Download CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTCENTRO DE ESTUDIOS EN SALUD
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA –UVG-
INFORME FINAL
ANALISIS E IMPLEMENTACIÓN DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE
BUNYAVIRUS UTILIZANDO ZANCUDOS DEL GENERO CULEX COMO
FUENTE DE MATERIAL GENETICO
PROYECTO FODECYT No. 034-2008
MARIA EUGENIA MORALES-BETOULLE, Ph.D.
Investigadora Principal
GUATEMALA, MAYO DE 2011
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología -CONCYT-.
OTROS AGRADECIMIENTOS:
Este proyecto se puedo llevar a cabo con el apoyo financiero del CDC a través del
Acuerdo
Cooperativo
U50/CCU021236-01.
con
la
Universidad
del
Valle
de
Guatemala
#
ÍNDICE
Página
RESUMEN……………………………………………………………………………………….VI
ABSTRACT……………………………………………………………………………………..VII
PARTE I
I.1
INTRODUCCIÓN…………………………………………………….…………………..1
I.2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………………………3
I.3
I.2.1
Antecedentes en Guatemala………………………………………………………3
I.2.2.
Justificación………………………………………………………………………5
OBJETIVOS E HIPOTESIS………………………………………………………………6
I.3.1
Objetivos………………………………………………………………………….6
I.3.1.1 General…………………………………………………………………...6
I.3.1.2 Específicos……………………………………………………………….6
I.3.2
I.4
Hipótesis………………………………………………………………………….6
METODOLOGÍA………………………………………………………………………....7
I.4.1
Localización………………………………………………………………………7
I.4.2
Las Variables……………………………………………………………………..8
I.4.2.1 Variables dependientes…………………………………………………..8
I.4.2.2 Variables independientes………………………………………………...8
I.4.3
Indicadores………………………………………………………………………..8
I.4.4
Estrategia Metodológica………………………………………………………….8
I.4.4.1 Población y muestra……………………………………………………...8
I.4.5
El Método………………………………………………………………………...9
I.4.5.1 Macerado de zancudos…………………………………………………..9
I.4.5.2 Extracción de ARN viral……………………………………………….10
I.4.5.3 Control interno de extracción de ARN…………………………………10
I.4.5.4 Estandarización de los ensayos de RT-PCR para
Amplificación de ARN viral…………………………………………………….11
I.4.5.4.1
Preparación de control positivo……………………………..11
I.4.5.4.2
Ensayo de RT-PCR para ortobunyavirus del
serogrupo California/Bunyamwera (Cal/Bwa)………………………………….12
I
I.4.5.4.3
Ensayo con cebador BunC para amplificación de la
secuencia completa del segmento S……………………………………………..12
I.4.5.4.4 Detección de bunyavirus en muestras
de zancudos…………………………………………………………….13
I.4.5.4.5
Aislamiento viral…………………………………………....14
I.4.6
La Técnica Estadística………………………………………………………......14
I.4.7
Los Instrumentos a utilizar……………………………………………………...14
I.4.7.1 Equipo…………………………………………………………………..14
I.4.7.2 Suministros y reactivos…………………………………………………15
PARTE II
II.1
MARCO TEÓRICO……………………………………………………………………..16
II.1.1
Generalidades de los bunyavirus………………………………………………..16
II.1.2
Características moleculares de bunyavirus……………………………………...17
II.1.3
Replicación……………………………………………………………………...20
II.1.4
Estudios basados en el genoma viral……………………………………………22
II.1.5
Principales enfermedades asociadas a bunyavirus………………………………23
II.1.6
Ecología y distribución………………………………………………………….24
II.1.7
Artrópodos vectores de bunyavirus……………………………………………..26
II.1.8
Diagnóstico……………………………………………………………………...28
PARTE III
III.1
RESULTADOS………………………………………………………………………….30
III.1.1 Captura e identificación de zancudos……………………...……………………30
III.1.2 Extracción de ARN viral y control interno………………...……………………31
III.1.3 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación
del ARN viral………………………………………………………….…………………32
III.1.4 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus…………………..………………….33
III.1.5 Aislamiento viral………………………………………………………………..36
III.2
DISCUSION……………………………………………………………………………..38
III.2.1 Extracción de ARN viral y control interno……………………………………...38
III.2.2 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación
del ARN viral…………………………………………………………………………….38
III.2.3 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus……………………………………...39
III.2.4 Aislamiento viral………………………………………………………………...41
PARTE IV
II
IV.1
CONCLUSIONES……………………………………………………………………….42
IV.2
RECOMENDACIONES…………………………………………………………………43
IV.3
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................44
PARTE V
V.1
INFORME FINANCIERO................................................................................................51
III
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Sitios de estudio, Puerto Barrios, Izabal………………………………………………7
Figura 2. Estructura de (a) los viriones y (b) del genoma de los Orthobunyavirus……………..18
Figura 3. Ilustración de la reorganización genómica en un bunyavirus…………………………19
Figura 4. Ciclo de replicación de los virus de la familia Bunyaviridae…………………….……22
Figura 5. Patogénesis de Orthobunyavirus en humanos…………………………………………25
Figura 6. Hembra adulta de Cx. taeniopus………………………………………………….……28
Figura 7. Verificación de la calidad del ARN extraído utilizando distintos
kits comerciales por medio del ensayo de PCR 18S…………………………………………..….31
Figura 8. Ensayo inicial de RT-PCR para detección de Orthobunyavirus………………………32
Figura 9. Ensayo optimizado de RT-PCR para la detección de Orthobunyavirus utilizando
distintos volúmenes de reacción……………………………………………………………….…33
Figura 10. Productos de amplificación del RT-¨PCR Cal/Bwa para
detección de Orthobunyavirus utilizando muestras de zancudos Culex
(Melanoconion) taeniopus colectados en Puerto Barrios, Izabal………………………………...34
Figura 11. Densidades de zancudos Cx. taeniopus colectados
en Puerto Barrios, Izabal……………………………………………………………………….…37
IV
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Listado de especies de zancudos del género Culex, capturados
en Puerto Barrios Izabal, 2007-2009.................................................................................. ...........30
Cuadro 2. Tasas de infección mensuales por bunyavirus en Cx. taeniopus………………..……35
V
RESUMEN
En Latinoamérica se han descrito, numerosos arbovirus responsables de ocasionar
zoonosis. Dentro de estos se encuentran virus emergentes o re-emergentes. Un ejemplo
de virus re-emergentes en Guatemala son los Bunyavirus. En el pasado, se aislaron
varios Bunyavirus de humanos, roedores y zancudos. Geográficamente, los Bunyavirus
están en áreas tropicales y subtropicales de países como México, Panamá, Honduras,
Guatemala, Brasil, Perú entre otros, donde se han asociado con enfermedades en
humanos, produciendo sintomatología febril, dolor de cabeza, mialgias, nauseas, vómitos
y casos severos de encefalitis.
Recientemente, Morales-Betoulle et al (datos no
publicados) aislaron un Bunyavirus del grupo C a partir de zancudos de la especie Culex
(Melanoconion) taeniopus. El objetivo de este proyecto, fue implementar una técnica de
diagnóstico molecular para Bunyavirus, y así mejorar la capacidad de detección de éstos.
Se implementó el ensayo Cal/Bwa y Bun C de RT-PCR para detectar ARN viral en las
muestras extraídas de zancudos Cx. taeniopus. Utilizando estos ensayos se analizaron 114
lotes de zancudos hembras (2942 individuos), detectándoos ARN viral en 16 lotes. Con
estos resultados se estimó la tasa de infección por ortobunyavirus en Cx. taeniopus. Para
los años 2007 y 2008 se observó actividad de bunyavirus con tasas de infección
significativamente mayores a 1 zancudo infectado por cada 1000. Adicionalmente, la
densidad relativa de Cx. taeniopus disminuyó anualmente y no fue posible la detección de
bunyavirus en 2009. Sin embargo, se considera importante continuar estudiando la
biología de Cx. taeniopus para determinar su importancia como posible vector de
bunyavirus en Guatemala.
VI
ABSTRACT
Several zoonotic diseases have been associated with emergent or re-emergent
arboviruses in Latin America. In Guatemala, examples of re-emergent viruses are the
Bunyaviruses. In the past, these viruses were isolated from human, rodent and mosquito
samples. These viruses can be found in tropical and subtropical regions of Mexico,
Brazil, Guatemala and Trinidad, among other countries, where they have been associated
with human illness, producing fever, headache, myalgia, nausea, and in some cases,
encephalitis.
Recently, Morales-Betoulle et al (unpublished data) isolated a Group C
Bunyavirus from Culex (Melanoconion) taeniopus mosquitoes. The aim of this study
was the implementation of a molecular diagnosis technique for the detection of
Bunyavirus. . An RT-PCR assay (Cal/Bwa and BunC) to detect viral RNA from Cx.
taeniopus samples was implemented. Using this assay, 114 pools (2942 individuals) of
female mosquitoes were analyzed and viral RNA was detected in 16 pools. Using these
results, the infection rate was estimated for Orthobunyavirus in Cx. taeniopus. In 2007
and 2008, Bunyavirus activity was observed with infection rates significantly higher than
1 infected mosquito per 1000 individuals. Additionally, Cx. taeniopus relative density
decreased yearly and it was not possible to detect Bunyavirus in 2009. Nevertheless, it is
important to study the ecology of Cx. taeniopus in order to understand its importance as a
potential
vector
of
Bunyavirus
in
Guatemala.
VII
PARTE I
I.1. INTRODUCCIÓN
Los arbovirus, son virus transmitidos por artrópodos, principalmente por
zancudos y garrapatas. Dentro de los arbovirus que causan enfermedad a los
humanos se encuentran tres familias principales: Togaviridae, Flaviviridae y
Bunyaviridae (Alatom y Payne 2009). La familia Bunyaviridae son virus de ARN,
envueltos, con genoma segmentado y comprende más de 258 virus con al menos
167 en el género Orthobunyavirus 1 . Esta familia se encuentra dividida en 5
géneros:
Phlebovirus, Nairovirus, Hantavirus, Tospovirus y Orthobunyavirus
(Alatom y Payne 2009). De los cinco géneros que pertenecen a la familia, cuatro
contienen virus que pueden infectar hospederos vertebrados y tres de los géneros
de bunyavirus que infectan vertebrados pueden ser transmitidos por artrópodos
hematófagos (Schmaljohn y Nichol 2007). Entre los vectores de estos virus se
incluye una gran variedad de zancudos, dentro de los que se encuentran
principalmente especies del género Aedes y Culex, algunos de los cuales se
encuentran en Guatemala (Morales-Betoulle et al., datos no publicados).
El género Orthobunyavirus se puede clasificar en diferentes grupos que
incluyen los Bunyamwera, Bwamba, Grupo C, Guama, Simbu, Mapputta y Grupo
California (CAL). Algunos virus que pertenecen al género de los Bunyavirus son
reconocidos como unos de los más importantes patógenos que afectan a los
humanos alrededor del mundo. En America del Norte, por los menos cuatro virus
(Encefalitis de California, La Crosse, Jamestown Canyon y Snowshoe hare) han
sido responsables de enfermedades que van desde una simple fiebre hasta una
encefalitis severa (Kuno et al., 1996). En Guatemala, en la década de los 70 y 80
se identificaron Bunyavirus del grupo C en personas que presentaban
1
Antes, el género Orthobunyavirus se conocía como Bunyavirus (Schmaljohn y Nichol 2007,
Soldan y González-Scarano 2005, Schmaljohn y Hooper 2001). A partir del 2003,
Orthobunyavirus es el nombre aceptado actualmente por el ICTV (ICTVdb Management 2006).
1
sintomatología muy parecida al dengue, como fiebre, dolor de cabeza, fatiga y
mialgia; y en zancudos de la especie Culex (Melanoconion) taeniopus (Scherer et
al., 1985). En muchos países alrededor del mundo los Bunyavirus se han asociado
con grandes epidemias y algunas enfermedades hemorrágicas. Sin embargo la
vigilancia de estos virus, depende principalmente de su detección en las
poblaciones de artrópodos vectores en su hábitat natural, debido a que para que
exista la transmisión de un virus de importancia a la salud humana debe haber
evidencia de la circulación de éste en el área y un vector competente para
replicarlo y transmitirlo (Kuno et al., 1996). Tradicionalmente esta detección se ha
hecho por medio de algunos ensayos serológicos y principalmente por la prueba
de neutralización, siendo métodos muy sensibles, sin embargo son muy laboriosos
y consumen mucho tiempo. El RT-PCR también es un método muy sensible,
específico y rápido, por lo que se ha convertido en una herramienta muy eficiente
y segura para la detección de diferentes virus.
Como se mencionó anteriormente, existe evidencia de la circulación de
Bunyavirus del Grupo C en Guatemala, sin embargo se desconoce si hay
circulación de los demás grupos de esta familia. Existe poca información, debido a
que a nivel nacional no se realiza vigilancia de estos virus, principalmente porque
la identificación de éstos es limitada debido a la carencia o al escaso acceso a
pruebas de laboratorio, y a que se conoce poco de sus signos y síntomas. Tomando
en cuenta que Guatemala es un país endémico para dengue y malaria, y que los
Bunyavirus se manifiestan clínicamente con síntomas muy similares a estas
enfermedades, la identificación de éstos patógenos es de suma importancia.
El objetivo de este estudio fue implementar una técnica de diagnóstico
molecular para la detección de Bunyavirus en Guatemala. Para esto se utilizó
como fuente de ARN macerados de zancudos de Culex (Melanoconion) taeniopus
vectores de este tipo de virus. En el Centro de Estudios en Salud (laboratorio de
enfermedades arbovirales y zoonóticas) se tienen ya implementadas otras pruebas
moleculares para la detección de arbovirus a partir de zancudos que luego se han
utilizado en muestras de humanos y otros vertebrados (ej. Equinos y bovinos). La
2
implementación del RT-PCR de Bunyavirus es importante para complementar la
capacidad local de diagnóstico y detección de diversos arbovirus que puedan
afectar la salud humana y animal.
I.2. PLANTEMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes en Guatemala
Entre los bunyavirus se encuentra una gran cantidad de virus asociados con
enfermedades en los humanos, principalmente en regiones tropicales y
subtropicales alrededor del mundo.
(Schmaljohn y Nichol 2007, Soldan y
González-Scarano 2005 y Vasconcelos et al. 2001). Dentro de estos virus, los del
género Orthobunyavirus (Bunyaviridae) son los más reportados en la región
tropical y subtropical del continente americano, ocasionado infecciones en los
humanos. Estas infecciones se manifiestan típicamente por una enfermedad febril,
muchas veces con síntomas similares al Dengue. En Guatemala, hay dos casos
documentados de enfermedad humana causada por bunyavirus (NEPV), siendo
éstos en zonas rurales similares a los sitios de estudio del presente trabajo.
(Scherer et al. 1983, Scherer et al 1986, Nunes et al. 2005, de Brito et al. 2007,
Moraes 2007, Quinan et al. 2008, Tauro et al. 2009).
Desde mediados del siglo XX se han observado brotes de enfermedad
causada por estos virus en América. Por ejemplo, variantes muy virulentas de
Oropouche virus (Ortobunyavirus: Bunyaviridae) han causado brotes epidémicos
de hasta
100,000 infecciones humanas en Brasil
(Vasconcelos et al. 1998,
Moraes 2007). Por otro lado, es generalmente aceptado que la aparición de
arbovirus emergentes puede estar relacionada con la modificación del ambiente
(Vasconcelos et al. 2001). La destrucción de hábitats naturales para realizar
proyectos de urbanización, la deforestación y el desarrollo agrícola se han
asociado con el aumento de la circulación de arbovirus, proponiéndose que este
aumento es debido a la proliferación de artrópodos vectores y a un cambio en la
distribución de éstos (Dégallier et al. 1992, Norris 2004). Así mismo, se ha
3
observado que en estas situaciones los virus pueden adaptarse rápidamente a
nuevos vectores, facilitándose de esta manera el desarrollo de un ciclo de
transmisión urbano. (Moraes 2007, Elliott 2009).
La participación de zancudos del género Culex en la transmisión de
bunyavirus en la naturaleza está bien documentada, encontrándose en Guatemala
varias especies de zancudos de este género (Scherer et al. 1976, LeDuc 1987,
Nunes et al. 2005, Soldan y González-Scarano 2005, Moraes et al. 2007, Tauro et
al. 2009, Yadav et al. 2008). En una serie de estudios, en Guatemala se obtuvo
aislados de bunyavirus del género Orthobunyavirus en humanos, zancudos y
roedores. Uno de estos aislados fue obtenido de zancudos Culex (Melanoconion)
taeniopus, sugiriendo a que estos zancudos podrían estar implicados en la ecología
de los bunyavirus en nuestro país. (Scherer et al. 1976, Scherer et al. 1985, Cupp
et al. 1986).
Para que exista transmisión de un arbovirus en la naturaleza es necesaria al
menos la presencia del virus, vectores competentes y hospederos susceptibles.
Aunque esté documentada la presencia de vectores competentes, es necesario que
los factores ambientales sean propicios para los zancudos. Entre estos factores se
encuentra los días con lluvia y la presencia de cuerpos artificiales y naturales de
agua. En Puerto Barrios, municipio en donde se ubican los sitios de este estudio,
se ha documentado la presencia de Cx. taeniopus (ArboZoo, datos no publicados).
Por otra parte, en Guatemala se ha aislado ortobunyavirus de Cx. taeniopus y
algunos vertebrados. Recientemente, un ortobunyavirus del Grupo C fue aislado
de Cx. taeniopus capturados en un sitio cercano a los sitios del presente estudio
(M.E. Morales-Betoulle et al., datos no publicados).
Según los datos anteriormente expuestos, se piensa que los sitios de
estudio reúnen las condiciones apropiadas para la transmisión de ortobunyavirus
por Cx. taenioupus en la naturaleza. Por todo esto, se consideró necesario
determinar la tasa de infección por ortobunyavirus en zancudos de Guatemala,
para poder estimar su importancia como posibles amenazas a la salud humana.
4
I.2.2 Justificación del trabajo de investigación
Actualmente, se conoce una amplia variedad de patógenos como virus,
bacterias y parásitos que son transmitidos por insectos hematófagos y pueden
afectar tanto a humanos como a animales. Estos, muchas veces, no reciben la
atención requerida y se han clasificado como agentes causales de enfermedades
tropicales desatendidas (LeBeaud 2008). Se ha observado que muchos de estos
representan una carga para la población al ocasionar perdidas humanas y
económicas, lo que hace necesario definir los ciclos de transmisión de estas
enfermedades. Es por esto que es importante conocer los ciclos de transmisión y
las características moleculares de éstos, para así implementar o mejorar los
sistemas de vigilancia.
En la actualidad, muchos virus que aparentemente habían dejado de
circular en distintas regiones, han aparecido nuevamente.
Entre los factores
asociados a la re-emergencia de estos se ha sugerido la evolución de los virus,
modificaciones en el comportamiento del hospedero, cambios en las prácticas de
agricultura y la implementación de nuevas técnicas de detección e identificación
(Peters 2001). Se ha observado que los avances en la virología molecular y en las
herramientas computacionales utilizadas para la vigilancia de ciertos virus han
mejorado la comprensión de éstos.
Aún cuando estos virus son de importancia para la salud pública humana y
veterinaria, es importante mencionar que aún en la actualidad, se conoce poco
acerca de la genero Orthobunyavirus, principalmente debido a la falta de
caracterización genética de la mayoría de los virus que la conforman. Es por esto
que es necesaria la implementación de herramientas de diagnóstico, que permitan
identificar si estos virus siguen circulando en la región y si están asociados a
enfermedad en humanos.
5
I.3. OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
Implementar una técnica de diagnóstico molecular para la detección de
Orthobunyavirus en Guatemala.
I.3.1.1 Específicos
1. Implementar el RT-PCR para la detección de Bunyavirus utilizando como
fuente de material genético zancudos de género Culex.
2. Obtener aislados virales de Bunyavirus a partir de las muestras positivas
por RT-PCR provenientes de Guatemala.
3. Determinar la tasa mínima de infección (MIR) debida a Bunyavirus en los
zancudos, utilizando los resultados del RT-PCR implementado.
I.3.2 Hipótesis:
Hipótesis Nula: Existen Bunyavirus circulando en las poblaciones de zancudos
del género Culex del municipio de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala.
6
I.4. METODOLOGIA
I.4.1 Localización
La investigación se llevó a cabo en el departamento de Izabal, el cual se
encuentra situado en la región Nor-Oriental de país (latitud 15° 44‘ 06" y longitud -88°
36‘ 17"). Cuenta con una extensión territorial de 9,038 kilómetros cuadrados y se
encuentra dividido en cinco municipios: Puerto Barrios, Livingston, Morales, El
Estor y Los Amates. Se encuentra localizado en la Costa Caribe de Guatemala a
0.67 msnm. El clima es tropical, ya que durante casi todo el año la temperatura y
el promedio de humedad relativa permanecen altos y sin una estación seca bien
definida, lo cual lo ubica en una zona de vida de Bosque Húmedo Subtropical
(López y Sosa 2008). Los sitios de estudio (15°45‘38.64", -88°32‘13.63" y 15°45‘43.62", 88°32‘9.82") están localizados en el área rural del municipio de Puerto Barrios,
departamento de Izabal, Guatemala. (Figura 1).
Figura 1. Sitios de estudio, Puerto Barrios, Izabal. Fuente: Morales et al. (datos
no publicados).
7
I.4.2 Las Variables
I.4.2.1 Variables dependientes
Resultado positivo a bunyavirus por medio de RT-PCR
I.4.2.2 Variables Independientes
Zancudos del género Culex capturados y procesados del los sitios de estudio en
Puerto Barrios, Izabal (Cantidad de zancudos mayor a cero). Sin embargo, esta
variable no fue controlada en el estudio.
I.4.3 Indicadores
Para las muestras positivas a Bunyavirus del Grupo C, el indicador es la presencia
de una banda de alrededor de 900 pares de bases (PB) visualizada en una gel de
agarosa.
De igual manera, para las muestras positivas del serogrupo
California/Bunyamwera, el indicador es la presencia de una banda de alrededor de
210 pares de bases (PB) visualizada en una gel de agarosa
I.4.4 Estrategia Metodológica
I.4.4.1 Población y Muestra
Se realizó un estudio retrospectivo en zancudos capturados previamente
como parte del estudio de vigilancia ecológica del West Nile virus, en el Centro
de Estudios en Salud de la Universidad del Valle de Guatemala (CES-UVG/CDCCAP). Las capturas mencionadas se realizaron del 2007 al 2009 en Puerto Barrios,
Izabal.
Se tuvo una población de 2942 zancudos del género Culex (Melanoconion)
taeniopus, correspondientes a 114 pools o lotes que contenían un máximo de 50
8
individuos. La cantidad de especies colectadas y el numero de individuos de éstas
fue abundante, por lo que se decidió trabajar con la especie Culex (Melanoconion)
taeniopus debido a que ha sido reportada por varios autores como una especie
potencialmente involucrada en los ciclos de transmisión de los bunyavirus como
se mencionará mas adelante (Marco teórico).
Estos zancudos fueron colectados mensualmente en los sitios de estudio,
durante el período de 2007 a 2009. Para las capturas se colocó por una noche en
cada sitio, una trampa CDC de luz y CO2 (John W. Hock Co. Gainesville, FL,
USA) y trampa grávida (Reiter 1983) con estiércol de vaca y agua como atrayente.
Los zancudos fueron almacenados en hielo seco, separados según fecha, sitio de
colecta y tipo de trampa utilizada y transportados de esta forma al laboratorio en la
UVG, en dónde fueron almacenados a -70 °C hasta su identificación.
Estos fueron separados por sexo y las hembras identificadas hasta género
o especie. La identificación de las hembras se realizó siguiendo sugerencias de
una clave previamente publicada (Sallum y Forattini 1996). Las hembras fueron
clasificadas y agrupadas en lotes de 50 individuos máximo, separadas según fecha
y sitio de colecta, tipo de trampa y estado (grávidas, alimentadas, o noalimentadas). Luego de su identificación y clasificación, los zancudos fueron
almacenados a -70 °C hasta su posterior maceración.
I.4.5 El Método:
I.4.5.1 Macerado de zancudos
Previo a la extracción de ARN para la detección viral, cada lote de zancudos
fue suspendido en solución amortiguadora BA-1 (Medio 199 – Sales de Hank 1X
con L-Glutamina, Tris-HCl 0.05 M pH 7.5, albúmina sérica bovina 1% pH 7.0, LGlutamina 2 mM, NaHCO3 0.35 g/L, penicilina 100 u/mL, estreptomicina 100 µg/L
y anfotericina B 1 µg/mL. Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). El tejido de los
zancudos fue macerado con un balín de cobre estéril en un macerador eléctrico
(Retsch. Newton, PA, modelo MM 301) a 25 rpm por 4 minutos, luego la mezcla se
9
centrifugó por 12 min a 2 750 g y 4 °C para separar el sobrenadante de los restos de
tejido. Se almacenó dos alícuotas de tejido a -70 °C.
I.4.5.2 Extracción de ARN viral
Se extrajo el ARN de los zancudos utilizando dos diferentes kits, el kit
QIAamp Viral RNA mini® (QIAgen. Valencia, CA) o el kit High Pure Viral
RNA®
(Roche
Diagnostics
GmbH.
Mannheim,
Alemania),
según
su
disponibilidad y siguiendo las especificaciones de los fabricantes. Las
extracciones de ARN fueron preservadas a -70°C hasta su procesamiento para la
detección viral.
I.4.5.3 Control interno de extracción de ARN
Para comparar ambas metodologías de extracción de ARN, se extrajo un
mismo lote macerado de zancudos con ambos kits y luego se comprobó la
eficiencia de cada método con un ensayo diseñado para detectar el ARN ribosomal
18S de zancudos de los géneros Aedes y Culex (Hoffmann et al. 2004). El ensayo se
basa en el uso de cebadores específicos para secuencias conservadas del ARNr de los
zancudos, por lo tanto un ensayo positivo demuestra que el ARN de la muestra está
en buen estado. Para cada reacción se utilizó el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR
(QIAgen. Valencia, CA): 16 µL de extracto de ARN, 40 pmol de cada cebador
(18S417 5’-ACGGGGAGGTAGTGACGAGAAATA-3’ y 18S920c 5’-TAATACT
AATGCCCCCAACTACTT-3’), 1X de cada componente del kit (según instrucciones
del fabricante) y agua libre de ARNasas suficiente para un volumen de 40 µL. Se
utilizó agua libre de ARNasas como control negativo. El programa de amplificación
incluyó un ciclo de transcripción reversa a 45 ºC por 1 hora y a 94 ºC por 3 min,
seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 30s, hibridización a 60 ºC por 1
min y extensión a 68 ºC por 3 min, seguidos de 7 min de extensión final a 72 ºC. Las
reacciones fueron realizadas en un termociclador ATC-402 o ATC-201
(NyxTechniK. San Diego, CA). Los productos de amplificación obtenidos fueron
visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. La
presencia de un producto de ~500 pb en un ensayo sin amplificación en los controles
negativos se consideró como un resultado positivo. Esta prueba fue utilizada para
10
comprobar la extracción de ARN en muestras seleccionadas al azar y la extracción de
ARN con el kit Roche.
I.4.5.4 Estandarización de los ensayos de RT-PCR para amplificación
del ARN viral
Se implementaron dos ensayos de RT-PCR para detectar el ARN viral en
las muestras extraídas de los grupos de zancudos. El ensayo Cal/Bwa y el ensayo
BunC.
I.4.5.4.1 Preparación de control positivo
Los ensayos fueron optimizados utilizando como control positivo ARN
extraído de Inkoo virus cepa KN 3641 (INKV, Orthobunyavirus), proporcionados
por A. Lambert y B.W. Johnson de la Division of Vector-Borne Infectious
Diseases (DVBID), Centers for Disease Control and Prevention (CDC), del
gobierno de los Estados Unidos de América. INKV es un ortobunyavirus del
serogrupo California/Bunyamwera presente únicamente en Europa (Schmaljohn y
Hooper 2001). Ya que este virus no circula en América, utilizarlo como control
positivo provee la ventaja de un control de calidad. Dichos controles fueron
obtenidos en forma de virus inactivo, sobrenadante de cultivo viral, en solución de
lisis viral del kit QIAamp. A partir de cada lisado viral obtenido se extrajo ARN
utilizando el kit QIAamp y el procedimiento especificado para ese kit a partir de
350 µL del lisado viral. El ARN extraído se recuperó tras dos elusiones en un
volumen final de 175 µL de solución AVE. Los extractos fueron almacenados a 70ºC. Con un genoma de 986 bases, INKV tiene un producto de amplificación de
208 pb para el ensayo Cal/Bwa (bases 112–320). Para el ensayo BunC tiene un
producto de amplificación del tamaño del segmento S, 986 pb.
11
I.4.5.4.2 Ensayo de RT-PCR para ortobunyavirus del serogrupo
California/Bunyamwera (Cal/Bwa).
El ensayo se implementó en base a un protocolo proporcionado por
colaboradores de DVBID para amplificación molecular de bunyavirus con
cebadores consenso (Lambert y Lanciotti 2009). El ensayo Cal/Bwa es específico
para detección de ortobunyavirus del serogrupo California/Bunyamwera amplifica
específicamente una región del segmento S, que corresponde al gen que codifica
la proteína no estructural (NS). La región amplificada tiene un tamaño entre 210 a
300 pb depende de la especie de ortobunyavirus detectada. Para las reacciones se
utilizó el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR (QIAgen. Valencia, CA).
Brevemente, para cada reacción de 20 µL se utilizó: 5 µL de extracto de ARN, 20
pmol de cada cebador (Cal/Bwa group forward, 5' GCA AAT GGA TTT GAT
CCT GAT GCA G 3' y Cal/Bwa group reverse, 5' TTG TTC CTG TTT GCT
GGA AAA TGA T 3'), 1X cada solución del kit y agua libre de ARNasas para
completar el volumen. Las mezclas de reacción fueron analizadas mediante un
RT-PCR de un paso. Los parámetros de reacción fueron modificados hasta
obtener una amplificación óptima con un producto esperado de 210 pb. El
programa de amplificación optimizado incluyó un ciclo de transcripción reversa a
50 ºC por 30 min y a 95 ºC por 15 min, seguido de 55 ciclos de desnaturalización
a 94ºC por 30s, hibridización a 55 ºC por 1 min y extensión a 72ºC por 2 min,
seguidos de 10 min de extensión final a 72 °C. Como templado de ARN se
utilizaron diluciones 1/100, 1/250, 1/500 y 1/1000 del extracto de control positivo.
Se analizó una porción de 8 a 10 µL de los productos de amplificación obtenidos
por electroforesis en gel de agarosa al 2%, éstos fueron visualizados con luz UV
luego de tinción con bromuro de etidio.
I.4.5.4.3 Ensayo con cebador BunC para amplificación de la
secuencia completa del segmento S
Se implementó un ensayo para amplificar la secuencia completa del
segmento S del ARN genómico de ortobunyavirus (Nunes et al. 2005) utilizando
12
el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR. El ensayo BunC se basa en el uso de un
cebador complementario a los extremos conservados de los tres segmentos
genómicos de los bunyavirus del gurpo C del género Orthobunyavirus (Nunes et
al. 2005). Debido al largo tamaño de los segmentos, solo se puede amplificar
fácilmente el segmento S, el más pequeño. Los productos de amplificación del
ensayo BunC tienen un tamaño aproximada de 900 pb. La composición de las
mezclas de reacción fue: 5 µL de extracto de ARN, 2 µM cebador (BunC
5'-AGTAGTGTGCTCCAC-3'), soluciones de enzimas y mezcla de reacción del
kit en concentración 1X y agua libre de ARNasas suficiente para alcanzar un
volumen de 20 µL. Las mezclas de reacción fueron analizadas mediante un
RT-PCR de un solo paso. Se utilizó el mismo programa de amplificación utilizado
para el ensayo Cal/Bwa. Como templado de ARN se utilizaron diluciones 1/100,
1/250, 1/500 y 1/1000 del extracto de control positivo. Un ensayo se consideró
exitoso si: a) no hubo amplificación en los controles negativos y b) hubo
amplificación en los controles positivos del tamaño esperado. Se analizó una
porción de 8 a 10 µL de los productos de amplificación obtenidos por
electroforesis en gel de agarosa al 2%, éstos fueron visualizados con luz UV luego
de tinción con bromuro de etidio.
I.4.5.4.4 Detección de Bunyavirus en muestras de zancudos
Como prueba inicial se utilizó el ensayo de RT-PCR Cal/Bwa para analizar
el ARN extraído de los grupos de zancudos. Todas las muestras positivas para este
ensayo fueron analizadas con el ensayo RT-PCR con el cebador BunC, para
amplificar la secuencia completa del segmento S. Se analizó una porción de 8 a 10
µL de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis en gel de
agarosa al 2%, éstos fueron visualizados con luz UV luego de tinción con bromuro
de etidio.
13
I.4.5.4.5 Aislamiento viral
Las muestras fueron enviadas para el aislamiento viral por colaboradores
de la División de Enfermedades Transmitidas por Vectores de los Centros para el
Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (DVBID-CDC) en
Fort Collins, Denver, Colorado.
I.4.6 La Técnica Estadística
Para analizar la tasa mínima de infección (MIR) por bunyavirus en los
zancudos analizados se utilizó un método de estimación de máxima verosimilitud
(MLE, por sus siglas en inglés). Este método está basado en la estimación de la
probabilidad de infección de un solo zancudo en base a los resultados negativos
del tamizaje molecular (Lampman y Novak 2004). Para analizar los datos se
utilizó el programa PooledInfRate, version 3.0 (Biggerstaff, 2006). Para el calculo
de estos datos se utilizó el total de lotes analizados, la cantidad de zancudos por lote
(de 1 a 50) y el total de zancudos.
Se realizó un Análisis de Varianza de Friedman para determinar si la
densidad relativa de Culex (Melanoconion) taeniopus varía con el tiempo de una
manera significativa. Por otro lado, se realizó una correlación de Spearman para
determinar si hay una correlación entre la densidad relativa de los zancudos y la
tasa de infección por bunyavirus en Cx. taeniopus.
I.4.7 Los instrumentos utilizados
Para desarrollo de este proyecto los materiales y equipo que se utilizaron fueron
los siguientes:
I.4.7.1 Equipo:
Cámara de electroforesis (RunOne)
Pipetas
Campana de extracción de químicos
Cámara de detección de geles
14
Termociclador Convencional
Centrífuga
Congelador -20
Congelador -70
Refrigeradoras
Autoclave
Agitador
Campana de Bioseguridad III
I.4.7.2 Suministros y Reactivos:
Tubos criogénicos
Cajas para almanecaje a -70C
Tubos cónicos
Guantes
Tubitos PCR en serie
Tapaderas tubos PCR en serie
Placas PCR
Puntas bloqueadas 10ul
Puntas bloqueadas 1000ul
Puntas bloqueadas 200ul
Puntas bloqueadas 20ul
Kit extracción ARN (QIAamp viral RNA)
Etanol
Buffer TBE 10X
Kit RT-PCR (QuantiTect SYBR Green)
Primers
Agarosa
15
PARTE II
II.1. MARCO TEORICO
II.1.1 Generalidades de los Bunyavirus
Los arbovirus reciben su nombre de “Arthropod borne virus”, ya que son
transmitidos por artrópodos. Son mantenidos en la naturaleza en ciclos zoonóticos
por estos artrópodos (vectores) que pueden ser zancudos. Después de la infección,
los vectores son capaces de transmitir el virus en el momento de ingerir sangre de
un hospedero amplificador, que son en su mayoría aves y mamíferos (Figueireo
2007). Dentro de los arbovirus se encuentran virus pertenecientes a diversas
familias: Togaviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae y Bunyaviridae
(Knipe, 2001). Dentro de esta última familia se encuentra el género Bunyavirus.
Este género contiene más de 150 virus divididos en varios grupos que se han
encontrado alrededor del mundo (Knipe, 2001).
La familia Bunyaviridae comprende un grupo grande de arbovirus,
compuesto por más de 300 especies (Soldan y González-Scarano 2005). Está
dividida en los géneros Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus y Phlebovirus,
con virus que pueden infectar vertebrados, y el género Tospovirus, con virus que
infectan plantas (Schmaljohn y Hooper 2001). La mayoría de bunyavirus son
transmitidos por artrópodos, excepto los pertenecientes al género Hantavirus
(Schmaljohn y Hooper 2001). Cada hantavirus se encuentra asociado a una
especie de roedor (subfamilias Sigmodontinae, Murinae y Arvicolinae) como
hospedero natural, con la que se ha relacionado por cientos de miles de años
(Zeier et al. 2005).
16
II.1.2 Características moleculares de Bunyavirus
En la figura 2 se muestra la estructura de los viriones y del genoma de los
Bunyavirus.
diámetro.
Los viriones son esféricos, tienen aproximadamente 100 nm de
Tienen una envoltura lipídica derivada de la célula del hospedero
(Wattam, 2006). El genoma es de ARN de una sola hebra en sentido negativo, o
puede ser también ambisentido. Este genoma segmentado de ARN y consta de
consta de tres segmentos, llamados grande, mediano y pequeño (segmento L, M y
S, respectivamente, por sus siglas en inglés).
El segmento L codifica la RdRp (proteína L) con una estrategia de
transcripción-traducción (polaridad) de sentido negativo. El segmento M codifica
las glicoproteínas de superficie Gn y Gc con una polaridad negativa. En algunos
géneros (Orthobunyavirus, Phlebovirus y Tospovirus) el segmento M también
codifica una proteína no estructural (NSM), en el mismo marco abierto de lectura
(ORF, por sus siglas en inglés). El segmento S codifica la proteína de la
nucleocápside (N) con una polaridad negativa.
En los ortobunyavirus también codifica una proteína no estructural (NSS),
en un ORF traslapado. Los virus de los géneros Phlebovirus y Tospovirus utilizan
una estrategia ambisentido para expresar dos proteínas, N y NSS (Schmaljohn y
Hooper 2001 y Beaty et al, 1982). Los tres segmentos tienen secuencias muy
conservadas en los extremos, pero difieren de virus de otros géneros.
Esta
característica permite diferenciarlos de virus de otros géneros y de la misma
familia: Bunyaviridae (Knipe, 2001).
17
Figura 2. Estructura de: (a) los viriones y (b) del genoma de los Orthobunyavirus.
Fuente: Tomado de Swiss Institute of Bioinformatics 2010.
(a)
(b)
18
Se ha observado la capacidad de reorganización génica en virus de los
géneros Orthobunyavirus (virus de los serogrupos Bunyanwera, California y
Grupo C), Hantavirus y Nairovirus (de Brito et al. 2007, Reese et al. 2008). Esta
reorganización se puede dar en células con infección dual por bunyavirus
relacionados (mismo género). Al replicarse los dos virus en la misma célula, los
segmentos del genoma se pueden reorganizar al empacarse el virión (de Brito et
al. 2007). Se ha conseguido obtener virus con genoma reorganizado al infectar
zancudos en el laboratorio, con una tasa alta de reorganización. A pesar de esto,
no se ha podido observar reorganización del genoma viral en mamíferos pequeños
(Borucki et al. 2002). Recientemente se comprobó la reorganización del genoma
de La Crosse virus (LACV, Ortobunyavirus: Bunyaviridae) en la naturaleza.
Zancudos de la especie Aedes triseriatus de regiones donde circulan dos genotipos
del virus mostraron infección por un tercer genotipo, que contenía segmentos del
genoma de los dos virus (Reese et al. 2008). En la Figura 3 muestra un ejemplo.
Figura 3: Ilustración de la reorganización genómica en un bunyavirus.
Cada panel es una representación de un genoma tripartito. Si una célula susceptible es infectada a la
vez por dos virus A y B diferentes pero relacionados, el ensamblaje viral podría generar un virus
reorganizado C, con segmentos de ambos virus. Una misma infección dual puede generar muchos
virus reorganizados.
Fuente: Reese et al. 2008
19
Los bunyavirus tienen una secuencia terminal conservada (STC) en los
extremos 5’ y 3’ de sus tres segmentos. Esta secuencia permite un apareamiento
de los extremos, generando una estructura estable de ARN circular de unión no
covalente, incluso al estar asociado con la proteína N (Schmaljohn y Hooper
2001). Estudios en LACV muestran que la STC es complementaria a partes del
ARNm de genes conservados en zancudos del género Aedes y otros dípteros. Este
ARNm es utilizado como cebador para la replicación y transcripción del genoma
viral en el artrópodo (Borucki et al. 2002). Esa interacción entre virus-vector
podría explicar la alta conservación de la STC. Otra función de la STC ha sido
observada en Bunyamwera virus (BUNV) mediante estudios de mutagénesis
dirigida. En estos estudios se observó que algunos nucleótidos de las STC son
esenciales para la señalización de la transcripción (Barr y Wertz 2005, Barr et al.
2005). Estas características de los ortobunyavirus han sido utilizadas para realizar
estudios del genoma viral
II.1.3 Replicación
El primer paso para la replicación del virus (Figura 4) es la unión del virus a
la célula, mediada por las glicoproteínas virales y receptores celulares (Schmaljohn
y Hooper 2001). La proteína Gn proteína se ha asociado a la capacidad del virus de
alcanzar altas viremias en la circulación periférica (virulencia periférica). También
se ha asociado a su capacidad para invadir tejido nervioso (neuroinvasividad)
(Borucki et al. 2002). Se ha propuesto que la proteína Gc puede ser un ligando de
los receptores celulares en los zancudos. También se ha involucrado a la proteína
Gn como ligando en tejidos específicos de zancudos (Schmaljohn y Hooper 2001,
Borucki et al. 2002). En un segundo paso, el virión ingresa a la célula blanco
mediante fagocitosis. Se cree que la acidificación del endosoma induce un cambio
conformacional en Gn y Gc, facilitando la fusión de las membranas viral y celular y
permitiendo la entrada de las ribonucleocápsides y la RdRp al citoplasma
(Schmaljohn y Hooper 2001).
20
En el citoplasma, ocurre la transcripción primaria del ARNm a partir de
plantillas del genoma. Para esto se utiliza cebadores metilados, derivados de ARN
mensajero del hospedero (Schmaljohn y Hooper 2001). Bunyaviridae es la única
familia de arbovirus que utiliza cebadores de transcripción derivados del
hospedero (Borucki et al. 2002). Se ha observado que solamente son necesarias
las proteínas L y N para la transcripción del ARN viral (Kukkonen et al. 2005). La
traducción del ARNc generado a partir de los segmentos L y S se realiza por
ribosomas libres. La traducción del ARNc del segmento M es realizada por
ribosomas unidos a membrana, en el retículo endoplasmático rugoso. La
transcripción del genoma completo a ARNc es realizada por la RdRp. Se presume
que para esto es necesaria la proteína N, pero no se ha identificado los factores
virales o celulares asociados (Schmaljohn y Hooper 2001). Se ha sugerido que la
proteína N actúa como una chaperona de ARN (Mir y Panganiban 2006).
La morfogénesis incluye la acumulación de las glicoproteínas primarias
Gn y Gc en el aparato de Golgi, glicosilación N-terminal y adquisición de
membranas modificadas del hospedero por gemación hacia adentro de la cisterna
del Golgi. Después hay una fusión de las vesículas citoplásmicas con la membrana
plasmática y se libera los viriones maduros (Schmaljohn y Hooper 2001).
Se ha observado diferencias entre la replicación en hospederos vertebrados
y zancudos. Aparentemente, algunos procesos de regulación asociados a la
transcripción del genoma viral a ARNm están fuertemente controlados por el
metabolismo de los ovarios de los zancudos. Estos procesos permitirían una
transmisión transovárica muy efectiva, generando progenie infectada (Borucki et
al. 2002).
21
Figura 4: Ciclo de replicación de los virus de la familia Bunyaviridae.
Fuente: Tomado y modificado de Schmaljohn y Nichol 2007.
II.1.4 Estudios basados en el genoma viral
Históricamente se clasificaba los bunyavirus en base a sus relaciones
antigénicas (Schmaljohn y Hooper 2001). Se utilizaba pruebas como fijación del
complemento, neutralización e inhibición de la hemoaglutinación para determinar
esas relaciones (Nunes et al. 2005). En base a las propiedades determinadas por
22
estas pruebas, se dividió los géneros en serogrupos. Los serogrupos, a su vez,
eran divididos en complejos formados por virus estrechamente relacionados
(Schmaljohn y Hooper 2001). Las propiedades antigénicas de los virus aún se
utilizan para clasificarlos en serogrupos, pero se busca utilizar una clasificación
basada en métodos moleculares, debido a la reproducibilidad, especificidad y
rapidez de éstos (de Brito et al. 2007, Nakouné et al. 2007, Arai et al. 2008,
Quinan et al. 2008, Yadav et al. 2008, Lambert y Lanciotti 2009).
Como resultado de la caracterización genética de algunos bunyavirus se cuenta
con información para diseñar cebadores específicos. Se ha publicado una gran
variedad de ensayos para detección de ácidos nucleicos de bunyavirus. En 2009 se
publicó ensayos que permiten detectar 47 virus diferentes de la familia
Bunyaviridae (Lambert y Lanciotti 2009). Para esto los investigadores diseñaron
cebadores basados en secuencias de consenso de bunyavirus pertenecientes a
distintos géneros y serogrupos. Con esa metodología lograron amplificar
secuencias del segmento S de los virus analizados mediante reacciones de
RT-PCR con múltiples cebadores (comúnmente llamadas múltiplex).
Otro enfoque para amplificar los ácidos nucleicos de bunyavirus es utilizar
cebadores dirigidos a la secuencia terminal conservada (STC). Se ha utilizado
variaciones de la STC del género Ortobunyavirus para detectar diversas especies
(Dunn et al. 1994, Nunes et al. 2005, Nakouné et al. 2007, Lambert y Lanciotti
2008, Mores et al. 2009; M.E. Morales-Betoulle, comunicación personal).
II.1.5 Principales enfermedades asociadas a los bunyavirus
Entre los bunyavirus transmitidos por artrópodos se encuentra muchos
virus zoonóticos. Los síndromes asociados a éstos son variados. Los bunyavirus
presentes en América se asocian principalmente a dos síndromes: encefalítico
(sobre todo serogrupos California y Bunyamwera) (Kuno et al. 1996) y febril
(sobre todo Grupo C) (Nunes et al. 2005). Entre los bunyavirus más estudiados
23
que causan encefalitis se encuentra La Crosse virus. La infección en niños con
este virus provoca una encefalitis aséptica, así mismo, la presencia de anticuerpos
contra LACV se ha correlacionado con enfermedades mentales que requieren de
cuidados especializados (Borucki et al. 2002, Reese et al. 2008).
Los ortobunyavirus del Grupo C causan comúnmente un síndrome febril,
muy similar al presentado por una persona enferma con Dengue (Scherer et al
1983, Scherer et al 1986). Durante estudios de VEEV en Guatemala, dos
investigadores del equipo contrajeron una enfermedad febril súbita con síntomas
similares al Dengue. En ambos casos se identificó al agente causal como NEPV
(Scherer et al. 1983).
II.1.6 Ecología y distribución
Los bunyavirus transmitidos por artrópodos se mantienen en la naturaleza
principalmente por dos ciclos: ciclo en reservorios artrópodos y ciclo de
amplificación en vertebrados
El ciclo en reservorios artrópodos perpetúa la
transmisión del virus entre los zancudos. Un zancudo hembra infectado puede
transmitir verticalmente el virus a su descendencia (Borucki et al. 2002). Debido a
la transmisión vertical, el virus puede sobrevivir el invierno en regiones
templadas. Los zancudos machos infectados verticalmente pueden transmitir el
virus, por vía venérea, a hembras no infectadas (Soldan y González-Scarano
2005).
En el ciclo de amplificación enzoótico se involucra la participación de
mamíferos pequeños. Al alimentarse de éstos, las hembras infectadas pueden
transmitir el virus al mamífero. El mamífero puede desarrollar una viremia corta y
alta, con capacidad para infectar otros artrópodos hematófagos. Si un artrópodo
infectado se alimenta de un humano (Figura 5), puede ocurrir una infección
zoonótica (Nichol 2001, Soldan y González-Scarano 2005). También se ha
observado ciclos de amplificación urbana que originan epidemias (Moraes 2007).
En los tres géneros de bunyavirus transmitidos por artrópodos se puede encontrar
24
virus que utilizan como vector alguna especie de zancudo (Nichol 2001). Los
ortobunyavirus utilizan como vectores principalmente zancudos, incluidos los
géneros Culex y Aedes (Moraes 2007, Reese 2008).
Figura 5. Patogénesis de Orthobunyavirus en humanos.
Fuente: Modificada de Wattam, 2006
25
La mayoría de estudios sobre bunyavirus, realizados en América tropical o
subtropical, se originan principalmente en Brasil (Nunes 2005, de Brito 2007,
Moraes 2007, Quinan 2008). En otros países se ha estudiado casos de infección
humana por bunyavirus emergentes (Scherer et al. 1983, Tauro et al. 2009). Entre
1968 y 1980 un equipo realizó estudios sobre Venezuelan equine encephalitis virus
(VEEV, Alphavirus: Togaviridae) en Guatemala (Scherer et al. 1986, Scherer et al.
1985, Cupp et al. 1986). Aunque el objetivo era analizar la ecología de VEEV,
durante esos estudios se obtuvo 34 aislados de diversos ortobunyavirus. Entre los
virus aislados se encontraron 28 del grupo C y 6 del grupo PAT. En total, se
identificaron siete aislados como Nepuyo virus (NEPV) y tres como Patois virus
(PATV). De estos virus, 31 fueron aislados de hámsteres centinela en La Avellana,
Santa Rosa, y Puerto Barrios, Izabal (Scherer et al. 1985). Dos aislados de NEPV se
obtuvieron de personas con enfermedad febril, también en Guatemala (Scherer et al.
1983). El único aislado viral de zancudos macerados provino de un grupo de Cx.
taeniopus y fue identificado como NEPV (Cupp et al. 1986).
I.2.7 Artrópodos vectores de bunyavirus
Los arbovirus de la familia Bunyaviridae utilizan una variedad de
artrópodos para su transmisión en la naturaleza. Los ortobunyavirus utilizan como
vectores principalmente zancudos, además de moscas culicoides y flebotominas
(Nichol 2001). Entre los zancudos vectores de ortobunyavirus en América se
encuentra varias especies del género Aedes (LeDuc 1987, Borucki et al. 2002,
Soldan y González-Scarano 2005, Moraes et al. 2007, Reese et al. 2008, Tauro et
al. 2009) y varias especies del género Culex (Scherer et al. 1976, LeDuc 1987,
Nunes et al. 2005, Soldan y González-Scarano 2005, Moraes et al. 2007, Tauro et
al. 2008, Yadav et al. 2008).
En Guatemala se aisló Nepuyo virus de zancudos Culex (Melanoconion)
taeniopus (Diptera: Culicidae) (Cupp et al. 1986). La sistemática de estos
zancudos ha sido muy discutida (Galindo 1969, Cupp et al. 1989, Williams y
Savage 2009). Es generalmente aceptado que la identificación hasta especie de
26
hembras adultas del subgénero Melanoconion es muy complicada y requiere
mucha experiencia. Debido a esto, muchos zancudos son solamente identificados
como pertenecientes al complejo Cx. taeniopus (Cupp et al. 1989). Las técnicas de
identificación actuales son tediosas y consumen mucho tiempo. Si se encuentra
que estos zancudos son vectores importantes de arbovirus será necesario
desarrollar nuevas técnicas, más apropiadas para la identificación rutinaria (Cupp
et al. 1989, Williams y Savage 2009).
Los zancudos del complejo Cx. taeniopus se encuentran distribuidos desde
el norte de Suramérica hasta el sur de Florida y el Caribe (Cupp et al. 1989). Se ha
encontrado que estos zancudos son comunes en hábitats boscosos y húmedos, y en
áreas peridomiciliares cercanas. La abundancia de hojas muertas y escombros de
árboles es favorable para la presencia de formas inmaduras de Cx. taeniopus
(Galindo 1969). En pocas ocasiones es posible encontrar los estadíos larvarios en
la naturaleza (M. Williams y H.M. Savage, comunicación personal). En hábitats
modificados, principalmente los cercanos a bosques secundarios, Cx. taeniopus es
uno de los grupos dominantes y presenta actividad desde el comienzo de la noche
(Cupp et al. 1986, Forattini et al. 1991).
Se ha encontrado que las hembras de Cx. taeniopus (Figura 6) son atraídas
por una variedad de hospederos vertebrados (Forattini et al. 1991). En Guatemala,
se determinó que estos zancudos se alimentan principalmente de mamíferos,
grandes y pequeños, incluidos los humanos, y aves. También se determinó que
pueden llegar a alimentarse de reptiles, cuando estos se encuentran en un ambiente
peridomiciliar (Cupp et al. 1986).
Cx. taeniopus es un vector conocido de arbovirus como el VEEV (Cupp et
al. 1979, Scherer et al. 1987). El papel de Cx. taeniopus en la transmisión de
bunyavirus ha sido sugerido por evidencia circunstancial. El aislamiento de
bunyavirus a partir de Cx. taeniopus en un hábitat con transmisión del virus
sugiere un papel de estos zancudos en la ecología viral (Cupp et al. 1986), pero no
comprueba un papel como vector. La transmisión de diversos arbovirus por Cx.
taeniopus ha sido evaluada de forma experimental. En base a esos estudios, se
27
sospecha que Cx. taeniopus puede ser un vector de ortobunyavirus como
Caraparu virus, Oriboca virus y Guama virus (Galindo y Srihongse 1967, Toda y
Shope 1967).
Figura 6: Hembra adulta de Cx. taeniopus.
Fuente: Colección de referencia del Laboratorio de Entomología Sistemática,
Departamento de Biología, Universidad del Valle de Guatemala.
I.2.8 Diagnóstico
Existe una amplia variedad de ensayos serológicos que se han utilizado
para el diagnóstico de infecciones causadas por virus del género Bunyavirus.
Entre estos se encuentran: la inhibición de hemaglutinación, neutralización y
ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”) para la detección de
inmunoglobulinas M y G (Nichol, 2001; Morales-Betoulle et al., 2001).
Para diagnosticar e identificar a los bunyavirus a partir de vectores se
puede aplicar algunas técnicas serológicas de detección de antígeno, sin embargo
el estándar de oro consiste en realizar aislados virales por medio de cultivo en
28
líneas celulares. Todas estas técnicas consumen tiempo y son en general muy
laboriosas o requieren de laboratorios de bio-seguridad de un nivel elevado (ej.
laboratorios de clase 3). Si se quiere trabajar con un gran número de especimenes
(e.g. zancudos), estas técnicas no necesariamente son las más adecuadas (Kuno et
al, 1996). Por lo tanto, es importante el desarrollo de técnicas más eficientes, que
consuman menos tiempo, y que eventualmente permitan identificar los diferentes
serotipos de Bunyavirus, como por ejemplo la detección molecular del ARN viral
por medio de RT-PCR (trascripción reversa seguida de la reacción en cadena de la
polimerasa).
29
PARTE III
III.1. RESULTADOS
III.1.1 Captura e identificación de zancudos
Para este trabajo se utilizaron zancudos capturados previamente en el marco
del estudio de vigilancia ecológica del West Nile virus, en el CES-UVG/CDC-CAP.
Durante este período se capturaron zancudos del género Culex pertenecientes al
menos 12 especies diferentes (Cuadro 1).
Cuadro 1. Listado de especies de zancudos del género Culex, capturados en
Puerto Barrios Izabal, 2007-2009
Listado de especies del género Culex
Culex( Culex) quinquefasciatus
Culex (Culex) interrogator
Culex (Culex) chidesteri
Culex (Culex) complejo coronador
Culex (Culex) corniger-lactator
Culex (Culex) declarator mollis
Culex (Culex) inflictus
Culex (Culex) mollis-inflictus
Culex (Culex) nigripalpus
Culex (Melanoconion) erraticus
Culex (Melanoconion) taeniopus
Culex (Melanoconion) theobaldi
Culex Melanoconion sp1
Fuente: Proyecto FODECYT 03-2007 y Estudio de vigilancia ecológica del West Nile virus, CESUVG/CDC-CAP.
1
Se incluyen tres especies que no pudieoron ser identificadas con la clave dicotomica disponible para
identificación de zancudos de Guatemala.
Para la detección de Bunyavirus se utilizó únicamente los zancudos
capturados e identificados de la especie Culex (Melaconion) taeniopus. Como se
mencionó anteriormente, esta especie fue seleccionada debido a que varias de las
epecies Culex (Melanoconion) incluyendo Cx. taeniopus son especies candidatas
30
vector de ortobunyavirus (Cupp et al. 1986, Galindo y Srihongse 1967, Toda y Shope
1967).
III.1.2 Extracción de ARN viral y control interno
Se observó que ambas metodologías de extracción de ARN (Roche y
Qiagen) fueron eficientes al realizar un PCR para la amplificación del ARN
ribosomal 18S de los zancudos.
Las muestras probadas para este ensayo
mostraron el producto esperado de alrededor de 500 pares de bases, indicando que
las extracciones fueron exitosas (Figura 8). Una vez comprobada la eficiencia de
ambas metodologías, se realizaron un total de 5 extracciones de ARN, cada una
con 23 lotes de zancudos y un control negativo.
Figura 7. Verificación de la calidad del ARN extraído utilizando distintos
kits comerciales por medio del ensayo de PCR 18S
Panel A) Los carriles 1 al 10 corresponden a las muestras extraídas con el kit comercial Qiagen.
Los carriles del 11 al 20 corresponden a las muestras extraídas con el kit comercial Roche. Panel
B) los carriles 1-2 corresponden a los controles negativos de extracción con el kit comercial
Qiagen, los carriles 3-4 corresponden a los controles negativos de extracción con el kit comercial
Roche, los carriles 5-6 corresponden a los controles negativos sin templado.
Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008
31
III.1.3 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación del
ARN viral
Se llevó a cabo la implementación de los ensayos de RT-PCR de punto
final (convencional)
para la detección de orthobunyavirus
utilizando los
parámetros de reacción previamente publicadas (Lambert y Lanciotti 2009). Para
esto, se modificó la composición de la mezcla de reacción del ensayo BunC para
así acoplarlo a las mismas condiciones de temperatura y tiempo del ensayo
Cal/Bwa (Figura 8). Un ensayo se consideró optimizado si se observaba claramente
un producto de amplificación de la longitud esperada.
Tanto para el ensayo
Cal/Bwa como para el ensayo BunC se observó amplificación del control positivo
INKV, indicando que su preparación fue exitosa.
Además se observó
amplificación utilizando diluciones del control positivo en un rango de entre 1/00
hasta 1/1000.
Figura 8. Ensayo inicial de RT-PCR para detección de Orthobunyavirus.
MM 1
2
3
4
5
6
A
7
MM 1
8
B
2
3
INKV
4
5
6
7
8
Neg.
~900 1000 pb
~210 pb
En el panel A se observa los productos del ensayo Cal/Bwa. En el panel B se observa los
productos del ensayo BunC. Los carriles 1-4 son diluciones 1/100, 1/250, 1/500 y 1/1000
del control de INKV. Los carriles 5-8 son controles negativos duplicados, de agua y sin
plantilla.
Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008
32
Adicionalmente, se redujo el volumen de reacción propuesto (50 μL) a 20
μL con el fin de utilizar menos reactivos y una menor cantidad de muestra (Figura
9).
Se observó que la disminución del volumen de reacción no afectó la
amplificación en ninguna de las distintas diluciones probadas.
Figura 9: Ensayo optimizado de RT-PCR para detección de Orthobunyavirus
utilizando distintos volúmenes de reacción
MM 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
A
INKV, 50 µL
INKV, 20 µL
~200 pb
B
~900 pb
En el panel A se observan los productos de amplificación del ensayo Cal/Bwa. En el panel B se
observan los productos de amplificación del ensayo BunC. Se utilizaron diluciones 1/100, 1/250,
1/500 y 1/1000 del ARN extraído del control de INKV en ambos casos. Los carriles 1-4
corresponden a reacciones de 50 µL con diluciones de INKV como plantilla, los carriles 8-11 a
reacciones de 20 µL. Los carriles 5 y 7 son controles negativos para las reacciones de 50 y 20 µL.
Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008
III.1.4 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus
Para detectar el ARN genómico de ortobunyavirus en las muestras de
zancudos se utilizaron las pruebas estandarizadas (Figura 10). Las muestras que
presentaron amplificación para ambos ensayos (Cal/Bwa y BunC), una banda clara
del tamaño esperado, fueron consideradas positivas.
33
Cneg
INKV
MM
INKV
MM
Cneg
Figura 10. Productos de amplificación del RT-PCR Cal/Bwa para detección de
ortobunyavirus utilizando muestras de zancudos Culex (Melanoconion) taeniopus
colectados en Puerto Barrios, Izabal.
En ambos paneles (A y B) los extremos izquierdo y derecho son marcadores moleculares de ADN
de doble hebra con masa molecular a intervalos de 100 pb. Los carriles 1-21 contienen productos
de amplificación de reacciones con muestra. El carril 22 contiene control negativo de agua y el
carril 23 contiene control positivo de INKV. Las bandas de amplificación del tamaño esperado se
muestran rodeadas por un círculo blanco.
Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008
Se analizó un total de 114 lotes de zancudos, en 16 de éstos se detectó la
posible presencia de orthobunyavirus por los ensayos estandarizados. En el ensayo
BunC se observó amplificación inespecífica de ácidos nucleicos (datos no mostrados),
en este caso, las muestras fueron consideradas sospechosas. Todas las muestras que
no presentaron amplificación alguna fueron consideradas negativas.
El cuadro 2 muestra los datos de cada lote de Cx. taeniopus positivo para
ortobunyavirus. Con estos datos se calculó la tasa de infección por el método
34
MLE para Cx. taeniopus. Adicionalmente, se determinó que la tasa de infección
por año de bunyavirus en los zancudos procesados fue de 4.77*1000
(IC95%=2.47,8.45)
zancudos
probados
para
2007
(IC95%=5.65,25.51) zancudos probados para 2008.
y
de
12.72*1000
En 2009 no se detectó
presencia de bunyavirus por el método utilizado.
Cuadro 2. Tasas de infección mensuales por bunyavirus en Cx. taeniopus.
Lotes
Zancudos
Año Mes
Capturados
Cantidad
Positivos
MLE
1
1
1
1
--7
301
9
1
3.63
2007 8
1198
29
4
3.58
9
229
7
1
4.43
10
441
13
2
5.13
1
6
3
1
183.50
2
193
6
1
5.34
2008 3
63
3
1
16.98
6
10
2
1
225.73
7
54
5
1
21.21
MIR
1000*
3.32
3.34
4.37
4.54
166.67
5.18
15.87
100.00
18.52
Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008.
Se trabajó un total de 114 lotes de zancudos hembra, que contenían 2,942 individuos (MIR= tasa
de infección*1000 zancudos, MLE= estimación de máxima verosímilitud*1000 zancudos). Se
muestra únicamente las tasas de infección indicadas como significativamente mayores a 1 zancudo
infectado por cada 1000 (α = 0.05).
* Estimado no es confiable debido a que la muestra contiene un único zancudo y este es positivo
Se observó que la distribución de Cx. taeniopus es predominantemente rural
y que su densidad relativa varía con el tiempo, disminuyendo anualmente.
Mediante un análisis de varianza de Friedman se determinó que sí hay un cambio
significativo en la densidad relativa media de Cx. taeniopus (p = 0.0377, α =
0.05). Al comparar la tasa de infección por bunyavirus y la densidad relativa de
Cx. taeniopus se observa una similitud en los patrones de ambos (Gráfica 1).
Mediante un análisis de correlación de Spearman se determinó que si hay
correlación entre la densidad relativa y la tasa de infección por bunyavirus en Cx.
taeniopus (r = 0.4360, p = 0.0204, α = 0.05).
35
III.1.5 Aislamiento viral
A pesar que se obtuvó amplificación de bunyavirus por medio de RT-PCR,
no fue posible aislar Bunyavirus a partir de las muestras enviadas de zancudos Cx.
taeniopus.
36
Figura 11. Densidades de zancudos Cx. taeniopus, colectados en Puerto Barrios, Izabal 2007-2009.
Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008
37
III.2 Discusión
El presente proyecto tenía como objetivo la implementación de ensayos
moleculares para la detección de bunyavirus utilizando zancudos del género Culex como
fuente de material genético, con el fin de fortalecer la capacidad nacional para la
detección de estos virus causantes de enfermedades de tipo febril en los humanos.
III.2.1 Extracción de ARN viral y control interno
Como se mencionó anteriormente, fue posible llevar a cabo la extracción de ARN
exitosamente a partir de zancudos utilizando dos distintos kits comerciales (Roche y
Qiagen). Es importante mencionar que cada vez que se utiliza un nuevo kit comercial, o
cuando se trabaja con distintas fuentes de material genético (sangre, tejidos, etc), en
necesario llevar a cabo pruebas utilizando un control interno (en este caso, la
amplificación del ARN 18S) para así garantizar los resultados obtenidos por los ensayos
moleculares
III.2.2 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación del ARN viral
Fue posible disminuir el volumen de reacción para ambos ensayos de PCR. Esto
es de importancia, ya que muchas veces a una misma muestra se le deben realizar varias
pruebas de diagnóstico. De igual manera, al momento de implementar una técnica es
necesario optimizar la cantidad de material para disminuir los costos y poder analizar una
mayor cantidad de muestras.
Como se mencionó en la sección de resultados, fue posible utilizar el mismo
programa de amplificación para ambos ensayos (BunC/CalBwa). Aún cuando este no es
un ensayo de PCR multiplex, es posible aprovechar las condiciones de los ciclos de
temperatura necesarios para la amplificación del virus al momento de tener la necesidad
de realizar ambos ensayos.
38
Una de las principales limitantes al momento de estandarizar un ensayo de RTPCR es la elección de un control positivo adecuado. En este caso se eligió el ARN de
Inkoo virus (INKV, Orthobunyavirus) no viable. INKV es un ortobunyavirus del
serogrupo California/Bunyamwera presente únicamente en Europa (Schmaljohn y
Hooper 2001). Ya que este virus no circula en América, utilizarlo como control positivo
provee la ventaja de un control de calidad: si se observa un resultado positivo a partir de
una reacción en que se utilizó como plantilla ARN extraído de una muestra, se puede
secuenciar el producto de amplificación. Si la secuencia coincide completamente con la
de INKV se puede concluir que el resultado es debido a una contaminación y, por lo
tanto, es inválido.
Se observó que el ensayo BunC puede generar amplificación inespecífica porque
se utiliza un solo cebador corto (15 b) y es posible que se una inespecíficamente en
ácidos nucleicos con secuencias similares. Debido a esto, se optó por considerar
presuntamente positiva una muestra con amplificación del tamaño esperado para el
ensayo Cal/Bwa.
Con la implementación de la capacidad dianósitca por medio de pruebas
moleculares de RT-PCR convencional para la detección de bunyavirus en Guatemala, se
cuenta con una herramienta más para la investigación de agentes virales zoonóticos que
circulan en el país.
39
III.2.3 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus
Se obtuvo amplificación de ARN de bunyavirus a partir de Cx. taenipus. Esto
sugiere que estos zancudos podrían estar implicados en el ciclo de transmisión de estos
virus, actuando como potenciales vectores. Esto apoya los resultados reportados por
Cupp et al. (1986) donde se aisló el virus Nepuyo (bunyavirus) a partir de la misma
especie de zancudo.
La proporción de zancudos infectados en un período de tiempo se estima
comúnmente como la tasa mínima de infección (MIR, por sus siglas en inglés). Este
estimado esta basado en la suposición de que al menos un
zancudo se encuentra
infectado en cada lote positivo. Debido a que no es posible conocer si más de un zancudo
del lote se encontraba estaba infectado, calcular la MIR puede subestimar el nivel real de
infección (Gu et al. 2003, Katholi y Unnasch 2006). Una alternativa para estimar la tasa
de infección es el método del estimador de máxima verosimilitud (MLE, por sus siglas en
inglés).
En el método MLE se asume que la prueba de detección es perfectamente
sensible y específica (es decir, siempre que hay infección ésta es detectada, y nunca se
detecta si no la hay), que cada zancudo es independiente de los demás (es decir, todos
tienen la misma probabilidad de estar infectados), y que todos los lotes están distribuidos
idénticamente (es decir, agrupar los zancudos no afecta la probabilidad de que estén
infectados). Asumiendo esto, aunque no se puede saber si hay más de un individuo
infectado en un lote positivo, se puede asegurar que no hay individuos infectados en los
lotes negativos. Tomando en cuenta los lotes negativos y la cantidad de zancudos que
contienen, es posible estimar la probabilidad de que un solo zancudo esté infectado en la
población (Barker 2000).
Aunque es posible que la tasa de infección (calculada por el método de MLE) en
algunos meses sea mas alta que en otros, no se pueden realizar conclusiones en base a esa
estimación porque el tamaño de la muestra no cumple con los requisitos mínimos para el
40
estimador MLE (Condotta et al. 2004). Por esta razón, se calcularon las tasas de
infección por año. Respecto a la tasa de infeccion, se observó que en 2008 fue mayor a
2007. Hay que considerar que la densidad de zancudos en 2007 fue mayor a 2008, esto
puede tener un efecto de dilución en la incidencia del virus en zancudos, resultando en
una menor tasa de infección estimada. En 2009 no se detectó la presencia de bunyavirus
en zancudos Cx. taeniopus, sin embargo, esto no significa que el o los virus no estén
circulando.
Los límites de confianza para el MLE son un reflejo del sesgo del estimador
(Katholi y Unnasch 2006). Es decir, mientras mayor sea el rango de confianza menos
exacto es el estimado. Debido a que la cantidad de lotes por cada mes es baja, los
estimados de tasa de infección cero (p.e. febrero 2007) tienen límites de confianza muy
amplios. Esto es porque con la cantidad de información disponible (p.e. lotes negativos)
no es posible asegurar que la tasa de infección sea realmente cero.
Se puede observar que la tasa de infección estimada por ambos métodos es
similar. Se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney que no hay una diferencia
significativa entre las tasas de infección calculadas por cada método (p = 0.5787, α =
0.05). Esto sugiere que la tasa de infección estimada es cercana a la tasa de infección real,
ya que MIR estima la tasa mínima de infección posible con los resultados obtenidos.
La detección de un pico de tasa de infección con un retraso respecto al pico de
densidad relativa puede tener varias explicaciones. Podría ser que al haber más zancudos
alimentándose, más hospederos vertebrados estén expuestos al virus. Las poblaciones de
posibles hospederos cambian poco en períodos cortos de tiempo, por lo que la
disminución en la población de posibles vectores aumenta la probabilidad de que un
zancudo se alimente de un vertebrado infectado. Esto, a su vez, aumenta la probabilidad
de capturar un zancudo infectado.
III.2.4 Aislamiento viral
Se ha observado en otros virus zoonóticos (Influenza A) que hay una
concordancia entre los resultados obtenidos por medio de técnicas moleculares y las
técnicas de aislamiento viral (Ferro et al 2010) ha reportado en la literatura que los
41
arbovirus presentan dificultad para ser aislados. Sin embargo, para los arbovirus se ha
observado que estos presentan dificultad de ser aislados en el laboratorio (Jubelt 2010).
Los métodos de PCR permiten la detección del material genético del virus, en
este caso, el ARN de bunyavirus, sin embargo, si el virus no se encuentra viable, no
puede llevarse a cabo el aislamiento de éste (H. Savage comunicación personal, DVBIDCDC). Dado el hecho que en este se obtuvo resultados positivos por medio de los
ensayos de PCR es importante continuar con la vigilancia de estos virus con el objeto de
tener aislados virales y lograr secuenciar las cepas circulantes en el país.
42
PARTE IV
IV.1. CONCLUSIONES
IV.1.1. Se implementaron pruebas para la detección de material genético de
ortobunyavirus en zancudos en Guatemala a través de ensayos moleculares
estandarizados.
IV.1.2. Se detectó material genético de ortobunyavirus en los zancudos de la especie
Culex (Melanoconion) taeniopus capturados en Puerto Barrios Izabal, durante 2007 y
2008, por medio de RT-PCR.
IV.1.3. No se obtuvó aislados virales a partir de zancudos Culex (Melanoconion)
taeniopus colectados en Puerto Barrios Izabal, durante el periodo de 2007 a 2009.
IV.1.4. Se obtuvó una tasa de infección de 4.77*1000 zancudos para el año 2007 y de
12.72*1000 zancudos para 2008. En el año 2009 no se detecto bunyavirus circulando
en los zancudos.
43
IV.2. RECOMENDACIONES
Las principales recomendaciones de la investigación son:
IV.2.1. Verificar el funcionamiento del ensayo de detección de ortobunyavirus
utilizando varios bunyavirus de identidad conocida.
IV.2.2. Continuar con estudios sobre la biología de Cx. taeniopus para definir su
importancia como posible vector de bunyavirus u otros arbovirus.
IV.2.3. Estudiar otras poblaciones
de Cx. taeniopus, del género Culex y otros
géneros, como por ejemplo zancudos del género Aedes, con el objetivo de
comprender el ciclo natural de los bunyavirus.
IV.2.4. Continuar con la investigación de bunyavirus de distintos serogrupos y otros
arbovirus en el país tanto en vectores como en humanos y animales posibles
hospederos.
44
IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Alatoom, A. y D. Payne. 2009. An Overview of Arboviruses and Bunyaviruses.
Labmedicine. 40(4): 237-240.
Arai, S. et al. 2008. «Molecular phylogeny of a newfound hantavirus in the Japanese
shrew mole (Urotrichus talpoides)». Proceedings of the National Academy of
Science 105(42):16296-16301.
Barker, J.T. 2000. «Statistical estimators of infection potential based on PCR pool
screening with unequal pool sizes». Tesis Doctoral del Department of Biostatistics,
School of Medical Sciences, The University of Alabama at Birmingham. 77 págs.
Barr, J.N. y G.W. Wertz. 2005. «Role of the Conserved Nucleotide Mismatch within
3’- and 5’-Terminal Regions of Bunyamwera virus in Signaling Transcription»
Journal of Virology. 79(6):3586–3594.
Beaty, B.J., B.R. Miller, R.E. Shope, E.J. Rozhon, y D.H. Bishop. 1982. Molecular
Basis of Bunyavirus per os infección of mosquitoes: Role of the middle-size RNA
segment. Proc. Natl. Acad. Sci. 79:1295-1297.
Biggerstaff, B. 2006. « An Excel® Add-In to compute infection rates from pooled data».
Manual de operación del programa PooledInfRate, versión 3.0. 20 págs.
Borucki, M.K.; B.J. Kempf, B.J. Blitvich, C.D. Blair y B.J. Beaty. 2002. «La Crosse
virus: replication in vertebrate and invertebrate hosts». Microbes and infection.
4:341–350.
45
Condotta, S.A.; F.F. Hunter y M.J. Bidochka. 2004. «West Nile virus Infection Rates
in Pooled and Individual Mosquito Samples». Vector-Borne and Zoonotic
Diseases.
4(3):198–203.
Cupp, E.W.; R.D. Kreutzer y S.C. Weaver. 1989. «The Biosystematics of Culex
(Melanoconion) taeniopus sensu lato in relation to Venezuelan Equine
Encephalomyelitis». Mosquito Systematics. 21(3):216–221.
Cupp, E.W.; W.F. Scherer, J.B. Lok, R.J. Brenner, G.M. Dziem and J.V. Ordonez.
1986. «Entomological studies at an enzootic Venezuelan Equine Encephalitis Virus
focus in Guatemala, 1977-1980». The American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene. 35(4):851–859.
Cupp, E.W.; W.F. Scherer y J.V. Ordonez. 1979. «Transmission of Venezuelan
encephalitis virus by naturally infected Culex (Melanoconion) opisthopus». The
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 28(6):1060-1063.
de Brito, C.L.; B.R. Quinan, R.F.V. Novaes, F.R. dos Santos, E.G. Kroon, C.A.
Bonjardim y P.C.P. Ferreira. 2007. «Caraparu virus (group C Orthobunyavirus):
sequencing and phylogenetic analysis based on the conserved region 3 of the RNA
polymerase gene». Virus Genes. 35:681–684.
Dunn, E.F.; D.C. Pritlove y R.M. Elliott. 1994. «The S RNA genome segments of
Batai, Cache valley, Guaroa, Kairi, Lumbo, Main drain and Northway
bunyaviruses: sequence determination and analysis». Journal of General Virology.
70:1281–1285.
Dégallier, N.; A.P.A. Travassos da Rosa, P.F.C. Vasconcelos, J.P. Hervé, G.C. Sá
Filho, J.F.S. Travassos da Rosa, E.S. Travassos da Rosa y S.G. Rodrigues.
1992. «». Journal of the Brazilian Association for the Advancement of Science.
44(2):124–135.
Elliott, R.M. 2009. «Bunyaviruses and climate change». Clinical Microbiology and
Infection. 15(6):510–517.
46
Ferro, P.; Peterson, M.; Merendino, T.; Nelson, M. y B. Lupiani. 2010. Comparison
of Real-Time
Reverse Transcription-PCR and Virus Isolation for Estimating
Prevalence of Avian Influenza Virus
in
Hunter-Harvested
Waterfowl Wintering Grounds Along the Texas Mid- Gold
Wild
Coast
Ducks
at
(2005-2006
Through 2008-2009) Avian Diseases 54 (S1) 655-659.
Figueireo, L.T. 2007. Emergent arboviruses in Brazil. Revista da Sociedade Brasileira
de Medicina Tropical. 40(2): 224-229.
Forattini, O.P.; A.C. Gomes, I. Kakitani y D. Marucci. 1991. «Observações sobre
domiciliação de mosquitos Culex (Melanoconion), em ambiente com acentuadas
modificações antrópicas». Revista de Saúde Pública. 25(4):257–266.
Galindo. P. 1969. «Notes on the Systematics of Culex (Melanoconion) taeniopus Dyar
and Knab and Related Species, Gathered During Arbovirus Investigations in
Panama». Mosquito Systematics Newsletter. 1(4):82–89.
Galindo, P. y S. Srihongse. 1967. «Transmission of arboviruses to hamsters by the bite
of naturally infected Culex (Melanoconion) mosquitoes». The American Journal of
Tropical Medicine and Hygiene. 16(4):525–530.
Gu, W.; R. Lampman y R.J. Novak. 2003. «Problems in estimating mosquito infection
rates using MIR». Journal of Medical Entomology. 40:595–596.
Hoffmann, P.R.; R.J. Woodrow, P.S. Calimlim, R. Sciulli, P.V. Effler, V. Miyamoto,
A. Imrie, R. Yanagihara y V.R. Nerurkar. 2004. «West Nile virus Surveillance:
A Simple Method for Verifying the Integrity of RNA in Mosquito
(Diptera:Culicidae) Pools». Journal of Medical Entomology. 41(4):731–735.
Jubelt, B. 2010. Viral Infection and Post Viral Syndromes. En: Merritt’s Neurology. 12
edición. Limpicot Williams and Wilkins, Philadelphia, USA. 580pp.
Katholi, C.R. y T.R. Unnasch. 2006. «Important experimental parameters for
determining infection rates in arthropod vectors using pool screening approaches».
The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74(5):779–785.
47
Knipe, D. y M. Peter. 2001. Fields Virolgy. Lippincott Williams & Wilkins. 4ta edición.
Volumen 2. 3087 pp.
Kuno, G.; C.J. Mitchell, G.J. Chang y G.C. Smith. 1996. «Detecting Bunyaviruses of
the Bunyamwera and California Serogroups by a PCR Technique». Journal of
Clinical Microbiology. 34(5):1184–1188.
Kukkonen, S.K.J.; A. Vaheri y A. Plyusnin. 2005. «L protein, the RNA-dependent
RNA polymerase of hantaviruses». Archives of Virology. 150:533–556.
Lambert, A.J. y R.S. Lanciotti. 2009. «Consensus Amplification and Novel Multiplex
Sequencing Method for S Segment Species Identification of 47 Viruses of the
Orthobunyavirus,
Phlebovirus
And
Nairovirus
Genera
of
the
Family
Bunyaviridae». Journal of Clinical Microbiology. 47(8):2398–2404.
Lampman y Novak. 2004. «Assessment of arbovirus vector infection rates using
variable size pooling». Medical Veterinary Entomology. 18(2):200-204.
LeBeaud, A.D. 2008. «Why arboviruses can be neglected tropical diseases». PLoS
Neglected Tropical Diseases 2(6): 247
LeDuc, JW. 1987. «Epidemiology and ecology of the California serogroup viruses». The
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 37(3):60S–68S.
López, M y S. Sosa. 2008. Análisis de Situación de Salud (ASIS). Guatemala.
50pp.
Mir, M.A. y A.T. Panganiban. 2006. «The bunyavirus nucleocapsid protein is an RNA
chaperone: Possible roles in viral RNA panhandle formation and genome
replication». RNA. 12:272–282.
Moraes, L.T. 2007. «Emergent arboviruses in Brazil». Revista da Sociedade Brasileira
de Medicina Tropical. 40(2):224–229.
Mores, C.N.; M.J. Turell, J. Dyer y C.A. Rossi. 2009. «Phylogenetic Relationships
Among Orthobunyaviruses Isolated from Mosquitoes Captured in Peru». VectorBorne and Zoonotic Diseases. 9(1):25–32.
48
Nakouné, E.; S. Gribaldo, C. Finance, A. Le Faou y B.H. Rihn. 2007. «Molecular
characterization of African orthobunyaviruses». The Journal of General Virology.
88:1761–1766.
Nichol, S.T. 2001. «Bunyaviruses». En Fields Virology, de Knipe, D.M. y P.M. Howley
(Editores). 4ª Edición. Philadelphia, P.A., U.S.A. Lippincott Williams & Wilkins.
págs. 1603–1633.
Norris, D.E. 2004. «Mosquito-borne Diseases as a Consequence of Land Use Change».
EcoHealth. 1(1):19–24.
Nunes, M.T.; A.P.A. Travassos da Rosa, S.C. Weaver, R.B. Tesh y P.F.C.
Vasconcelos. 2005. «Molecular Epidemiology of Group C Viruses (Bunyaviridae,
Orthobunyavirus) Isolated in the Americas». Journal of Virology. 79(16):10561–
10570.
Peters, C.J. 2001. The viruses in our past, the viruses in our future. En SGM
Symposium 60: New Challenges to Health: the Threat of Virus Infection, de Smith,
G.L.; Irving, W.L.; McCauley, J.W. y D.J. Rowland (Editores). Cambridge,
Cambridge University Press:. págs. 1–32.
Quinan, B.R.; C.L. de Brito, R.F.V. Novaes, J.R. dos Santos, E.G. Kroon, C.A.
Bonjardim y P.C.P. Ferreira. 2008. «Sequence and phylogenetic analysis of the
large (L) segment of the Tahyna virus genome». Virus Genes. 36:435–437.
Reiter, P. 1983. «A portable, battery-powered trap or collecting gravid Culex
mosquitoes». Mosquito News 43:496-8.
Reese, S.M.; B.J. Blitvich, C.D. Blair, D. Geske, B.J. Beaty y W.C. Black I.V. 2008.
«Potential for La Crosse virus segment reassortment in nature». Virology Journal.
5:164.
Sallum, M.A.M. y O.P. Forattini. 1996. «Revision of the Spissipes section of Culex
(Melanoconion) (Diptera: Culicidae)». Journal of the American Mosquito Control
Association. 12(3):517–600.
49
Scherer W.F.; R.W. Dickerman, J.V. Ordonez, C. Seymour, L.D. Kramer, P.B.
Jahrling y C.D. Powers. 1976. «Ecologic studies of Venezuelan Encephalitis
Virus and isolations of Nepuyo and Patois viruses during 1968-1973 at a marsh
habitat near the epicenter of the 1969 outbreak in Guatemala». The American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 25(1):151–162.
Scherer W.F.; R.W. Dickerman, E.W. Cupp y J.V. Ordonez. 1985. «Ecologic
observations of Venezuelan Encephalitis Virus in vertebrates and isolations of
Nepuyo and Patois viruses from sentinel hamsters at Pacific and Atlantic habitats
in Guatemala, 1968-1980». The American Journal of Tropical Medicine and
Hygiene. 34(4):790–798.
Scherer W.F.; R.W. Dickerman y J.V. Ordonez. 1983. «Enfermedad humana causada
por el virus Nepuyo, un bunyavirus de Mesoamérica transmitido por mosquitos».
Boletín de la Oficina Sanitaria Panamericana. 95(2):111–117.
Scherer W.F.; R.W. Dickerman, J.V. Ordonez, C. Seymour, L.D. Kramer, P.B.
Jahrling y C.D. Powers. 1986. «Ecologic studies of Venezuelan Encephalitis
Virus and isolations of Nepuyo and Patois viruses during 1968-1973 at a marsh
habitat near the epicenter of the 1969 outbreak in Guatemala». The American
Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 25(1):151–162.
Scherer, W.F.; S.C. Weaver, C.A. Taylor, E.W. Cupp, R.W. Dickerman y H.H.
Rubino. 1987. Vector Competence of Culex (Melanoconion) taeniopus for
Allopatric and Epizootic Venezuelan Equine Encephalomyelitis Viruses. The
American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 36(1):194–197.
Schmaljohn, C.S. y J.W. Hooper. 2001. «Bunyaviridae: The Viruses and Their
Replication». En Fields Virology, de Knipe, D.M. y P.M. Howley (Editores). 4ª
Edición. Philadelphia, P.A., U.S.A. Lippincott Williams & Wilkins. págs. 1581–
1602.
50
Schmaljohn, C.S y S.T. Nichol. 2007. «Bunyaviridae». En Fields Virology, de Knipe,
D.M. y P.M. Howley (Editores). 5ª Edición. Philadelphia, P.A., U.S.A. Lippincott
Williams & Wilkins. págs. 1741–1789.
Soldan, S.M. y F. González-Scarano. 2005. «Emerging infectious diseases: The
Bunyaviridae». Journal of Neurovirology. 11:412–423.
Swiss Institute of Bioinformatics. 2010. Bunyaviridae. Viral Zone. Disponible en
http://expasy.org/viralzone/all_by_species/82.html
Tauro, L.B.; F. Ludeña y M.S. Contigiani. 2009. «First detection of human infection
by Cache Valley and Kairi viruses (Orthobunyavirus) in Argentina». Transactions
of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 103:197–199.
Toda, A. y R.E. Shope. 1967. «Transmission of Guamá and Oriboca viruses by naturally
infected mosquitoes». Nature. 208:304.
Vasconcelos, P.F.C.; A.P.A. Travassos da Rosa, F.P. Pinheiro, R.E. Shope, J.F.S.T
Rosa, S.G. Rodrigues, M. Dégallier, E.S. Travassos da Rosa. 1998.
«Arboviruses pathogenic for man in Brazil». En: An overview of arbovirology in
Brazil and neighbouring countries, de Travassos da Rosa, A.P.A.; P.F.C.
Vasconcelos y J.F.S.T Rosa (Editores). Instituto Evandro Chagas, Belém. págs.72–
99.
Vasconcelos, P.F.C.; A.P.A. Travassos da Rosa, S.G. Rodrigues, E.S. Travassos da
Rosa, N. Dégallier y J.F.S. Travassos da Rosa. 2001. «Inadequate management
of natural ecosystem in the Brazilian Amazon region results in the emergence and
reemergence of arboviruses». Cadernos de Saúde Pública. 17(S):155–164.
Wattam, R., 2006.
Bioinformatics
Crimean-Congo Hemorragic Fever (CCHF) Virus.
Institute.
Disponible
Virginia
en:
http://pathport.vbi.vt.edu/pathinfo/pathogens/CCHF_2.html
51
Williams, M. y H.M. Savage. 2009. «Identification of Culex (Melanoconion) Species of
the United States Using Female Cibarial Armature (Diptera:Culicidae)». Journal of
Medical Entomology. 46(4):745–752.
Yadav, P.D.; A.C. Mishra y D.T. Mourya. 2008. «Molecular characterization of Umbre
virus (Bunyaviridae)». Virology Journal. 5:115.
Zeier, M.; M. Handermann, U. Bahr, B. Rensch, S. Müller, R. Kehm, W. Muranyi y
G. Darai. 2005. «New Ecological Aspects of Hantavirus Infection: A Change of a
Paradigm and a Challenge of Prevention – A Review». Virus Genes. 30(2):157–
180.
52
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO
DÉCIMA NOVENA CONVOCATORIA
LINEA FODECYT
"ANÁLISIS E IMPLEMENTACIÓN
Nombre del Proyecto:
Grupo
DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BUNYAVIRUS
Numero del Proyecto:
UTILIZANDO ZANCUDOS DEL GÉNERO CULEX COMO FUENTE DE MATERIAL GENÉTICO"
034-2008
Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto:
Monto Autorizado:
Plazo en meses
Fecha de Inicio y Finalización:
Q359,947.50
12 MESES
02/03/2009 al 28/02/2010
Renglon
DRA. MARÍA EUGENIA MORALES BETOULLE
Nombre del Gasto
PRÓRROGA AL 31/08/2010
TRANSFERENCIA
Asignacion
Presupuestaria
En Ejecuciòn
Mas (+)
Menos (-)
Pendiente de
Ejecutar
Ejecutado
Servicios no personales
1
181
181
189
199
2
241
243
261
262
267
291
295
3
323
Estudios, investigaciones y proyectos
factibilidad
Estudios, investigaciones y proyectos
factibilidad (Evaluación Externa de Impacto)
de
Q
122,125.00
Q
Q
8,000.00
5,000.00
Otros estudios y/o servicios
Otros servicios no personales
MATERIALES Y SUMINISTROS
Papel de escritorio
Q
Productos de papel o cartón
Elementos y compuestos químicos
Q
Combustibles y Lubricantes
Tintes, pinturas y colorantes
Q
Útiles de oficina
Q
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio
Q
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
Equipo médico-sanitario y de laboratorio
Q
GASTOS DE ADMÓN. (10%)
Q
MONTO AUTORIZADO
(-) EJECUTADO
SUBTOTAL
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR
Q
107,125.00 Q
15,000.00
Q
5,000.00 Q
Q
Q
5,000.00 Q
8,000.00
-
Q
Q
Q
32.90 Q
3,675.00 Q
986.00 Q
32.90 Q
77,774.11 Q
14.00
0.89
de
Q
5,000.00
1,000.00
74,100.00
1,000.00
2,500.00 Q
2,006.90
Q
Q
976.38 Q
493.05 Q
23.62
0.05
59,700.00 Q
5,551.00
Q
54,125.69 Q
23.31
Q
3,850.00 Q
Q
57,649.39 Q
32,722.50 Q
0.61
-
12,557.90 Q
12,557.90 Q
336,885.02 Q
23,062.48
Q
27,622.48
53,800.00
32,722.50
Q
359,947.50 Q
Q
Q
Q
359,947.50
332,325.02
27,622.48
Q
27,622.48
Disponibilidad
53