Download Expresion y funcion DAT

SOCIEDAD MEXICANA DE BIOQUÍMICA, A C.
XXVII
CONGRESO NACIONAL
EXPRESION Y FUNCION DEL TRANSPORTADOR DE DOPAMINA EN CORAZÓN DE COBAYO;
ESTUDIO COMPARATIVO CON LOS TRANSPORTADORES DE NOREPINEFRINA Y COLINA.
Reynoso Palomar A. R.1 De la Cruz López F2. Chagoya de Sánchez V3, Martínez Pérez L3. Gómez
Villalobos M.J.1
1
Instituto de Fisiología, BUAP. 14 sur # 6301, Col. San Manuel. CP.72570, Tel.2295500 ext. 7308,
Fax. 01-222-233-4511 [email protected] [email protected] 2Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, IPN. Prol. Carpio y Plan de Ayala, México, D.F.11340. Tel.(5)729-6300 ext.
62350. Fax. (5)7296210 [email protected]. 3 Instituto de fisiología Celular UNAM, Edificio principal
Sur-305. Cir. Ext S/N, Ciudad Universitaria, Del. Coyoacán. CP.04510 México DF. Tel (52)56125614,
Fax (52)56162282. [email protected], [email protected].
RESUMEN. El transpordator de dopamina (TD) es un mecanismo de transporte especializado, que
regula la concentración de dopamina en la sinapsis. Su existencia en corazón es cuestionada y por
lo tanto la neurotransmisión dopaminergica. En este trabajo se estudio por métodos fisiológicosfarmacológicos y de western blot la presencia del transportador de dopamina (TD) en el corazón de
cobayo, y en forma comparativa los transportadores de noradrenalina (TNA) y colina (TC), para
demostrar la existencia la neurotransmisión dopaminérgica en el corazón de cobayo. METODOS Los
estudios se realizaron en corazones aislados de cobayos machos con peso promedio de 300 ± 15
gramos. Se realizaron curvas dosis respuesta (10-8 a 10-5 M), evaluando la frecuencia cardíaca y la
dP/dtmax, del corazón aislado, de acuerdo al sistema de Langendorff, con agonistas de la
neurotransmisión dopaminérgica, noradrenérgica y colinérgica (±7-OH-DPAT, noradrenalina y
acetilcolina) respectivamente, así como, con inhibidores de los transportadores de cada
neurotransmisor; nomifensina, nisoxetina y vesamicol, respectivamente. Los estudios de western blot
se realizaron usando anticuerpos selectivos para el TD (AB1591P), TNA (AB5066P) y TAC
(MAB5420), y se determino la expresión de los transportadores respectivamente en los tejidos
cardíacos. RESULTADOS El uso de inhibidores selectivos de los transportadores de dopamina
(nominfensina), noradrenalina (nisoxetina) y de colina (vesamicol)(10-8 a 10-5 M, respectivamente)
produjeron efectos similares a los efectos de los agonistas de los neurotransmisores
correspondientes, (7-OH-DPAT, noradrenalina y acetilcolina) en los parámetros de frecuencia
cardiaca y dP/dtmax. El 7-OH-DPAT, la nominfensina, el vesamicol y la acetilcolina indujeron un efecto
cronotrópico e inotrópico negativos. La noradrenalina y nisoxetina produjeron un efecto estimulatorio
en los parámetros estudiados, sin embargo nisoxetina indujo un efecto dual en relación a la dosis
usada; a concentración nanomolar produjo un efecto estimulatorio y a concentración micromolar un
efecto depresor, sugiriendo mecanismos de acción adicionales del fármaco. Los estudios de western
blot, muestran la expresión del transportador de dopamina de noradrenalina y de colina en los cuatro
tejidos cardíacos (aurícula derecha e izquierda y ventrículo derecho e izquierdo) con bandas de 70,
54 y 50 KDa, respectivamente. CONCLUSION. Los estudios realizados demuestran la presencia del
transportador de dopamina en los tejidos cardíacos, constituyendo un fuerte argumento para apoyar
la existencia de la neurotransmisión dopaminérgica en el mismo y sugiriendo su participación
conjunta con la neurotranmisión noradrenérgica y colinérgica en la regulación de las funciones del
órgano.
ANTECEDENTES
La recaptura de neurotransmisores se realiza a través de bombas recaptadoras o
transportadores, proteínas ubicadas principalmente en la membrana de los telodendrones y del
soma de la neurona, recientemente ha sido corroborado por diverso estudios que los
transportadores, son importantes reguladores de la concentración extracelular del
neurotransmisor y que por lo tanto puede determinar las acciones de los mismos en las células
blanco. La neurotransmisión dopaminérgica (NT-DA) mediada por la dopamina participa
fundamentalmente en la regulación de las funciones del sistema nervioso central. Sin embargo
existen amplias evidencias experimentales que sugieren la presencia de la NT DA en el sistema
cardiovascular (Missale et al 1988, Amenta et al 1993). Deterding y cols 2001, mencionan la
presencia del transportador de dopamina (DAT) en corazón de humano, realizando un estudio
de la estimación de dosis equivalentes efectivas y dosis para órganos específicos, para la
determinación de la biodistribución y dosimetría de radiación del DAT (Ligando [18F] FECNT).
Previamente publicamos información relevante acerca de la presencia de receptores
dopaminérgicos D3 y D4 en el corazón de cobayo, elementos de la NT-DA, así como sugerimos
su probable participación funcional (Gómez et al 2002). En este trabajo nos proponemos
estudiar a través de estudios fisiológicos- farmacológicos y de western blot, la expresión y la
participación funcional del transportador de dopamina en los tejidos cardiacos del corazón de
cobayo. Simultáneamente se estudio en forma comparativa, al transportador de noradrenalina y
de acetilcolina.
HIPOTESIS:
El Transportador de dopamina esta presente en terminales nerviosas del corazón de
cobayo y forma parte estructural de un sistema de neurotransmisión dopaminérgica en el
mismo.
OBJETIVO GENERAL
1 – Demostrar la presencia estructural y funcional del transportador de dopamina en el corazón
de cobayo
OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Realizar curvas dosis-respuesta con los agonistas de la neurotransmisión dopaminérgica (7OH-DPAT), noradrenérgica (noradrenalina) y colinérgica (acetilcolina)(10-8 a 10-5 M), evaluando
las funciones de automatismo (frecuencia cardíaca) y contractilidad (dP/dtmax) en el corazón
íntegro de cobayo y en la frecuencia espontánea de aurícula derecha aislada de cobayo.
2.- Realizar curvas dosis-respuesta con los antagonistas de los transportadores de
noradrenalina (Nisoxetina), de colina (Vesamicol) y de dopamina (Nominfensina) (10-8 a 10-5 M)
evaluando las funciones de automatismo (frecuencia cardíaca) y contractilidad (dP/dtmax) en el
corazón íntegro de cobayo y en la frecuencia espontánea de aurícula derecha aislada de
cobayo.
3.- Realizar estudios de expresión de los transportadores de dopamina, noradrenalina y colina a
través de western blot en los tejidos del corazón de cobayo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Todas las sustancias químicas empleadas fueron de Sigma (St Louis, Mo, USA). Todos los
procedimientos se efectuaron utilizando cobayos (Hartley) machos de 250–300 g, proporcionados
por el Bioterio “Claude Bernard” de la B.U.A.P.
Estudios Fisiológicos-Farmacológicos en corazón íntegro y en aurícula derecha.
Los animales (n=8 por protocolo), fueron anestesiados con Pentobarbital sódico (0.40g/Kg/ip.), el
corazón se extrajo y se colocó en un sistema de perfusión retrógrada de acuerdo a Langendorff, y
fueron prefundidos con solución de Krebs-Henseleit (composición en mmol/l: 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.66
MgSO4, 24.88 NaHCO3, 1.18 KH2PO4, 5.5 glucosa, 2.0 Piruvato de Sodio, 2.52 CaCl2, 0.027 EDTA a
37 ºC) y gas carbógeno 95 % (O2) y 5 % (CO2) a un flujo continuo (10 ml / min) generando una
presión de perfusión coronaria de 40 mm Hg. Se registro la actividad eléctrica con registro del
electrocardiograma a través de la inserción de electrodos unipolares en ventrículo derecho, y la
actividad mecánica a través del registro de la dP/dt máx obtenida de la presión sistólica del ventrículo
izquierdo. Las señales se registraron a través de un polígrafo GRASS modelo 79D de 8 canales y
registradas por computadora a través del sistema ADC11 de Pico Technology, LTD. Previa
estabilización de la preparación durante 30 minutos se realizaron curvas dosis respuesta de todos los
fármacos (10-9 a 10-5M) durante 20 minutos cada concentración. Los resultados se expresan como el
promedio ± el error estándar (SEM), en valores absolutos y/o porcentualizados. Posteriormente los
resultados entre los diferentes grupos de estudio se analizaron por el método de ANOVA de una vía,
y se aplicó la prueba de Dunnet. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo.
Estudios de Western Blot
Se utilizaron anticuerpos contra los transportadores de Dopamina (Rabbit Anti-Dopamine Transporter
policlonal antibody AB1591P), Norepinefrina (Rabbit Anti-Norepinephrine Transporter policlonal
antibody AB5066P) y de Colina (Mouse Anti-High Affinity Choline Transporter Monoclonal antibody,
MAB5420, todos de Chemicon-Millipore, Temecula, CA, USA). Una vez obtenidos los corazones
(n=4 por transportador) se lavaron y se congelaron en solución de 2-metilbutano/hielo seco para
mantenerlos en congelación a -80°C hasta su empleo. La purificación de los transportadores
membranales se realizó con base en los protocolos modificados de Selinsky y de Janson y Ryden,
brevemente se separaron los tejidos cardíacos, se trituraron y se colocaron en buffer de lisis
(1g/10ml) (Tris HCl. PH 7.4 = 5mM, EDTA 2mM, Benzamidina 10mg/ml, Aprotinina 5mg/ml,
Leupeptina 5mg/ml). Los tejidos se homogenizaron por separado en politrón a 40,000 rpm., por 20
segundos. Después de centrifugaciones se resuspendió cada pellet en 100 µl de buffer de
resuspensión (75mM Tris-HCl PH 7.4, 12.5 mM MgCl, 5 mM EDTA) y se hicieron 2 alícuotas de 50µl
c/u; una para congelación a -80°C y la otra para determinación de proteína (Bradford) y electroforesis
de proteínas en gel de SDS-acrilamida 10%. Se incubo la proteína con anticuerpo primario (dilución
1:400) durante 12 horas en cuarto frío; y después con anticuerpo secundario (dilución 1:3000)
(antiperoxidasa) por 1 hr, se marcaron con luminol y se expusieron a placa radiográfica para finalizar
con su revelado.
RESULTADOS
Estudios Fisiológicos-farmacológicos en corazón íntegro y en aurícula derecha.
En los protocolos experimentales el uso de agonistas de la neurotransmisión noradrenérgica,
dopaminérgica y colinérgica (noradrenalina, (±)-7-OH-DPAT y acetilcolina, respectivamente 10-8 a 10-5
M), se observaron los efectos esperados en la frecuencia cardíaca (TABLA 1) y en la dP/dtmax.; un
efecto cronotrópico e inotrópico positivo con la noradrenalina, y un efecto cronotrópico e inotrópico
negativo con el (±)-7-OH-DPAT y la acetilcolina. El uso de inhibidores de los transportadores de
noradrenalina, dopamina y acetilcolina (nisoxetina, nominfensina y vesamicol, respectivamente 10-9 a
10-5 M), indujeron efectos similares, al agonista del neurotransmisor correspondiente excepto por la
nixocetina. Con la nisoxetina en lugar de obtener un efecto estimulatorio predominante, se observo
un efecto dual, cronotrópico positivo a concentración nanomolar (12 % de incremento en la frecuencia
cardíaca) y cronotrópico e inotropico negativo a concentración micromolar. (TABLA 1). Los resultados
relacionados con la frecuencia de disparo de la aurícula derecha fueron muy similares a los
observados en el corazón íntegro. Sin embargo el efecto cronotrópico negativo de la nominfensina,
fue discretamente mayor TABLA1, sugiriendo una mayor distribución del transportador de DA en
tejido auricular. Por otro lado el efecto cronotrópico negativo de la nisoxetina fue menor, sugiriendo la
predominante distribución ventricular del transportador de noradrenalina.
Parámetros
Valores
Control
Noradrenalina
-5
(10 M)
Nisoxetina
-5
(10 M)
(±)-7-OH-DPAT
-5
(10 M)
Nomifensina
-5
(10 M)
Acetilcolina
-5
(10 M)
Vesamicol
-5
(10 M)
Frecuencia
Cardiaca
(latidos/min)
240 ± 16
100 %
**332 ± 24
152 % (↑ 52 %)
**178 ± 24
66 % (↓ 44 %)
**176 ± 26
73 % (↓ 27 %)
*208 ± 18
88 % (↓ 12 %)
**168 ± 18
53 % (↓ 47 %)
**188 ± 18
64 % (↓ 36 %)
dP/dt max
(mmHg/seg)
1800 ±
420
100 %
1760 ± 350
145 % (↑ 45 %)
1260 ± 350
72 %(↓ 28 %)
1600 ± 560
88 %(↓ 12 %)
*1400 ± 320
74 % (↓ 26 %)
*1400 ± 320
74 % (↓ 26 %)
*1400 ± 320
74 % (↓ 26 %)
Frecuencia
Auricular
(latidos/min)
180 ± 16
100 %
**232 ± 24
135 % (↑ 35 %)
*156 ± 24
84 % (↓ 16 %)
*148 ± 26
82 % (↓ 18%)
*146 ± 18
78 % (↓ 22 %)
*112 ± 18
59 % (↓ 41 %)
*168 ± 18
87 % (↓ 13 %)
Tabla 1. Se muestra el efecto máximo de los fármacos usados en los parámetros estudiados. *p<
0.05, **p<0.01, en relación a los valores basales en cada protocolo.
Estudios de Western Blot
Los resultados se muestran el en la figura 1, en donde se corrobora que todos los tejidos cardiacos
expresan a los tres transportadores. Las bandas correspondientes para cada transportador fueron
concordantes con lo reportado en la literatura, (Brandon et al 2004, Melikian et al 1994, Yan et al 2002).
AD
AI
KDa
VD VI
AD
AI
KDa
TD
AD
AI
VD
VI
75
50
50
50
VI
KDa
75
75
VD
TNA
TAC
Figura 1. Imagen representativa de los resultados de Western blot del transportador de dopamina
(TD), del transportador de norepinefrina (TNA) y del transportador de colina en el corazón de cobayo,
con un peso molecular de 70KDa, 54 KDa y 50 KDa, respectivamente. AD-auricula derecha, AIaurícula izquierda, VD-ventrículo derecho y VI-ventrículo izquierdo. Para cada transportador el
estudio se realizó por cuadruplicado.
CONCLUSIONES
Los estudios realizados demuestran la presencia del transportador de dopamina en los tejidos
cardíacos, constituyendo un fuerte argumento para apoyar la existencia de la neurotranmisión
dopaminérgica en el mismo y sugiriendo su participación conjunta con la neurotranmisión
noradrenérgica y colinérgica en la regulación de las funciones del órgano.
Referencias
Amenta F, Gallo P, Rossodivita A y Ricci A (1993) Radioligand binding and autoradiographic analysis of
dopamine receptors in the human heart. Nauny-Schmiedberg`s Pharmacol. 347:147-154.
Deterding T A, Votaw JR, Wang CK, Eshima D, Eshima L, Keil R, Malveaux E, Clinton DK, Goodman
MM and Hoffman JM (2001) Biodistribution and Radiation Dosimetry of the Dopamine Transporter Ligand
[18F]FECNT. J Nuclear Med 42(2):376-381.
Missale C, Castelletti L, Mema M, Carruba OM and Spano P (1988) Identification and characterization of
postsynaptic D1 and D2 dopamine receptors in the cardiovascular system. J Cardiovasc Pharmacol.
11:643-650.
Gómez MJ., Rousseau G., Nadeau R., Berra R., Flore G and Suárez J: Functional and autoradiographic
characterization of dopamine D2-family receptors in the guinea pig heart.. Can J Physiol and Pharmacol
2002, 80(6):578-587.
Brandon PE, Mellot T, Pizzo PD, Coufal N, D’amour AK, Gobeske K, Lortie M, López-Coviella I, Berse B,
Thal JL, Gage HF and Krzystof BJ (2004) Choline Transporter 1 Maintains Cholinergic Function in
Choline Acetyltransferase Haploinsufficiency. J Neurosci 24(24): 5459-5466.
Yan Qu H, Kline EA, Ma XL, Youming D and Eduard C (2002) Traumatic brain injury reduces dopamine
transporter protein expression in the rat frontal cortex. Neurochem LW & W 13(15): 1899-1901.
Melikian EH, McDonald KJ, Gu H, Rudnick G, Moore RK and Blackely DR (1994) Human
Norepinephrine Transporter. Biosynthetic Studies Using A Site-Direct Polyclonal Antibody. J Biol Chem
269(16):12290-12297.