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Técnicas de identificación de
micobacterias diferentes a M tuberculosis
Servicio Micobacterias
Inst. Nacional de Enfermedades Infecciosas
ANLIS “Dr. C. G. Malbrán”
Identificación de cultivos positivos
en medio sólido
Características culturales
Colonias como migas de pan, secas,
sin pigmentación y desarrollo lento
características culturales compatibles con M tuberculosis
Se encauza para tipificación
Bioseguridad
Cabinas de seguridad biológica tipo IIA con salida al exterior, UPS y
validación anual
Antesala que separe el área de trabajo del resto del laboratorio
Pruebas bioquímicas
Características microscópicas
Niacina
Catalasa
Nitrato reductasa
Identificación de cultivos positivos
en medio sólido
Características culturales
Colonias lisas y
pigmentadas o
que toman el
color del medio
No es M tuberculosis
Se encauza para tipificación si es necesario
Identificación de cultivos positivos
en medio líquido
Si se observan grumos se puede
sospechar en M tuberculosis
Si se observa turbidez pareja se
puede sospechar de
micobacteria ambiental
Características microscópicas
Precisión de la observación de cuerdas en extendidos de caldos
positivos para la identificación de M tuberculosis
1.
2.
3.
4.
5.
Yagupsky PV et al. J Clin Microbiol, 1990, 28:1451-53
Morris AJ, Reller LB. J Clin Microbiol, 1993, 31: 2353 – 54
Badak FZ et al. J Clin Microbiol, 1999, 37:4189-91
Attorri S et al J Clin Microbiol, 2000, 38:1426 – 29
Coelho AGV et al J Bras Pneumol,2007, 33: 707-11
Un resultado de sensibilidad a
isoniacida da mayor precisión
a la identificacion
Tests inmunocromatograficos de flujo lateral
(ICA : Immunochromatographic assay )
para la identificación del complejo Mycobacterium tuberculosis
* Es un sistema de doble anticuerpo
* Test disponibles:
CAPILIA TB (Tauns laboratorios, Inc., Numazu, Japan)
Tibilia rapid test (Hangzhou, China)
SD bioline Ag MPT 64 rapid test (Standad Diagnostic,
South Korea)
MGIT TBc ID test (Becton Dickinson)
*Se puede realizar de medio líquido y sólido
* Límite de detección: 105 UFC/ml
Tests inmunocromatograficos de flujo lateral
(ICA : Immunochromatographic assay )
para la identificación del complejo Mycobacterium tuberculosis
Anticuerpo policlonal
anti inmunoglobulina de raton
inmovilizado en la membrana
(captura el exceso de monoclonal
indica que está en buenas condiciones
y que ha migrado correctamente)
Segundo anticuerpo raton anti MPB64
(reconoce otro epitope del antígeno)
inmovilizado en la membrana
Raton anti MPB64 conjudado con
partículas de oro coloidales
15 minutos
Algunas cepas de BCG (Glaxo, Pasteur, Tice) no expresan MPB64
Se encontraron mutantes de M. tuberculosis que no expresan el Ag
Capilia, Tauns Japon ,Nippon BD Co Ltd
Standards Diagnostics, Corea
80 – 100 µl de suspensión bacteriana
M. avium
M.tuberculosis
M.kansasii
M.tuberculosis
M.tuberculosis
Evaluación del test de inmunocromatografía lateral para la identificación de
Mycobacterium tuberculosis en medio lìquido
Test
comercial
N
Sensibilidad
(95% CI)
Especificidad
(95% CI)
VPP
(95% CI)
VPN
(95% CI)
CAPILIA
TB
2565
(49,8% TBC)
98,8 (98,1-99,3)
99,1 (98,3-99,6)
99,4 (98,9-99,8)
98,2 (97,1-98,9)
BIOLINE
SD
242
(83% Tbc)
97,0 (93,6-98,9)
100 (91,4-100)
100 (98,8-100)
87,2 (74,3-95,2)
MGIT
TBcID
1002
(60,7% Tbc)
97,9 (96,4-98,9)
99,5 (98,2-99,9)
99,7 (98,8-100
96,8 (94,6-98,3)
Brent A. et al journal of Clinical Microbiology Dec 2011, 4343-4346
Nuestra experiencia
Datos del poster CAPILIA
1º etapa: Capilia TB test (Tauns Laboratories, Japan) vs PRA.
Participaron 3 laboratorios de referencia de CABA y LNR.
Se investigaron: - 349 cultivos positivos en MGIT 960
- 192 aislamientos de micobacterias ambientales
Resultados discordantes investigados por métodos bioquímicos.
Aislamientos (n)
PRA
ICL
CAPILIA TB
CMT
Otra
micobacteria
Total
CMT
320
0
320
Negativo
3
218
321
Total
323
218
541
Sensibilidad= 99,1% (IC 95% 97,8 -100)
Especificidad= 100% (IC 95% 99,8 -100)
3 aislamientos dieron falsos negativos un Mycobacterium tuberculosis y dos de M bovis-BCG.
2 de los 323 (0,6%) cultivos de M. tuberculosis contenían también M. avium
Tiempo requerido para crecimiento e identificación: Muestras B (+) (n= 203): 11 (2-30) días.
Muestras B (-) (n= 138): 17 (5–39) días.
2º etapa: MGIT TBCID test vs PRA
Se estudiaron 97 aislamientos de pacientes con riesgo de
micobacteriosis o tuberculosis resistente a drogas , en LRN.
Resultados discordantes investigados por métodos bioquímicos.
Aislamientos (n)
PRA
CMT
Otra
micobacteria
Total
CMT
84
0
84
Negativo
2
11
13
Total
86
11
97
ICL
MGIT TBc ID
Sensibilidad= 97,7% (IC 95% 93,9 -100)
Especificidad= 100% (IC 95% 95,5 -100)
Falsos negativos 2 aislamientos de M tuberculosis.
1 de 84 (1.2%) aislamientos de M tuberculosis también contenía M intracellulare.
Identificación molecular de especies de micobacterias
a partir de cultivo
Moléculas útiles para identificación de especies de micobacterias
Blancos específicos para Complejo M tuberculosis
- IS6110
- MPB 64
Blancos comunes a las micobacterias
16S rRNA, ITS 16S – 23S rRNA, 16S rDNA
Proteína de shock térmico (hsp 65)
DNA Girasa B (gyr B)
RNA polimerasa (rpoB)
Superóxido dismutasa (sodA)
Sistema de reparación y recombinación de DNA (recA)
Métodos: -PCR / nested PCR
-PCR real time
- Accu Probe (Gen Probe)
- LIPAs
- PRA
AccuProbe:
Se basa en la hibridación del rRNA de las micobacterias a sondas DNA
especie específicas.
Solo nos permite identificar las micobacterias más importantes desde el
punto de vista clínico
RIBOSOMAS
*
*
*
*
*
SONDA
ARNr
S y E > 90%
destrucción
química de la
marca no
hibridizada
ADN-ESTER
DE ACRIDINA + H2O2 + OH-
LUZ
LIPAs hibridación en tiras con sondas
1) Extracción ADN
Hervir a 100ºC
30 min
Centrifugar
20’ a
14000 rpm
2) Amplificación de blancos específicos con primers biotinilados
• ITS 16S-23S rRNA
• rRNA 23S
•16S
3) Hibridación sobre tiras de nitrocelulosa
Especial cuidado con la temperatura de
hibridación, máxima desviación tolerada +/-1 ºC.
Orientar bien la tira y ver que queda totalmente
sumergida.
4) Reacción colorimétrica
5) Interpretación de resultados
INNO-LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics, Belgium)
Amplifica la región espaciadora entre los genes RNA ribosomal 16S - 23 S
se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada especie
16 especies prevalentes
GenoType Mycobacterium (Hain, Germany)
Amplifica la región 23 S del gen RNA ribosomal
se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada micobacteria
CM 13 especies prevalentes
AS
identificación 16 especies raras
InnoLIPA
Concordancia
86%
GenoType
90-96%
Makinen J, et al Clin Microbiol Infect 2006, 12:481-483.
Lee AS, et al J Med Microbiol, 2009,58:900-4.
Safianowka A, et al. Pneumonol Alergol Pol. 2010;78:363-8.
PCR-reverse dot blot hybridization (RDBH)
Amplifica la región 16 S del gen RNA ribosomal
se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada especie
22 especies
340 aislamientos
99% de concordancia
con secuenciación
Xueqiong Wu,l, et al J. Clin. Microbiolo 45: 1898, 2007
PRA
Amplificación de un fragmento del gen hsp65
Restricción enzimática
Hae III
Bste II
Electroforesis en gel de agarosa
Tinción de ADN
(bromuro de etidio)
Segmentos
cortados por
la Enzima
BstE II
Enzima
Hae III
Mycobacterium
abscessus
Evaluación en la rutina de trabajo
Experiencia I (2004)
todos los aislamientos recibidos
Especie
n: 633
N° aislamientos
% concordancia
Complejo M tuberculosis
268
100
M avium
80
99
M intracellulare
65
100
M fortuitum
23
100
M peregrinum
25
100
M chelonae
12
100
M abscessus
35
100
M kansasii
13
71
100
82
Otras especies
93% de los aislamientos que llegan a nuestro laboratorio
en un lapso de 3-7 días
Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Evaluación en la rutina de trabajo
Experiencia II (2005-2007)
aislamientos de especies no resueltas en la experiencia
anterior n: 170
Especie
N° aislamientos
% concordancia
M gordonae tipo VII
19
100
M lentiflavum tipo I
13
100
M simae tipo I
13
100
M simae nuevo tipo
19
100
M marinum
10
100
M xenopi
10
100
84
Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
Secuenciación:
Para la identificación molecular de micobacterias además de la
secuenciación del gen 16S rRNA, considerado gold stsndard, se han
propuestos otros genes: ITS 16s – 23S rRNA, y los genes 23S rRNA,
hsp65, rpoB, sodA, recA.
Kit comercial MicroSeq 500 (Aplied Biosystem)
Comparación con base de datos
GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbanklindex.html)
EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/)
DNA Data Bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)
Es un técnica que requiere equipamiento y reactivos muy costoso, y
personal muy entrenado
* El uso de test moleculares para diferenciar entre CMTBC y otras
micobacterias es importante para elegir un tratamiento adecuado
sobretodo en países donde la prevalencia de tuberculosis es baja y
la enfermedad por otras micobacterias son más frecuentes. El uso
en países con alta prevalencia de tuberculosis donde la mayoría de
los casos son B(+) es menos útil
* En pacientes con inmunosupresión severa el uso de estas técnicas
permite discernir entre tuberculosis y micobacteriosis