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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYTSECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYTFONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTCENTRO DE ESTUDIOS EN SALUD UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA –UVG- INFORME FINAL ANALISIS E IMPLEMENTACIÓN DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BUNYAVIRUS UTILIZANDO ZANCUDOS DEL GENERO CULEX COMO FUENTE DE MATERIAL GENETICO PROYECTO FODECYT No. 034-2008 MARIA EUGENIA MORALES-BETOULLE, Ph.D. Investigadora Principal GUATEMALA, MAYO DE 2011 AGRADECIMIENTOS: La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-. OTROS AGRADECIMIENTOS: Este proyecto se puedo llevar a cabo con el apoyo financiero del CDC a través del Acuerdo Cooperativo U50/CCU021236-01. con la Universidad del Valle de Guatemala # ÍNDICE Página RESUMEN……………………………………………………………………………………….VI ABSTRACT……………………………………………………………………………………..VII PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN…………………………………………………….…………………..1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA…………………………………………………3 I.3 I.2.1 Antecedentes en Guatemala………………………………………………………3 I.2.2. Justificación………………………………………………………………………5 OBJETIVOS E HIPOTESIS………………………………………………………………6 I.3.1 Objetivos………………………………………………………………………….6 I.3.1.1 General…………………………………………………………………...6 I.3.1.2 Específicos……………………………………………………………….6 I.3.2 I.4 Hipótesis………………………………………………………………………….6 METODOLOGÍA………………………………………………………………………....7 I.4.1 Localización………………………………………………………………………7 I.4.2 Las Variables……………………………………………………………………..8 I.4.2.1 Variables dependientes…………………………………………………..8 I.4.2.2 Variables independientes………………………………………………...8 I.4.3 Indicadores………………………………………………………………………..8 I.4.4 Estrategia Metodológica………………………………………………………….8 I.4.4.1 Población y muestra……………………………………………………...8 I.4.5 El Método………………………………………………………………………...9 I.4.5.1 Macerado de zancudos…………………………………………………..9 I.4.5.2 Extracción de ARN viral……………………………………………….10 I.4.5.3 Control interno de extracción de ARN…………………………………10 I.4.5.4 Estandarización de los ensayos de RT-PCR para Amplificación de ARN viral…………………………………………………….11 I.4.5.4.1 Preparación de control positivo……………………………..11 I.4.5.4.2 Ensayo de RT-PCR para ortobunyavirus del serogrupo California/Bunyamwera (Cal/Bwa)………………………………….12 I I.4.5.4.3 Ensayo con cebador BunC para amplificación de la secuencia completa del segmento S……………………………………………..12 I.4.5.4.4 Detección de bunyavirus en muestras de zancudos…………………………………………………………….13 I.4.5.4.5 Aislamiento viral…………………………………………....14 I.4.6 La Técnica Estadística………………………………………………………......14 I.4.7 Los Instrumentos a utilizar……………………………………………………...14 I.4.7.1 Equipo…………………………………………………………………..14 I.4.7.2 Suministros y reactivos…………………………………………………15 PARTE II II.1 MARCO TEÓRICO……………………………………………………………………..16 II.1.1 Generalidades de los bunyavirus………………………………………………..16 II.1.2 Características moleculares de bunyavirus……………………………………...17 II.1.3 Replicación……………………………………………………………………...20 II.1.4 Estudios basados en el genoma viral……………………………………………22 II.1.5 Principales enfermedades asociadas a bunyavirus………………………………23 II.1.6 Ecología y distribución………………………………………………………….24 II.1.7 Artrópodos vectores de bunyavirus……………………………………………..26 II.1.8 Diagnóstico……………………………………………………………………...28 PARTE III III.1 RESULTADOS………………………………………………………………………….30 III.1.1 Captura e identificación de zancudos……………………...……………………30 III.1.2 Extracción de ARN viral y control interno………………...……………………31 III.1.3 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación del ARN viral………………………………………………………….…………………32 III.1.4 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus…………………..………………….33 III.1.5 Aislamiento viral………………………………………………………………..36 III.2 DISCUSION……………………………………………………………………………..38 III.2.1 Extracción de ARN viral y control interno……………………………………...38 III.2.2 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación del ARN viral…………………………………………………………………………….38 III.2.3 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus……………………………………...39 III.2.4 Aislamiento viral………………………………………………………………...41 PARTE IV II IV.1 CONCLUSIONES……………………………………………………………………….42 IV.2 RECOMENDACIONES…………………………………………………………………43 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................44 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO................................................................................................51 III ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Sitios de estudio, Puerto Barrios, Izabal………………………………………………7 Figura 2. Estructura de (a) los viriones y (b) del genoma de los Orthobunyavirus……………..18 Figura 3. Ilustración de la reorganización genómica en un bunyavirus…………………………19 Figura 4. Ciclo de replicación de los virus de la familia Bunyaviridae…………………….……22 Figura 5. Patogénesis de Orthobunyavirus en humanos…………………………………………25 Figura 6. Hembra adulta de Cx. taeniopus………………………………………………….……28 Figura 7. Verificación de la calidad del ARN extraído utilizando distintos kits comerciales por medio del ensayo de PCR 18S…………………………………………..….31 Figura 8. Ensayo inicial de RT-PCR para detección de Orthobunyavirus………………………32 Figura 9. Ensayo optimizado de RT-PCR para la detección de Orthobunyavirus utilizando distintos volúmenes de reacción……………………………………………………………….…33 Figura 10. Productos de amplificación del RT-¨PCR Cal/Bwa para detección de Orthobunyavirus utilizando muestras de zancudos Culex (Melanoconion) taeniopus colectados en Puerto Barrios, Izabal………………………………...34 Figura 11. Densidades de zancudos Cx. taeniopus colectados en Puerto Barrios, Izabal……………………………………………………………………….…37 IV ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Listado de especies de zancudos del género Culex, capturados en Puerto Barrios Izabal, 2007-2009.................................................................................. ...........30 Cuadro 2. Tasas de infección mensuales por bunyavirus en Cx. taeniopus………………..……35 V RESUMEN En Latinoamérica se han descrito, numerosos arbovirus responsables de ocasionar zoonosis. Dentro de estos se encuentran virus emergentes o re-emergentes. Un ejemplo de virus re-emergentes en Guatemala son los Bunyavirus. En el pasado, se aislaron varios Bunyavirus de humanos, roedores y zancudos. Geográficamente, los Bunyavirus están en áreas tropicales y subtropicales de países como México, Panamá, Honduras, Guatemala, Brasil, Perú entre otros, donde se han asociado con enfermedades en humanos, produciendo sintomatología febril, dolor de cabeza, mialgias, nauseas, vómitos y casos severos de encefalitis. Recientemente, Morales-Betoulle et al (datos no publicados) aislaron un Bunyavirus del grupo C a partir de zancudos de la especie Culex (Melanoconion) taeniopus. El objetivo de este proyecto, fue implementar una técnica de diagnóstico molecular para Bunyavirus, y así mejorar la capacidad de detección de éstos. Se implementó el ensayo Cal/Bwa y Bun C de RT-PCR para detectar ARN viral en las muestras extraídas de zancudos Cx. taeniopus. Utilizando estos ensayos se analizaron 114 lotes de zancudos hembras (2942 individuos), detectándoos ARN viral en 16 lotes. Con estos resultados se estimó la tasa de infección por ortobunyavirus en Cx. taeniopus. Para los años 2007 y 2008 se observó actividad de bunyavirus con tasas de infección significativamente mayores a 1 zancudo infectado por cada 1000. Adicionalmente, la densidad relativa de Cx. taeniopus disminuyó anualmente y no fue posible la detección de bunyavirus en 2009. Sin embargo, se considera importante continuar estudiando la biología de Cx. taeniopus para determinar su importancia como posible vector de bunyavirus en Guatemala. VI ABSTRACT Several zoonotic diseases have been associated with emergent or re-emergent arboviruses in Latin America. In Guatemala, examples of re-emergent viruses are the Bunyaviruses. In the past, these viruses were isolated from human, rodent and mosquito samples. These viruses can be found in tropical and subtropical regions of Mexico, Brazil, Guatemala and Trinidad, among other countries, where they have been associated with human illness, producing fever, headache, myalgia, nausea, and in some cases, encephalitis. Recently, Morales-Betoulle et al (unpublished data) isolated a Group C Bunyavirus from Culex (Melanoconion) taeniopus mosquitoes. The aim of this study was the implementation of a molecular diagnosis technique for the detection of Bunyavirus. . An RT-PCR assay (Cal/Bwa and BunC) to detect viral RNA from Cx. taeniopus samples was implemented. Using this assay, 114 pools (2942 individuals) of female mosquitoes were analyzed and viral RNA was detected in 16 pools. Using these results, the infection rate was estimated for Orthobunyavirus in Cx. taeniopus. In 2007 and 2008, Bunyavirus activity was observed with infection rates significantly higher than 1 infected mosquito per 1000 individuals. Additionally, Cx. taeniopus relative density decreased yearly and it was not possible to detect Bunyavirus in 2009. Nevertheless, it is important to study the ecology of Cx. taeniopus in order to understand its importance as a potential vector of Bunyavirus in Guatemala. VII PARTE I I.1. INTRODUCCIÓN Los arbovirus, son virus transmitidos por artrópodos, principalmente por zancudos y garrapatas. Dentro de los arbovirus que causan enfermedad a los humanos se encuentran tres familias principales: Togaviridae, Flaviviridae y Bunyaviridae (Alatom y Payne 2009). La familia Bunyaviridae son virus de ARN, envueltos, con genoma segmentado y comprende más de 258 virus con al menos 167 en el género Orthobunyavirus 1 . Esta familia se encuentra dividida en 5 géneros: Phlebovirus, Nairovirus, Hantavirus, Tospovirus y Orthobunyavirus (Alatom y Payne 2009). De los cinco géneros que pertenecen a la familia, cuatro contienen virus que pueden infectar hospederos vertebrados y tres de los géneros de bunyavirus que infectan vertebrados pueden ser transmitidos por artrópodos hematófagos (Schmaljohn y Nichol 2007). Entre los vectores de estos virus se incluye una gran variedad de zancudos, dentro de los que se encuentran principalmente especies del género Aedes y Culex, algunos de los cuales se encuentran en Guatemala (Morales-Betoulle et al., datos no publicados). El género Orthobunyavirus se puede clasificar en diferentes grupos que incluyen los Bunyamwera, Bwamba, Grupo C, Guama, Simbu, Mapputta y Grupo California (CAL). Algunos virus que pertenecen al género de los Bunyavirus son reconocidos como unos de los más importantes patógenos que afectan a los humanos alrededor del mundo. En America del Norte, por los menos cuatro virus (Encefalitis de California, La Crosse, Jamestown Canyon y Snowshoe hare) han sido responsables de enfermedades que van desde una simple fiebre hasta una encefalitis severa (Kuno et al., 1996). En Guatemala, en la década de los 70 y 80 se identificaron Bunyavirus del grupo C en personas que presentaban 1 Antes, el género Orthobunyavirus se conocía como Bunyavirus (Schmaljohn y Nichol 2007, Soldan y González-Scarano 2005, Schmaljohn y Hooper 2001). A partir del 2003, Orthobunyavirus es el nombre aceptado actualmente por el ICTV (ICTVdb Management 2006). 1 sintomatología muy parecida al dengue, como fiebre, dolor de cabeza, fatiga y mialgia; y en zancudos de la especie Culex (Melanoconion) taeniopus (Scherer et al., 1985). En muchos países alrededor del mundo los Bunyavirus se han asociado con grandes epidemias y algunas enfermedades hemorrágicas. Sin embargo la vigilancia de estos virus, depende principalmente de su detección en las poblaciones de artrópodos vectores en su hábitat natural, debido a que para que exista la transmisión de un virus de importancia a la salud humana debe haber evidencia de la circulación de éste en el área y un vector competente para replicarlo y transmitirlo (Kuno et al., 1996). Tradicionalmente esta detección se ha hecho por medio de algunos ensayos serológicos y principalmente por la prueba de neutralización, siendo métodos muy sensibles, sin embargo son muy laboriosos y consumen mucho tiempo. El RT-PCR también es un método muy sensible, específico y rápido, por lo que se ha convertido en una herramienta muy eficiente y segura para la detección de diferentes virus. Como se mencionó anteriormente, existe evidencia de la circulación de Bunyavirus del Grupo C en Guatemala, sin embargo se desconoce si hay circulación de los demás grupos de esta familia. Existe poca información, debido a que a nivel nacional no se realiza vigilancia de estos virus, principalmente porque la identificación de éstos es limitada debido a la carencia o al escaso acceso a pruebas de laboratorio, y a que se conoce poco de sus signos y síntomas. Tomando en cuenta que Guatemala es un país endémico para dengue y malaria, y que los Bunyavirus se manifiestan clínicamente con síntomas muy similares a estas enfermedades, la identificación de éstos patógenos es de suma importancia. El objetivo de este estudio fue implementar una técnica de diagnóstico molecular para la detección de Bunyavirus en Guatemala. Para esto se utilizó como fuente de ARN macerados de zancudos de Culex (Melanoconion) taeniopus vectores de este tipo de virus. En el Centro de Estudios en Salud (laboratorio de enfermedades arbovirales y zoonóticas) se tienen ya implementadas otras pruebas moleculares para la detección de arbovirus a partir de zancudos que luego se han utilizado en muestras de humanos y otros vertebrados (ej. Equinos y bovinos). La 2 implementación del RT-PCR de Bunyavirus es importante para complementar la capacidad local de diagnóstico y detección de diversos arbovirus que puedan afectar la salud humana y animal. I.2. PLANTEMIENTO DEL PROBLEMA I.2.1 Antecedentes en Guatemala Entre los bunyavirus se encuentra una gran cantidad de virus asociados con enfermedades en los humanos, principalmente en regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo. (Schmaljohn y Nichol 2007, Soldan y González-Scarano 2005 y Vasconcelos et al. 2001). Dentro de estos virus, los del género Orthobunyavirus (Bunyaviridae) son los más reportados en la región tropical y subtropical del continente americano, ocasionado infecciones en los humanos. Estas infecciones se manifiestan típicamente por una enfermedad febril, muchas veces con síntomas similares al Dengue. En Guatemala, hay dos casos documentados de enfermedad humana causada por bunyavirus (NEPV), siendo éstos en zonas rurales similares a los sitios de estudio del presente trabajo. (Scherer et al. 1983, Scherer et al 1986, Nunes et al. 2005, de Brito et al. 2007, Moraes 2007, Quinan et al. 2008, Tauro et al. 2009). Desde mediados del siglo XX se han observado brotes de enfermedad causada por estos virus en América. Por ejemplo, variantes muy virulentas de Oropouche virus (Ortobunyavirus: Bunyaviridae) han causado brotes epidémicos de hasta 100,000 infecciones humanas en Brasil (Vasconcelos et al. 1998, Moraes 2007). Por otro lado, es generalmente aceptado que la aparición de arbovirus emergentes puede estar relacionada con la modificación del ambiente (Vasconcelos et al. 2001). La destrucción de hábitats naturales para realizar proyectos de urbanización, la deforestación y el desarrollo agrícola se han asociado con el aumento de la circulación de arbovirus, proponiéndose que este aumento es debido a la proliferación de artrópodos vectores y a un cambio en la distribución de éstos (Dégallier et al. 1992, Norris 2004). Así mismo, se ha 3 observado que en estas situaciones los virus pueden adaptarse rápidamente a nuevos vectores, facilitándose de esta manera el desarrollo de un ciclo de transmisión urbano. (Moraes 2007, Elliott 2009). La participación de zancudos del género Culex en la transmisión de bunyavirus en la naturaleza está bien documentada, encontrándose en Guatemala varias especies de zancudos de este género (Scherer et al. 1976, LeDuc 1987, Nunes et al. 2005, Soldan y González-Scarano 2005, Moraes et al. 2007, Tauro et al. 2009, Yadav et al. 2008). En una serie de estudios, en Guatemala se obtuvo aislados de bunyavirus del género Orthobunyavirus en humanos, zancudos y roedores. Uno de estos aislados fue obtenido de zancudos Culex (Melanoconion) taeniopus, sugiriendo a que estos zancudos podrían estar implicados en la ecología de los bunyavirus en nuestro país. (Scherer et al. 1976, Scherer et al. 1985, Cupp et al. 1986). Para que exista transmisión de un arbovirus en la naturaleza es necesaria al menos la presencia del virus, vectores competentes y hospederos susceptibles. Aunque esté documentada la presencia de vectores competentes, es necesario que los factores ambientales sean propicios para los zancudos. Entre estos factores se encuentra los días con lluvia y la presencia de cuerpos artificiales y naturales de agua. En Puerto Barrios, municipio en donde se ubican los sitios de este estudio, se ha documentado la presencia de Cx. taeniopus (ArboZoo, datos no publicados). Por otra parte, en Guatemala se ha aislado ortobunyavirus de Cx. taeniopus y algunos vertebrados. Recientemente, un ortobunyavirus del Grupo C fue aislado de Cx. taeniopus capturados en un sitio cercano a los sitios del presente estudio (M.E. Morales-Betoulle et al., datos no publicados). Según los datos anteriormente expuestos, se piensa que los sitios de estudio reúnen las condiciones apropiadas para la transmisión de ortobunyavirus por Cx. taenioupus en la naturaleza. Por todo esto, se consideró necesario determinar la tasa de infección por ortobunyavirus en zancudos de Guatemala, para poder estimar su importancia como posibles amenazas a la salud humana. 4 I.2.2 Justificación del trabajo de investigación Actualmente, se conoce una amplia variedad de patógenos como virus, bacterias y parásitos que son transmitidos por insectos hematófagos y pueden afectar tanto a humanos como a animales. Estos, muchas veces, no reciben la atención requerida y se han clasificado como agentes causales de enfermedades tropicales desatendidas (LeBeaud 2008). Se ha observado que muchos de estos representan una carga para la población al ocasionar perdidas humanas y económicas, lo que hace necesario definir los ciclos de transmisión de estas enfermedades. Es por esto que es importante conocer los ciclos de transmisión y las características moleculares de éstos, para así implementar o mejorar los sistemas de vigilancia. En la actualidad, muchos virus que aparentemente habían dejado de circular en distintas regiones, han aparecido nuevamente. Entre los factores asociados a la re-emergencia de estos se ha sugerido la evolución de los virus, modificaciones en el comportamiento del hospedero, cambios en las prácticas de agricultura y la implementación de nuevas técnicas de detección e identificación (Peters 2001). Se ha observado que los avances en la virología molecular y en las herramientas computacionales utilizadas para la vigilancia de ciertos virus han mejorado la comprensión de éstos. Aún cuando estos virus son de importancia para la salud pública humana y veterinaria, es importante mencionar que aún en la actualidad, se conoce poco acerca de la genero Orthobunyavirus, principalmente debido a la falta de caracterización genética de la mayoría de los virus que la conforman. Es por esto que es necesaria la implementación de herramientas de diagnóstico, que permitan identificar si estos virus siguen circulando en la región y si están asociados a enfermedad en humanos. 5 I.3. OBJETIVOS E HIPOTESIS I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General Implementar una técnica de diagnóstico molecular para la detección de Orthobunyavirus en Guatemala. I.3.1.1 Específicos 1. Implementar el RT-PCR para la detección de Bunyavirus utilizando como fuente de material genético zancudos de género Culex. 2. Obtener aislados virales de Bunyavirus a partir de las muestras positivas por RT-PCR provenientes de Guatemala. 3. Determinar la tasa mínima de infección (MIR) debida a Bunyavirus en los zancudos, utilizando los resultados del RT-PCR implementado. I.3.2 Hipótesis: Hipótesis Nula: Existen Bunyavirus circulando en las poblaciones de zancudos del género Culex del municipio de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala. 6 I.4. METODOLOGIA I.4.1 Localización La investigación se llevó a cabo en el departamento de Izabal, el cual se encuentra situado en la región Nor-Oriental de país (latitud 15° 44‘ 06" y longitud -88° 36‘ 17"). Cuenta con una extensión territorial de 9,038 kilómetros cuadrados y se encuentra dividido en cinco municipios: Puerto Barrios, Livingston, Morales, El Estor y Los Amates. Se encuentra localizado en la Costa Caribe de Guatemala a 0.67 msnm. El clima es tropical, ya que durante casi todo el año la temperatura y el promedio de humedad relativa permanecen altos y sin una estación seca bien definida, lo cual lo ubica en una zona de vida de Bosque Húmedo Subtropical (López y Sosa 2008). Los sitios de estudio (15°45‘38.64", -88°32‘13.63" y 15°45‘43.62", 88°32‘9.82") están localizados en el área rural del municipio de Puerto Barrios, departamento de Izabal, Guatemala. (Figura 1). Figura 1. Sitios de estudio, Puerto Barrios, Izabal. Fuente: Morales et al. (datos no publicados). 7 I.4.2 Las Variables I.4.2.1 Variables dependientes Resultado positivo a bunyavirus por medio de RT-PCR I.4.2.2 Variables Independientes Zancudos del género Culex capturados y procesados del los sitios de estudio en Puerto Barrios, Izabal (Cantidad de zancudos mayor a cero). Sin embargo, esta variable no fue controlada en el estudio. I.4.3 Indicadores Para las muestras positivas a Bunyavirus del Grupo C, el indicador es la presencia de una banda de alrededor de 900 pares de bases (PB) visualizada en una gel de agarosa. De igual manera, para las muestras positivas del serogrupo California/Bunyamwera, el indicador es la presencia de una banda de alrededor de 210 pares de bases (PB) visualizada en una gel de agarosa I.4.4 Estrategia Metodológica I.4.4.1 Población y Muestra Se realizó un estudio retrospectivo en zancudos capturados previamente como parte del estudio de vigilancia ecológica del West Nile virus, en el Centro de Estudios en Salud de la Universidad del Valle de Guatemala (CES-UVG/CDCCAP). Las capturas mencionadas se realizaron del 2007 al 2009 en Puerto Barrios, Izabal. Se tuvo una población de 2942 zancudos del género Culex (Melanoconion) taeniopus, correspondientes a 114 pools o lotes que contenían un máximo de 50 8 individuos. La cantidad de especies colectadas y el numero de individuos de éstas fue abundante, por lo que se decidió trabajar con la especie Culex (Melanoconion) taeniopus debido a que ha sido reportada por varios autores como una especie potencialmente involucrada en los ciclos de transmisión de los bunyavirus como se mencionará mas adelante (Marco teórico). Estos zancudos fueron colectados mensualmente en los sitios de estudio, durante el período de 2007 a 2009. Para las capturas se colocó por una noche en cada sitio, una trampa CDC de luz y CO2 (John W. Hock Co. Gainesville, FL, USA) y trampa grávida (Reiter 1983) con estiércol de vaca y agua como atrayente. Los zancudos fueron almacenados en hielo seco, separados según fecha, sitio de colecta y tipo de trampa utilizada y transportados de esta forma al laboratorio en la UVG, en dónde fueron almacenados a -70 °C hasta su identificación. Estos fueron separados por sexo y las hembras identificadas hasta género o especie. La identificación de las hembras se realizó siguiendo sugerencias de una clave previamente publicada (Sallum y Forattini 1996). Las hembras fueron clasificadas y agrupadas en lotes de 50 individuos máximo, separadas según fecha y sitio de colecta, tipo de trampa y estado (grávidas, alimentadas, o noalimentadas). Luego de su identificación y clasificación, los zancudos fueron almacenados a -70 °C hasta su posterior maceración. I.4.5 El Método: I.4.5.1 Macerado de zancudos Previo a la extracción de ARN para la detección viral, cada lote de zancudos fue suspendido en solución amortiguadora BA-1 (Medio 199 – Sales de Hank 1X con L-Glutamina, Tris-HCl 0.05 M pH 7.5, albúmina sérica bovina 1% pH 7.0, LGlutamina 2 mM, NaHCO3 0.35 g/L, penicilina 100 u/mL, estreptomicina 100 µg/L y anfotericina B 1 µg/mL. Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO). El tejido de los zancudos fue macerado con un balín de cobre estéril en un macerador eléctrico (Retsch. Newton, PA, modelo MM 301) a 25 rpm por 4 minutos, luego la mezcla se 9 centrifugó por 12 min a 2 750 g y 4 °C para separar el sobrenadante de los restos de tejido. Se almacenó dos alícuotas de tejido a -70 °C. I.4.5.2 Extracción de ARN viral Se extrajo el ARN de los zancudos utilizando dos diferentes kits, el kit QIAamp Viral RNA mini® (QIAgen. Valencia, CA) o el kit High Pure Viral RNA® (Roche Diagnostics GmbH. Mannheim, Alemania), según su disponibilidad y siguiendo las especificaciones de los fabricantes. Las extracciones de ARN fueron preservadas a -70°C hasta su procesamiento para la detección viral. I.4.5.3 Control interno de extracción de ARN Para comparar ambas metodologías de extracción de ARN, se extrajo un mismo lote macerado de zancudos con ambos kits y luego se comprobó la eficiencia de cada método con un ensayo diseñado para detectar el ARN ribosomal 18S de zancudos de los géneros Aedes y Culex (Hoffmann et al. 2004). El ensayo se basa en el uso de cebadores específicos para secuencias conservadas del ARNr de los zancudos, por lo tanto un ensayo positivo demuestra que el ARN de la muestra está en buen estado. Para cada reacción se utilizó el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR (QIAgen. Valencia, CA): 16 µL de extracto de ARN, 40 pmol de cada cebador (18S417 5’-ACGGGGAGGTAGTGACGAGAAATA-3’ y 18S920c 5’-TAATACT AATGCCCCCAACTACTT-3’), 1X de cada componente del kit (según instrucciones del fabricante) y agua libre de ARNasas suficiente para un volumen de 40 µL. Se utilizó agua libre de ARNasas como control negativo. El programa de amplificación incluyó un ciclo de transcripción reversa a 45 ºC por 1 hora y a 94 ºC por 3 min, seguido de 45 ciclos de desnaturalización a 94 ºC por 30s, hibridización a 60 ºC por 1 min y extensión a 68 ºC por 3 min, seguidos de 7 min de extensión final a 72 ºC. Las reacciones fueron realizadas en un termociclador ATC-402 o ATC-201 (NyxTechniK. San Diego, CA). Los productos de amplificación obtenidos fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. La presencia de un producto de ~500 pb en un ensayo sin amplificación en los controles negativos se consideró como un resultado positivo. Esta prueba fue utilizada para 10 comprobar la extracción de ARN en muestras seleccionadas al azar y la extracción de ARN con el kit Roche. I.4.5.4 Estandarización de los ensayos de RT-PCR para amplificación del ARN viral Se implementaron dos ensayos de RT-PCR para detectar el ARN viral en las muestras extraídas de los grupos de zancudos. El ensayo Cal/Bwa y el ensayo BunC. I.4.5.4.1 Preparación de control positivo Los ensayos fueron optimizados utilizando como control positivo ARN extraído de Inkoo virus cepa KN 3641 (INKV, Orthobunyavirus), proporcionados por A. Lambert y B.W. Johnson de la Division of Vector-Borne Infectious Diseases (DVBID), Centers for Disease Control and Prevention (CDC), del gobierno de los Estados Unidos de América. INKV es un ortobunyavirus del serogrupo California/Bunyamwera presente únicamente en Europa (Schmaljohn y Hooper 2001). Ya que este virus no circula en América, utilizarlo como control positivo provee la ventaja de un control de calidad. Dichos controles fueron obtenidos en forma de virus inactivo, sobrenadante de cultivo viral, en solución de lisis viral del kit QIAamp. A partir de cada lisado viral obtenido se extrajo ARN utilizando el kit QIAamp y el procedimiento especificado para ese kit a partir de 350 µL del lisado viral. El ARN extraído se recuperó tras dos elusiones en un volumen final de 175 µL de solución AVE. Los extractos fueron almacenados a 70ºC. Con un genoma de 986 bases, INKV tiene un producto de amplificación de 208 pb para el ensayo Cal/Bwa (bases 112–320). Para el ensayo BunC tiene un producto de amplificación del tamaño del segmento S, 986 pb. 11 I.4.5.4.2 Ensayo de RT-PCR para ortobunyavirus del serogrupo California/Bunyamwera (Cal/Bwa). El ensayo se implementó en base a un protocolo proporcionado por colaboradores de DVBID para amplificación molecular de bunyavirus con cebadores consenso (Lambert y Lanciotti 2009). El ensayo Cal/Bwa es específico para detección de ortobunyavirus del serogrupo California/Bunyamwera amplifica específicamente una región del segmento S, que corresponde al gen que codifica la proteína no estructural (NS). La región amplificada tiene un tamaño entre 210 a 300 pb depende de la especie de ortobunyavirus detectada. Para las reacciones se utilizó el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR (QIAgen. Valencia, CA). Brevemente, para cada reacción de 20 µL se utilizó: 5 µL de extracto de ARN, 20 pmol de cada cebador (Cal/Bwa group forward, 5' GCA AAT GGA TTT GAT CCT GAT GCA G 3' y Cal/Bwa group reverse, 5' TTG TTC CTG TTT GCT GGA AAA TGA T 3'), 1X cada solución del kit y agua libre de ARNasas para completar el volumen. Las mezclas de reacción fueron analizadas mediante un RT-PCR de un paso. Los parámetros de reacción fueron modificados hasta obtener una amplificación óptima con un producto esperado de 210 pb. El programa de amplificación optimizado incluyó un ciclo de transcripción reversa a 50 ºC por 30 min y a 95 ºC por 15 min, seguido de 55 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 30s, hibridización a 55 ºC por 1 min y extensión a 72ºC por 2 min, seguidos de 10 min de extensión final a 72 °C. Como templado de ARN se utilizaron diluciones 1/100, 1/250, 1/500 y 1/1000 del extracto de control positivo. Se analizó una porción de 8 a 10 µL de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis en gel de agarosa al 2%, éstos fueron visualizados con luz UV luego de tinción con bromuro de etidio. I.4.5.4.3 Ensayo con cebador BunC para amplificación de la secuencia completa del segmento S Se implementó un ensayo para amplificar la secuencia completa del segmento S del ARN genómico de ortobunyavirus (Nunes et al. 2005) utilizando 12 el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR. El ensayo BunC se basa en el uso de un cebador complementario a los extremos conservados de los tres segmentos genómicos de los bunyavirus del gurpo C del género Orthobunyavirus (Nunes et al. 2005). Debido al largo tamaño de los segmentos, solo se puede amplificar fácilmente el segmento S, el más pequeño. Los productos de amplificación del ensayo BunC tienen un tamaño aproximada de 900 pb. La composición de las mezclas de reacción fue: 5 µL de extracto de ARN, 2 µM cebador (BunC 5'-AGTAGTGTGCTCCAC-3'), soluciones de enzimas y mezcla de reacción del kit en concentración 1X y agua libre de ARNasas suficiente para alcanzar un volumen de 20 µL. Las mezclas de reacción fueron analizadas mediante un RT-PCR de un solo paso. Se utilizó el mismo programa de amplificación utilizado para el ensayo Cal/Bwa. Como templado de ARN se utilizaron diluciones 1/100, 1/250, 1/500 y 1/1000 del extracto de control positivo. Un ensayo se consideró exitoso si: a) no hubo amplificación en los controles negativos y b) hubo amplificación en los controles positivos del tamaño esperado. Se analizó una porción de 8 a 10 µL de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis en gel de agarosa al 2%, éstos fueron visualizados con luz UV luego de tinción con bromuro de etidio. I.4.5.4.4 Detección de Bunyavirus en muestras de zancudos Como prueba inicial se utilizó el ensayo de RT-PCR Cal/Bwa para analizar el ARN extraído de los grupos de zancudos. Todas las muestras positivas para este ensayo fueron analizadas con el ensayo RT-PCR con el cebador BunC, para amplificar la secuencia completa del segmento S. Se analizó una porción de 8 a 10 µL de los productos de amplificación obtenidos por electroforesis en gel de agarosa al 2%, éstos fueron visualizados con luz UV luego de tinción con bromuro de etidio. 13 I.4.5.4.5 Aislamiento viral Las muestras fueron enviadas para el aislamiento viral por colaboradores de la División de Enfermedades Transmitidas por Vectores de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (DVBID-CDC) en Fort Collins, Denver, Colorado. I.4.6 La Técnica Estadística Para analizar la tasa mínima de infección (MIR) por bunyavirus en los zancudos analizados se utilizó un método de estimación de máxima verosimilitud (MLE, por sus siglas en inglés). Este método está basado en la estimación de la probabilidad de infección de un solo zancudo en base a los resultados negativos del tamizaje molecular (Lampman y Novak 2004). Para analizar los datos se utilizó el programa PooledInfRate, version 3.0 (Biggerstaff, 2006). Para el calculo de estos datos se utilizó el total de lotes analizados, la cantidad de zancudos por lote (de 1 a 50) y el total de zancudos. Se realizó un Análisis de Varianza de Friedman para determinar si la densidad relativa de Culex (Melanoconion) taeniopus varía con el tiempo de una manera significativa. Por otro lado, se realizó una correlación de Spearman para determinar si hay una correlación entre la densidad relativa de los zancudos y la tasa de infección por bunyavirus en Cx. taeniopus. I.4.7 Los instrumentos utilizados Para desarrollo de este proyecto los materiales y equipo que se utilizaron fueron los siguientes: I.4.7.1 Equipo: Cámara de electroforesis (RunOne) Pipetas Campana de extracción de químicos Cámara de detección de geles 14 Termociclador Convencional Centrífuga Congelador -20 Congelador -70 Refrigeradoras Autoclave Agitador Campana de Bioseguridad III I.4.7.2 Suministros y Reactivos: Tubos criogénicos Cajas para almanecaje a -70C Tubos cónicos Guantes Tubitos PCR en serie Tapaderas tubos PCR en serie Placas PCR Puntas bloqueadas 10ul Puntas bloqueadas 1000ul Puntas bloqueadas 200ul Puntas bloqueadas 20ul Kit extracción ARN (QIAamp viral RNA) Etanol Buffer TBE 10X Kit RT-PCR (QuantiTect SYBR Green) Primers Agarosa 15 PARTE II II.1. MARCO TEORICO II.1.1 Generalidades de los Bunyavirus Los arbovirus reciben su nombre de “Arthropod borne virus”, ya que son transmitidos por artrópodos. Son mantenidos en la naturaleza en ciclos zoonóticos por estos artrópodos (vectores) que pueden ser zancudos. Después de la infección, los vectores son capaces de transmitir el virus en el momento de ingerir sangre de un hospedero amplificador, que son en su mayoría aves y mamíferos (Figueireo 2007). Dentro de los arbovirus se encuentran virus pertenecientes a diversas familias: Togaviridae, Flaviviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae y Bunyaviridae (Knipe, 2001). Dentro de esta última familia se encuentra el género Bunyavirus. Este género contiene más de 150 virus divididos en varios grupos que se han encontrado alrededor del mundo (Knipe, 2001). La familia Bunyaviridae comprende un grupo grande de arbovirus, compuesto por más de 300 especies (Soldan y González-Scarano 2005). Está dividida en los géneros Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus y Phlebovirus, con virus que pueden infectar vertebrados, y el género Tospovirus, con virus que infectan plantas (Schmaljohn y Hooper 2001). La mayoría de bunyavirus son transmitidos por artrópodos, excepto los pertenecientes al género Hantavirus (Schmaljohn y Hooper 2001). Cada hantavirus se encuentra asociado a una especie de roedor (subfamilias Sigmodontinae, Murinae y Arvicolinae) como hospedero natural, con la que se ha relacionado por cientos de miles de años (Zeier et al. 2005). 16 II.1.2 Características moleculares de Bunyavirus En la figura 2 se muestra la estructura de los viriones y del genoma de los Bunyavirus. diámetro. Los viriones son esféricos, tienen aproximadamente 100 nm de Tienen una envoltura lipídica derivada de la célula del hospedero (Wattam, 2006). El genoma es de ARN de una sola hebra en sentido negativo, o puede ser también ambisentido. Este genoma segmentado de ARN y consta de consta de tres segmentos, llamados grande, mediano y pequeño (segmento L, M y S, respectivamente, por sus siglas en inglés). El segmento L codifica la RdRp (proteína L) con una estrategia de transcripción-traducción (polaridad) de sentido negativo. El segmento M codifica las glicoproteínas de superficie Gn y Gc con una polaridad negativa. En algunos géneros (Orthobunyavirus, Phlebovirus y Tospovirus) el segmento M también codifica una proteína no estructural (NSM), en el mismo marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés). El segmento S codifica la proteína de la nucleocápside (N) con una polaridad negativa. En los ortobunyavirus también codifica una proteína no estructural (NSS), en un ORF traslapado. Los virus de los géneros Phlebovirus y Tospovirus utilizan una estrategia ambisentido para expresar dos proteínas, N y NSS (Schmaljohn y Hooper 2001 y Beaty et al, 1982). Los tres segmentos tienen secuencias muy conservadas en los extremos, pero difieren de virus de otros géneros. Esta característica permite diferenciarlos de virus de otros géneros y de la misma familia: Bunyaviridae (Knipe, 2001). 17 Figura 2. Estructura de: (a) los viriones y (b) del genoma de los Orthobunyavirus. Fuente: Tomado de Swiss Institute of Bioinformatics 2010. (a) (b) 18 Se ha observado la capacidad de reorganización génica en virus de los géneros Orthobunyavirus (virus de los serogrupos Bunyanwera, California y Grupo C), Hantavirus y Nairovirus (de Brito et al. 2007, Reese et al. 2008). Esta reorganización se puede dar en células con infección dual por bunyavirus relacionados (mismo género). Al replicarse los dos virus en la misma célula, los segmentos del genoma se pueden reorganizar al empacarse el virión (de Brito et al. 2007). Se ha conseguido obtener virus con genoma reorganizado al infectar zancudos en el laboratorio, con una tasa alta de reorganización. A pesar de esto, no se ha podido observar reorganización del genoma viral en mamíferos pequeños (Borucki et al. 2002). Recientemente se comprobó la reorganización del genoma de La Crosse virus (LACV, Ortobunyavirus: Bunyaviridae) en la naturaleza. Zancudos de la especie Aedes triseriatus de regiones donde circulan dos genotipos del virus mostraron infección por un tercer genotipo, que contenía segmentos del genoma de los dos virus (Reese et al. 2008). En la Figura 3 muestra un ejemplo. Figura 3: Ilustración de la reorganización genómica en un bunyavirus. Cada panel es una representación de un genoma tripartito. Si una célula susceptible es infectada a la vez por dos virus A y B diferentes pero relacionados, el ensamblaje viral podría generar un virus reorganizado C, con segmentos de ambos virus. Una misma infección dual puede generar muchos virus reorganizados. Fuente: Reese et al. 2008 19 Los bunyavirus tienen una secuencia terminal conservada (STC) en los extremos 5’ y 3’ de sus tres segmentos. Esta secuencia permite un apareamiento de los extremos, generando una estructura estable de ARN circular de unión no covalente, incluso al estar asociado con la proteína N (Schmaljohn y Hooper 2001). Estudios en LACV muestran que la STC es complementaria a partes del ARNm de genes conservados en zancudos del género Aedes y otros dípteros. Este ARNm es utilizado como cebador para la replicación y transcripción del genoma viral en el artrópodo (Borucki et al. 2002). Esa interacción entre virus-vector podría explicar la alta conservación de la STC. Otra función de la STC ha sido observada en Bunyamwera virus (BUNV) mediante estudios de mutagénesis dirigida. En estos estudios se observó que algunos nucleótidos de las STC son esenciales para la señalización de la transcripción (Barr y Wertz 2005, Barr et al. 2005). Estas características de los ortobunyavirus han sido utilizadas para realizar estudios del genoma viral II.1.3 Replicación El primer paso para la replicación del virus (Figura 4) es la unión del virus a la célula, mediada por las glicoproteínas virales y receptores celulares (Schmaljohn y Hooper 2001). La proteína Gn proteína se ha asociado a la capacidad del virus de alcanzar altas viremias en la circulación periférica (virulencia periférica). También se ha asociado a su capacidad para invadir tejido nervioso (neuroinvasividad) (Borucki et al. 2002). Se ha propuesto que la proteína Gc puede ser un ligando de los receptores celulares en los zancudos. También se ha involucrado a la proteína Gn como ligando en tejidos específicos de zancudos (Schmaljohn y Hooper 2001, Borucki et al. 2002). En un segundo paso, el virión ingresa a la célula blanco mediante fagocitosis. Se cree que la acidificación del endosoma induce un cambio conformacional en Gn y Gc, facilitando la fusión de las membranas viral y celular y permitiendo la entrada de las ribonucleocápsides y la RdRp al citoplasma (Schmaljohn y Hooper 2001). 20 En el citoplasma, ocurre la transcripción primaria del ARNm a partir de plantillas del genoma. Para esto se utiliza cebadores metilados, derivados de ARN mensajero del hospedero (Schmaljohn y Hooper 2001). Bunyaviridae es la única familia de arbovirus que utiliza cebadores de transcripción derivados del hospedero (Borucki et al. 2002). Se ha observado que solamente son necesarias las proteínas L y N para la transcripción del ARN viral (Kukkonen et al. 2005). La traducción del ARNc generado a partir de los segmentos L y S se realiza por ribosomas libres. La traducción del ARNc del segmento M es realizada por ribosomas unidos a membrana, en el retículo endoplasmático rugoso. La transcripción del genoma completo a ARNc es realizada por la RdRp. Se presume que para esto es necesaria la proteína N, pero no se ha identificado los factores virales o celulares asociados (Schmaljohn y Hooper 2001). Se ha sugerido que la proteína N actúa como una chaperona de ARN (Mir y Panganiban 2006). La morfogénesis incluye la acumulación de las glicoproteínas primarias Gn y Gc en el aparato de Golgi, glicosilación N-terminal y adquisición de membranas modificadas del hospedero por gemación hacia adentro de la cisterna del Golgi. Después hay una fusión de las vesículas citoplásmicas con la membrana plasmática y se libera los viriones maduros (Schmaljohn y Hooper 2001). Se ha observado diferencias entre la replicación en hospederos vertebrados y zancudos. Aparentemente, algunos procesos de regulación asociados a la transcripción del genoma viral a ARNm están fuertemente controlados por el metabolismo de los ovarios de los zancudos. Estos procesos permitirían una transmisión transovárica muy efectiva, generando progenie infectada (Borucki et al. 2002). 21 Figura 4: Ciclo de replicación de los virus de la familia Bunyaviridae. Fuente: Tomado y modificado de Schmaljohn y Nichol 2007. II.1.4 Estudios basados en el genoma viral Históricamente se clasificaba los bunyavirus en base a sus relaciones antigénicas (Schmaljohn y Hooper 2001). Se utilizaba pruebas como fijación del complemento, neutralización e inhibición de la hemoaglutinación para determinar esas relaciones (Nunes et al. 2005). En base a las propiedades determinadas por 22 estas pruebas, se dividió los géneros en serogrupos. Los serogrupos, a su vez, eran divididos en complejos formados por virus estrechamente relacionados (Schmaljohn y Hooper 2001). Las propiedades antigénicas de los virus aún se utilizan para clasificarlos en serogrupos, pero se busca utilizar una clasificación basada en métodos moleculares, debido a la reproducibilidad, especificidad y rapidez de éstos (de Brito et al. 2007, Nakouné et al. 2007, Arai et al. 2008, Quinan et al. 2008, Yadav et al. 2008, Lambert y Lanciotti 2009). Como resultado de la caracterización genética de algunos bunyavirus se cuenta con información para diseñar cebadores específicos. Se ha publicado una gran variedad de ensayos para detección de ácidos nucleicos de bunyavirus. En 2009 se publicó ensayos que permiten detectar 47 virus diferentes de la familia Bunyaviridae (Lambert y Lanciotti 2009). Para esto los investigadores diseñaron cebadores basados en secuencias de consenso de bunyavirus pertenecientes a distintos géneros y serogrupos. Con esa metodología lograron amplificar secuencias del segmento S de los virus analizados mediante reacciones de RT-PCR con múltiples cebadores (comúnmente llamadas múltiplex). Otro enfoque para amplificar los ácidos nucleicos de bunyavirus es utilizar cebadores dirigidos a la secuencia terminal conservada (STC). Se ha utilizado variaciones de la STC del género Ortobunyavirus para detectar diversas especies (Dunn et al. 1994, Nunes et al. 2005, Nakouné et al. 2007, Lambert y Lanciotti 2008, Mores et al. 2009; M.E. Morales-Betoulle, comunicación personal). II.1.5 Principales enfermedades asociadas a los bunyavirus Entre los bunyavirus transmitidos por artrópodos se encuentra muchos virus zoonóticos. Los síndromes asociados a éstos son variados. Los bunyavirus presentes en América se asocian principalmente a dos síndromes: encefalítico (sobre todo serogrupos California y Bunyamwera) (Kuno et al. 1996) y febril (sobre todo Grupo C) (Nunes et al. 2005). Entre los bunyavirus más estudiados 23 que causan encefalitis se encuentra La Crosse virus. La infección en niños con este virus provoca una encefalitis aséptica, así mismo, la presencia de anticuerpos contra LACV se ha correlacionado con enfermedades mentales que requieren de cuidados especializados (Borucki et al. 2002, Reese et al. 2008). Los ortobunyavirus del Grupo C causan comúnmente un síndrome febril, muy similar al presentado por una persona enferma con Dengue (Scherer et al 1983, Scherer et al 1986). Durante estudios de VEEV en Guatemala, dos investigadores del equipo contrajeron una enfermedad febril súbita con síntomas similares al Dengue. En ambos casos se identificó al agente causal como NEPV (Scherer et al. 1983). II.1.6 Ecología y distribución Los bunyavirus transmitidos por artrópodos se mantienen en la naturaleza principalmente por dos ciclos: ciclo en reservorios artrópodos y ciclo de amplificación en vertebrados El ciclo en reservorios artrópodos perpetúa la transmisión del virus entre los zancudos. Un zancudo hembra infectado puede transmitir verticalmente el virus a su descendencia (Borucki et al. 2002). Debido a la transmisión vertical, el virus puede sobrevivir el invierno en regiones templadas. Los zancudos machos infectados verticalmente pueden transmitir el virus, por vía venérea, a hembras no infectadas (Soldan y González-Scarano 2005). En el ciclo de amplificación enzoótico se involucra la participación de mamíferos pequeños. Al alimentarse de éstos, las hembras infectadas pueden transmitir el virus al mamífero. El mamífero puede desarrollar una viremia corta y alta, con capacidad para infectar otros artrópodos hematófagos. Si un artrópodo infectado se alimenta de un humano (Figura 5), puede ocurrir una infección zoonótica (Nichol 2001, Soldan y González-Scarano 2005). También se ha observado ciclos de amplificación urbana que originan epidemias (Moraes 2007). En los tres géneros de bunyavirus transmitidos por artrópodos se puede encontrar 24 virus que utilizan como vector alguna especie de zancudo (Nichol 2001). Los ortobunyavirus utilizan como vectores principalmente zancudos, incluidos los géneros Culex y Aedes (Moraes 2007, Reese 2008). Figura 5. Patogénesis de Orthobunyavirus en humanos. Fuente: Modificada de Wattam, 2006 25 La mayoría de estudios sobre bunyavirus, realizados en América tropical o subtropical, se originan principalmente en Brasil (Nunes 2005, de Brito 2007, Moraes 2007, Quinan 2008). En otros países se ha estudiado casos de infección humana por bunyavirus emergentes (Scherer et al. 1983, Tauro et al. 2009). Entre 1968 y 1980 un equipo realizó estudios sobre Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV, Alphavirus: Togaviridae) en Guatemala (Scherer et al. 1986, Scherer et al. 1985, Cupp et al. 1986). Aunque el objetivo era analizar la ecología de VEEV, durante esos estudios se obtuvo 34 aislados de diversos ortobunyavirus. Entre los virus aislados se encontraron 28 del grupo C y 6 del grupo PAT. En total, se identificaron siete aislados como Nepuyo virus (NEPV) y tres como Patois virus (PATV). De estos virus, 31 fueron aislados de hámsteres centinela en La Avellana, Santa Rosa, y Puerto Barrios, Izabal (Scherer et al. 1985). Dos aislados de NEPV se obtuvieron de personas con enfermedad febril, también en Guatemala (Scherer et al. 1983). El único aislado viral de zancudos macerados provino de un grupo de Cx. taeniopus y fue identificado como NEPV (Cupp et al. 1986). I.2.7 Artrópodos vectores de bunyavirus Los arbovirus de la familia Bunyaviridae utilizan una variedad de artrópodos para su transmisión en la naturaleza. Los ortobunyavirus utilizan como vectores principalmente zancudos, además de moscas culicoides y flebotominas (Nichol 2001). Entre los zancudos vectores de ortobunyavirus en América se encuentra varias especies del género Aedes (LeDuc 1987, Borucki et al. 2002, Soldan y González-Scarano 2005, Moraes et al. 2007, Reese et al. 2008, Tauro et al. 2009) y varias especies del género Culex (Scherer et al. 1976, LeDuc 1987, Nunes et al. 2005, Soldan y González-Scarano 2005, Moraes et al. 2007, Tauro et al. 2008, Yadav et al. 2008). En Guatemala se aisló Nepuyo virus de zancudos Culex (Melanoconion) taeniopus (Diptera: Culicidae) (Cupp et al. 1986). La sistemática de estos zancudos ha sido muy discutida (Galindo 1969, Cupp et al. 1989, Williams y Savage 2009). Es generalmente aceptado que la identificación hasta especie de 26 hembras adultas del subgénero Melanoconion es muy complicada y requiere mucha experiencia. Debido a esto, muchos zancudos son solamente identificados como pertenecientes al complejo Cx. taeniopus (Cupp et al. 1989). Las técnicas de identificación actuales son tediosas y consumen mucho tiempo. Si se encuentra que estos zancudos son vectores importantes de arbovirus será necesario desarrollar nuevas técnicas, más apropiadas para la identificación rutinaria (Cupp et al. 1989, Williams y Savage 2009). Los zancudos del complejo Cx. taeniopus se encuentran distribuidos desde el norte de Suramérica hasta el sur de Florida y el Caribe (Cupp et al. 1989). Se ha encontrado que estos zancudos son comunes en hábitats boscosos y húmedos, y en áreas peridomiciliares cercanas. La abundancia de hojas muertas y escombros de árboles es favorable para la presencia de formas inmaduras de Cx. taeniopus (Galindo 1969). En pocas ocasiones es posible encontrar los estadíos larvarios en la naturaleza (M. Williams y H.M. Savage, comunicación personal). En hábitats modificados, principalmente los cercanos a bosques secundarios, Cx. taeniopus es uno de los grupos dominantes y presenta actividad desde el comienzo de la noche (Cupp et al. 1986, Forattini et al. 1991). Se ha encontrado que las hembras de Cx. taeniopus (Figura 6) son atraídas por una variedad de hospederos vertebrados (Forattini et al. 1991). En Guatemala, se determinó que estos zancudos se alimentan principalmente de mamíferos, grandes y pequeños, incluidos los humanos, y aves. También se determinó que pueden llegar a alimentarse de reptiles, cuando estos se encuentran en un ambiente peridomiciliar (Cupp et al. 1986). Cx. taeniopus es un vector conocido de arbovirus como el VEEV (Cupp et al. 1979, Scherer et al. 1987). El papel de Cx. taeniopus en la transmisión de bunyavirus ha sido sugerido por evidencia circunstancial. El aislamiento de bunyavirus a partir de Cx. taeniopus en un hábitat con transmisión del virus sugiere un papel de estos zancudos en la ecología viral (Cupp et al. 1986), pero no comprueba un papel como vector. La transmisión de diversos arbovirus por Cx. taeniopus ha sido evaluada de forma experimental. En base a esos estudios, se 27 sospecha que Cx. taeniopus puede ser un vector de ortobunyavirus como Caraparu virus, Oriboca virus y Guama virus (Galindo y Srihongse 1967, Toda y Shope 1967). Figura 6: Hembra adulta de Cx. taeniopus. Fuente: Colección de referencia del Laboratorio de Entomología Sistemática, Departamento de Biología, Universidad del Valle de Guatemala. I.2.8 Diagnóstico Existe una amplia variedad de ensayos serológicos que se han utilizado para el diagnóstico de infecciones causadas por virus del género Bunyavirus. Entre estos se encuentran: la inhibición de hemaglutinación, neutralización y ELISA (“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”) para la detección de inmunoglobulinas M y G (Nichol, 2001; Morales-Betoulle et al., 2001). Para diagnosticar e identificar a los bunyavirus a partir de vectores se puede aplicar algunas técnicas serológicas de detección de antígeno, sin embargo el estándar de oro consiste en realizar aislados virales por medio de cultivo en 28 líneas celulares. Todas estas técnicas consumen tiempo y son en general muy laboriosas o requieren de laboratorios de bio-seguridad de un nivel elevado (ej. laboratorios de clase 3). Si se quiere trabajar con un gran número de especimenes (e.g. zancudos), estas técnicas no necesariamente son las más adecuadas (Kuno et al, 1996). Por lo tanto, es importante el desarrollo de técnicas más eficientes, que consuman menos tiempo, y que eventualmente permitan identificar los diferentes serotipos de Bunyavirus, como por ejemplo la detección molecular del ARN viral por medio de RT-PCR (trascripción reversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa). 29 PARTE III III.1. RESULTADOS III.1.1 Captura e identificación de zancudos Para este trabajo se utilizaron zancudos capturados previamente en el marco del estudio de vigilancia ecológica del West Nile virus, en el CES-UVG/CDC-CAP. Durante este período se capturaron zancudos del género Culex pertenecientes al menos 12 especies diferentes (Cuadro 1). Cuadro 1. Listado de especies de zancudos del género Culex, capturados en Puerto Barrios Izabal, 2007-2009 Listado de especies del género Culex Culex( Culex) quinquefasciatus Culex (Culex) interrogator Culex (Culex) chidesteri Culex (Culex) complejo coronador Culex (Culex) corniger-lactator Culex (Culex) declarator mollis Culex (Culex) inflictus Culex (Culex) mollis-inflictus Culex (Culex) nigripalpus Culex (Melanoconion) erraticus Culex (Melanoconion) taeniopus Culex (Melanoconion) theobaldi Culex Melanoconion sp1 Fuente: Proyecto FODECYT 03-2007 y Estudio de vigilancia ecológica del West Nile virus, CESUVG/CDC-CAP. 1 Se incluyen tres especies que no pudieoron ser identificadas con la clave dicotomica disponible para identificación de zancudos de Guatemala. Para la detección de Bunyavirus se utilizó únicamente los zancudos capturados e identificados de la especie Culex (Melaconion) taeniopus. Como se mencionó anteriormente, esta especie fue seleccionada debido a que varias de las epecies Culex (Melanoconion) incluyendo Cx. taeniopus son especies candidatas 30 vector de ortobunyavirus (Cupp et al. 1986, Galindo y Srihongse 1967, Toda y Shope 1967). III.1.2 Extracción de ARN viral y control interno Se observó que ambas metodologías de extracción de ARN (Roche y Qiagen) fueron eficientes al realizar un PCR para la amplificación del ARN ribosomal 18S de los zancudos. Las muestras probadas para este ensayo mostraron el producto esperado de alrededor de 500 pares de bases, indicando que las extracciones fueron exitosas (Figura 8). Una vez comprobada la eficiencia de ambas metodologías, se realizaron un total de 5 extracciones de ARN, cada una con 23 lotes de zancudos y un control negativo. Figura 7. Verificación de la calidad del ARN extraído utilizando distintos kits comerciales por medio del ensayo de PCR 18S Panel A) Los carriles 1 al 10 corresponden a las muestras extraídas con el kit comercial Qiagen. Los carriles del 11 al 20 corresponden a las muestras extraídas con el kit comercial Roche. Panel B) los carriles 1-2 corresponden a los controles negativos de extracción con el kit comercial Qiagen, los carriles 3-4 corresponden a los controles negativos de extracción con el kit comercial Roche, los carriles 5-6 corresponden a los controles negativos sin templado. Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008 31 III.1.3 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación del ARN viral Se llevó a cabo la implementación de los ensayos de RT-PCR de punto final (convencional) para la detección de orthobunyavirus utilizando los parámetros de reacción previamente publicadas (Lambert y Lanciotti 2009). Para esto, se modificó la composición de la mezcla de reacción del ensayo BunC para así acoplarlo a las mismas condiciones de temperatura y tiempo del ensayo Cal/Bwa (Figura 8). Un ensayo se consideró optimizado si se observaba claramente un producto de amplificación de la longitud esperada. Tanto para el ensayo Cal/Bwa como para el ensayo BunC se observó amplificación del control positivo INKV, indicando que su preparación fue exitosa. Además se observó amplificación utilizando diluciones del control positivo en un rango de entre 1/00 hasta 1/1000. Figura 8. Ensayo inicial de RT-PCR para detección de Orthobunyavirus. MM 1 2 3 4 5 6 A 7 MM 1 8 B 2 3 INKV 4 5 6 7 8 Neg. ~900 1000 pb ~210 pb En el panel A se observa los productos del ensayo Cal/Bwa. En el panel B se observa los productos del ensayo BunC. Los carriles 1-4 son diluciones 1/100, 1/250, 1/500 y 1/1000 del control de INKV. Los carriles 5-8 son controles negativos duplicados, de agua y sin plantilla. Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008 32 Adicionalmente, se redujo el volumen de reacción propuesto (50 μL) a 20 μL con el fin de utilizar menos reactivos y una menor cantidad de muestra (Figura 9). Se observó que la disminución del volumen de reacción no afectó la amplificación en ninguna de las distintas diluciones probadas. Figura 9: Ensayo optimizado de RT-PCR para detección de Orthobunyavirus utilizando distintos volúmenes de reacción MM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A INKV, 50 µL INKV, 20 µL ~200 pb B ~900 pb En el panel A se observan los productos de amplificación del ensayo Cal/Bwa. En el panel B se observan los productos de amplificación del ensayo BunC. Se utilizaron diluciones 1/100, 1/250, 1/500 y 1/1000 del ARN extraído del control de INKV en ambos casos. Los carriles 1-4 corresponden a reacciones de 50 µL con diluciones de INKV como plantilla, los carriles 8-11 a reacciones de 20 µL. Los carriles 5 y 7 son controles negativos para las reacciones de 50 y 20 µL. Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008 III.1.4 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus Para detectar el ARN genómico de ortobunyavirus en las muestras de zancudos se utilizaron las pruebas estandarizadas (Figura 10). Las muestras que presentaron amplificación para ambos ensayos (Cal/Bwa y BunC), una banda clara del tamaño esperado, fueron consideradas positivas. 33 Cneg INKV MM INKV MM Cneg Figura 10. Productos de amplificación del RT-PCR Cal/Bwa para detección de ortobunyavirus utilizando muestras de zancudos Culex (Melanoconion) taeniopus colectados en Puerto Barrios, Izabal. En ambos paneles (A y B) los extremos izquierdo y derecho son marcadores moleculares de ADN de doble hebra con masa molecular a intervalos de 100 pb. Los carriles 1-21 contienen productos de amplificación de reacciones con muestra. El carril 22 contiene control negativo de agua y el carril 23 contiene control positivo de INKV. Las bandas de amplificación del tamaño esperado se muestran rodeadas por un círculo blanco. Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008 Se analizó un total de 114 lotes de zancudos, en 16 de éstos se detectó la posible presencia de orthobunyavirus por los ensayos estandarizados. En el ensayo BunC se observó amplificación inespecífica de ácidos nucleicos (datos no mostrados), en este caso, las muestras fueron consideradas sospechosas. Todas las muestras que no presentaron amplificación alguna fueron consideradas negativas. El cuadro 2 muestra los datos de cada lote de Cx. taeniopus positivo para ortobunyavirus. Con estos datos se calculó la tasa de infección por el método 34 MLE para Cx. taeniopus. Adicionalmente, se determinó que la tasa de infección por año de bunyavirus en los zancudos procesados fue de 4.77*1000 (IC95%=2.47,8.45) zancudos probados para 2007 (IC95%=5.65,25.51) zancudos probados para 2008. y de 12.72*1000 En 2009 no se detectó presencia de bunyavirus por el método utilizado. Cuadro 2. Tasas de infección mensuales por bunyavirus en Cx. taeniopus. Lotes Zancudos Año Mes Capturados Cantidad Positivos MLE 1 1 1 1 --7 301 9 1 3.63 2007 8 1198 29 4 3.58 9 229 7 1 4.43 10 441 13 2 5.13 1 6 3 1 183.50 2 193 6 1 5.34 2008 3 63 3 1 16.98 6 10 2 1 225.73 7 54 5 1 21.21 MIR 1000* 3.32 3.34 4.37 4.54 166.67 5.18 15.87 100.00 18.52 Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008. Se trabajó un total de 114 lotes de zancudos hembra, que contenían 2,942 individuos (MIR= tasa de infección*1000 zancudos, MLE= estimación de máxima verosímilitud*1000 zancudos). Se muestra únicamente las tasas de infección indicadas como significativamente mayores a 1 zancudo infectado por cada 1000 (α = 0.05). * Estimado no es confiable debido a que la muestra contiene un único zancudo y este es positivo Se observó que la distribución de Cx. taeniopus es predominantemente rural y que su densidad relativa varía con el tiempo, disminuyendo anualmente. Mediante un análisis de varianza de Friedman se determinó que sí hay un cambio significativo en la densidad relativa media de Cx. taeniopus (p = 0.0377, α = 0.05). Al comparar la tasa de infección por bunyavirus y la densidad relativa de Cx. taeniopus se observa una similitud en los patrones de ambos (Gráfica 1). Mediante un análisis de correlación de Spearman se determinó que si hay correlación entre la densidad relativa y la tasa de infección por bunyavirus en Cx. taeniopus (r = 0.4360, p = 0.0204, α = 0.05). 35 III.1.5 Aislamiento viral A pesar que se obtuvó amplificación de bunyavirus por medio de RT-PCR, no fue posible aislar Bunyavirus a partir de las muestras enviadas de zancudos Cx. taeniopus. 36 Figura 11. Densidades de zancudos Cx. taeniopus, colectados en Puerto Barrios, Izabal 2007-2009. Fuente: Proyecto FODECYT 34-2008 37 III.2 Discusión El presente proyecto tenía como objetivo la implementación de ensayos moleculares para la detección de bunyavirus utilizando zancudos del género Culex como fuente de material genético, con el fin de fortalecer la capacidad nacional para la detección de estos virus causantes de enfermedades de tipo febril en los humanos. III.2.1 Extracción de ARN viral y control interno Como se mencionó anteriormente, fue posible llevar a cabo la extracción de ARN exitosamente a partir de zancudos utilizando dos distintos kits comerciales (Roche y Qiagen). Es importante mencionar que cada vez que se utiliza un nuevo kit comercial, o cuando se trabaja con distintas fuentes de material genético (sangre, tejidos, etc), en necesario llevar a cabo pruebas utilizando un control interno (en este caso, la amplificación del ARN 18S) para así garantizar los resultados obtenidos por los ensayos moleculares III.2.2 Estandarización de ensayos de RT-PCR para amplificación del ARN viral Fue posible disminuir el volumen de reacción para ambos ensayos de PCR. Esto es de importancia, ya que muchas veces a una misma muestra se le deben realizar varias pruebas de diagnóstico. De igual manera, al momento de implementar una técnica es necesario optimizar la cantidad de material para disminuir los costos y poder analizar una mayor cantidad de muestras. Como se mencionó en la sección de resultados, fue posible utilizar el mismo programa de amplificación para ambos ensayos (BunC/CalBwa). Aún cuando este no es un ensayo de PCR multiplex, es posible aprovechar las condiciones de los ciclos de temperatura necesarios para la amplificación del virus al momento de tener la necesidad de realizar ambos ensayos. 38 Una de las principales limitantes al momento de estandarizar un ensayo de RTPCR es la elección de un control positivo adecuado. En este caso se eligió el ARN de Inkoo virus (INKV, Orthobunyavirus) no viable. INKV es un ortobunyavirus del serogrupo California/Bunyamwera presente únicamente en Europa (Schmaljohn y Hooper 2001). Ya que este virus no circula en América, utilizarlo como control positivo provee la ventaja de un control de calidad: si se observa un resultado positivo a partir de una reacción en que se utilizó como plantilla ARN extraído de una muestra, se puede secuenciar el producto de amplificación. Si la secuencia coincide completamente con la de INKV se puede concluir que el resultado es debido a una contaminación y, por lo tanto, es inválido. Se observó que el ensayo BunC puede generar amplificación inespecífica porque se utiliza un solo cebador corto (15 b) y es posible que se una inespecíficamente en ácidos nucleicos con secuencias similares. Debido a esto, se optó por considerar presuntamente positiva una muestra con amplificación del tamaño esperado para el ensayo Cal/Bwa. Con la implementación de la capacidad dianósitca por medio de pruebas moleculares de RT-PCR convencional para la detección de bunyavirus en Guatemala, se cuenta con una herramienta más para la investigación de agentes virales zoonóticos que circulan en el país. 39 III.2.3 Detección de bunyavirus en Cx. taeniopus Se obtuvo amplificación de ARN de bunyavirus a partir de Cx. taenipus. Esto sugiere que estos zancudos podrían estar implicados en el ciclo de transmisión de estos virus, actuando como potenciales vectores. Esto apoya los resultados reportados por Cupp et al. (1986) donde se aisló el virus Nepuyo (bunyavirus) a partir de la misma especie de zancudo. La proporción de zancudos infectados en un período de tiempo se estima comúnmente como la tasa mínima de infección (MIR, por sus siglas en inglés). Este estimado esta basado en la suposición de que al menos un zancudo se encuentra infectado en cada lote positivo. Debido a que no es posible conocer si más de un zancudo del lote se encontraba estaba infectado, calcular la MIR puede subestimar el nivel real de infección (Gu et al. 2003, Katholi y Unnasch 2006). Una alternativa para estimar la tasa de infección es el método del estimador de máxima verosimilitud (MLE, por sus siglas en inglés). En el método MLE se asume que la prueba de detección es perfectamente sensible y específica (es decir, siempre que hay infección ésta es detectada, y nunca se detecta si no la hay), que cada zancudo es independiente de los demás (es decir, todos tienen la misma probabilidad de estar infectados), y que todos los lotes están distribuidos idénticamente (es decir, agrupar los zancudos no afecta la probabilidad de que estén infectados). Asumiendo esto, aunque no se puede saber si hay más de un individuo infectado en un lote positivo, se puede asegurar que no hay individuos infectados en los lotes negativos. Tomando en cuenta los lotes negativos y la cantidad de zancudos que contienen, es posible estimar la probabilidad de que un solo zancudo esté infectado en la población (Barker 2000). Aunque es posible que la tasa de infección (calculada por el método de MLE) en algunos meses sea mas alta que en otros, no se pueden realizar conclusiones en base a esa estimación porque el tamaño de la muestra no cumple con los requisitos mínimos para el 40 estimador MLE (Condotta et al. 2004). Por esta razón, se calcularon las tasas de infección por año. Respecto a la tasa de infeccion, se observó que en 2008 fue mayor a 2007. Hay que considerar que la densidad de zancudos en 2007 fue mayor a 2008, esto puede tener un efecto de dilución en la incidencia del virus en zancudos, resultando en una menor tasa de infección estimada. En 2009 no se detectó la presencia de bunyavirus en zancudos Cx. taeniopus, sin embargo, esto no significa que el o los virus no estén circulando. Los límites de confianza para el MLE son un reflejo del sesgo del estimador (Katholi y Unnasch 2006). Es decir, mientras mayor sea el rango de confianza menos exacto es el estimado. Debido a que la cantidad de lotes por cada mes es baja, los estimados de tasa de infección cero (p.e. febrero 2007) tienen límites de confianza muy amplios. Esto es porque con la cantidad de información disponible (p.e. lotes negativos) no es posible asegurar que la tasa de infección sea realmente cero. Se puede observar que la tasa de infección estimada por ambos métodos es similar. Se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney que no hay una diferencia significativa entre las tasas de infección calculadas por cada método (p = 0.5787, α = 0.05). Esto sugiere que la tasa de infección estimada es cercana a la tasa de infección real, ya que MIR estima la tasa mínima de infección posible con los resultados obtenidos. La detección de un pico de tasa de infección con un retraso respecto al pico de densidad relativa puede tener varias explicaciones. Podría ser que al haber más zancudos alimentándose, más hospederos vertebrados estén expuestos al virus. Las poblaciones de posibles hospederos cambian poco en períodos cortos de tiempo, por lo que la disminución en la población de posibles vectores aumenta la probabilidad de que un zancudo se alimente de un vertebrado infectado. Esto, a su vez, aumenta la probabilidad de capturar un zancudo infectado. III.2.4 Aislamiento viral Se ha observado en otros virus zoonóticos (Influenza A) que hay una concordancia entre los resultados obtenidos por medio de técnicas moleculares y las técnicas de aislamiento viral (Ferro et al 2010) ha reportado en la literatura que los 41 arbovirus presentan dificultad para ser aislados. Sin embargo, para los arbovirus se ha observado que estos presentan dificultad de ser aislados en el laboratorio (Jubelt 2010). Los métodos de PCR permiten la detección del material genético del virus, en este caso, el ARN de bunyavirus, sin embargo, si el virus no se encuentra viable, no puede llevarse a cabo el aislamiento de éste (H. Savage comunicación personal, DVBIDCDC). Dado el hecho que en este se obtuvo resultados positivos por medio de los ensayos de PCR es importante continuar con la vigilancia de estos virus con el objeto de tener aislados virales y lograr secuenciar las cepas circulantes en el país. 42 PARTE IV IV.1. CONCLUSIONES IV.1.1. Se implementaron pruebas para la detección de material genético de ortobunyavirus en zancudos en Guatemala a través de ensayos moleculares estandarizados. IV.1.2. Se detectó material genético de ortobunyavirus en los zancudos de la especie Culex (Melanoconion) taeniopus capturados en Puerto Barrios Izabal, durante 2007 y 2008, por medio de RT-PCR. IV.1.3. No se obtuvó aislados virales a partir de zancudos Culex (Melanoconion) taeniopus colectados en Puerto Barrios Izabal, durante el periodo de 2007 a 2009. IV.1.4. Se obtuvó una tasa de infección de 4.77*1000 zancudos para el año 2007 y de 12.72*1000 zancudos para 2008. En el año 2009 no se detecto bunyavirus circulando en los zancudos. 43 IV.2. RECOMENDACIONES Las principales recomendaciones de la investigación son: IV.2.1. Verificar el funcionamiento del ensayo de detección de ortobunyavirus utilizando varios bunyavirus de identidad conocida. IV.2.2. Continuar con estudios sobre la biología de Cx. taeniopus para definir su importancia como posible vector de bunyavirus u otros arbovirus. IV.2.3. Estudiar otras poblaciones de Cx. taeniopus, del género Culex y otros géneros, como por ejemplo zancudos del género Aedes, con el objetivo de comprender el ciclo natural de los bunyavirus. IV.2.4. Continuar con la investigación de bunyavirus de distintos serogrupos y otros arbovirus en el país tanto en vectores como en humanos y animales posibles hospederos. 44 IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Alatoom, A. y D. Payne. 2009. An Overview of Arboviruses and Bunyaviruses. Labmedicine. 40(4): 237-240. Arai, S. et al. 2008. «Molecular phylogeny of a newfound hantavirus in the Japanese shrew mole (Urotrichus talpoides)». 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Contigiani. 2009. «First detection of human infection by Cache Valley and Kairi viruses (Orthobunyavirus) in Argentina». Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 103:197–199. Toda, A. y R.E. Shope. 1967. «Transmission of Guamá and Oriboca viruses by naturally infected mosquitoes». Nature. 208:304. Vasconcelos, P.F.C.; A.P.A. Travassos da Rosa, F.P. Pinheiro, R.E. Shope, J.F.S.T Rosa, S.G. Rodrigues, M. Dégallier, E.S. Travassos da Rosa. 1998. «Arboviruses pathogenic for man in Brazil». En: An overview of arbovirology in Brazil and neighbouring countries, de Travassos da Rosa, A.P.A.; P.F.C. Vasconcelos y J.F.S.T Rosa (Editores). Instituto Evandro Chagas, Belém. págs.72– 99. Vasconcelos, P.F.C.; A.P.A. Travassos da Rosa, S.G. Rodrigues, E.S. Travassos da Rosa, N. Dégallier y J.F.S. Travassos da Rosa. 2001. «Inadequate management of natural ecosystem in the Brazilian Amazon region results in the emergence and reemergence of arboviruses». Cadernos de Saúde Pública. 17(S):155–164. Wattam, R., 2006. Bioinformatics Crimean-Congo Hemorragic Fever (CCHF) Virus. Institute. Disponible Virginia en: http://pathport.vbi.vt.edu/pathinfo/pathogens/CCHF_2.html 51 Williams, M. y H.M. Savage. 2009. «Identification of Culex (Melanoconion) Species of the United States Using Female Cibarial Armature (Diptera:Culicidae)». Journal of Medical Entomology. 46(4):745–752. Yadav, P.D.; A.C. Mishra y D.T. Mourya. 2008. «Molecular characterization of Umbre virus (Bunyaviridae)». Virology Journal. 5:115. Zeier, M.; M. Handermann, U. Bahr, B. Rensch, S. Müller, R. Kehm, W. Muranyi y G. Darai. 2005. «New Ecological Aspects of Hantavirus Infection: A Change of a Paradigm and a Challenge of Prevention – A Review». Virus Genes. 30(2):157– 180. 52 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO DÉCIMA NOVENA CONVOCATORIA LINEA FODECYT "ANÁLISIS E IMPLEMENTACIÓN Nombre del Proyecto: Grupo DEL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE BUNYAVIRUS Numero del Proyecto: UTILIZANDO ZANCUDOS DEL GÉNERO CULEX COMO FUENTE DE MATERIAL GENÉTICO" 034-2008 Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: Monto Autorizado: Plazo en meses Fecha de Inicio y Finalización: Q359,947.50 12 MESES 02/03/2009 al 28/02/2010 Renglon DRA. MARÍA EUGENIA MORALES BETOULLE Nombre del Gasto PRÓRROGA AL 31/08/2010 TRANSFERENCIA Asignacion Presupuestaria En Ejecuciòn Mas (+) Menos (-) Pendiente de Ejecutar Ejecutado Servicios no personales 1 181 181 189 199 2 241 243 261 262 267 291 295 3 323 Estudios, investigaciones y proyectos factibilidad Estudios, investigaciones y proyectos factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) de Q 122,125.00 Q Q 8,000.00 5,000.00 Otros estudios y/o servicios Otros servicios no personales MATERIALES Y SUMINISTROS Papel de escritorio Q Productos de papel o cartón Elementos y compuestos químicos Q Combustibles y Lubricantes Tintes, pinturas y colorantes Q Útiles de oficina Q Útiles menores, médico-quirúrgicos y de laboratorio Q PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES Equipo médico-sanitario y de laboratorio Q GASTOS DE ADMÓN. (10%) Q MONTO AUTORIZADO (-) EJECUTADO SUBTOTAL (-) CAJA CHICA TOTAL POR EJECUTAR Q 107,125.00 Q 15,000.00 Q 5,000.00 Q Q Q 5,000.00 Q 8,000.00 - Q Q Q 32.90 Q 3,675.00 Q 986.00 Q 32.90 Q 77,774.11 Q 14.00 0.89 de Q 5,000.00 1,000.00 74,100.00 1,000.00 2,500.00 Q 2,006.90 Q Q 976.38 Q 493.05 Q 23.62 0.05 59,700.00 Q 5,551.00 Q 54,125.69 Q 23.31 Q 3,850.00 Q Q 57,649.39 Q 32,722.50 Q 0.61 - 12,557.90 Q 12,557.90 Q 336,885.02 Q 23,062.48 Q 27,622.48 53,800.00 32,722.50 Q 359,947.50 Q Q Q Q 359,947.50 332,325.02 27,622.48 Q 27,622.48 Disponibilidad 53