3 622000 1600000 2650000 4050000 4266666 3200000 2750000 6950000 6600000 Se calculó la velocidad específica de crecimiento (µ) mediante la fórmula: Dónde: X2= número de bacterias final X0= número de bacterias inicial T= tiempo transcurrido entre X2 y X0 Entonces se obtuvieron los datos presentados en la tabla 6. Tabla 6. Velocidad especifica de crecimiento (µ) para Agrobacterium sp. 104ppt 15,13 h-1 156ppt 13,89 h-1 208ppt 13,05 h-1 También fue calculado el tiempo de duplicación (td) en cada salinidad utilizando la fórmula: Y se obtuvo que: td 104ppt:0,046 días td 156ppt: 0,049 días td 208ppt: 0,053 días Se realizó una transformación a horas y se obtuvieron los datos presentados en la tabla 7. Tabla 7. Tiempo de duplicación (td) para Agrobacterium sp. td 104ppt 1,5 horas td 156ppt 1,11 horas td 208ppt 1,16 horas El gráfico de regresión realizado (Fig.4) muestra las etapas de la cinética de crecimiento para cada concentración de sales, en las que se observa las fases de adaptación, exponencial, estabilización y muerte. Para 104ppt a las 24 horas se observó un número máximo de 32 500 000 de bacterias, en 156ppt llegó a 7 400 000 bacterias a las 36 horas y a 208ppt llegó a un número máximo de 9 738 889 de bacterias a las 84 horas. 35000000 30000000 25000000 20000000 208ppt 104ppt 15000000 156ppt 10000000 5000000 0 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72h 84h 96h Figura 4.Cinética de crecimiento de Agrobacterium sp. También se realizó un gráfico de barras (Fig.5) en el cual se observa el incremento en el número de bacterias según las distintas salinidades presentando el mayor aumento a 104ppt. 35000000 NÚMERO DE BACTERIAS 30000000 25000000 20000000 208ppt 15000000 104ppt 10000000 156ppt 5000000 0 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72h 84h 96h HORAS Figura 5. Crecimiento de Agrobacterium sp. Se realizó la prueba de TUKEY en el programa Simfit staditics y se obtuvo los datos presentados en la tabla 8, donde tenemos que la columna uno corresponde a 104ppt, la columna dos a 156ppt y la columna tres a 208ppt. Los resultados obtenidos indican que entre las concentraciones de 156ppt y 208ppt no existe una diferencia significativa con una probabilidad de 0.96 Tabla 8. Prueba de TUKEY en la cinética de crecimiento para Agrobacterium sp. También se realizó la prueba de barras de error para determinar la variabilidad entre los tratamientos y sus resultados (Fig. 6) Figura 6. Diferencias entre las distintas salinidades En la figura 6 tenemos que el número 1.00 corresponde a 104ppt, el 2.00 corresponde a 156ppt y el 3.00 a 208ppt. Existe una diferencia amplia entre la media de 104 ppt con relación a las otras dos concentraciones y entre 156ppt y 204ppt la media alcanzada entre estas no tiene una diferencia grande. 6.5 Actividad enzimática Se tuvo como resultado el crecimiento de Agrobacterium sp. en todos los sustratos probados, pero solo hubo presencia de enzimas en el medio de producción para proteasas y caseinasas, obteniendo un tamaño de halo máximo para proteasas de 31,01mm de diámetro. A B Figura 7. Producción de proteasa por Agrobacterium sp. A) Halo enzimático B) Control Figura8. Producción de caseinasas por Agrobacterium sp. 6.6 Actividad enzimática a 104ppt y 156ppt Para la prueba de producción a distintas salinidades se seleccionó el sustrato de leche descremada (Proteasas), debido a que este sustrato presento mayor producción enzimática, como resultado se obtuvo presencia del halo de producción en la concentración de 104ppt con una medida máxima de 18.2 mm de diámetro a los cinco días, pero el halo se presentó luego de 48 horas de haber sido incubada la bacteria. Mientras que en el ensayo a 156ppt no se obtuvo un halo de producción pasado los cinco días. A B Figura 9. Proteasa producida por Agrobacterium sp. a 104ppt. A) Control B) Halo enzimático 7. DISCUSIÓN Narváez T. y Verónica E. (2007) indicaron la presencia de Agrobacterium sp. en las piscinas de ECUASAL, siendo este el lugar donde se obtuvo el actual aislado de la cepa Agrobacterium sp.; los resultados obtenidos en la presente investigación también concuerdan con que Agrobacterium sp. produce proteasas a partir de las 24 horas de haber sido inoculada. Se determinó que aumentando la salinidad del medio a 104 ppt. la producción de proteasas por Agrobacterium sp. empieza luego de 48 horas de haberse inoculado; presentando una disminución considerable al tamaño del halo observado a una salinidad de 70 ppt. que fue la idónea para la producción de proteasas. En esta investigación se obtuvo un número máximo de Agrobacterium sp. de 32.5x106, mientras que Cuervo R. y Durán J. (2010) presentaron un número máximo de crecimiento para Agrobacterium tumefaciens de 7.8x108 lo que indica una diferencia significa entre estas cepas y se podría deber a que no se llegó a saber si la bacteria con la que se realizó la presente investigación es la misma especie. Otra razón se debe a que Agrobacterium sp. se la aisló de un ambiente salino y A. tumefaciens es de ambiente mesófilo, lo cual también marca una diferencia en los resultados obtenidos. Cuervo R. y Durán J. (2010) realizaron la cinética de crecimiento de A. tumefaciens libre de concentraciones de sales; por lo cual en esta investigación Agrobacterium sp. obtuvo un crecimiento diferente debido a que las condiciones físico-químicas (altas concentraciones de sales y temperatura) fueron distintas. Los resultados obtenidos coinciden con los resultados descritos por Mendoza et. al. (2000) que las bacterias halófilas presentan producción de diferentes enzimas como en el caso de Agrobacterium sp. descrita en esta investigación. Sánchez et. al. (2004) determinaron que las bacterias halófilas son productoras de proteasas a distintas concentraciones de ClNa lo cual corrobora los resultados de nuestra investigación obteniendo resultados de producción proteolítica en concentraciones de hasta 104 ppt. Esta investigación contribuye al conocimiento de las propiedades de la cepa Agrobacterium sp. de las lagunas de ECUASAL y su eventual uso para producción de enzimas proteolíticas a distintas concentraciones de ClNa. 8. CONCLUSIÓN Agrobacterium sp. se encuentra presente en las salinas de ECUASAL como bacteria halotolerante, debido a su crecimiento normal y continuo hasta una salinidad de 156ppt valor aproximado a tres molar de ClNa. También se determinó que para Agrobacterium sp. la velocidad de crecimiento (µ) es de 13-15 h-1 y el tiempo de duplicación (td) es de 1.2 a 1.5 horas. Se determinó que no existe variación significativa entre el número de bacterias obtenidas a una salinidad de 156ppt y 208 ppt, mientras que a 104ppt si existe una diferencia significativa, obteniendo así un mayor número de bacterias en menor tiempo. También se observó que Agrobacterium sp. es productora de proteasas y caseinasas y que a una concentración de sales de 104ppt y 30°C su producción de proteasas es menor a la alcanzada a 70 ppt. 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Breed, R. Murray, E. Nathan R. 1957. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Seventh edition Baltimore the Williams &wilking company. pp. 288289. 2. Chada V. y Patel B. K. C. 2008. Extremozymes belonging to Glycosyl Hydrolase family from Halothermothrixorenii (an extremophilic bacteria). 7th International Symposium for Subsurface Microbiology.Shizuoka, pp. 73. 3. Cowan ST. 1974. Cowan and Steel`s manual for identification of medical bacteria, ed. Cambrige: Cambrige University Press, pp. 26-27. 4. Cuervo R. y Durán J. 2010. Resistance of the Yuca (Manihot Esculenta Crantz) to the White Fly (Aleurotra-Chelus Socialis) by Means of the Technology of the ADN. Revista Científica Guillermo de Ockham. 9 (1): pp 83-91. 5. Gnanados J. 2006. Microbial diversity with potential for application in biotechnology.Plant Biology and Biotechnology. pp. 60: 80-90. 6. Kamekura, M., Hamawata, T., Onishi, H. 1982. Application of halophilic nuclease H from Micrococcus varians subs. halophilus to commercial production of flavoring agent 5´-GMP.ApplEnvironMicrobiol. pp. 44: 994-5. 7. Mendoza et. al. 2000. Producción de enzimas extracellares por bacterias aisladas de invertebrados marinos. Revista Peruana de Biología 7 (2). 8. Narváez Terán, Verónica Elizabeth. 2007. Aislamiento e identificación de bacterias aerobias halófilas con actividad proteolítica procedentes de piscinas de la industria de sal ECUASAL localizada en Santa Elena - Ecuador. Facultad de Ingeniería en Biotecnología. ESPE. Sede Sangolqui. 9. RHRAP. (2009) [<www.whsrn.org/es/perfil-de-sitio/lagunasdeecuasal>].[Visitado el día 15-03-2012]. 10. Rodriguez-Valera F. et. al. 1981. Characteristic of the heterotropic bacterial population in hypersaline enviroments of different salt concentrations. MicrobEcol. 7(3): pp 235-43. 11. Rodríguez –Valera, F. 1993. Introduction to saline environments. En R.H. Vreeland y L. Hochstein (Eds.).The Biology of Halophilic Bacteria.Boca Raton: CRC Press. pp. 1-23. 12. Sánchez et. al. 2004. Extracellular proteases produced by marine bacteria isolated from sea water contaminated with fishing effluents. Revista Peruana de Biología 11(2): pp 179-186. 13. Sánchez-Porro C. et. al. 2003. Diversity of moderately halophilic bacteria producing extracellular hydrolytic enzymes.JApplMicrobiol. pp. 295-300. 14. Van den Burg, B. 2003. Extremophiles as a source for novel enzymes. Current opinion in Microbiology. 6: pp. 213-218. 15. Ventosa, A., Nieto J., Oren A. 1998. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. MicrobiolMolBiol Rev. 62(2): pp. 504-44. 16.[<http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.20Cultivo%20de%20m icroorganismos.pdf>]. [Visitado el día 15-03-2012].