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INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD
FUNDACIÓN HÉCTOR A. BARCELÓ
CARRERA DE TÉCNICOS EN ANÁLISIS CLÍNICOS
ASIGNATURA: ANÁLISIS CLÍNICOS II: ETAPA ANALÍTICA
Guía de estudio Nº 8 2008. Microbiología
Autor: Dr. Enrique Martins
Esta guía de estudio ha sido confeccionada como un complemento de la asignatura
Microbiología. En ella ya se han visto las técnicas básicas de microbiología.
En esta guía abordaremos el estudio de sistemas automatizados para la detección de
microorganismos en muestras clínicas, sistemas comerciales de identificación de
microorganismos, pruebas alternativas de sensibilidad a los Antimicrobianos, técnicas
inmunológicas aplicadas a microbiología y métodos moleculares.
MÉTODOS RÁPIDOS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
Con raras excepciones, los métodos de análisis bacteriológico de muestras clínicas requieren
tiempo para lograr resultados confiables. Este tiempo, en muchos casos, es demasiado largo
para que la instauración de una terapia apropiada rinda sus frutos en la salud de los pacientes.
Por esta razón se han desarrollado algunos métodos para acelerar el diagnóstico
bacteriológico, que veremos a continuación.
Métodos automatizados para detectar microorganismos en hemocultivos
Como ya se ha visto en la asignatura Microbiología, el procesamiento manual de los
hemocultivos requiere la observación visual de las botellas de hemocultivo para buscar signos
de desarrollo de microorganismos en las primeras 6 a 18 hs posteriores a la siembra, y luego la
observación diaria con el mismo fin, por un período de siete días. Además requiere la
realización de una coloración y la siembra de subcultivos ciegos luego de las primeras 24 hs de
incubación y otro a los siete días, si no hay evidencias de desarrollo, o cuando se observe
alguna alteración en las botellas como hemólisis, turbidez, producción de gas, “chocolatización”
de la sangre, o la presencia de colonias en la interfase de los medios. Por todo esto los
métodos manuales son demasiado laboriosos para ser prácticos en laboratorios que procesan
un gran número de muestras. Además, la necesidad de hacer más subcultivos expone más
veces al personal al contacto con la sangre del paciente.
Los métodos automatizados de lectura continua representan un gran avance en la práctica
microbiológica, ya que aceleran el tiempo de recuperación de bacterias en la sangre en
aproximadamente 12 horas, eliminan la necesidad de realizar un subcultivo ciego y acortan el
período habitual de incubación de 7 a 5 días, sin una reducción importante de la recuperación
de patógenos, pero si con una reducción significativa de la recuperación de contaminantes.
Existen métodos radiométricos y no radiométricos. Los primeros se basan en la utilización de
precursores marcados con 14C y en la medida de la producción de CO2 marcado en la parte
superior (sin medio líquido) de las botellas. Este método está en desuso, los métodos más
utilizados son los no radiométricos. Al principio se desarrollaron métodos no radiométricos para
medir el CO2 en el espacio de gas de la botella. Actualmente estos métodos han sido
reemplazados por métodos de monitoreo continuo:
 Bact-Alert (Organon Teknika)
 BACTEC 9000
 ESP (Extra Sensing Power) (Difco)
 Vital (bioMérieux)
El funcionamiento es similar para todos los sistemas: consisten en un contenedor de las
botellas de hemocultivo que sirve como incubadora, agitador continuo, y detector del
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crecimiento microbiano. La capacidad varía con los distintos sistemas desde 120 hasta casi
400 botellas. Las botellas están identificadas con un código de barras, a través del cuál, la
muestra y los datos del paciente ingresan a la computadora del sistema.
La diferencia entre los sistemas es el indicador de desarrollo bacteriano y el sistema de
detección de este desarrollo.
Bact-Alert
Cada botella de hemocultivo tiene capacidad para 10 ml de sangre. A medida que los
microorganismos crecen en la mezcla de sangre y caldo de cultivo, se libera CO 2 . Unido al
fondo de cada tubo hay un sensor químico sensible al CO2 que está separado de la mezcla
sangre-caldo de cultivo por una membrana permeable al CO2 sólo en la dirección hacia el
sensor. En presencia de CO2, el sensor pasa de color verde a amarillo. Esto se puede observar
a simple vista aunque el detector dentro del aparato reacciona antes de que el cambio de color
sea aparente a simple vista.
Se pueden unir hasta 5 módulos contenedores de botellas más a la misma computadora,
llegando a una posibilitar el monitoreo de 1440 botellas.
El chequeo de los sensores de cada botella se realiza automáticamente cada 10 minutos. Ni
bien el CO2 acumulado alcanza para altera el sensor, se genera una señal sonora se alerta, y
se señala en la computadora la posición de la botella. En el monitor se puede observar un
gráfico que refleja la producción de CO2.
BACTEC 9000
Es similar en apariencia al sistema Bact-Alert. Hay dos tamaños 9240, que contiene 240
botellas y 9120, que contiene 120. Se pueden unir hasta 5 módulos a una misma computadora.
Cada botella tiene un disco sensor unido al fondo de la botella, la diferencia es que este
sistema usa luz fluorescente para detectar el CO2, en vez de luz del espectro visible. El
detector también actúa cada 10 minutos. El volumen de sangre por botella es hasta 10ml. Una
vez detectada la producción de CO2, la computadora señala la posición de la botella en el
módulo contenedor. También se puede extraer un gráfico de la producción de CO 2.
La forma de la botella con su pico más fino lo hace apto parea ser usado con Vacutainer,
aunque se debe tener la precaución de evitar el reflujo hacia las venas del paciente.
Difco ESP
Este sistema se diferencia de los dos anteriores en: 1) la producción de CO2 es monitoreada
manométricamente, 2) entonces se monitorea consumo y producción de CO 2, y 3) también se
sensan cambios en las concentraciones de H2 y O2. Los módulos tienen capacidad para 128 o
384 botellas dependiendo del modelo, y también se pueden unir más de uno al sistema
computarizado. Las botellas aceptan un volumen de sangre de hasta 10 ml. Una vez que la
botella es colocada en su posición la presión de gas se monitorea continuamente, cada 12
minutos. Una ventaja de este sistema es que se puede obtener una lectura positiva antes de
que se produzca una cantidad de CO2 detectable, ya que el consumo de O2 es previo a la
producción de CO2. Así las lecturas pueden ocurrir hasta 8 horas antes que en los otros
sistemas. Además puede detectar microorganismos asacarolíticos, que no producen CO 2 en
cantidad suficiente para disparar los detectores de estos sistemas.
Vital
Es mecánicamente y electrónicamente similar a los sistemas Bact-Alert y BACTEC. La
diferencia es que incorpora una molécula fluorescente soluble directamente en el caldo de
cultivo. A medida que el CO2 se acumula las moléculas detectoras fluorescen, y esto es
sensado por el detector que está apuntado al centro de las botellas.
Los medios de cultivos son preparados apuntando a la recuperación de determinados tipos de
microorganismos. Cada sistema tiene su propio “set” de botellas:
Bact-Alert
 Aeróbicas estándar
 Anaeróbicas estándar
 Pedi-Bact
 Fan (aeróbicas/anaeróbicas) para microorganismos fastidiosos.
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BACTEC
 Aerobic/f
 Anaerobic/f
 Plus aerobic/f
 Plus anaerobic/f
 Peds plus/f
 Myco/f
ESP




Vital


Aerobic 80 A
Anaerobic 80 N
EZ draw 40 A
EZ draw 40 N
Aerobic
anaerobic
Ventajas de los métodos automatizados de monitoreo continuo:
 detección más temprana del desarrollo microbiano
 mayor porcentaje de recuperación
 mayor Bioseguridad, menor riesgo para el operador
 disminución de la carga de trabajo, fácil manejo, ahorro de tiempo
 base de datos y estadística en el mismo sistema
Desventajas:
 alto costo
 falsos positivos (menor al 1%) por cortes de luz, elevado número de leucocitos,
problemas de ventilación de botellas aerobias en algunos sistemas.
 selección limitada de los medios de cultivo
 gran tamaño de algunos instrumentos
 ajustes en los horarios del personal debido al monitoreo continuo.
Sistemas comerciales de identificación rápida de microorganismos
Los laboratorios clínicos microbiológicos deben ser eficientes en la identificación de los
microorganismos. La identificación se lleva a cabo a través de pruebas bioquímicas, que
pueden realizarse en la forma convencional o a través de sistemas comerciales de
identificación. Estos consisten en tiras plásticas que contienen pequeños pocillos donde se
realizan desde 20 a 30 pruebas bioquímicas simultáneamente, que pueden ser leídas o
reveladas en 24 horas. En algunos de estos métodos, los microorganismos más frecuentes se
pueden identificar en cuatro horas.
La interpretación de 20 o 30 pruebas bioquímicas simultáneas no es fácil y además llevaría
demasiado tiempo, por eso estos sistemas están asociados con sistemas computarizados que
tienen una importante base de datos. Los resultados de estas combinaciones de pruebas
bioquímicas se trasladan a la computadora a través de un código numérico binario, en el cual
una reacción positiva equivale a “1” y una reacción negativa equivale a “0”. Así, a la serie de
pruebas bioquímicas se le asigna un código binario, por ejemplo: 11010100001001111010010.
El código binario es transformado por la computadora en un “número de biotipo”, que es una
representación numérica de características fenotípicas expresadas por un único tipo de
bacteria en particular.
Cuando se introduce en la computadora el patrón de resultados para una serie de pruebas
bioquímicas, esta devuelve el género y la especie de uno o más microorganismos, y dos
números asociados: la frecuencia estimada de ocurrencia y el cálculo de la probabilidad de que
ése sea el microorganismo en la muestra.
La frecuencia estimada de ocurrencia indica el número de cepas del microorganismo,
seleccionadas al azar, que tendrían el mismo exacto número de biotipo. Por ejemplo si la
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frecuencia que entrega la computadora es 1/180, esto significa que hay una chance en 180 de
encontrar este exacto patrón de pruebas bioquímicas para este microorganismo.
El porcentaje de probabilidad es la comparación entre el número de biotipo de la muestra con
cada taxón almacenado en la base de datos. Cuanto más parecidos sean estos números,
mayor será la probabilidad de que se trate del organismo seleccionado.
Cualquier identificación con un porcentaje de probabilidad mayor o igual al 90% puede ser
informado.
Cuando el porcentaje es menor, la identificación es dudosa y se deben realizar más pruebas
bioquímicas para hacer la identificación con mayor certeza.
Las respuestas derivadas de los sistemas computarizados deben ser interpretadas en conjunto
con el resto de la información disponible de la muestra como la morfología de la colonia, las
reacciones en los medios de aislamiento, la morfología en la coloración de gram, resultados de
las pruebas bioquímicas iniciales, patrones de susceptibilidad a antibióticos y la situación
clínica del paciente.
Cuando se encuentran discrepancias entre estas fuentes de información se debe rechequear
las pruebas para ver si ha habido un error en la interpretación o si se ha sembrado bien el
microorganismo. Además, muchas especies pueden tener varios números de biotipo, ya que
una o más reacciones pueden ser variables.
La selección de las pruebas bioquímicas para cada tira depende del tipo de microorganismo
que se apunte a identificar: Enterobacteriaceae, bacilos gram negativos no fermentadores,
Staphylococcus spp, Streptococcus spp, anaerobios, levaduras y muchos más.
También existen sistemas de lectura automáticos, en los que los resultados de las pruebas
bioquímicas son relevados por un lector óptico que envía sus determinaciones directamente a
la computadora.
Principales sistemas comerciales de identificación
API (bioMérieux Vitek)
Este sistema se ha convertido en el método de referencia contra el que se compara la
performance de otros sistemas. Es el más utilizado en el país.
Contiene 21 pruebas. La identificación es en 24 hs para la gran mayoría de las especies
bacterianas. Tiene una gran base de datos que incluye cepas poco comunes.
El inconveniente que tiene es que la inoculación es complicada, pero esto rápidamente se
soluciona con la práctica.
Se requiere experiencia para interpretar las reacciones “borderline”, que pueden afectar el
número de biotipo, y por lo tanto la identificación.
API RAPID 20E es un sistema similar para enterobacterias con ciertas modificaciones que
hacen que las reacciones ocurran más rápido y se puedan interpretar en cuatro horas.
Algunas de los sistemas son:
 20 A, AN, ANI para anaerobios
 20 C AUX para levaduras
 20 E, RAPID 20E para enterobacterias
 20 NE para bacilos negativos no fermentadores
 20 Strep para estreptococos/enterococos
 Coryne para Corynebacterium y otros bacilos gram positivos
 Staph para estafilococos/Micrococcus
Otros sistemas comerciales de identificación de microorganismos
Becton Dickinson Microbiology Systems
 Crystal Gram-Positive para cocos y bacilos gram positivos
 Enterotube II para enterobacterias
 Crystal Neisseria/Haemophilus para Neisseria spp, Haemophilus spp, Moraxella spp,
Gardnerella vaginalis y otros patógenos fastidiosos
 Cristal rapad stool enteric para patógenos gram negativos intestinales
 Minitek para anaerobios, enterobacterias, microorganismos gram positivos, Neisseria
spp, bacilos no fermentadores y levaduras
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Dade Microscan
 NEG ID Type2 para enterobacterias, bacilos no fermentadores, microorganismos gram
positivos
 POS ID para cocos gram positivos y Listeria spp
 Rapid Anaerobe para anaerobios
 Rapid HNID para Neisseria spp, Haemophilus spp, Moraxella spp y Gardnerella
vaginalis.
Entre los sistemas automatizados y semiautomatizados podemos nombrar a Vitek System
(biomérieux Vitek) y Microscan Walkaway (Dade MicroScan).
Pruebas rápidas de sensibilidad a los antimicrobianos
Métodos semiautomáticos
Existen varios sistemas semiautomáticos para la realización de pruebas de susceptibilidad a
los antimicrobianos. Los dos sistemas más usados son: Vitek (bioMérieux) y MicroScan (Dade
Internacional).
El instrumento Vitek usa un análisis de crecimiento en tarjetas plásticas asistido por
computadora para calcular la concentración inhibitoria mínima (CIM). En algunas
circunstancias, el cálculo de la CIM depende de la identificación de la cepa bacteriana. Una
ventaja es la exactitud adicional provista por la correlación por computadora del patrón de
crecimiento y la identificación del microorganismo; el problema con esto es que cuando no se
puede hacer una identificación adecuada (o todavía no está disponible), los pruebas de
susceptibilidad a antimicrobianos pueden dar resultados dudosos o difíciles de interpretar.
El sistema MicroScan está basado en la tecnología tradicional para realizar la CIM. El test se
hace en placas de microtiter junto con las pruebas de identificación. Se incuban “overnight” y se
leen al otro día visualmente o con aparatos semiautomáticos. El sistema “Walkaway” incorpora
un sistema de detección fluorescente que puede proveer la identificación y la susceptibilidad a
antimicrobianos en el mismo día, para algunos microorganismos.
La principal ventaja es la rapidez. También pueden disminuir la carga de trabajo de un
laboratorio.
Las desventajas del sistema son varias:
 El aislamiento del microorganismo y la preparación de la suspensión bacteriana son
realizados por el operador, por lo tanto, el proceso nunca es totalmente automatizado.
 El inóculo es la variable más importante que afecta los resultados, y no está
automatizado.
 No se puede seleccionar otros antibióticos que los que están en los paneles.
 No es aplicable a todos los grupos de bacterias como microorganismos fastidiosos,
anaerobios y algunos bacilos no fermentadores.
 El valor de CIM sólo es confiable dentro de las concentraciones testeadas.
 Falsa sensibilidad o falsa resistencia comparada con los métodos de referencia en los
métodos rápidos.
 Puede no expresar todos los mecanismos de resistencia bacterianos como la
producción de β-lactamasas.
Métodos Epsilométricos (E-Test, AB Biodisk)
Consiste en una tira impregnada de antibiótico que se coloca en la superficie de una placa de
agar, inoculada con el microorganismo problema de la misma manera que para las pruebas de
sensibilidad por difusión de discos. El contenido de antibiótico de la tira está graduado y las
concentraciones están impresas en la misma tira. Luego de la incubación se puede leer la CIM
en la tira graduada, en la zona donde la concentración de antibiótico ha sido suficiente para
inhibir el crecimiento bacteriano.
Al contrario que con los discos de difusión, en este caso sí importa la orientación de la tira, ya
que si se coloca con el frente hacia abajo, los resultados pueden dar alterados.
La difusión del antibiótico comienza en el momento que la tira es apoyada en el agar, entonces
una vez colocada, no se debe mover. Una placa con inóculo pobre puede llevar a malas
interpretaciones de la CIM.
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El E-Test es efectivo para los microorganismos comunes, pero también sirve para bacterias
fastidiosas, anaerobios, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Helicobacter
pylori, levaduras, micobacterias, Nocardia spp.
La metodología es más sencilla que la de dilución en caldo. Sirve para evaluar combinaciones
de antibióticos.
Métodos Inmunológicos en Microbiología Clínica
Los métodos para detectar directamente antígenos bacterianos, usando anticuerpos como
reactivos, han ganado gran aceptación para el diagnóstico rápido de ciertas enfermedades
infecciosas.
Algunos de los tipos de reacciones antígeno-anticuerpo que se utilizan en microbiología ya las
hemos estudiado en la clase previa de Inmunología, por lo que sólo veremos su uso práctico.
 Reacciones de precipitina: actualmente se utiliza el método de doble difusión para el
diagnóstico serológico de ciertas infecciones fúngicas sistémicas que pueden
comprometer la vida de pacientes con algún defecto inmunológico, como aspergilosis,
blastomicosis, histoplasmosis y coccidioidomicosis.
 Reacciones de aglutinación: se utilizan mucho para la detección de grupos
serológicos de Estreptococos y Enterococos (clasificación de Lancefield), o la
detección directa en un hisopado de fauces de estreptococos del grupo “A”. Se usan
para la detección en líquido cefalorraquídeo del polisacárido capsular de Cryptococcus
neoformans, un hongo que produce infecciones de las meninges en pacientes
inmunocomprometidos, típicamente HIV positivos. También se utiliza para el
diagnóstico etiológico rápido de meningitis bacterianas producida por Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo b y otros, y Neisseria meningitidis, varios
serogrupos. Otro uso es el de la detección de agentes bacterianos causantes de
diarreas que pueden comprometer la vida de infantes, como Salmonella, Shigella,
Vibrio, Escherichia coli enterohemorrágica, etc.
 Inmunoensayos en fase sólida: la mayoría se utilizan para la detección de antígenos
virales como HIV, hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV). También se usan para detectar
antígenos bacterianos como antígenos capsulares de S. pneumoniae, H influenzae tipo
b, antígenos de pared del estreptococo grupo “A” y los antígenos de Chlamydia
trachomatis.
Método de Inmunofluorescencia (IF)
Es un método alternativo a los EIA para detectar y localizar antígenos para el diagnóstico de
enfermedades bacterianas, fúngicas, parasitarias y virales. Esta técnica también se puede usar
para el diagnóstico retrospectivo de enfermedades infecciosas por medio de la detección de
anticuerpos.
Para la detección de antígenos, el anticuerpo específico se conjuga con una sonda
fluorescente como el isotiocianato de fluoresceína, resultando en un marcador sensible sin la
afinidad del anticuerpo alterada. Este conjugado se agrega a células o tejidos fijados en un
portaobjetos, y se une a su antígeno específico, formando un inmunocomplejo estable. Luego
se lava para eliminar el exceso de material que no reacciona, se seca la preparación y se
observa en el microscopio de fluorescencia. Los antígenos unidos específicamente al
anticuerpo conjugado con la sonda fluorescente se pueden detectar como objetos brillantes
color verde manzana o amarillo-naranja (depende del fluorocromo usado), contra un fondo
oscuro.
Las técnicas de inmunofluorescencia pueden ser directas (IFD), como la técnica descripta
previamente, o indirectas (IFI). Las directas se usan para detectar antígenos, mientras que las
técnicas indirectas se pueden usar para detectar antígenos o anticuerpos.
IFI, para la detección de anticuerpos: los portaobjetos que contienen células o tejidos con los
antígenos específicos son cubiertos con diluciones del suero del paciente. Luego se agrega un
anticuerpo de origen animal específico de anticuerpos humanos, marcado con fluoresceína.
Luego se lava, se seca posteriormente y se observa al microscopio de fluorescencia,
estableciéndose la mayor dilución con fluorescencia positiva, dando el título del anticuerpo
específico.
Estos métodos se usan para la detección de Chlamydia trachomatis, Legionella spp, y ciertos
parásitos como Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Tripanosoma cruzi.
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Métodos Moleculares en Microbiología Clínica
Se emplean para la confirmación de resultados obtenidos por cultivo como alternativa de otros
métodos convencionales que requieren más tiempo y son muy laboriosos.
Sondas de ácidos nucleicos
Son ácidos nucleicos de cadena simple que pueden “hibridar” específicamente con su cadena
complementaria. Una sonda se puede construir para detectar DNA o RNA.
El principio básico es la hibridación, que involucra la desnaturalización del DNA doble cadena
en cadenas simples, y la detección del DNA simple cadena resultante, con una sonda marcada
de DNA simple cadena.
Algunos ejemplos de uso:
 Confirmación de cultivo: Campylobacter, enterococos, H. influenzae, Listeria
monocytogenes, complejo Mycobacterium avium, complejo M. tuberculosis,
Streptococcus agalactiae, Neisseria gonorrhoeae, etc.
 Detección directa en muestras clínicas: Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis,
Legionella pneumophila, S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, hongos, virus, parásitos.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica altamente sensible por medio de la cual, ínfimas cantidades de secuencias
específicas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), pueden ser enzimáticamente amplificadas para
alcanzar una señal mínima que se pueda detectar.
PCR es una técnica de amplificación de secuencias blanco específicas, lo que se logra por la
unión específica de sondas oligonucleotídicas a la cadena de ácido nucleico que se quiere
detectar.
La detección de los productos finales se hace por separación electroforética del amplificado en
geles de agarosa o poliacrilamida.
Principales aplicaciones:
 Identificación de especies bacterianas
 Detección de cepas toxigénicas de Corynebacterium diphteriae, E. coli O 157 H7
 Detección de gen mec A en estafilococos
 Detección de H. pylori en biopsias gástricas
 Tipificación molecular de cepas
 Detección de H. ducreyi y Treponema pallidum en úlceras genitales
 Detección de M. tuberculosis en muestras clínicas
 Detección de Aspergillus spp en lavado broncoalveolar
 Detección de Candida spp y Pneumocystis carinii en muestras clínicas
PREGUNTAS DE REVISIÓN
1. Repase la técnica manual de hemocultivo. ¿Cuáles son las ventajas de los métodos
automatizados de hemocultivo?
2. ¿Cuál es la principal diferencia entre los distintos sistemas de hemocultivo
automatizados?
3. ¿Cuáles son las ventajas de los sistemas de identificación rápida de microorganismos?
4. ¿Qué diferencia encuentra entre los métodos de difusión de discos para el estudio de
susceptibilidad a antimicrobianos y el método epsilométrico?
5. ¿Cuál es el fundamento de la inmunofluorescencia?
BIBLIOGRAFÍA
1)
2)
3)
Koneman, E. Allen, S., Janda, W., Schreckenberger, P., Winn, W. Color Atlas and Textbook of Diagnostic
Microbiology. Fifth edition. New York: Lippincott; 1992.
Woods, G. Manejo y recogida de muestras para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. En: Henry
H. El Laboratorio en el Diagnóstico Clínico. Madrid: Marbán Libros; 2005.
Manual de operación del sistema Bact/Alert. Sala de Bacteriología. Hospital Interzonal General de Agudos
“General. San Martín” de La Plata.
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