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EL TEXTO EN COLOR ROJO HA SIDO MODIFICADO
Con fundamento en el numeral 4.11.1 de la Norma Oficial
Mexicana NOM-001-SSA1-2010, se publica el presente
proyecto a efecto de que los interesados, a partir del 1º de
noviembre y hasta el 31 de diciembre de 2015, lo analicen,
evalúen y envíen sus observaciones o comentarios en idioma
español y con el sustento técnico suficiente ante la CPFEUM,
sito en Río Rhin número 57, colonia Cuauhtémoc, código
postal 06500, México, D.F. Fax: 5207 6890
Correo electrónico: [email protected].
internacionales) y ha mostrado repetidamente que es: sensible,
confiable y reproducible para estimar la potencia de diferentes
tipos de interferón humano.
Para los cultivos de células de mamíferos, todos los procesos
se realizan usando los procedimientos estándar, para mantener
las células en cultivo. Se indican los volúmenes de reactivos
para cultivos celulares en botellas de 75 cm2, se pueden usar
otro tipo de contenedores (botellas o microplacas), pero los
volúmenes deben ser ajustados de acuerdo a los recipientes
utilizados.
Mantenimiento y preparación de células Hep2c
MGA 0700 ENSAYOS DE INTERFERÓN
INTRODUCCIÓN
Las monografías de los interferones humanos contienen
generalmente un bioensayo basado en la actividad del
interferón para inhibir el efecto citopático de un virus sobre las
células de una línea celular. El virus, la línea celular y los
detalles del ensayo no se especifican con la finalidad de
brindarle flexibilidad apropiada al bioensayo ya que algunas
monografías cubren más de un sub-tipo de interferón.
Este MGA brinda información para diseñar, optimizar y
validar el ensayo una vez que se ha seleccionado la
combinación apropiada de la línea celular y el virus a usar. Se
detalla un procedimiento de un ensayo antiviral en particular,
como un ejemplo de un método adecuado, junto con
información de otras combinaciones virus – línea celular y una
guía de cómo adaptar y validar los procedimientos para esas
otras combinaciones.
ENSAYO ANTIVIRAL (REDUCCIÓN DEL EFECTO
CITOPÁTICO)
El ensayo antiviral de los interferones humanos se basa en la
inducción de una respuesta celular en las células humanas, la
cual previene o reduce el efecto citopático de un virus
infeccioso. La potencia del interferón se estima comparando
su efecto protector contra el efecto citopático viral, con el
mismo efecto de una preparación de referencia apropiada
calibrada en Unidades Internacionales.
1.
ENSAYO DE INTERFERÓN UTILIZANDO
CÉLULAS Y VIRUS (EJEMPLO CELULAS HEP2C
Y VIRUS DE LA ENCEFALOMIOCARDITIS)
El objetivo de este ensayo antiviral de interferones humanos
es la reducción del efecto citopático. Se usan células Hep2c
infectadas por el virus de la encefalomiocarditis (EMCV), para
medir la potencia de diferentes preparaciones de interferón
humano en prueba. Este ensayo se ha utilizado en tres estudios
colaborativos de la Organización Mundial de la Salud (OMS)
para preparaciones de interferón alfa, interferón beta e
interferón gama humano (candidatos a estándares
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Las células Hep2c deben ser propagadas y mantenidas en el
medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero
de bovino neonato, L-glutamina 4 mM y antibióticos si es
necesario (penicilina 10 000 UI/mL y estreptomicina
10 ng/mL).
Los bancos celulares se almacenan congelados mediante los
procedimientos estándar de operación. Las células en cultivo
se pueden mantener hasta un nivel de 30 pases, después se
deben preparar nuevos cultivos a partir de los bancos celulares.
La propagación de las células se realiza cuando los cultivos
alcanzan una confluencia aproximada del 90 %.
Preparar la suspensión homogénea de células para el ensayo a
una concentración de 6 × 105 células/mL.
Propagación del virus EMCV
El virus de la encefalomiocarditis se propaga en cultivos
confluentes de células L929. Para ello se sigue el siguiente
procedimiento:
Medio de cultivo A. Medio de cultivo RPMI 1640
suplementado con 10 % de suero de neonato bovino,
L- glutamina 4 mM y si es necesario con antibióticos
(penicilina 10 000 UI/mL, estreptomicina 10 ng/mL).
Medio de cultivo B. Medio de cultivo RPMI 1640
suplementado con 2 % de suero de neonato bovino,
L-glutamina 4 mM y si es necesario con antibióticos
(penicilina 10 000 UI/mL, estreptomicina 10 ng/mL).
Solución colorante. 0.5 g de naftaleno negro, 90 mL de ácido
acético glacial, 8.2 g acetato de sodio anhidro y agua cuanto
baste para 1 000 mL.
Solución de fijación. 100 mL de formaldehído al 40 %,
90 mL de ácido acético glacial, 8.2 g de acetato de sodio
anhidro y agua cuanto baste para 1 000 mL
Eliminar el medio de cultivo de las células confluentes en
botellas de 75 cm2 e inocular con 2.0 mL de una suspensión
del virus EMCV diluido en el medio de cultivo B, para que
contenga aproximadamente 2.5 × 108 Unidades Formadoras de
Placa (UFP) por mililitro. Cada botella contendrá de 4.0 a
6.0 × 107 células (L929), para tener una multiplicidad de
infección de aproximadamente 10 UFP/célula. Distribuir
cuidadosamente la suspensión del virus sobre toda la
CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-4
Métodos generales de análisis
1
Río Rhin 57
col. Cuauhtémoc
06500, del. Cuauhtémoc
México D. F., México.
monocapa de células e incubar a 37 °C durante 1 h, en una
atmosfera de 5 % de CO2
Después de la adsorción del virus, adicionar aproximadamente
40.0 mL del medio de cultivo B a cada botella e incubar a
37 ºC durante aproximadamente 30 h en una atmosfera de 5 %
de CO2. Remover el medio de cultivo y almacenarlo en
refrigeración.
Colocar las botellas a una temperatura menor o igual a -20 ºC
para congelar la monocapa de células. Descongelar a
temperatura ambiente y adicionar aproximadamente 5 mL de
medio de cultivo B y agitar las botellas para romper las células.
Transferir el contenido de cada botella al medio de cultivo
cosechado y mantenido a en refrigeración. Transferir el medio
de cultivo con el virus EMCV a tubos de centrífuga de 50 mL
y centrifugar a 500 x g durante 10 min, para remover los
detritos celulares. Distribuir la suspensión de virus clarificada
en recipientes de vidrio con tapón de rosca o tubos a razón de:
20.0; 10.0; 5.0; 1.0; 0.5 y 0.2 mL y almacenar a una
temperatura menor o igual a -70 ºC. Los volúmenes mayores
pueden ser descongelados, distribuidos en pequeños
volúmenes y volver a congelar a la misma temperatura si se
requiere. Los abastos del virus EMCV retendrán su título
original si se almacenan permanentemente a una temperatura
menor o igual a -70 ºC, pero ciclos repetidos de congelacióndescongelación o su almacenamiento a temperaturas mayores
a -70 ºC provoca la pérdida progresiva del título viral.
PROCEDIMIENTO PARA EL ENSAYO
Determinación del Intervalo Dosis – Respuesta
Preparación de las Soluciones
Realizar diluciones decimales del estándar apropiado
delinterferón (sub-tipo de interferón estándar de la OMS), en
el medio de cultivo A, para tener un intervalo de concentración
que va de 0.001 a 1 000 UI/mL. Llevar a cabo el
procedimiento del ensayo en microplacas de 96 pozos.
Adicionar a cada pozo 50 L del medio de cultivo A y
adicionar a cada pozo 50 L de cada una de las diluciones de
la preparación de referencia, excepto a los testigos de virus.
Mezclar el contenido de los pozos con una pipeta multicanal.
Adición de la suspensión celular
Preparar una suspensión de células Hep2c que contenga
aproximadamente 1.2 × 106 células/mL en el medio de cultivo
A. Colocar 50 L de la suspensión celular en cada uno de los
pozos de la microplaca usando una pipeta multicanal.
Incubar las microplacas a 37 ºC en una atmosfera con 5.0 %
de CO2 durante aproximadamente 24 h.
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Infección viral
Revisar al microscopio si los cultivos de células Hep2c han
desarrollado una monocapa confluente, que sean cultivos
saludables y que presenten la morfología característica de las
células Hep2c.
Remover el medio de cultivo agotado, invirtiendo las
microplacas y sacudiéndolas ligeramente sobre un lienzo
absorbente.
Diluir el virus EMCV en el medio de cultivo A fresco, para
tener un título de aproximadamente 6 × 107 UFP/mL. Con una
pipeta multicanal, inocular 100 L a todos los pozos
incluyendo los testigos de virus excepto los testigos de células
a los cuales se les adicionan 100 L del medio de cultivo A.
Incubar las microplacas a 37 ºC en una atmósfera con 5.0 %
de CO2 durante aproximadamente 24 h.
Tinción
Revisar las microplacas al microscopio y verificar la presencia
de efecto citopático (ECP) en los testigos de virus. La
monocapa celular debe verse totalmente destruida, mientras
que en el control negativo (sin virus) debe verse intacta. El
intervalo de tiempo para el máximo desarrollo del ECP puede
variar de un ensayo a otro, debido a las variaciones inherentes
de las células Hep2c al virus reto.
Eliminar el medio de cultivo de los pozos e inactivarlo en una
solución descontaminante de hipoclorito de sodio. Adicionar a
los pozos una solución amortiguadora de fosfatos salina a pH
7.4, eliminar esta solución en la solución descontaminante.
Adicionar 150 L de la solución de tinción, teñir las células
durante 30 min a temperatura ambiente. Eliminar e inactivar el
colorante en la solución descontaminante. Adicionar
aproximadamente 150 L de la solución fijadora y fijar los
cultivos durante 10 min a temperatura ambiente. Retirar e
inactivar la solución fijadora en la solución descontaminante y
lavar los cultivos sumergiendo las microplacas en agua
potable. Eliminar el agua y secar las microplacas
superficialmente por inversión en papel secante, eliminar el
agua residual de los pozos incubando las microplacas de 20 °C
a 37 ºC hasta eliminar toda el agua.
Adicionar 150 L de hidróxido de sodio al 0.1 M a cada pozo,
eluir el colorante mediante agitación suave, antes de leer al
espectrofotómetro, asegurarse de que el colorante está
uniformemente distribuido en todos los pozos.
Leer la absorbancia de 610 a 620 nm, en el lector de
microplacas, usando como blanco algunos pozos sin células y
con aproximadamente 150 µL de hidróxido de sodio 0.1 M.
Estimar la concentración estándar de interferón que da la
máxima y la mínima reducción del efecto citopático, la cual
corresponde a la dosis respuesta para el intervalo de trabajo del
ensayo.
CONSULTA A USUARIOS DE LA FEUM 2015-4
Métodos generales de análisis
2
Río Rhin 57
col. Cuauhtémoc
06500, del. Cuauhtémoc
México D. F., México.
una respuesta lineal entre la producción de color y la cuenta de
células viables.
Ensayo
Realizar el ensayo como se describió anteriormente usando:
1) Solución de prueba, utilizar la muestra diluida usando un
factor de dilución de 2 en el medio de cultivo A, para tener una
concentración nominal que cubra el intervalo de trabajo del
ensayo.
2) Solución de referencia, un estándar de interferón apropiado
(como el subtipo específico de interferón de la OMS), diluido
usando un factor de dilución de 2 en el medio de cultivo A,
para tener una concentración nominal que cubra el intervalo de
trabajo del ensayo.
Validación Estadística
Al igual que el método de Líneas Paralelas. El método
seleccionado debe cumplir los criterios estadísticos de:
respuesta lineal, paralelismo y varianza.
Validación del Método
Al igual que todos los métodos de microtitulación en placa. Se
debe validar el procedimiento.
Análisis de Datos
Los resultados del ensayo de reducción del ECP generalmente
dan una curva dosis-respuesta de tipo sigmoidea, cuando la
concentración de interferón (el log recíproco de la dilución de
interferón), se grafica contra la absorbancia de la tinción.
Graficar la concentración de interferón (log recíproco de la
dilución) contra la absorbancia de la tinción para la
preparación de referencia y para la solución de interferón de
prueba. Usando la porción lineal de la curva calcular la
concentración de interferón en la muestra, comparando la
respuesta para la solución de prueba y la de la referencia,
usando el método estadístico común para ensayos de líneas
paralelas.
2.
VALIDACIÓN DE OTROS PROCEDIMIENTOS
Selección de la Línea Celular y el Virus
Se han utilizado otras combinaciones de líneas celulares y
virus en las determinaciones de la actividad antiviral de los
Interferones. En cada caso, la combinación de la línea celular
y el virus seleccionado se basa en cuál de ellas se obtiene la
mayor sensibilidad en la respuesta para la preparación de
interferón que se desea probar y que den una respuesta paralela
cuando se prepara con la preparación de referencia de
Interferón. Por ejemplo, se ha utilizado a EMCV en
combinación con la línea de células epiteliales A549
proveniente de carcinoma de pulmón. También se han
utilizado al virus de Semliki Forest o al virus Sindbis con
fibroblastos humanos, al virus de la estomatitis vesicular con
fibroblastos diploides humanos, con la línea de células WISH
proveniente de amnios humano o con la línea celular MDBK
de riñón de bovino (Madin-darby bovin kidney).
Elección de Respuesta
Los procedimientos de tinción descritos anteriormente miden
las células que permanecen viables. Se han usado otro tipo de
respuestas, incluyendo las tinciones con metil violeta, cristal
violeta o la conversión del azul de tiasol (MTT). En cada caso
la selección del método se basa en su capacidad para producir
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