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BIO-FLASH anti-HBc
3000-8578
100 tests
BIO-FLASH anti-HBc es un inmunoensayo quimioluminiscente de dos pasos totalmente automatizado para
la determinación cualitativa de anticuerpos totales contra el antígeno core de la hepatitis B (anti-HBc) en
suero o plasma humano con el instrumento BIO-FLASH.
Sumario
La hepatitis B es una enfermedad hepática producida por el virus de la hepatitis B (HBV) y representa un
importante problema de salud global. El virus causa una variedad de enfermedades del hígado que van desde la
hepatitis aguda y crónica a cirrosis y cáncer primario de hígado. Las enfermedades causadas por el HBV tienen
una distribución mundial. Se estima que aproximadamente un tercio de la población mundial ha sido infectada con
el HBV. De éstos, unos 350 millones de personas están crónicamente infectadas y en riesgo de desarrollar una
enfermedad grave y muerte, sobre todo por cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. La infección por el HBV
varía considerablemente en diferentes áreas geográficas y la prevalencia de la infección crónica por HBV puede
variar desde 0,2 a 15%. Los principales modos de transmisión del HBV son la exposición perinatal a una madre
infectada, horizontal, parenteral y sexual, y las tasas relativas de estos modos varían alrededor del mundo. La
transmisión parenteral y la sexual son frecuentes en los países industrializados, mientras que la transmisión
perinatal y la horizontal predominan en los países en desarrollo.1,2
Durante la infección viral aparecen varios marcadores serológicos entre los cuáles está el anti-HBc. El antígeno
core de la hepatitis B (HBcAg) es un componente interno del virus de la hepatitis B que es antigénicamente distinto
del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). El sistema antígeno-anticuerpo HBcAg/anti-HBc fue descrito
3
en 1971 por Almeida et al. El anti-HBc generalmente se puede detectar en la sangre poco después de la
detección de HBsAg y antes de la manifestación clínica de la hepatitis. En la hepatitis B aguda con recuperación,
el anti-HBc es el único marcador serológico de la infección en el período comprendido entre la desaparición del
HBsAg y la aparición de anti-HBs. El anti-HBc puede persistir de por vida, mientras que el anti-HBs puede llegar a
volverse negativo en algunos pacientes. En la hepatitis B crónica el anti-HBc se detecta juntamente con el HBsAg,
pero en algunos individuos puede que este antígeno no sea detectable. Las donaciones de sangre tomadas
cuando el anti-HBc es el único marcador serológico de la hepatitis B pueden ser infecciosas y se ha sugerido que
el cribado para anti-HBc, además del cribado para HBsAg, podría reducir aún más la incidencia de hepatitis B post
5
transfusión. De hecho, el cribado para anti-HBc en donaciones de sangre es obligatorio en varios países.
La determinación de anti-HBc, HBsAg y anti-HBs se recomienda en el caso de pacientes inmunodeprimidos, como
los pacientes con VIH y en el caso de personas inmunodeprimidas, debido a un mayor riesgo de reactivación de la
6
hepatitis B. Por otro lado, la detección de anti-HBc también se debe realizar en cualquier persona antes de la
aplicación de la vacuna contra la hepatitis B para determinar el estado inmunológico con el fin de vacunar sólo a
las personas negativas para anti-HBc.
Principio
Cuando las micropartículas paramagnéticas y el tampón de ensayo de BIO-FLASH anti-HBc se mezclan e
incuban con la muestra, si ésta presenta anticuerpos específicos anti-HBc, éstos se combinan con el antígeno HBc
que recubre las micropartículas. Después de una separación magnética y lavado para eliminar la muestra residual,
se añade un trazador que consiste en un anticuerpo IgG de conejo anti-HBc marcado con isoluminol que puede
unirse al antígeno HBc que recubre las micropartículas. Tras una segunda incubación, separación magnética y
otro lavado, se añaden los reactivos que activan la reacción quimioluminiscente. El luminómetro del BIO-FLASH
mide la luz emitida como unidades relativas de luz (URL), que son inversamente proporcionales a la concentración
de anti-HBc de la muestra.
El BIO-FLASH utiliza un método de reducción de datos con ajuste a una curva logística de 4 parámetros (4PLC)
para generar una Curva de Calibración Maestra (CCM). Esta curva viene predefinida, depende del lote y se
almacena en el instrumento a través del código de barras del cartucho. Con la medición de los calibradores (que
se suministran en un kit aparte), la CCM predefinida se transforma en una Curva de Calibración de Trabajo (CCT)
nueva y específica para el instrumento. Las concentraciones de los calibradores están incluidas en los códigos de
barras de los tubos de calibradores.
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Esquema de la reacción:
Activadores
(Triggers)
URL
Partícula magnética
Muestra
Trazador
Emisión de luz
Componentes
Cartucho de reactivos
El kit BIO-FLASH anti-HBc contiene un cartucho de reactivos para 100 determinaciones (REF 3000-8578).
Nota: El diseño del cartucho está protegido por patente (US D565,741 / Diseño CE 000762992-0001)
Composición del cartucho de reactivos:
El cartucho se compone de 4 viales que contienen:
A.
1 vial cilíndrico de suspensión de micropartículas
recubiertas con antígeno HBc recombinante.
Contiene < 0,1% de azida sódica.
B.
1 vial de tampón de ensayo.
C.
1 vial opaco de trazador que consiste en un
anticuerpo IgG de conejo anti-HBc marcado con
isoluminol. Contiene < 0,1% de azida sódica.
D.
1 vial vacío.
Preparación
Véase la figura siguiente.
Cartucho: las micropartículas sedimentan durante su transporte y almacenamiento, por lo que se tienen que
mezclar para volverlas a resuspender.
•
La primera vez que vaya a utilizar el cartucho, inviértalo suavemente 30 veces sin que se forme espuma
(las burbujas pueden hacer que los sensores de líquido del instrumento den lecturas erróneas).
•
Compruebe que las micropartículas se hayan resuspendido totalmente. Si no es así, siga invirtiendo el
cartucho hasta que se resuspendan en su totalidad.
•
Si las micropartículas no se resuspenden o detecta que el precinto de los reactivos está roto, NO UTILICE EL
CARTUCHO.
•
Una vez resuspendidas las micropartículas, sitúe el cartucho sobre una superficie sólida y retire con cuidado
la lengüeta roja de seguridad para el transporte.
•
Manteniendo el cartucho en la superficie sólida, apriete las dos pestañas situadas a los lados del tapón
perforador (parte gris) y presione la parte superior del cartucho hasta que quede en posición de bloqueo. Una
vez en posición de bloqueo, las pestañas tienen que quedar ocultas. No invierta el cartucho abierto.
•
Deje reposar el cartucho durante 5 minutos antes de cargarlo en el instrumento.
•
Una vez cargado el cartucho, el instrumento mezcla su contenido de forma automática a intervalos periódicos.
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Precauciones
Los reactivos BIO-FLASH son para diagnóstico IN VITRO.
Uso exclusivo para profesionales.
La azida sódica puede reaccionar con tuberías y desagües de plomo o cobre dando lugar a azidas metálicas
altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante.
ATENCIÓN: MATERIAL DE RIESGO BIOLÓGICO.
Deseche todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante.
Por favor, no reutilice ni reintroduzca reactivos en los cartuchos o viales.
Recolección y conservación de las muestras
Usar suero fresco (también se pueden utilizar tubos con gel separador de suero) o plasma (EDTA, Li-heparina,
Na-heparina, Na-citrato y ACD). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las muestras
no deben ser inactivadas por calor. Las partículas en suspensión deben eliminarse por centrifugación. En las
directrices CLSI H18-A3 y H21-A5 encontrará más información sobre la manipulación, el transporte, el
procesamiento y la conservación de las muestras.
Suero
Las muestras de suero pueden ser conservadas entre 2-8°C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más
largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20°C. Las muestras pueden
congelarse/descongelarse un máximo de 3 veces. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no
haya burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis.
Plasma
Las muestras de plasma pueden ser conservadas entre 2-8°C durante 8 días. Si es por un período de tiempo más
largo, deben ser congeladas a una temperatura igual o inferior a -20°C. Descongelar el plasma a 37°C.
Descongelar las muestras sólo una vez. Mezclar bien después de descongelarlas. Compruebe que no haya
burbujas en las muestras y, en caso contrario, elimínelas en su totalidad antes del análisis.
Volumen de muestra
El volumen de muestra necesario para realizar una única prueba con BIO-FLASH anti-HBc varía en función del
tipo de recipiente que se utilice. Una prueba requiere al menos 100 µL más el volumen muerto, que es de 200 µL
si se utiliza la copa de muestra recomendada (REF 3000-8209).
Otros materiales
Los siguientes materiales no se suministran con el cartucho de reactivos y se tienen que comprar aparte.
REF 3000-8579
BIO-FLASH anti-HBc Calibrators (Calibradores)
REF 3000-8580
BIO-FLASH anti-HBc Controls (Controles)
Lea detenidamente las instrucciones correspondientes si desea más información.
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No utilice otros calibradores. La información que necesita el instrumento BIO-FLASH para calibrar el ensayo
BIO-FLASH anti-HBc está incluida en los códigos de barras de los viales.
Utilizar controles de otros fabricantes puede dar lugar a resultados imprevistos.
Asegúrese de que en el instrumento BIO-FLASH haya una cantidad suficiente de los siguientes consumibles
antes de procesar muestras, calibradores o controles:
REF 3000-8206
BIO-FLASH Cuvettes (Cubetas)
Nota: El diseño de las cubetas está protegido por patente (US D560,816 / Diseño CE 000762984-0001)
REF 3000-8204
BIO-FLASH Triggers (Activadores)
REF 3000-8205
BIO-FLASH System Rinse (Solución del sistema)
Instrumento / realización del ensayo
En el Manual del Usuario del BIO-FLASH encontrará las instrucciones completas para realizar el ensayo.
Calibración
El código de barras del cartucho contiene una Curva de Calibración Maestra (CCM) que es válida para el lote de
reactivos. Sin embargo, para todos los reactivos se necesita una Curva de Calibración de Trabajo (CCT), que es
específica para cada lote y válida hasta la fecha de caducidad de éste. Se debe obtener una nueva CCT cuando los
resultados de los controles salgan fuera del rango de aceptación o cuando se hayan realizado ajustes en el instrumento.
Lea detenidamente el Manual del Usuario del BIO-FLASH para configurar una CCT.
Control de calidad
Para realizar un programa completo de control de calidad se recomiendan dos niveles de control. Los controles
BIO-FLASH anti-HBc negativo y positivo se han diseñado para dicho programa. Los controles se deben analizar
al menos cada 24 horas por día de utilización. Asegúrese de que los resultados de los controles se encuentran
dentro del rango de aceptación ya que, si no es así, puede ser indicativo de resultados no válidos, ante los que el
usuario deberá tomar medidas correctivas. En este caso, verifique todos los resultados obtenidos desde la última
comprobación de control de calidad aceptable del analito en cuestión. Puede resultar necesario recalibrar el
instrumento. En el Manual del Usuario del instrumento encontrará más información. Para la identificación y
resolución de situaciones anormales de control de calidad, consulte Westgard et al.7
Conservación y estabilidad
Los reactivos que no se hayan abierto se mantienen estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta
del cartucho si se conservan entre 2-8°C en posición vertical.
Una vez abierto, la estabilidad del cartucho cargado en el instrumento BIO-FLASH o guardado a 2-8°C es de
8 semanas.
Trazabilidad de calibradores y controles
Los valores se expresan en UA/mL y se asignaron mediante múltiples ensayos con el instrumento BIO-FLASH
utilizando lotes específicos de reactivos, frente a patrones internos referenciados al Standard anti-HBc IgG del
Instituto Paul Ehrlich (HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc).
Interpretación de resultados
La cantidad de analito en cada muestra se determina a partir de la luz emitida (URL), mediante interpolación en la
Curva de Calibración de Trabajo almacenada. Los resultados de BIO-FLASH anti-HBc se expresan como UA/mL.
Como el ensayo es cualitativo, el valor numérico del resultado sólo es indicativo de la cantidad de anticuerpo
presente.
La determinación de anti-HBc con el ensayo BIO-FLASH anti-HBc se interpreta de la siguiente manera:
•
•
•
Las muestras con un resultado < 0,90 UA/mL se consideran no reactivas (negativas).
Las muestras con un resultado ≥ 0,90 y < 1,00 UA/mL se consideran indeterminadas (zona gris).
Las muestras con un resultado ≥ 1,00 UA/mL se consideran reactivas (positivas).
Las muestras con resultado inicialmente reactivo o indeterminado deben ser reanalizadas por duplicado. Si en la
repetición ambos valores son inferiores a 0,90, el resultado final de la prueba se interpreta como negativo para
anticuerpos anti-HBc. Si el resultado es positivo o indeterminado, la muestra debe ser investigada con una prueba
adicional y deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la sintomatología y la historia clínica. Un
resultado repetidamente positivo es indicativo de infección por HBV. Las muestras con una concentración mayor que
12,00 UA/mL se reportan como > 12,00.
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Limitaciones
El resultado de una única muestra no es suficiente para diagnosticar una infección por HBV. Por tanto, además de
los resultados de BIO-FLASH anti-HBc deben tenerse en cuenta otros datos como, por ejemplo, la
sintomatología, la historia clínica, los resultados de otras pruebas y demás información relevante. Un resultado
negativo no excluye la posibilidad de exposición o infección por HBV. Como en todos los inmunoensayos
sensibles, existe la posibilidad de obtener resultados positivos que no se repitan.
Resultados esperados
El anticuerpo anti-HBc es el marcador más frecuente de infección por el virus de la hepatitis B porque se detecta
tanto en la infección aguda como en la crónica y en la infección pasada. La prevalencia de anti-HBc y de otros
marcadores de la hepatitis B varía ampliamente en el mundo, desde alta (70-95%, ej., África, Asia y Pacífico
Oeste) a intermedia (20-55%, ej., sur y este Europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, América del Norte y
2
partes de América del Sur). La implementación de los programas de vacunación debería reducir la incidencia de
la infección por el HBV.
Características funcionales
Nota: los datos siguientes son representativos; los resultados en experimentos aislados pueden variar respecto a
estos datos.
Especificidad
La evaluación de especificidad se realizó probándose muestras de suero de donantes de sangre no
seleccionados, incluidos donantes de primera vez y de pacientes ingresados. Se probaron un total de 5.097
muestras frescas de sueros no seleccionados procedentes de dos bancos de sangre, de los cuales 3.536 eran del
Centro EFS Atlantique de Tours (Francia) y 1.561 eran del Centro EFS Nord de France de Lille (Francia).
Las muestras "repetidamente reactivas" fueron re-analizadas utilizando otro ensayo comercial. La especificidad se
calculó, obteniéndose los resultados mostrados en la siguiente tabla:
Muestras
analizadas
Donantes de sangre
Pacientes hospitalizados
RR
Inicialmente Repetidamente
reactivas
que eran
reactivas
(IR)
(RR)
indeterminadas
n
5097
210
n
31
28
n
13
25
n
5
0
RR
que eran
positivas
confirmadas
n
3
25
Especificidad
%
99,9
100
Sensibilidad
Un panel de muestras comprobadamente positivas para anti-HBc de diversos orígenes se probó con el
BIO-FLASH anti-HBc en comparación con los métodos comerciales de EIA y CLIA disponibles para anti-HBc.
Este panel incluía 28 muestras frescas del mismo día (≤ 1 día después de la recolección). Los resultados de
sensibilidad se muestran en la siguiente tabla:
Método de referencia
Método EIA
Método CLIA
Muestras
analizadas
n
403
205
Muestras
reactivas
n
400
205
Sensibilidad
%
100
100
En el caso de las 403 muestras analizadas en comparación con el método de EIA, dos muestras salieron en zona
gris con BIO-FLASH y otra con el método de referencia. Por esta razón, estas muestras no fueron consideradas
para el cálculo de la sensibilidad.
Sensibilidad para seroconversión
Estudios adicionales de sensibilidad se llevaron a cabo mediante análisis de muestras de 3 paneles comerciales
de seroconversión para hepatitis B. Los resultados obtenidos con el BIO-FLASH anti-HBc fueron concordantes
con los de otros métodos comerciales para todas las muestras.
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Precisión
Se evaluó, conforme a las directrices CLSI EP05-A2, la precisión intra-ensayo y total (ensayo a ensayo y día a día)
en múltiples ensayos. Los resultados se resumen en la tabla siguiente:
Control negativo
Control positivo
Alrededor del valor de corte
Media (UA/mL)
0,28
2,12
1,09
Intra-ensayo
0,077 SD
4,3 % CV
5,0 % CV
Total
0,094 SD
5,8 % CV
7,3 % CV
Reproducibilidad
Se evaluó la reproducibilidad entre réplicas, entre lotes y entre instrumentos usando 50 muestras. Los resultados
se muestran en la tabla siguiente:
Réplica 2 vs. Réplica 1
Lote 2 vs. Lote 1
Instrumento 2 vs. Instrumento 1
n
50
50
50
Co-negatividad
100%
100%
100%
Co-positividad
100%
100%
100%
Interferencias
Estudios conforme a las directrices CLSI EP7-A2 han demostrado que las siguientes sustancias potencialmente
interferentes no alteran los resultados de BIO-FLASH anti-HBc:
Sustancia potencialmente interferente
Hemoglobina
Bilirrubina indirecta
Bilirrubina directa
Triglicéridos
Factor reumatoide
HAMA
Concentración
500 mg/dL
18 mg/dL
18 mg/dL
1300 mg/dL
800 UI/mL
1 µg/mL
% Interferencia
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
≤ 10
Reactividad cruzada
Fueron analizadas con el ensayo BIO-FLASH anti-HBc un total de 111 muestras positivas para condiciones que
potencialmente podrían producir reacción cruzada y de mujeres embarazadas. Se considera que ocurre una
reacción cruzada cuando el diagnóstico cambia de positivo a negativo o viceversa. Las muestras reactivas se
compararon con un ensayo de referencia para evaluar la concordancia entre los ensayos. Los resultados se
resumen en la siguiente tabla:
Reacción cruzada potencial
ANA (anticuerpos antinucleares)
anti-CMV (anticuerpos frente a Citomegalovirus)
anti-E. coli
anti-EBV (anticuerpos frente al virus Epstein-Barr)
anti-HAV-IgG (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis A)
anti-HAV-IgM (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis A)
anti-HDV IgG (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis D)
anti-HEV (anticuerpos frente al virus de la Hepatitis E)
anti-HIV (anticuerpos frente al virus de la inmunodeficiencia humana)
anti-HSV (anticuerpos frente al virus Herpes simplex)
anti-Rubella
anti-Toxoplasma
anti-VZV (anticuerpos frente al virus de la Varicela Zoster)
IgG elevadas
IgM elevadas
Mononucleosis
Mujeres embarazadas
Mujeres embarazadas (multíparas incluidas)
RF (Factor reumatoide)
RPR (Reagina plasmática rápida)
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Concordancia
5/5
6/6
12/12
4/4
6/6
5/5
5/5
4/4
7/7
5/5
10/10
4/4
5/5
5/5
4/4
4/4
7/7
5/5
5/5
3/3
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Límite de detección y sensibilidad analítica
Conforme a las directrices CLSI EP17-A, el límite de detección (LD) se sitúa en 0,39 UA/mL.
La sensibilidad analítica obtenida fue de 0,74 PEI-U/mL. Se determinó mediante la interpolación del valor de corte
en la recta de regresión obtenida al probar diluciones seriadas del Standard anti-HBc del Instituto Paul Ehrlich
(HBc Reference Material 82, IgG-anti-HBc). Según estudios internos con el BIO-FLASH anti-HBc, 1,00 PEI-U/mL
equivale a aproximadamente 1,4 UI/mL del primer Standard Internacional de la OMS para anti-HBc (código NIBSC
95/522).
Efecto de prozona
El BIO-FLASH anti-HBc es un ensayo de inhibición de dos pasos. El protocolo del ensayo incluye un lavado
después de la incubación de la muestra, lo que elimina el efecto de prozona. Experimentalmente no se observó
ningún efecto de prozona con una muestra tan alta como 160,00 UA/mL.
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