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HEPATITIS B
Aplicación de la
biología molecular
Bioq Mariángeles Auat
Bioq Diego J. Fernández
VIRUS HEPATITIS B (VHB)
 Miembro de la familia Hepadnaviridae.
 Virus de DNA doble cadena.
 3200 pares de bases y 42 nm de diámetro.
 8 variantes genómicas (A – H).
 Posee un intermediario RNA para su replicación.
 Utiliza una transcriptasa inversa.
VIRUS HEPATITIS B (VHB)
VIRUS HEPATITIS B (VHB)
ANTIGENO
CARACTERISTICAS
HBsAg
Antígeno de la envoltura
viral.
HBcAg
Antígeno asociado con el
core del VHB.
HBeAg
Antígeno soluble relacionado
con la región pre core.
Beckenbaum S, Sotiropoulos GC et al. Hepatitis B and liver tranplantation: 2008 update, Rev Med.
Virol. 2009; 19:7-29.
VIRUS HEPATITIS B (VHB)
Cadena L (-)
HBcAg HBeAg
Proteína X
Cadena S (+)
HBsAg
Polimerasa
CICLO DE REPLICACION VIRAL
Reciclaje
Cadena +
Entrada
Unión a RE
Cadena -
Transporte
Vesicular
Traducción
Citoplasma
Transcripción
cccDNA
Núcleo
Reparación
Hepatitis B virus Infection – Natural History and clinical consequences. Ganem D. NEJM 2004; 350:1118-29
Majon BJ. Epidemiology and Natural history of hepatitis B.Semin Liver Disease. 2005;25 (suppl 1) : 3-7
GENOMA DEL VHB
MUTANTE
REGIÓN
MUTADA
MECANISMO
AGENTE
OPORTU
NIDAD
FRECUENCIA
HBeAg
menos
Gen
pre-core
Presión Inmune
(selección)
Respuesta
natural o
inducida por
tratamiento
Infección
Crónica
Alta
YMDD
Gen Pol
Terapéutico
(resistencia)
Lamivudina
Infección
Crónica
Alta
Superficie
Gen S
Presión Inmune
(selección)
HBIG o
Vacuna
Inmunización
en zonas
endémicas
Baja
VIRUS HEPATITIS B (VHB)
EPIDEMIOLOGÍA MUNDIAL
EPIDEMIOLOGIA (ARGENTINA)
• El 2% de la población general está infectada y el 0.5% de
los adultos es portador. La mayor prevalencia se da en los
trabajadores de la salud.
• Existen alrededor de 300.000 portadores, de los cuales
sólo 15.000 tienen diagnóstico.
• El 66% de los que cursan la enfermedad lo hacen de
forma asintomática, por lo que los riesgos de sus
contactos son muy altos.
VIAS DE INFECCIÓN
• Vertical o Perinatal:
Vía principal en zonas endémicas.
• Horizontal:
Por contacto parenteral/sexual con
personas infectadas.
• Exposición nosocomial:
Accidentes con agujas u otro tipo de
exposición percutánea o permucosa
GRUPOS DE RIESGO
 Adictos a drogas por vía intravenosa
 Profesionales de la salud
 Individuos con conducta sexual de riesgo
 Recién nacidos de madres infectadas
 Pacientes en hemodiálisis
 Pacientes transfundidos
PATOGENESIS
El VHB no es directamente citotóxico
La RESPUESTA INMUNE es la RESPONSABLE de la
INJURIA HEPATOCELULAR
La respuesta inmune puede ser:
Humoral: Ac vs HBsAg. Neutralizan su acción. No son
eficaces en erradicar la infección por si solos.
Celular: Responsable tanto de la sintomatología
como de la resolución de la infección.
HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN
La infección por VHB tiene tres etapas. La duración de cada una
de ellas depende de:
 La respuesta inmunológica del individuo
 Su edad en el momento de la infección
 Y con qué cepa o genotipo del virus de la hepatitis B se
infectaron.
HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN
Fase I: Inmunotolerancia
Fase II: Depuración Inmunológica
Infección
Aguda
Infección
Crónica
Fase III: De baja replicación
Estas etapas se hacen más evidentes en el curso de la infección
crónica. La transición de una etapa a otra NO es LINEAL
HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN
FASE DE INMUNOTOLERANCIA
• El sistema inmunológico básicamente ignora la
infección por VHB. Hay una falta o una muy débil
respuesta inmune contra hepatocitos infectados
• Infección aguda: corresponde al periodo de incubación
• En la infección crónica adquirida perinatalmente puede
durar años (15 a 20 años)
• Daños hepáticos mínimos.
HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN
FASE DE DEPURACIÓN INMUNOLÓGICA
• El sistema inmunológico finalmente reconoce al virus (ALT/AST
ELEVADAS)
• En la infección aguda corresponde al periodo de síntomas
clínicos (3 – 4 semanas)
• En la infección crónica puede durar de meses a años. En la
infección adquirida perinatalmente esta etapa se observa en la
adolescencia o adultez.
• La mayor parte del daño hepático tiene lugar durante esta
fase.
Aparición de mutantes e menos por selección natural, evaden el sistema inmune.
HISTORIA NATURAL DE LA INFECCIÓN
FASE DE BAJA REPLICACIÓN
•
El virus disminuye la tasa de replicación.
Desaparición HBeAg y aparición anti-HBe. Puede
detectarse ADN-VHB por técnicas sensibles de
biología molecular.
•
En esta etapa no se produce daño hepático.
•
Pueden existir brotes de reactivación (por
inmunosupresión) Retorno a la fase de depuración
inmunológica.
Infección Aguda
Niños
70% <5 años
10% perinatal
Resolución
Infección Aguda
en el Adulto
30% <5 años
90% perinatal
< 5%
> 95%
Resolución
Infección Crónica
Infección Crónica
~1%
Hepatitis Crónica
2-10 %
~3%
Muerte
Portador Crónico
Inactivo
Cirrosis
~3%
Trasplante
2-8 %
HCC
INFECCIÓN AGUDA
Síntomas
HBeAg
Malestar general. Fatiga, artralgias,
síntomas
anti-HBe digestivos, Coluria, ictericia,
acolía, Hígado doloroso
HBsAg
Total anti-HBc
Título
IgM
anti-HBc
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
Anti-HBs
52
semanas
Infección Persistente
HBsAg (+) > 6 meses
Portador Crónico
Hepatitis Crónica
ALT-AST dentro del rango de Ref.
Biopsia hepática normal
Función hepática anormal
Histología alterada
Con replicación
viral
Sin replicación
viral
HBeAg +
HBeAg -
• Corresponde
a la fase de
tolerancia
inmunológica
• Luego de la
etapa de
depuración
inmunológica.
• Virus
salvaje
• Virus
mutante
• Se da en
infecciones
perinatales
• Aparece por
presión
inmune/tto. No
se descarta
primoinfección
INFECCIÓN CRÓNICA
HBsAg
Serología
Anti-HBs
HBeAg
Anti-HBe
ALT
ADN-VHB
109-1010
Reactivación
>105 c/ml
c/ml
(viremia)
107-108 c/ml
Lesión
Estadio
cronicidad
0
<105 c/ml
Inflamación
mínima
Hepatitis crónica
activa
Inflamación
mínima/cirrosis
Normal a
cirrosis
Inmunotolerante
(fase I)
Aclaramiento inmune
(fase II)
Portador inactivo
(fase III)
Resuelta
10
20
30
40
50
60
70
Años
Proceso dinámico caracterizado por fases replicativas y no replicativas según la
interacción virus-huésped
HEPATOCARCINOMA CELULAR (HCC)
•La incidencia de HCC varía con la geografía, la etnia, la edad y el
sexo.
•La frecuencia de HCC sigue la misma distribución geográfica que
la infección por HBV.
•El 80% de los cáncer de hígado se deben a HBV.
•Integración del genoma viral y activación de oncogenes.
•La vacuna ha ejercido un efecto preventivo considerable en el
desarrollo del HCC.
Laboratorio
LABORATORIO
1. Pruebas Bioquímicas
2. Serología
3. Biología molecular - CARGA
VIRAL
BIOQUÍMICA DEL HÍGADO
• Transaminasas: ALT/AST
Hepatitis Aguda: Incrementos de 20 a
100 veces el valor de referencia
• Bilirrubinemia
Hepatitis crónica: Se elevan entre 2
y 10 veces el valor de referencia
• FAL
• GGT
• ALBUMINA
•COLESTEROL
• TIEMPO DE PROTROMBINA
Valoran el grado de
insuficiencia hepática
LABORATORIO
Serología
Antígeno
Anticuerpo
SUPERFICIE
HBsAg
Infectividad
Anti-HBs
CORE
HBcAg
No se encuentra en circulación
SISTEMA E
HBeAg
Replicación
Resolución/Inmunidad
Anti-HBc
Contacto
Anti-HBe
Puede indicar cese de replicación
La existencia de Mutantes HBeAg menos nos impide afirmar que la
desaparición de HBeAg y la presencia de Anti-HBe indica ausencia de
replicación viral.
El HBeAg no aparece en ausencia de HBsAg
LABORATORIO
• Estos marcadores son detectados por inmunoensayos
competitivos y no competitivos.
• Enzimoinmunoanálisis de micropartículas (MEIA). Axsym-Abbott
Ensayo no
competitivo
tipo
sandwich
1. Incubación muestra
2. Formación
inmunocomplejos
(IC) Unión
irreversible del IC a
fibras de vidrio.
3. Lavado para
eliminar el
material no unido.
Agregado del Ac.
marcado con FAL
4. Se agrega el
sustrato MUP y
se mide el
producto
fluorescente MU
PRUEBAS SEROLÓGICAS
Prueba
Tipo de ensayo
Sensibilidad
Especificidad
Resultados
HBsAg
No competitivo
100%
99,6%
Cualitativos
R/NR
Anti-HBs
No competitivo
100%
100%
Cuantitativos
UI/l
Anti- HBc
No competitivo
98,6%
100%
Cualitativos
R/NR
HBeAg
No competitivo
99,6%
99,5%
Cualitativos
R/NR
Anti-HBe
Competitivo
100%
99,8%
Cualitativos
R/NR
Según insertos Axsym - Abbott
HBsAg
negativo
HBsAg positivo
Hepatitis
Cronica
(virus
salvaje)
Hepatitis
Cronica
(virus
mutante)
INTERPRETACION RESULTADOS
Vacunado
HBsAg
AntiHBs
AntiHBc
HBeAg
AntiHBe
ADNVHB
ALT
Contacto
pasado
Hepatitis
Aguda
Portador
Tolerante
Portador
inactivo
PERFILES INUSUALES
1- Anti-HBc (+) aislado
1. Infección muy lejana con
pérdida del Anti-HBs
2. Falso positivo
metodológico
3. Paciente con infección
Oculta (HBsAg negativo)
Anti HBs +++
Anti-HBs +
Anti-HBs -
Evaluar infección por HIV y HCV
•
La coinfección con HCV puede interferir en la síntesis de HBsAg.
•
Presencia de FP para Anti-HBc en asociación con coinfección
HIV/HCV.
PERFILES INUSUALES
2- HBsAg (–) y HBeAg (+)
La OMS y el fabricante sugieren, en estos casos, repetir la
prueba en una nueva muestra.
WHO/CDC/CSR/LYO/2002.2:HepatitisB
Perfiles
Inusuales
¿CARGA
VIRAL?
LABORATORIO
Biología molecular - Carga Viral
Métodos disponibles
• Hibridación Molecular
1- Hibridación Líquida (Genostics, Abbott)
2- Ensayo de captura del hibrido (Digene)
3- Branched DNA (Versant HBV-Bayer)
Methods in Molecular Medicine, vol. 95: Hepatitis B and D Protocols, volume 1
LABORATORIO
Biología molecular - Carga Viral
• Amplificación del DNA del VHB
1. PCR cuantitativa Cobas Amplicor Monitor (Roche)
2. Real time PCR - Taq Man
Real time PCR-TaqMan
Cobas Amplicor Monitor (Roche)
Amplificación por PCR
Detección de los amplicones
( DNA del VHB y estándar interno)
( DNA del VHB y estándar interno)
Cuantificación del ADN del VHB
Cálculo de
los
resultados
DO HBV (A 660nm) X moléculas ADN QS
DO QS (A 660nm)
Ventajas del uso de QS (estándar interno o de cuantificación):
1. Compensa las diferencias en la eficiencia de extracción del
DNA entre las muestras
2. Detecta posibles inhibidores en la mezcla de reacción.
Inhibidores más comunes de PCR:
Heparina, Talco , Saliva
Expresión de los resultados
Unidades empleadas:
Ejemplo
1. Copias ADN-VHB/ ml
32147000 copias/ml (107)
2. Log10
log 6,8
3. UI/ml
6100000 UI/ml
• Falta de estandarización en los resultados entre los distintos
métodos. OMS (2001) crea un estándar internacional asignándole
un valor de 1.000.000 UI/ml (106 UI/ml) (Saldanha et al., Vox Sang
2001;80:63‐71)
• Cada prueba debe convertir sus datos a UI.
Cobas Amplicor HBV Monitor (Roche) 1 UI/ml = 5.6 copias/ml
Permitirá comparar los datos de diferentes laboratorios.
DIFERENCIAS EN LA SENSIBILIDAD Y RANGO LINEAL ENTRE
LOS DISTINTOS METODOS
UTILIDAD DE LA CARGA VIRAL
1- DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR VHB
Útil para Dx de Hepatitis crónica HBeAg(-).
Perfiles serológicos inusuales??
2- EVALUACIÓN Y PRONÓSTICO
Niveles séricos DNA-VHB > 104 copias/ml - 2000 UI/ml es un
predictor de riesgo significativo para el desarrollo de cirrosis y
CHC. La relación es independiente del estado del HBeAg y del
nivel de ALT.
JAMA. 2006;295(1):65-73 Gastroenterology 2006;130:678–686
3- TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN



CUANDO TRATAR
SELECCIÓN DE LA TERAPIA. ADN-VHB: 109(J Antimicrob. Chemotherp.)
MONITOREO – Respuesta virológica
Journal of Hepatology 39 (2003) S31–S35
TRATAMIENTO
Objetivo
Evitar la progresión a cirrosis hepática y CHC.
•
•
•
•
Supresión de la replicación viral sostenida
Normalización de las transaminasas
En pacientes con HBeAg (+) la seroconversión
Idealmente la seroconversión del HBsAg.
A quien tratar?
Pacientes con riesgo de progresión de la enfermedad.
Hepatitis Crónica HBeAg (+) y HBeAg (-)
TRATAMIENTO
Guías de consenso con recomendaciones
HBeAg (+)
AASLD
2007
HBeAg (-)
ADN-VHB
ALT
ADN-VHB
ALT
> 20000 UI/ml
> 2x VSR
> 2000 UI/ml
> 2x VSR
> 20000 UI/ml
< 2x VSR
Biopsia
inflamación
y fibrosis
> 2000 UI/ml
< 2x VSR
Biopsia
inflamación
y fibrosis
Hepatology 2007; 45:507-39
TRATAMIENTO
Criterios de respuesta al tratamiento
Criterios de Respuesta al Tratamiento
Criterios de Respuesta Parámetro
Bioquímico
Normalización o mejoría de las
aminotransferasas
Virológico
Disminución del DNA-VHB (caída 1 log)
Serológico
Seroconversión del HBeAg y HBsAg
Histológico
Disminución o desaparición de la actividad
necroinflamatoria o fibrosis
El monitoreo de la carga viral durante el tratamiento debe
hacerse siempre con el mismo método
TRATAMIENTO
Drogas usadas
• Inmunomoduladores (vía subcutánea – Tto. limitado)
IFN
IFN pegilado: unido a una molécula de polietilenglicol que produce
una molécula de mayor tamaño con disminución de su excreción
renal y prolongación del efecto biológico
• Análogos de nucleósidos/nucleótidos (vía oral – Tto. prolongado)
►Son moléculas VIROSTÁTICAS. Inhibición competitiva de la ADNpol.
Lamivudina: se asocia a una alta tasa de desarrollo de resistencia
(70% a los 4 años)
Adefovir, ENTECAVIR, Telbivudina.
Caso
Clínico
CASO CLINICO
•Paciente de sexo femenino, de 20 años de edad que
ingresa en enero 2009 al servicio de HepatologiaTrasplante hepatico
•Tiene antecedentes de atresia de vías biliares corregida
a los 2 meses de vida en el Hospital Gutiérrez.
•Presentó 3 episodios de hemorragia digestiva alta por
varices esofágicas secundarias a Hipertensión portal que
requieren tratamiento endoscópico.
• Al año se presenta con múltiples episodios de
infecciones urinarias y un estadío cirrótico avanzado. Es
así que se decide PLAN DE TRASPLANTE HEPATICO.
• Se realiza protocolo pre trasplante.
PERFIL DE LABORATORIO
13-01-09
20-01-10
AST (UI/L)
42
125
ALT (UI/L)
30
102
BT (mg/dl)
3.4
9.9
BD (mg/dl)
2.17
4.74
BI (mg/dl)
1.23
5.16
FAL (UI/L)
471
822
GGT (UI/L)
52
113
PT (g/dl)
6.6
6.2
ALB (g/dl)
2.8
3
PERFIL DE LABORATORIO
26-02-10
01-04-10
HBsAg
No Reactivo
No Reactivo
Anti-HBc (total)
No Reactivo
No Reactivo
Anti-HBs
Reactivo
Reactivo
HBeAg
Reactivo
Reactivo
Anti-HBe
No Reactivo
No Reactivo
HCV
No Reactivo
-
AFP
2.3
-
PERFIL INUSUAL
NUEVA MUESTRA
PERFIL DE LABORATORIO
• 22-05-10
Carga viral: No detectable por método de amplificación
Cobas Amplicor Monitor (Roche)
•09-11-10
Carga viral: No detectable por método de amplificación
Cobas Amplicor Monitor (Roche)
• Se
descarta infección por VHB.
• La posibilidad de la presencia de FP para HBeAg repetidamente esta
descripto en el inserto de la prueba.
• El 3,42% (8/234) presentaron HBeAg(+) repetidamente en ausencia de
HBsAg. Axsym Abbott HBe 2.0
Conclusiones
CONCLUSIONES
 Es imprescindible el uso de técnicas de Biología Molecular
en el diagnóstico, pronóstico y monitoreo del tratamiento
de la infección por VHB.
 Evaluamos la utilización de la carga viral en dilucidar
perfiles serológicos inusuales.
 Se aspira a que las técnicas moleculares tengan mayor
sensibilidad y una mayor amplitud en el rango lineal (Real
time PCR – Taq Man) y además lograr estandarizar los
resultados con el uso universal de estándares
internacionales.
 Genotipificación a futuro.