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Evolución de las herramientas del
Laboratorio en el diagnostico de
enfermedades infecciosas
Patricia Bravo
Asesoria Microbiología
Enfermedades infecciosas y
Microbiología
El hombre ha evolucionado también los
microbios, de ahí la necesidad de Innovar
y avanzar
Enfermedades infecciosas causa
muerte 24%
Cuatro Etapas de la Microbiología
Primer periodo, especulativo, antigüedad a los
primeros microscopistas.
Segundo periodo, lenta acumulación de
observaciones (desde 1675 aprox. hasta mitad
del siglo XIX), inicia con descubrimiento de
Leeuwenhoek.
Tercer periodo, de cultivo de microorganismos,
llega hasta finales del siglo XIX, Pasteur y Koch
posicionan Microbiología como ciencia
experimental.
Cuarto periodo (inicios siglo XX hasta nuestros
días), estudio de microorganismos por fisiología,
bioquímica, genética, epidemiología; Surgimiento
de microbiología especializada (Virología,
Inmunología, etc), inclusión de microbiología
como Ciencia Biológica.
Microbiología Clínica ¿Que nos
espera?
Necesidad:
Rapidez en Diagnóstico
Mayor estandarización
Capacidad respuesta a nuevos desafíos:
agentes de bioterrorismo y patógenos
emergentes.
Costo razonable
Presentación unitaria
Pruebas en la misma consulta médica o “pie de
cama”, fuera del laboratorio.
Sensibilidad, especificidad, valor predictivo
positivo y negativo.
¿Que se espera de Resultados de
microbiología?:Obtener un organismo
"culpable", la visualización.
◦ Confirmación de diagnostico clínico:
Identificación del agente
Detección Serológica
◦ Identificación de cepa/aislamiento/subtipo
◦ Caracterización de sensibilidad a antimicrobianos.
◦ Identificación de sero-conversiones o portadores
en la población.
◦ Colección de datos epidemiológicos
PACIENTE SOSPECHOSO DE
ENFERMEDAD INFECCIOSA
RUTA MICROBIOLOGICA
RUTA INMUNOLOGICA
Sangre, Heces
Orina
Biopsia de Tejido
Escobillón secreción
MICROBIOLOGIA CONVENCIONAL
Cultivo enriquecido,
Selectivo,
Medios diferenciales
Muestra de Sangre
(Búsqueda de Ac contra
patógeno sospechoso
MICROBIOLOGIA
MOLECULAR
Búsqueda e identificación
del Genoma del patógeno
Por Hibridación Acido
Nucleico PCR
Susceptibilidad antibiótica
Aislamiento en cultivo Puro
Identificación, con ensayos
Cultivo Dependientes,
Identificación Inmunológica,
Identificación Molecular
Susceptibilidad
Antibiótica
(Decisión en eficacia de
Terapia)
Inmunológica (Búsqueda de
patógenos microbianos
o partículas virales)
Anticuerpos Fluorescentes
Ensayos de Anticuerpos
(Aglutinación, RIA, ELISA)
Métodos disponibles en microbiología:
tradicionales y modernos
◦ Microscopia: Tinciones. – Cultivo
◦ Métodos Bioquímicos: Identificación Fenotípica y
Susceptibilidad Antimicrobiana
◦ Métodos inmunológicos
◦ Métodos Moleculares en bacterias, virus, hongos.
Microscopia: Tinciones. - Cultivo
Características microscópicas:
◦ Estudio microscópico en fresco
◦ Tinciones: forma, agrupación, estructura y tamaño.
Tinciones primarias: Gram y Ziehl Neelsen.
Microscopia óptica, electrónica, de barrido,
fluorescente, campo oscuro.
Microscopia: Tinciones. - “Cultivo”:
◦ Características fenotípicas: tamizaje primario:
Gram, morfología en cultivo, catalasa, oxidasa,
atmosfera de crecimiento, movilidad, medios
de cultivo básicos, selectivos y diferenciales.
◦ Pruebas secundarias: Determinar género del
microorganismo. Cultivos medios especiales,
oxido-fermentación, producción de esporas,
fermentación de glucosa y pruebas primarias.
Métodos Bioquímicos: Identificación
Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana
Métodos Bioquímicos: Identificación
Fenotípica y Susceptibilidad Antimicrobiana
ID y sensibilidad
automatizada:
bioquímicas, ABO por
MIC. Mecanismos de
resistencia. Aplicación de
marcadores
epidemiológicos.
Datos analizados en un
ordenador, que
proporciona, la
identificación del
microorganismo y
antibiograma.
Automatización Hemocultivos
Bactec 9000
BD
BacTAlert 3D
BioMerieux
Versa Trek
Trek Diagnostic System
Sistema
Tecnología
Sistema detecta producción
de CO2 por fluorescencia
Medición de produccion
de CO2 por colorimetria
Sistema con detección de gases
orgánicos (02, CO2, N2,H2), por
cambios de presión.
Conección a
LIS
Si por EpiCenter
Si con Copernico
Si, no opcion manejo de curvas.
Control de
calidad
Automatico
Semi-Automatico
ND *
Neutralización
de antibioticos
Resinas polimericas de
intercambio iónico y
cationico.
Carbón activado y tierra
de Neón
Solo inhibe aminoglicosidos
Interferencia
Coloración de
Gram
Las particulas de resinas no
interfieren en la coloración.
Interferencia en las
botellas FAN
No inteferencia.
Métodos inmunológicos
- Aparición precoz de IgM persiste poco
tiempo. Indica infección en fase aguda.
(No siempre es detectable).
- Aparición más tardía de IgG, persiste a
altas concentraciones periodos
prolongados y en ocasiones de por vida.
Ayuda detección de seroconversión .
Permiten diagnósticos indirectos y
estudios epidemiológicos.
Métodos inmunológicos - diagnostico
indirecto:
-Cultivos negativos: Tratamiento ABO o agente
no es cultivable.
-Toma de muestra tardía el patógeno ya no se
recupera.
-En fases sub-agudas microorganismos son
difíciles de recuperar.
-Interpretación de un aislamiento en portadores
sanos difícil.
- Casos atípicos o asintomáticos.
-En los casos de aislamientos mixtos
Ventajas de los métodos tradicionales
◦ Pueden captar todo lo que crece, mejor detección
de infecciones mixtas
◦ Sensibilidad de los métodos establecida
◦ Organismos viables pueden ser recuperados
Desventajas de métodos
tradicionales
Labor intensiva
Costoso
Toma tiempo: lento
Una actividad ‘habilidad’ dependiente de
operador
Resultados pueden no tener una
identificación definitiva.
Métodos Moleculares en bacterias,
parásitos; virus, hongos.
Métodos Moleculares en bacterias,
parásitos, virus, hongos.
Aplicación:
• Cepas escasa descripción,
Nuevos patógenos
• Cepas baja frecuencia de
aislamiento
• Cepas con fenotipos atípicos
• Cepas difícil identificación
fenotípica
• Cepas de crecimiento lento o
fastidioso
• Bacterias de difícil cultivo
• Antibioticoterapia
• Bacterias de impacto
comunidad
Tomado de Rodicio M, Mendoza MC. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2004
Biología Molecular:
Evolución de métodos analíticos
1993
2000
2008
GeneXpert
TIEMPOS DE METODOS DIAGNOSTICOS
Tiempo de
diagnostico
1 – 7 dias
Sensibilidad
Alta*
Alta**
- Hibridizacion
3 – 4 hrs
Alta1
Buena
- PCR
3 – 4 hrs
Alta2
Buena
30 min
Baja3
Alta
3 – 5 hrs
Buena4
Alta
- ELISA
3 – 4 hrs
Alta
Baja
Immunofluorescencia
- Immunoblot
2 – 4 hrs
Bueno
Buena
2 – 4 hrs
Bueno
Buena
- Neutralizacion
4 – 7 dias
Bueno
Alta
- HIA
2 – 4 hrs
Baja
Buena
Deteccion Virus
- Aislamiento virus
MicroscopiaElectronica
- ELISA de captura
Especificidad
Serologia
1
ca. 104 part/ml,
2
ca. 200 genoma equival/ml,
3
4
≥ 106 particula/ml,
ca. 0.01 µg antigeno/ml
* Dependiendo del
sistema de cultivo
** Dependiendo del
sistema de deteccion
Prof. Matthias Niedrig, RKI
Diagnostico Molecular – Pruebas
basadas en ácidos nucleicos
Amplificación (e.j. PCR): obtiene gran numero de
copias de un gen.
No requiere organismos viables
Puede ser muy sensible – pero sujeto a
contaminación
Por su rapidez requiere una secuencia blanco del
gen conocida
Por lo tanto se pueden perder los desconocidos
Pruebas Moleculares están restringidas a
detección (cualitativa), cuantificación (carga viral)
y genotipificacion.
Diagnostico Molecular: Técnicas
1. Enzimas de restricción
2. Técnicas de separación electroforética
de ácidos nucleicos
3. Hibridación de ácidos nucleicos
4. Amplificación enzimática del ADN
(PCR)
5. Microarreglos
6. Espectrometría de masa
Enzimas de restricción: ER
El actual aislamiento de ADN es sencillo involucra
la ruptura de las células y la posterior purificación
del componente de ADN.
◦ ER son Proteínas que reconocen secuencias
especificas del ADN, con actividad de endonucleasas
(hacen cortes secuenciales específicos de nucleótidos
en ambas hebras del DNA).
◦ Sitio de Restricción es la secuencia de nucleótidos en
una pieza de DNA que una enzima de restricción
corta.
Técnicas de separación electroforética
de ácidos nucleicos
Electroforesis en Gel
◦ Técnica mas utilizada para estudio de
macrocromoleculas: proteínas y ácidos nucleicos
◦ Moléculas cargadas pasan a través del gel de agarosa
o polímeros de poliacrilamida para ser separadas:
Las moléculas mas grandes o mas difusas se mueven mas lento,
tienden a quedarse colgadas en la matriz del gel.
Moléculas con grandes cargas se mueven mas rápido debido al
voltaje eléctrico que es empleado para empujar a las
moléculas a través del gel.
Hibridación de ácidos nucleicos
La doble cadena en ADN es separada mediante
un proceso físico (calor) o químico (como soda
cáustica).
Las dos hebras complementarias se separan, el
ADN se desnaturaliza.
Una muestra de cadenas simples (o
desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra
de cadenas simples.
La muestra combinada se enfría lentamente, las
moléculas sencillas se van emparejando por las
zonas complementarias se va formando una
nueva molécula hibridada
Hibridación de ácidos nucleicos
Los métodos utilizan una cadena sencilla de
ADN marcada por un método físico-químico,
bien sea con Radioactividad o con
Fluorocromos. Esta cadena tiene una
Secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza
como SONDA para detectar otras moléculas
de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia
parecida.
Dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos
que se usan en los laboratorios de biología
molecular:
◦ Método tipo Southern o Southern blot: ADN
◦ Método tipo Northern o Northern blot: ARN
Hibridación de ácidos nucleicos: PCR
La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, se
basa en secuenciación de una fracción especifica de
DNA, utiliza hibridación de oligonucleotidos para
completar el proceso.
Amplificación : Entre la desnaturalización de hebras de
ADN y antes de extensión del cebador hay una unión
de los cebadores a la hebra de secuencia
complementaria mediante una hibridación de ADN. Esto
marca la especificidad de la reacción.
16S
Utilidad de PCR- RT Virologia
Una infección viral Severa puede ser detectada
en fase aguda en muestras de sangre o del sitio
de infección.
Algunos virus humanos incluyen:
HPV, Citomegalovirus, Herpes Simple virus,
Rotavirus,Virus Influenzae A, B, H1N1,
Enterovirus
Sub-tipificación o Cuantificación Viral – HSV,
HPV, HCV
Utilidad de PCR- RT: Bacteriología
Resultados de Microscopia dan falsos positivos:
- T.vaginalis, N.gonorrhoeae
Patógenos Intracelulares – virus, Mycop.genitalium
Baja Sensibilidad
– Chlamydia sp.,Neisseria sp.
Seropositividad es común – Chlamydia sp.
Crecimiento del Microbio es lenta – M. tuberculosis
Cuantificación de expresión genes
Medir Eficacia de la antibioticoterapia
Genotipificacion
Métodos de tipificación Genotípica
Metodos
basados en Fingerprint
Perfil Plasmido, RFLP(restriction
fragment length polymorphism),
PFGE, AFLP
Metodos basados Character
MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis),
ribotyping (fragmentos de restriccion
que contienen todos o parte de los
genes codificando para el rRNA 16S y
23S), microarreglos
Metodos basados en Secuenciacion
◦ MLST
◦ SNP=single nucleotide polymorphism
typing
Minimum spanning tree of 240
strains Salmonella Enteritidis by
MLVA
Tipos MRSA con PFGE & MLST
PFGE
McDougal LK et al, 2003, J Clin Microbiol 41:5113-20
Microarreglos - Microarrays
Los chips o arrays de ADN son sondas moleculares fijadas y
ordenadas sobre un soporte sólido nitrocelulosa, nylon o
portaobjetos con residuos de polilisinas en disposición regular y
prefijada.
Las sondas, pueden ser clones de ADN, ARN, productos de PCR u
oligonucleotidos sintéticos y previo a la hibridación se marca con
una sustancia fluorescente o radiactiva.
La principal ventaja: en una única prueba pueden detectarse miles
de genes.
Aplicación de arrays en microbiología clínica es escasa: a) patogenia
bacteriana; b) análisis de evolución bacteriana y epidemiología
molecular; c) mecanismos de acción y de resistencia antibiótica. d)
diagnóstico microbiológico de las enfermedades infecciosas.
DESARROLLO MICROARRAYS
Espectrometría de masa
Identificación bacteriana mediante espectrometría de masas
(MALDI-TOF)
Se emplea un espectrómetro de masas, para generar un perfil proteico
(“huella química”) que es una representación gráfica, por orden creciente
de masa frente a la abundancia relativa de las proteínas del
microorganismo.
Característico de cada microorganismo.
a.i.
1400
1200
1000
800
600
400
200
4000
6000
8000
10000
12000
14000
m/z
Espectrometría de masa
Veamos un Ejemplo:
Tuberculosis - TBC
PROCEDIMIENTO
TECNICAS
EXAMEN DIRECTO
Coloración de Kinyoun
Coloración de ZiehlNeelsen
TIEMPO DEL
REPORTE DESDE EL
DIA EN QUE SE
PROCESA LA
MUESTRA
2- 24 HORAS
DETECCION DE
CRECIMIENTO
Lowestein-Jensen
Ogawa- Kudoh
20-25 DÌAS
IDENTIFICACIÓN DE
LA ESPECIE
Pbas bioquímicas
tradicionales (Niacina,
Catalasa, Red. Nitratos)
50-55 DIAS
PRUEBAS DE
SENSIBILIDAD
Método proporciones
múltiples
60 DIAS
Tuberculosis - TBC
Microscopía Ziehl Neelsen:
Baja Sensibilidad 70 a 80%,
OMS recomienda 2 o 3 frotis de muestras del caso sospechado
Requiere un técnico capacitado
Laborioso: 1-2 horas
Overall Sensitivity of AFB smear: 22-80%
Tuberculosis - TBC
Coloraciones fluoro cromáticas: Auramina O – Rodamina
2.15 hr.
Inmunológicas: ADA, Prueba de Interferón Gamma
Quantiferon TB: ensayo de liberación de cito quinas.
Overall Sensitivity of AFB smear: 22-80%
Tuberculosis - TBC: Cultivo
Cultivo Medio cultivo
convencional:
◦ Altamente sensible
◦ Lento: 4 a 6 semanas
Tuberculosis - TBC: Cultivo 15-18 dias
MGIT 960
Positive
Average TTD: 7days
Tuberculosis - TBC: Identificación fenotipica:
50 a 55 dias
Tuberculosis – TBC: Susceptibilidad 30
dias
Medio Solido
MGIT 960
1. Conc. Absoluta
2. Metodos Proporciones
3. Radio Resistencia
Average TAT: 8 wks
2-3 weeks
Método MODS :
(Méétodo Susceptibilidad Directa por
(M
Observacióón Microscó
Observaci
Microscópica)
J. Clinic. Microbiol. p. 1093–1097 Vol. 45, Nº4
Evaluation of Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay for detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium
tuberculosis.
Girum Shiferaw, Yimtubezinash Woldeamanue Mekdes Gebeyehu, Feven Girmachew, Daniel Demessie, and Eshetu Lemma
Tuberculosis – TBC: Molecular 2 hrs
a 2 dias
Métodos de Amplificación de Ácidos Nucleicos:
- Gen-Probe AccuProbe®
- GeneXpert - PCR
- HPLC (hrs)
- HAIN
Altamente específicos.
En muestras Clínicas desempeño variable:
Altamente sensible en muestras
positivas por frotis (95-100%)
Hasta ahora, no tan sensible en muestras
negativas por frotis (60-75%)
Muy sensible en cultivo :
Para identificación
Para susceptibilidad a
medicamentos
Identificación correcta por HPLC de
M. tuberculosis según diferentes
autores
REFERENCIA
NO CEPAS
EVALUADA
S
No. confir.
HPCL
CONCOR.
( %)
1
Glickman(1994)
649
648
99
2
Guthertz (1993)
122
122
100
3
Butler (1991)
CIB
319
319
100
82
80
98
Tuberculosis – TBC: PCR GeneXpert
Población HIV positiva
n
Sensibilidad
Especificidad
(IC 95%)
n
%
(IC 95%)
893/913 97,9
(96,9-98,8)
19/19
100
(98,5-100,0)
BK-C+ 293/391 74,9
(70,6-79,2)
34/71
47,9
(36,3-59,5)
852/861 99,0
(98,3-99,7)
423/429 98,6
(97,5-99,7)
BK+
%
1 Helb D et al J Clin Microbiol. 2010 ; 48:229-37
Paises
Vietnan Uganda
2 Boehme CC et al N Engl J Med. 2010 9; 363:1005-15
Peu Azerbajan Sudafrica India
4 Marlowe EM et al . J Clin Microbiol. 2011 .Feb 2. [Epub ahead of print]
EEUU
5 Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9
España
6 Malbruny B et al. Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 553-5
Francia
7 Bowles EC et al Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 988-9
Holanda
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Sudafrica
9 Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70
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10 Scott LE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001061
Sudafrica
11 Lawn SDE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001067
Sudafrica
Tuberculosis – TBC
IMPACTO DE INNOVACION EN MICROBIOLOGIA
Oportunidad de respuesta: Resultados en tiempo real (Horas –
7d).
Mejora Calidad del servicio de laboratorio.
Agilizar el flujo de trabajo
Estandariza, promueve precisión.
Mejora vigilancia epidemiológica: oportunidad Reducción de
infecciones intrahospitalarias y brotes epidémicos.
Ayuda a controlar Resistencia bacteriana.
Disminuye DDD antibiótica.
Reducción tiempo hospitalización paciente
Mejor pronostico de las enfermedades infecciosas