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PREVALENCIA DE ANTICUERPOS DE COLERA
PORCINO EN COLOMBIA
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oc*opECUARIA
ADRIANA SOFIA ORTEGA GARZON
ANA ROSA PUENTES MARTINEZ
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGIA
SANTAFE DE BOGOTA, D.C.
1995
PREVALENCIA DE ANTICUERPOS DE COLERA
PORCINO EN COLOMBIA
ADRIANA SOFIA ORTEGA GARZON
ANA ROSA PUENTES MARTINEZ
Trabajo de Grado presentado como requisito para obtar al titulo de
Bacterióloga y Laboratorista Clínico
Director
GUILLERMO GONZALEZ GARZON
M.V.Z. Ph.D
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGIA
SANTAFE DE BOGOTA,
1995
Centro de Documentación
CEISA
U.-
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
2
La UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA, respeta
los conceptos emitidos por las estudiantes del PROGRAMA
DE BACTERIOLOGIA en sus trabajos de Grado; vela porque
en ellos se acate la Constitución, las Leyes de la
República, la filosofía y políticas institucionales; no
atenten contra la moral y las buenas costumbres, y sean
un aporte a la solución de las necesidades del país.
NOTA DE ACEPTACION
CONCEPTO
ASESOR
A-Rl 7° £112'
JURADOS
y
0
H/b cc3ul
wj.1/
11;i, a-.
Santafé de Bogotá ) D.C., Junio 1 de 1995
A Dios todopoderoso, por ser
migran amigo y maestro.
A mis padres y hermanos,
por su apoyo y comprensión.
ANA ROSA.
Al Señor todopoderoso,
por ser mí gula.
A mis familiares y amigos,
por su constante apoyo.
ADRIANA SOFÍA.
MW
AGRADECIMIENTOS
Las autoras expresan sus agradecimientos:
Al Dr. GUILLERMO GONZALEZ G., profesional vinculado al Instituto Colombiano
Agropecuario ICA-CEISA, por su colaboración, dedicación y empeño para
culminar el presente proyecto.
Ala Dra. MYRIAN LUCIA TORRES, vinculada al ICA-CEISA, por su dedicación,
coordinación y orientación en la elaboración del presente trabajo.
Al Dr. DARlO MOGOLLON, profesional del ICA-CEISA, por sus aportes e ideas.
A la Dra. ESPERANZA RIVERA, decana de la Facuttad de Bacteriología de la
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA, por su apoyo.
A la Dra.INES LOMBANA, coordinadora proyectos de investigación y al Dr.
ANTONIO GARCIA asesor interno, por su orientación.
A los Drs. JUAN FERNANDO GALLEGO Y ESPERANZA CORTES, por su
ayuda en la realización del texto.
A los Drs. ISAAC GALLEGO y RAFAEL NEIRA, por colaborar en la realización
de fotográfias y filminas.
.:...
A los señores LEOPOLDO GARZON y ANCIZAR FERNANDEZ por su ayuda en
la parte instrumental.
A la Corporación Colombiana de Investigación (CORPOICA-CEISA) por la
utilización de sus instalaciones y equipos.
A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron para la
realización de la presente investigación.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN......................................................7
1. INTRODUCCION ...............................................15
2. REVISION DE LITERATURA ..................................... 20
2.1. COLERA PORCINO. . ....................................... 22
2. 1.1 Propiedades físico- químicas del virus........................ 23
2.1.2. Cultivo del V ........................................... 24
2.1.3. Patogénesis. ........................ . .... . ........... .. 28
2.1.4. Signos................................................ 33
2.1.5. Epidemiología.......................................... 34
2.1.5.1. Huésped .......................................... 34
2.1.5.2. Transmisión........................................ 35
2.1.6. Profilaxis.............................................. 38
2.1.6.1. Control: . .............. .... ........... ............. 38
39
2.1.6.2. Vacunación.........................................
2.1.6.2.1. Inoculación simultánea........................... 40
2.1.6.2.2. Vacunas con virus inactivado....................... 40
2.1.6.2.3. Virus vivo modificado: ............................ 41
2.1.6.2.4. Suero Hiperinmune .............................. 42
2.1.6.2.5. Vacunación en Colombia.......................... 42
2.1.7. Reacción Inmune........................................ 44
2.2. DIARREA VIRAL BOVINA .................................... 46
2.3. REACCION CRUZADA ...................................... 47
2.4. DIAGNOSTICO ............................................ 52
2.5. COLERA PORCINO EN COLOMBIA............................ 54
2.5.1. Grado de tecnificación de la industria porcina.................. 54
2.5.2. Situación en Colombia ................................... 56
3. MATERIALES Y METODOS PARA LA TECNICA DE NEUTRALIZACION DE LA
FLUORESCENCIA ............................................. 59
3. l. MATERIALES:
59
3.2. MET000 . .... ...................................... . ... 62
3.3. INTERPRETACION' ......................................64
4. RESULTADOS ................................................66
4.1. GENERALES ..............................................66
4 .1.1.Sexo .................................................68
4.1.2. Edad .................................................71
4.2. TAMAÑO DE LA PIARA. ... .............. . ...................72
4.2.1. Edad ....................... . ........ . .............. ..74
4.2.2. Sexo . .................... . ........ . .................. 78
4.3. DISTRIBUCION GEOGRAFICA. ............................... 78
4.4. DISTRIBUCION TEMPORAL . ................................. 82
5. DISCUSION ............................ . .... . ................. 84
6. ANTICUERPOS LIGADOS A LA PEROXIDASA .......................98
6.1. MATERIALES: .... . .... . ........................... . ........ 99
6.2. MODIFICACIONES REALIZADAS A LA TECNICA .................101
6.3. METODO . ................... . ............ . ............... 103
6.4. INTERPRETACION . ..... . ...... . ........................... 105
7. RESULTADOS Y DISCUSION INMUNOPEROXIDASA .................108
8. CONCLUSIONES GENERALES ...................................115
BIBLIOGRAFIA ..................................................117
ANEXOS....................................................... 129
LISTA DE TABLAS
Tabla N01. Porcentaje de distribución por títulos a cólera porcino sobre 268 sueros
estudiados....................................................68
Tabla NO2. Distribución de sueros de hembras porcinas positivas a cólera porcino,
por título sobre 46 sueros estudiados ........................ ... ..... 70
Tabla NO3. Distribución de machos positivos al cólera porcino, por título, sobre 26
sueros............ .... .... .... .......................... . ....70
Tabla N14. El porcentaje de distribución de sueros porcinos positivos al CP según
título detectado ................. . ............. . ................71
Tabla N05. Porcentaje de sueros porcinos positivos y negativos al cólera porcino
hallados en granjas con diferente población ................. . ......... 72
Tabla N°6. Porcentaje de comparación de títulos serológicos al CP en poblaciones
porcinas de diferente tamaño poblacional. ....... . ................... 74
Tabla N°7. Porcentaje de distribución de sueros negativos y positivos en cerdos
mayores de seis meses procedentes de piaras de diferente tamaño . ....... 75
Tabla N08. Porcentaje de distribución al CP de sueros porcinos mayores de seis
meses procedentes de granjas de diferente tamaño . ................. ..77
Tabla N09. Porcentaje de negatividad a cólera porcino en sueros porcinos según
distribución geográfica .................................... . ...... 80
Tabla N°10. Porcentaje de negatividad a CP de sueros porcinos colectados durante
1993y1994...................................................82
Tabla N°11. Porcentaje de comparación de títulos al CP por las técnicas de
anticuerpos fluorescentes y anticuerpos ligados a peroxidasa en 155 sueros
porcinos......................................................110
Tabla N°12. Coincidencia por títulos entre las técnicas de inmunofluorescencia y
anticuerpos ligados a peroxidasa, sobre 155 sueros analizados. ...... ..... 111
--:
LISTA DE FIGURAS
Figura N° 1. Vísceras positivas por anticuerpos fluorescentes a Cp en años
1984/1993..................................................... 58
Figura N° 2. Distribución por títulos de sueros positivos a Cólera Porcino sobre 268
sueros estudiados . ........................ . ........ . ............ 67
Figura N° 3. Comparación de sueros positivos a Cólera Porcino según el sexo. ..
69
Figura N°4. Comparación de sueros positivos y negativos a Cólera Porcino en granjas
de diferente población . ............ . ..... . ........................ 73
Figura N°5. Comparación de sueros positivos en porcinos mayores de 6 meses según
la tecnificación .................................................. 76
Figura N° 6. Porcentaje de negatividad al VCP según sexo, de acuerdo a la
tecnificación....... ................ . ............................ 79
Figura N°7. 'bepartamentos con mayor riesgo. ...... ..................... 81
Figura N° 8. Comparación de títulos a CP durante 1993 y primer semestre de 199483
Figura N° 9. Comparación de títulos por la técnica de anticuerpos fluorescentes y
anticuerpos ligados a la peroxidasa..... .......................... ..108
LISTA DE FOTOGRAFIAS
Fotografía N0 1. Fluorescencia positiva.................................65
Fotografía NO2. Fluorescencia negativa . .................... . ....... ... 65
Fotografía N°3. Peroxidasa Positiva...................................106
Fotografía N14. Peroxidasa Negativa . ............... . ................. 106
RESUMEN
Se realizó una encuesta seroepidemiológica en vanas regiones del país, por
medio de la prueba de ¡nmunofluorescencia, tendiente a conocer la prevalencia
de porcinos que han desarrollado anticuerpos contra el Cólera porcino (CP), ya
sea post-vacunales o post-infección.
Se estudiaron 783 sueros y se consideraron las siguientes variables: grado de
tecnificación, edad y sexo. De este total se detecto la presencia de un 63.2%
de sueros con títulos menores de 1:16 y un 36.8% de sueros con títulos
mayores.
Entre los sueros positivos se observo un mayor porcentaje con títulos 1:16
(54,5%), 1:32 (21.6%), 1:128 (16.8%) y el menor porcentaje fue 1:64 (7.5%).
Las piaras tecniflcadas presentaron un 57.9% de negatividad «1;16), mientras
que las no tecniflcadas un 70.3%.
No se observó diferencia significativa entre los sexos.
En los cerdos menores de seis meses se presentó un 61.5% de sueros sin
anticuerpos, mientras que en los mayores de seis meses un 65.6%.
Entre los departamentos estudiados se evidenció que Córdoba, Meta y Choco
presentaban los más bajos porcentajes de sueros negativos o con títulos
menores de 1:16, indicando que aparentemente existe un gran número de
cerdos susceptibles a la enfermedad.
El alto porcentaje de sueros porcinos sin anticuerpos, sugiere que existe un gran
riesgo de presentación de brotes de la enfermedad a menos que se tomen
medidas urgentes para proteger la población.
Se estudió la técnica de anticuerpos ligados a la peroxidasa, para ser estudiar
algunos sueros porcinos con y sin anticuerpos contra CP. A la técnica descrita
se le hicieron una serie de modificaciones importantes que permiten su
realización sobre cultivo de células PK15 en crecimiento sobre laminillas. La
técnica permitió una clara y fácil lectura con base a las características de la
coloración descrita en la literatura.
El estudio inicial con 155 sueros positivos y negativos estudiados con la técnica
de neutralización de la fluorescencia permitió observar mayor sensibilidad de
la técnica de anticuerpos ligados a peroxidasa. Sin embargo su laboriosidad es
un inconveniente que sugiere mayor consideración en estudios serológicos
futuros.
1. INTRODUCCION
El Cólera Porcino (CP), Peste Porcina o Fiebre Porcina Clásica, es una
enfermedad contagiosa caracterizada en su forma aguda, por la presencia de
hemorragias, necrosis e infartación de órganos internos con mortalidad entre el
90y 100%, también han sido descritas otras formas de presentación con baja
mortalidad pero de indudable importancia epidemiológica. Liess (1981).
En 1822 se presentó en Francia, distribuyendose más tarde por el resto de
Europa (Alemania 1833, Inglaterra 1862). La primera descripción de la
enfermedad en América se hizo en 1840 en los Estados Unidos (Tenesse,
Kentucky e Indiana). Hanson (1957); Paasch et.al (1994). En la actualidad se
considera endémica en todos los países productores de cerdos con excepción
de los que han llevado a cabo programas de erradicación.
16
En Colombia el primer brote se presentó en Cúcuta en 1942, en animales que
aparentemente provenían de Venezuela, mostrando un cuadro febril contagioso
con mortalidad alta, el cual afectó a cerdos de todas las razas y edades.
Manrique y Raye (1973). Desde entonces se viene trabando en programas de
diagnóstico y control de la enfermedad. El seguimiento de la actividad del CP se
ha restringido algunas veces a la sospecha clínica, al cuadro epidemiológico y
a las lesiones macro y microscópicas. Las observaciones basadas sobre los
resultados de vísceras de cerdos sacrificados en varios mataderos del país,
sugieren la presencia de posibles portadores del virus ya sea de origen vacuna¡
o de cepas silvestres de baja virulencia. Estudios preliminares sobre el diferente
grado de virulencia de las cepas aisladas han confirmado una amplia variación,
observándose que algunas de ellas poseen la capacidad de sobrepasar la
protección vacuna¡. (Villate, comunicación personal).
A nivel de laboratorio se controla la antigenicidad, la esterilidad y potencia de la
vacuna; se desconocen los efectos inmunosupresores y la exacerbación de
gérmenes banales oportunistas y de patógenos específicos, la capacidad de
producir portadores, el posible aumento en la difusión del agente, la reversión
0
17
a virulencia y la capacidad de producir reacciones alérgicas y problemas
reproductivos.
OPECUAFZ
El análisis de tos resultados de los diagnósticos de Cólera Porcino en los últimos
años, señala la existencia repetitiva de regiones con muy baja o nula casuística,
durante varios años; disminución nacional del número de casos desde 1989
cuando se presentó en el Valle del Cauca una gran epidemia; un mayor número
de cepas en piaras con pequeñas poblaciones, en todos los casos se obtuvo
baja morbi-mortalidad. Llama la atención la disminución del número de casos
reportados y diagnosticados dado que no se conoce incremento en el
cubrimiento vacuna¡ ó en esfuerzos divulgativos sobre la bondad de vacunar.
En Europa se ha demostrado que en la presentación del Cólera Porcino existen
factores de mercadeo que determinan la presentación cíclica de la enfermedad,
y en otras entidades infecciosas diferentes al Cólera, existiendo características
propias del agente etiológico, de su epidemiología, que hacen que se reporte el
fenómeno de ciclicidad. Como se desconoce en éste medio éste fenómeno, se
pensó que la presencia de anticuerpos específicos contra CP podría ser el
origen de la disminución de la casuística observada.
18
Actualmente se desconoce la prevalencia de porcinos que han desarrollado
anticuerpos post-infección o post-vacunación, si estos son protectivos o nó;
dificultando los mecanismos apropiados para la prevención de brotes, para el
desarrollo de campañas de vacunación y para la movilización de animales.
En respuesta a estos hechos la presente investigación se encaminó a conocer
algunos aspectos de la epidemiología de la enfermedad bajo condiciones
ecológicas propias, tomando como base la determinación de la prevalencia de
anticuerpos por medio de pruebas de laboratorio específicas.
A pesar de que por mucho tiempo en este laboratorio la técnica de
neutralización de la fluorescencia ha demostrado todas sus bondades, se
considero importante la implementación de otra técnica que augurara resultados
más exactos, más económicos y menos laboriosos. La técnica de
inmunoperoxidasa ha demostrado ser para muchos agentes infecciosos y desde
luego para el CP, una técnica que llena tales requerimientos.
19
Objetivos específicos:
Por medio de encuestas serológicas determinar la población porcina
susceptible en el país, relacionada con la tecnificación de las piaras, la
edad y el sexo.
Implementación de la técnica de inmunoperoxidasa y comparación con la
de Neutralización de la Fluorescencia.
2. REVISION DE LITERATURA
La forma aguda del Cólera Porcino fue reconocida en Kentucky, Tennesse e
Indiana (Estados Unidos) durante los primeros años de la década de 1840,
Hanson (1957). Se ha sugerido que la enfermedad pudo haber existido en
cerdos de esas áreas como una forma atípica por muchos años y que la
presentación aguda podría haberse originado más como un cambio en la
genética, nutrición y manejo de los cerdos, que como una alteración del virus.
Se desconoce si éste fué transferido al cerdo a partir de un reservorio animal
americano en algún momento precedente, o si fué inducido por cerdos foráneos.
En la actualidad catorce países de América reportan el Cólera Porcino, todos
ellos poseen una densa población porcina, (excepto Canadá, Estados Unidos
y República Dominicana).
*
21
En Colombia no se tienen datos de la existencia del Cólera Porcino (CP) antes
de 1942; aunque se presentaron epizootias compatibles con la enfermedad en
la especie porcina en los departamentos de la Guajira, Magdalena y Chocó, no
se pudieron atribuir al Cólera Porcino porque no fueron confirmados por el
laboratorio. Manrique y Ra ye (1973).
El primer brote de la enfermedad se presentó en el mes de mayo de 1942 en
Cúcuta, aparentemente los animales provenían de Venezuela, presentaban un
cuadró febril, contagioso y altamente mortal el cual afectó a cerdos sin distinción
de raza, género o edad. Manrique y Ra ye (1973).
A partir de 1970 se empezaron a realizar trabajos sobre la patogénesis,
transmisión y cultivos de Diarrea Vira¡ Bovina y Cólera Porcino; entre estos
Borda (1975), hace referencia entre la relación antigénica del Cólera y la Diarrea
Vira¡ Bovina.
Otras investigaciones a este nivel han sido los realizados por Rico y Castro
(1982), que hacen referencia a la evaluación inmunológica y patogénesis en
cerdos vacunados contra el Cólera Porcino. Y el realizado en 1993 por Ramirez
22
sobre cultivos celulares y suero fetal bovino inactivado con BEl en el estudio del
virus de la Diarrea Vira¡ Bovina, donde expone las dificultades del diagnóstico
de la enfermedad a través del laboratorio por la alta contaminación que
presentan los cultivos con cepas no citopáticas del virus de la Diarrea Vira¡
Bovina. Ramírez (1993), Rico y Castro (1982).
El sistema de Diagnóstico en Colombia ha recibido especial cuidado, adoptando
técnicas que permiten un diagnóstico confiable. La evaluación de estos
resultados constata la presencia permanente de la enfermedad en la población
porcina Colombiana y corroboran que el Cólera porcino debe considerarse como
la entidad infecciosa más importante en esta industria. La presencia del virus se
ha comprobado en todos los ecosistemas y tipos de manejo presentes en
Colombia.
2.1. COLERA PORCINO
El Cólera Porcino (CP) también llamado Peste Porcina o Fiebre Porcina Clásica,
se define como una enfermedad altamente contagiosa, causada por un virus de
23
la familia Togaviridae, género Pestivirus, denominado Virus del Cólera Porcino.
Dahie and Liess (1992), Gibbs (1981), Van Oirschot (1992), Cottral (1978).
Según Dunne (1970) el Cólera presenta una mortalidad del 90 al 100 % en la
forma aguda. Pero también se ha caracterizado por producir enfermedad de tipo
crónico con baja mortalidad en animales adultos, abortos, muerte fetal y
anomalías congénitas, Carbrey et.al . (1966)
2.1.1 Propiedades fisico- químicas del virus.
El agente causal del Cólera Porcino es un virus ARN, de polaridad positiva,
perteneciente al género Pestivirus, familia Togaviridae; con envoltura y simetría
icosaédrica, y replicación citoplasmatica en las células infectadas. Westaway
et.al (1985).
El ARN del virus del Cólera Porcino tiene un coeficiente de sedimentación de 4045S en gradiente de sacarosa y un peso molecular de 40X10 Kd establecido
por electroforesis en geles de poliacrilamida. El virus posee una sola cadena de
ARN, su diámetro es de 40-50 nm, con una nucleocápside de 29 nm. Presenta
24
proyecciones como flecos de 6-8 nm en la superficie del virion. Van Oirschot
(1992).
El virus del Cólera Porcino posee tres polipeptidos estructurales: 2
glicoproteínas de envoltura El de 55.000 daltons y E2 de 46.000 daltons y una
proteína del núcleo (CORE) no glicosilada de 36.000 daltons. Las proteínas de
envoltura son las que poseen mayores determinantes antigénicos para los
anticuerpos neutralizantes. Fenner (1992).
La inactivación física del virus del Cólera Porcino depende del medio que
contiene el virus, ejemplo: en los cultivos celulares se inactiva en 10 minutos a
60°C. El virus es estable a pH 5-10, por encima y por debajo de este rango la
virulencia se pierde rápidamente. Los solventes como éter, etanol, cloroformo
y desoxicolato lo inactivan rápidamente, porque actúan sobre los lípidos de la
envoltura. Van Oirschot (1992).
2.1.2. Cultivo del Virus.
Los cultivos celulares se derivan de células de un cultivo primario o de una línea,
disgregadas por medios enzimáticos o químicos. Freshney (1987).
25
Los cultivos primarios consisten en células tomadas de un tejido u órgano,
provenientes de un animal recién sacrificado, las cuales conservan una
morfología similar a los de lss células del órgano que les dio origen. Dentro de
un mismo cultivo se encuentran por lo general diferentes tipos de células que
mantienen la distribución diploide de los cromosomas. Estos, a diferencia de las
líneas celulares, no se propagan indefinidamente in-vitro. Freshney (1987).
Las líneas celulares se obtienen de los cultivos primarios mediante un cambio
defenotipo o transformación. Las líneas celulares continuas están formadas por
células que se han diferenciado morfológica y genéticamente de las células
originales. Una característica típica de estos cultivos es ser aneuploide y tener
a menudo un complemento de cromosomas entre diploide ytriploide. Un número
considerable de líneas están asociadas con transformaciones malignas como
reducción en el enriquecimiento del suero, crecimiento en medio y aneuploidía.
Freshney (1987).
Considerando que cada tipo de cultivo celular animal tiene su aplicación en
virología, la elección de las especies y tejidos, así como del cultivo (primario,
26
cepas celulares o línea celular) dependen del virus y de los objetivos
experimentales. Stranostrom et.al (1974).
La adsorción de los viriones a las membranas celulares ocurre a través de
estructuras específicas que se localizan externamente a la envoltura vira¡. Estas
estructuras han sido aisladas y corresponden a receptores (gp 53, gp 25) que
al ser neutralizados por los anticuerpos, originan la no adsorción y la no
penetración del virus a las células en los cerdos inmunizados. Sólo células de
ciertas especies y ciertos tejidos muestran receptividad en mayor o menor
grado. El virus del cólera porcino es pantotrópico. También se sabe que las
concentraciones óptimas de cationes en el medio de cultivo favorecen la
adsorción vira¡ a las células. Uno de los primeros intentos para cultivar el virus
del CP en células renales del cerdo se hizo en 1960; las características de
replicación, conservación de la patogénicidad y antigénicidad fueron
determinantes para la ulterior popularidad de éste método. Rumenap et. al
(1989).
Se ha observado que la composición del medio de cultivo, el tampón y el tipo de
células, determinan el desarrollo del efecto citopático del virus del cólera porcino
27
sobre el cultivo celular, el mecanismo que ejerce este fenómeno es
desconocido, pero se conjetura que es el sistema enzimático celular el que se
ve comprometido; en ocasiones el suero utilizado para el medio de cultivo puede
contener anticuerpos que inhibirán la acción del virus, impidiendo el efecto
citopático. King and Harkness (1975), Bolin (1985).
A las cuatro horas postinoculación menos del uno por ciento de las células de
la línea PK1 5 contienen antígeno vira¡, a las doce horas, el noventa y nueve por
ciento de las células lo contienen. El antígeno únicamente está en el citoplasma
de las células infectadas lo que sugiere que la replicación del virus del cólera es
enteramente extranuclear. En cultivos de linfocitos y de monocitos, el virus
puede replicarse satisfactoriamente, aunque pierde capacidad patógena para el
cerdo. Rumenap et.al (1989).
Para la investigación del virus se han utilizado diferentes tipos de células,
mientras que para el diagnóstico existe la tendencia de usar la línea PK1 5,
Terpstra et.al (1984). Se menciona que si la línea PKI 5 se mantiene infectada
en forma continua, al cabo de cierto número de pases muestra alteraciones de
tipo genético, pero existen controversias al respecto pues en otros estudios se
28
asegura que dicha infección persistente no afecta a las células PK1 5 aún
cuando el virus pueda transmitirse de células madre a células hijas durante la
mitosis. Se ha estimado que las células PK15 normales tienen un ciclo de
reproducción de 15,2 horas; la síntesis de DNA se estima en un período de 6 a
9 horas, la fase postsíntesis de DNA y mitosis en 3,8 horas y la fase postmitótica
en 4,5 horas. Estas células en condiciones de infección aguda o permanente
con el virus del GP extienden el período de síntesis de DNA en 0,9 y 0,7 horas
respectivamente. Se ha visto que el virus del GP puede replicarse con más éxito
si las células PK1 5 son previamente tratadas con virus Senda¡ (virus
parainfluenza) inactivado con beta-propiolactona. Dichas células desarrollan
numerosos sincitios. También se ha determinado que las células infectadas con
virus de GP incrementan la absorción de glucosa del medio y elevan la
producción de glicógeno y de ácido pirúvico a las 36 horas postinfección.
2.1.3. Patogénesis.
En condiciones naturales, el virus del GP infecta al cerdo por la vía oronasal.
Van Oirschot and Terpstra (1989), Liess (1986), Van Oirschot (1986), Terpstra
(1991). Ocasionalmente el virus puede entrar por vía conjuntiva¡, genital o por
lesiones de la piel. Van Oirschot and Terpstra (1986).
29
Forma aguda:
El virus tiene afinidad por los endotelios y el sistema reticuloendotelial. La
invasión primaria del virus se realiza a través del epitelio, sin embargo el daño
severo de las funciones del metabolismo es por alteración del endotelio
vascular. Carbrey (1984), Ressang (1973). Siete horas después de la infección
del virus del CP se detecta en las tonsilas que son el sitio primario de
replicación, Carbrey (1984), Trautwein (1988); luego es transportado por vía
linfática a los ganglios linfáticos, alcanza los vasos eferentes y se produce la
viremia inicial, luego se localiza en el bazo, en la médula ósea, ganglios
linfáticos viscerales y estructuras linfoides pequeñas en el epitelio intestinal.
Debido alas células mononucleares y polimorfonucleares aumentan sus niveles.
Probablemente el virus no invade los órganos parenquimatosos hasta la fase de
viremia tardía. Ressang (1973), Ressang (1973 a), Van Oirschot and Terpstra
(1989), Cheville and Mengeting (1969), Van Oirschot (1992). Las células de
predilección del virus son las epiteliales, endoteliales y reticulares. Ressang
(1973a).
El tiempo que emplea el virus en su propagación está relacionado con la
virulencia. El de alta virulencia puede ser detectado en los órganos cinco a seis
30
días después de la infección . Ressang (1973), Van Oirschot and Terpstra
(1989).
La trombocitopenia y alteracion en la síntesis del fibrinógeno son desórdenes
debidos a la degeneración de las células endoteliales, que explican las múltiples
hemorragias en la fase terminal del GP agudo. Trautwein (1988), Trigo (1985).
Según Charley et.al (1980) se presentan cambios de reactividad inmune de los
cerdos en la forma aguda del Cólera Porcino.
Las infecdones persistentes
Son causadas generalmente por virus de baja o moderada virulencia. Existen
dos formas de persistencia: crónica y la de ataque tardío.
Fase cróiica:
Tiene tres fases, Van Oirschot (1992) y Van Oirschot and Terpstra (1989)
Enfermedad aguda
Mejoramiento clínico
Exacerbación de la enfermedad aguda.
31
En la primera enfermedad aguda el virus se propaga más lentamente que en la
aguda y sus concentraciones en suero y órganos son bajos.
En el período de mejoramiento dínico, los títulos en el suero son bajos o
ausentes y hay evidencia deformación excesiva de células plasmáticas y por lo
tanto un aumento de gamma globulinas en el suero. Mientras tanto el antígeno
vira¡ esta usualmente limitado a células del epitelio de las tonsilas, glándulas
salivares, íleon y riñón. La desaparición temporal del virus del CP puede ser
debida a la formación de anticuerpos específicos ola la escasa producción de
virus en los glóbulos blancos. La circulación de complejos antígeno-anticuerpo
puede ocasionar su acumulación en tos riñones, causando eventualmente
glomerulonefritis. Cheville etal (1970), Van Oirschot (1992).
Durante la tercera fase el virus se propaga nuevamente a través del organismo.
Puede ser favorecida por una disminución de la respuesta inmune que se
desarrolla en la infección crónica. Los cerdos pueden ser susceptibles a una
infección bacteriana secundaria durante esta fase de la infección. Mengeling and
Packer (1969), Trautwein (1988).
0
32
Ataque tardío:
Inicialmente tiene un curso inaparente, puede aparecer vanos meses después
M primer contacto con el virus. Esta infección es secuela del virus de baja
virulencia durante la vida fetal. Van Oirschot and Terpstra (1977). Los cerdos
pueden tener niveles de viremia altos, que pueden decrecer después de la
ingestióna de anticuerpos calostrales. El sindrome se caracteriza por un largo
período en que los animales no presentan signos de enfermedad, pero pocos
meses después de la exposición primaria, los cerdos mueren o desarrollan
anorexia leve, depresión, conjuntivitis, dermatitis, diarrea y disturbios en la
locomoción con parálisis en el tren posterior. La temperatura corporal es normal.
Los cerdos sobreviven más o menos seis meses pero todos eventualmente
mueren.
Los cerdos con persistencia de Cólera Porcino congénito desarrollan
anticuerpos neutralizantes, por eso persiste la viremia. Van Oirschot and
Terpstra (1989), Van Oirschot (1992). Por la diseminación sanguínea se puede
explicar la frecuente infección trasplacental en cerdas preñadas. El virus se
multiplica rápidamente en la placenta e infecta al feto (s). El efecto de la
infección congénita está determinado por la edad de los fetos y la virulencia
33
específica del virus. Terpstra (1991). Dependiendo de está virulencia, se pueden
encontrar o nó anticuerpos neutralizantes después de la infección postnatal. Van
Oirschot (1992). Los cerdos en la fase crónica desarrollan anticuerpos y los
cerdos con persistencia congénita son inmunotolerantes al virus.
2.1.4. Signos.
Los signos clínicos son determinados por la virulencia del virus y por la
susceptibilidad del huésped. Wensvoort and Terpstra (1985), Carbrey (1984),
Shimizu and Shimizu (1983) yVan Oirschot( 1992). Mengeling and Packer (1969)
describen tres fases del Cólera Porcino:
Fase aguda: Se presenta Anorexia, depresión, aumento en la temperatura y
leucopenia (Generalmente es persistente) semanas después de la infección,
la apariencia general y el aspecto han disminuido.
En la segunda fase las características clínicas generalmente mejoran.
En la tercera fase los cerdos estan de nuevo anoréxicos, deprimidos y
presentan temperatura elevada.
1
®
r,
2.1.5. Epidemiología.
Corrxct
Centro de Documentación 34
(EISA
2.1.5.1. Huésped. El cerdo es el huésped natural del Cólera y fuente de
diseminación del virus. El contacto directo entre el huésped y los cerdos
susceptibles, es el principal medio de transmisión, los cerdos infectados pueden
difundir el virus antes que aparezca los signos de la enfermedad y durante ésta.
Van Oirschot (1992).
Los cerdos se recobran generalmente del GP desarrollando anticuerpos de baja
especificidad. Los cerdos infectados con cepas virulentas pueden difundirlas de
10 a 20 días; cuando la infección post-natal es debida a una cepa de baja
virulencia esta se caracteriza por cortos períodos de excreción del virus.
Consecuentemente la cepa virulenta es difundida rápidamente en una piara e
induce a una alta morbilidad. Los cerdos infectados crónicamente difunden
continua o intermitentemente el virus hasta la muerte. Van Oirschot (1992).
Cuando una cerda es expuesta a la cepa del virus del CP de baja virulencia la
infección inicial puede pasar desapercibida, pero el virus es transmitido al feto
in-útero. Tales infecciones congénitas usualmente producen fetos muertos y/o
cerdos que mueren pocas semanas después del nacimiento. Debido a que el
35
virus del GP permanece en grandes cantidades en los fetos, el virus puede ser
diseminado durante el parto. Van Oirschot and Terpstra (1977).
El virus del CP puede sobrevivir en la carne de cerdo o productos cárnicos
procesados. La supervivencia del virus se puede prolongar por meses cuando
la carne se almacena en frío o por años en congelación. Los cerdos susceptibles
pueden contraer la enfermedad cuando se alimentan con desperdicios de carne
o sobrantes de la cocina que no han recibido ningún tratamiento apropiado.
Terpstra (1991).
2.1.5.2. Transmisión:
Vías.-Bajo condiciones experimentales el cerdo puede ser infectado por vía oral,
nasal, aerogena, conjuntiva¡, genital y parenteral. Dunne et.al . (1960), Hughes
et.al . (1960), Liess et.al. (1976). Las infecciones por estas vías ocurren en una
u otra forma bajo condiciones naturales. Los cerdos infectados pueden difundir
el virus durante la incubación. Ressang (1973).
T,ansmLionporeIhcwnbre:Es de gran significado en áreas de alta densidad de
cerdos; granjeros, inseminadores, equipo de vacunación y veterinarios pueden
36
transmitir el virus por instrumentos y drogas. El hombre es considerado el
causante del 40% de la diseminación del virus del CP. Wachendofer et.al .
(1978), es muy común que los veterinarios no cambien de aguja ni dejennga en
el momento de la vacunación.
Transmisión pcvaire:Los reportes son escasos. Hughes and Gustafson (1960).
Transmisión por arfrópodos: Los artrópodos pueden contribuir, bajo ciertas
condiciones, a la diseminación del Cólera. En 1919 Dorset et.aJ reportaron que
la mosca doméstica y la mosca de establo podían contaminarse con el virus del
GP a través de secreciones oculares o sangre de cerdos infectados. La
transmisión a cerdos puede ser por inoculación de una suspensión u
homogenizado de moscas domésticas o por la exposición a picaduras luego de
24 horas. Más recientemente Miller et.al (1974) aislaron el virus del GP de
moscas y las mantuvo sin infectarse por 72 horas después de ser alimentadas
con sangre contaminada.
Stewari et.al (1975) aislaron el virus del GP de cerdos inoculados con un p001
de mosquitos; estos cerdos contrajeron el CP desarrollando una infección
37
crónica con una viremia persistente durante 30 o más días. Las especies de
mosquitos utilizadas por Stewart fueron Aedes aegyptus y Culex tarsalis,
sugiriendo la transmisión biológica y mecánica del virus.
Fuentes de Infecdón: Los cerdos domésticos son la mayor fuente de virus, este
se multiplica en diversos órganos y es excretado por el moco nasal, saliva y
fluidos biológicos. Liess (1987).
Los mecanismos de transmisión del virus del CP basados sobre 600 casos
ocurridos en los EEUU indican que el trasporte o la movilización de cerdos
infectados, constituyeron el 36% yel 25% fue ocasionado por otros mecanismos
como préstamo o venta de equipos de porcicultura entre vecinos, cerdos
extraviados, perdidos o vagabundos.
Otras fuentes de infección se consideran dentro de las siguientes categorías: un
19% asociadas con el uso inadecuado de vacuna: 5% al uso de lavazas o
desperdicios de cocina y el 15% restante se debe a una miscelánea de las
causas antes mencionadas. USDA (1964).
38
En algunos países los brotes agudos de CP se han considerado como
indicadores de infecciones inadvertidas en poblaciones porcinas. En ellas la
prevalencia se determina al azar por pruebas serológicas en la piara de cría.
Liess (1987).
2.1.6. Profilaxis.
Para prevenir efectos los efectos devastadores de la enfermedad, algunos
países han establecido medidas de prevención y control:
2.1.6.1. Control: La eliminación de todos los animales sospechosos y enfermos
es el mejor método para evitar la difusión de la enfermedad en una granja,
región o país. Los estudios de patogénicidad del virus del CP y las
características epizootiológicas de la enfermedad demuestran que la principal
forma de transmisión es por contacto directo y por portadores sanos. El
incumplimiento de esta norma ha mantenido constante una alta incidencia de la
enfermedad en muchas regiones del país, en las cuales se elaboran embutidos
con carne procedente de animales enfermos, estos productos refrigerados
protegen las características patogénicas del virus y frecuentemente
39
desencadenan brotes de la enfermedad en granjas que aún utilizan lavazas sin
cocimiento en la alimentación del cerdo.
Las medidas de prevención son básicamente las mismas que se toman para
otras enfermedades porcinas contagiosas. Mogollón (1988):
Evitar el envío de animales infectados o sin vacunar al matadero, a las
ferias y a otros sitios de dispersión.
Realizar limpieza y desinfección estricta de las instalaciones, vehículos y
todos los objetos que hayan podido ser contaminados por cerdos
infectados y sus excreciones.
Evitar la alimentación de cerdos con lavazas no tratadas.
Realizar cuarentenas y controles serológicos a todas las nuevas
adquisiciones de la granja.
Ejercer estrictas medidas de control de movilización a la piara.
2.1.6.2. Vacunación. Su objetivo es reducir el número de brotes agudos de la
enfermedad. Si se usa en forma masiva puede ayudar a erradicarla. Se conocen
cuatro procedimientos para la protección contra el CP. Fechner (1966):
oMétodos de inoculación simultánea.
1ølJO1 A
40
Vacunación con virus inactivado.
Vacunación con virus vivo modificado.
•Inyección de suero hipennmune.
2.1.6.2.1. Inoculación simultánea: Este método se comenzó a aplicar en
1908 en EEUU y consistía en inyectar simultáneamente un virus virulento y
suero hiperinmune. Dunne reportó en 1967 que el empleo de una cantidad
suficiente de antisuero (un mililitro por libra de peso corporal hasta las treinta
libras), junto con el virus virulento, eliminada prácticamente la posibilidad de que
se produjera la enfermedad, y estimulaba una protección adecuada, sin
embargo el uso excesivo de antisuero era capaz de interferir con el desarrollo
de la inmunidad activa.
2.1.6.2.2. Vacunas con virus inactivado: Las vacunas preparadas con virus
inactivado han sido tratadas con formalina, calor, cristal violeta, etc. La
utilización de vacunas inactivadas produce títulos de anticuerpos relativamente
bajos por pruebas de seroneutralización, Carbrey et.al (1969).
41
2.1.6.2.3. Virus vivo modificado: La atenuación de las propiedades patógenas
de un virus sin perder su característica inductora de anticuerpos se puede
conseguir por diversos procedimientos. Dunne (1967). Este método de
vacunación utiliza productos preparados con virus vivo modificado por pasajes
en conejos, cerdos, o cultivo de tejidos. Baker (1946), Mott (1961). La
multiplicación in-vitro sobre cultivo de células permite manejos estériles mucho
más satisfactorios que la utilización de animales, en los cultivos celulares se
controlan contaminantes bacteriológicos, micoplásmicos o virales. Van Waveren
(1956).
En una investigación realizada por Terpstra y Tielen en 1976, se examinó en
diversos grupos de edad la formación de anticuerpos en lechones de hembras
inmunes y no inmunizadas después de la inoculación con la "Cepa China",
además se estudio el efecto de una revacunación sobre el título sérico en
hembras, que habían recibido uno o tres años antes una dosis única de virus C.
Las mediciones de anticuerpos se efectuaron por la prueba de reducción en
microplaca en células PK 15 y por la prueba de inmunofluorescencia indirecta,
Ressang and Van Bekkun (1973).
42
Los lechones de cerdas no inmunes se vacunaron con éxito a partir de la
segunda semana de vida. En estos animales persistieron los anticuerpos
neutralizantes hasta la edad de matanza, a un nivel que se considera protectivo
frente a un desafió.
El estudio demostró que el virus C se puede difundir de lechones vacunados a
sus madres no vacunadas y a sus hermanos de lechigada.
Según Phillips (1966) el criterio más importante para considerar una vacuna
inocua es que no produzca signos de Peste Porcina, tales como fiebre,
inapetencia, muerte o lesiones macroscópicas.
2.1.6.2.4. Suero Hipennmune: Según Fechner (1966), el uso de suero
hiperinmune contra la peste porcina fue introducido en Alemania por Uhlenhuth
después de haber sido demostrado que el suero de animales convalecientes
produce en los cerdos sanos una defensa frente a las infecciones naturales.
2.1.6.2.5. Vacunación en Colombia. Las cepas utilizadas para la fabricación
de vacunas son: cepa GPE, Cepa PAV y Cepa China Lapinizada (LPC)
43
producidas en cultivos celulares; Cepa China (cepa C) y LPC, producidas en
conejo. Aynaud (1988); Ogawa and Hatareyama (1984); Terpstra and Tielen
(1976).
La cepa LPC es utilizada en Colombia para la fabricación de vacunas contra la
Peste Porcina. Esta vacuna se elabora con virus vivo modificado "Cepa China",
preservado con sustancias tampones, liofilizado y mantenido en envases de
vidrio, neutro sellado bajo condiciones de vacío.
Esta vacuna tiene gran poder inmunógeno si se conserva en condiciones
óptimas y se administra en cerdos sanos.
Cada ampolleta contiene: 1000 dosis infectantes, penicilina y
dihidroestreptomicina (como preservativos). El laboratorio recomienda aplicar la
vacuna a cerdos mayores de tres semanas, garantizando inmunidad sólida
desde el octavo día de su aplicación con refuerzo anual. La dosis para cada
cerdo es de 2 ml.
44
Las vacunas inducen anticuerpos neutralizantes en cerdos. Terpstra and
Wensvoort (1987). Se demuestra que existe relación directa entre el título de los
anticuerpos neutralizantes y la protección que estos producen. Paasch etal
(1994).
Se reporta que títulos mayores o iguales de 1:25 de anticuerpos neutralizantes
evitan que el animal muera cuando es desafiado con una cepa vira¡. Terpstra
and Wensvoort (1987).
También es necesario tener en cuenta que no solo los anticuerpos
neutralizantes son los responsables de la protección, ya que un cerdo sin
anticuerpos pude resistir un desafió vira¡. Paasch et.al (1994).
2.1.7. Reacción Inmune.
Los cerdos recuperados del CP desarrollan anticuerpos contra el virus de CP.
Ellos aparecen tardíamente en la circulación. Y pueden ser demostrados por
técnicas de neutralización, inmunofluorescencia indirecta, inmunodifusión,
fijación de complemento y de hemaglutinación pasiva, siendo las pruebas de
neutralización las más específicas, por ejemplo se puede diferenciar entre
45
anticuerpos para los virus de el CP y la DVB. Bajos títulos de anticuerpos
neutralizantes para CP pueden surgir de infecciones con DVB. Las pruebas de
neutralización son más rápidas y se pueden aplicar a gran escala. Jensen
(1981), Terpstra and Robijns (1984).
Anticuerpos neutralizantes también pueden ser producidos durante el curso
agudo y subagudo del CP, Mengeling and Packer (1969). Cerdos infectados con
CP crónico, eventualmente tienen una respuesta específica de anticuerpos, con
ocurrencia simultanea de virus y anticuerpos en la sangre. Mengeling and
Packer (1969). Los anticuerpos para el virus de CP se forman solamente en la
fase terminal del desarrollo fetal. Trautwein et.al (1977). Cerdos con CP
congénito rara vez producen anticuerpos específicos: el tamaño de tales cerdos
es normal, producen respuesta inmune para antígenos no relacionados con el
virus de CP, quedando inmunotolerantes. Van Oirschot (1992).
Cerdos que no desarrollan una respuesta de anticuerpos normal luego de un
primer contacto con el Virus del Cólera Porcino (VCP) se pueden reexponer a
este virus, dando así una hiperreactividad caracterizada por un período de
incubación más corto y una infección más severa que en cerdos infectados
46
primariamente, pero permitiendo así una resistencia aumentada a las cepas
virulentas.
Se debe tener en cuenta que los cerdos infectados persistentemente con el CP
de baja o moderada virulencia tienen una supervivencia prolongada cuando se
inoculan con cepas de alta virulencia. Van Oirschot (1992).
Las inmunoglobulinas representan del 49.2% al 75.9% de las proteínas
calostrales del cerdo y la lgG del 65.3% al 89.3% de las inmunoglobulinas
calostrales. La concentración de todas las inmunoglobulinas es más alta en el
calostro que en el suero, pero su proporción es diferente. La inmunoglobulina A
tiene más alta proporción en calostro que en suero. Porter (1969).
2.2. DIARREA VIRAL BOVINA
La infección del ganado lechero con el virus de la Diarrea Vira¡ Bovina (DVB) fue
descrita por primera vez en New York en 1946, se aisló en cultivo de células de
riñón bovino en 1957. Este agente cuya distribución es mundial causa la
47
Enfermedad de las Mucosas (MD) en bovinos denominada comúnmente Diarrea
Vira¡ Bovina. Paton et.al . (1992).
Su transmisión se efectúa por contacto con alimentos, agua y desechos
contaminados. Se presenta en forma aguda, crónica y subclínica, siendo esta
última la más común. Bielefeldt (1983), Bolin (1990).
La infección post-natal con el virus de DVB en cerdos tiene un curso subclínico
y ocasionalmente aparecen infecciones pre-natales. La infección in-útero con
este virus puede ocasionar muerte prenatal o perinatal. Los cerdos nacidos
pueden aparecer clinicamente afectados, estar aparentemente sanos o pueden
permanecer infectados persistentemente y desarrollar signos de enfermedad o
anticuerpos tempranos o tardíos. Esto generalmente se observa en infecciones
experimentales. Terpstra and Wensvoort (1988).
2.3. REACCION CRUZADA.
La primera descripción de la relación antigénica entre el virus del GP y el de la
DVB indica un alto grado de homogenicidad. Darbyshire (1960). Esto ha sido
48
confirmado por numerosos investigadores y la relación fue extendida a la
enfermedad de la frontera. Moenning (1992).
Antisueros policlonales contra pestivirus generalmente distinguen las diferentes
cepas por pruebas de inmunofluorescencia o inmunodifusión. A través de
ensayos de neutralización cruzada se diferencia el virus del CP y los pestivirus
de los rumiantes. Los serotipos o serogrupos pueden ser completamente
diferenciados. Aynaud et.al (1974), Neukirch et.al (1980).
La envoltura vira¡ parece ser el sitio de mayor variación antigénica y el desarrollo
de anticuerpos monoclonales directamente contra pestivirus, ofrece facilidades
para un análisis detallado. Anticuerpos monodonales contra VCP son dirigidos
contra la envoltura vira¡, glicoproteína (gp53) y la mayoría muestra neutralización
M virus infectante, indicando que la glicoproteína 53 constituye una parte
importante de la membrana del virion. Los anticuerpos monoclonales reaccionan
con una especie homóloga aislada pero siempre neutralizándola completamente
Greiser-Wilke et.al (1990). Estas observaciones indican que la función o papel
de la conservación de epitopes neutralizantes del virus del Cólera Porcino puede
variar de virus a virus. Moenning et.al (1989).
49
Los anticuerpos monodonales contra la mayor glicoproteína viral son útiles para
el análisis de la composición antigénica de Ja superficie vira¡. Los Flavivirus,
pestivirus ofrecen sitios antigénicos en la superficie de cada uno, incluyendo
epitopes individuales. Heinz and Kunz (1981). Usando vanas técnicas
Wensvoort (1989) realizó un mapeo topográfico y funcional de la gp 53 del VCP
usando 13 anticuerpos monoclonales y reorganizando diferentes epitopes de la
cepa Brescia homóloga. Cuatro sitios (A1-3, 8, C, O) fueron identificados por
estudios competitivos, ensayos de captura de antígenos, neutralización y
aislamiento de mutantes libres neutralizantes.
El sitio Al y A2 puede ser conservado en todas las cepas del virus del CP. Los
sitios A3, B, C, D, despliegan alguna variabilidad. El sitio A,B,C puede ser
también importante en la inducción de anticuerpos neutralizantes. Una
neutralización sinérgica puede observarse cuando se usan anticuerpos
monodonales contra Al y B ó Al y C. Neutralización cruzada entre el virus del
CP y pestivirus de rumiantes usando anticuerpos monodonales no están
descritas. Esto en contraste con el resultado obtenido con antisueros
policlonales con propiedades de neutralización cruzada; una exploración
tentativa es la neutralización cruzada siendo efectiva y utilizada para más de una
50
especie de anticuerpos a diferencia de los anticuerpos monoclonales que tienen
un solo sitio antigénico en la glicoproteína vira¡ mayor.
En general los anticuerpos monoclonales con una extensa reactividad, son
dirigidos contra la proteína no estructural p125. Peters et.al (1986), Edwards
et.al (1989). Este resultado concuerda con la secuencia genómica de datos
evaluables que indican una mayor homogeneidad (>80%) en las respectivas
partes del genoma de los pestivirus. Collett et.al (1989) , Moormann et.al (1990).
Dentro de la relación se encuentran varias analogías:
FISICO-QUIMICAS
Respuesta idéntica a la ultrafiltración y a la ultracentrifugación.
Magnitudes similares y densidad débil.
Sensibilidad comparable con respecto a temperatura, pH, éter, cloroformo,
desoxicolato y tripsina.
Los dos virus tienen una base de RNA y contienen lípidos esenciales.
Notables analogías en microscopia electrónica en cuanto a morfología y
dimensiones.
51
CULTURALES:
Aunque se cultivan en sistemas celulares diferentes, el virus de DVB y el
de CP se han podido adaptar a las células renales de bovinos.
La velocidad de crecimiento es similar.
El efecto citopatogénico es variable en las diferentes cepas de DVB yVCP.
INMUNOLOGICAS:
Se ha notado un fenómeno de interferencia entre los dos virus, el del GP
inhibe el crecimiento de cepas citopatogénicas de la enfermedad de las
mucosas adaptada en células PK15. Se cree que el fenómeno de
respuesta hacia los dos virus es idéntico, es decir, que los sistemas
enzimáticos de las células infectadas se movilizarían sobre el primer virus
infectante y no podría actuar contra el segundo. Se considera que no es
debido a la producción de interferón . Gibbs (1981), Maramorosch (1991),
Saural et.al (1972).
Por sus propiedades similares la detección de los virus se dificulta pues
presentan reacciones cruzadas en las pruebas serológicas, una forma de
diferenciarlas es realizar diluciones a la muestra analizada, pues el virus del CP
52
tiene un título mayor que el virus de la DVB, cuando se emplean antígenos
homólogos.
2.4. DIAGNOSTICO
Las técnicas de diagnóstico más usadas son: anticuerpos ligados a peroxidasa
(PLA) y la inmunofluorescencia (IF), los cuales se utilizan para detectar
antígenos o anticuerpos contra los virus den GP y DVB. En ambas se pueden
emplear anticuerpos policlonales o monodonales, que ayudan en el diagnóstico
diferencial de los diversos virus que conforman el género pestivirus. Dahie et.al
(1991). Sin embargo en estudios realizados para evaluar las técnicas se ha
concluido que la PLA es más sensible mientras que la lF es más fácil de realizar.
Pejsak (1993).
En general los pestivirus son difíciles de propagar en cualquier línea celular,
pero el virus de GP es relativamente fácil de replicar en las células PKI 5 (células
de riñón de cerdo), permitiendo así detectar anticuerpos en los sueros de los
cerdos. Rivero et.al (1988).
Centro de IJOC(irncfj;çj
53
CEIs,
La seroneutralización en cultivo celular es el método más específico en el
diagnóstico de CP. Consiste en mezclar cantidad constante de virus con
diluciones variables de suero, inocular cultivos celulares y revelar el virus no
neutralizado por inmunofluorescencia directa. Carbrey et.al (1969), Cortes et.al
(1982). Esto también puede hacerse visible utilizando suero marcado con
peroxidasa, Terpstra and Robijns (1984).
Se presentan falsos positivos por seroneutralización, si el cerdo esta infectado
con virus de DVB (por su similitud antigénica con el GP). Neukirch et.al (1980),
Matthaeus (1981). La prueba de seroneutralizadón es oficial para la lucha y
erradicación del GP en Europa. Todos los sueros que poseen la capacidad de
neutralizar el virus de GP entre las diluciones
115 1140 deben ser sometidos
a una prueba idéntica frente al virus de la diarrea vira¡ bovina. Broint et.al (1983),
Jensen (1981), Liess (1981).
La inmunofluorescencia indirecta: su especificidad es inferior a la de la
seroneutralizadón pues no permite distinguir los anticuerpos inducidos por el
virus del GP y por el virus de DVB. Ressang and Van Bekkun (1973). En el
laboratorio para la propagación del virus de GP se utiliza cultivo celular PKI 5,
54
el cual debe ser suplementado con suero fetal bovino (SFB) libre de anticuerpos
y antígeno de DVB, que son frecuentemente contaminantes de estos. Si el suero
utilizado tiene anticuerpos contra el virus de DVB va a interferir haciendo que el
virus del CP pierda habilidad para infectar las células. Si hay antígeno de DVB
se van a presentar falsos positivos. Carbrey et.al (1984).
25. COLERA PORCINO EN COLOMBIA.
2.5.1. Grado de tecnificación de la industria porcina.
Según el tamaño de la piara, se puede dividir en diferentes estratos del 1 al 4.
Esta clasificación coincide con el grado de tecnificación teniendo en cuenta
materiales de construcción, área, cantidad, grado de automatización, etc.
Tecnología artesanal o simple: cobertizo rústico, comederes o bebederes
equivalentes a una llanta ó balde, sitios de parición improvisados. Piaras
estrato 1 (<25 animales).
Tecnología media: cobertizos en teja, piso en cemento, comederes o
bebederes de asbesto o cemento. Piaras estrato 2 (<175 animales).
55
Tecnología superior: Bebederes y comederes automáticos o semi automáticos, cerca eléctrica para pastoreo, corrales de ladrillo o cemento.
Piaras estrato 3 (>175 animales).
Tecnología especial: Planta de alimentos, de tratamiento de agua, jaulas
parideras, de gestación y precebos. Piaras estrato 4 (>500 animales).
Según los parámetros reproductivos y productivos los estratos 1 y 2 (no
tecnificados), la edad de las cerdas para la primera monta varia entre 7,7 y 8,6
meses y el peso de ellas oscila entre 60 y 80 Kg., mientras que en piaras estrato
3y4 (tecnificado) la edad de monta es 7,3 y 7,6 meses y el peso es de 95 a 105
Kg.; siendo esta última la edad y peso adecuado para realizar la primera monta
a las hembras de cija. Esto también va a influir en el número de partos por año
y en la cantidad de lechones nacidos vivos y en el peso que tengan.
En cuanto a la alimentación en los estratos 1 y 2 se utiliza una pequeña
proporción de concentrado. La tendencia a usarlo aumenta a la medida que
crece el tamaño de las explotaciones.
56
Tipo de explotación predominante: Las piaras de estracto bajo se
caracteriza por ser cebadoras, en estratos medios predominan granjas de
cria, pero a medida que el tamaño de la piara es mayor, existe una más
alta participación de explotaciones integrales (cria, levante y ceba).
Tamaño de explotación predominante: Las granjas no tecnificadas
predominan en nuestro país en un 97.7% mientras que las granjas
mayores de 500 animales corresponden a un 0,03% de las existentes en
el país.
La mayor proporción poblacional esta en los grupos correspondientes a
explotaciones pequeñas, particularmente en el grupo de menos de 25 cabezas,
el cual abarca el 70,3% de porcinos del país.
2.5.2. Situación en Colombia:
El análisis de los registros del centro de diagnóstico de Bogotá y de los informes
de la oficina de sanidad animal del ICA, dejan claro que las muestras
sospechosas por diagnóstico dínico, patológico, corresponden en su mayoría
a piaras con poblaciones hasta de 175 animales y que aún predios con
poblaciones entre 2 y 25 animales, aportan el 53,7% de los casos de cólera.
57
Aparentemente, el problema del CP se presenta en el país en relación inversa
al tamaño de la piara y por consiguiente a su tecniflcación. Se informa así mismo
que hay baja morbilidad (10.1 a 34%) y baja mortalidad (9.1 a 28.3%). En todos
estos reportes, se desconoce si se aplica vacuna, aunque se supone que es
mínimo su uso. Esta baja morbi-mortalidad, junto con el bajo número de casos
reportados por año, Figura N°1, y la limitada distribución de la enfermedad
(1987, 15 departamentos; 1988,12; 1898,9; 1990,9; 1991, 10) podrían sugerir
que las cepas del CP actuantes en Colombia son de baja virulencia y de baja
capacidad de propagación (considerando desde luego la existencia de
problemas inherentes a su reporte y diagnóstico). Se sugiere que el CP se
presenta en forma soterrada y permanente, con bajo número de casos, con
signologia atípica, en un número indeterminado de piaras cuyas características
específicas se desconocen y que por condiciones del medio ambiente
especiales se aumenta el número de casos y la virulencia, dando origen a
epidemias con morbi-mortalidad, lesiones y signos característicos.
w
58
i
il 1
Figura N 9 1: Visceras positivas por anticuerpos
fluorescentes a CP en años 1984/1993
VISC ERAS
O MUESTRAS POR AÑO M POSITIVAS POR AÑO
/
2
1
(1)
1(O
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1084 1085 1988 1987 1988 1980 1990 1991 1992 1998
AÑOS
3.MATERIALES Y METODOS PARA LA TECNICA DE
NEUTRALIZACION DE LA FLUORESCENCIA
3.1. MATERIALES:
PBS
Medio MEM
Tubos Leighton
Suero Equino
Suero Fetal Bovino Irradiado.
Pipetas eppendorf 10, 25, 50, 200, 100 1.
Virus: Cepa de GP aislada de un brote natural en el valle del Cauca y
mantenida a nivel de laboratorios por pases en porcinos. Antígeno utilizado
en el laboratorio de control de insumos pecuarios (LAN IP) del ICA. Título
(dosis infectante cultivo celular 0,2 mi) DICG/mi.
60
Suero positivo control: Obtenido en el laboratorio LAN 1 a partir de un porcino
vacunado y retado con la cepa de CP arriba mencionada.
Suero negativo control: Obtenido de cerdos no vacunados, mantenidos en
aislamiento, con resultados serológicos negativos al cólera porcino.
Conjugado específico: Obtenido de la NADL (E.U) suero anti-HC conjugado
con lsotiocianato de Fluoresceina.
Cultivo celular: Células PKI 5, mantenidas en medio MEM, adicionado de suero
fetal bovino irradiado a partes iguales con suero equino, además contenía
Penicilina, Streptomicina, Anfotericina y Glutamina, Anexo A. Las laminillas
en tubos Leighton se prepararon a partir de células de 48 horas de incubación
a 37°C (desprendidas con tripsina verseno); las laminillas luego de 48 horas
de incubación a 37°C se lavaron con PBS antes de ser infectadas. Anexo B.
yC.
sueros en estudio: La escogencia del cerdo a muestrear se hizo "intencionada"
que es un método no probabilistico en la que las características cualitativos
(nc o r p.c,Jc CI
Centro de Documentación
61
CEISA
de su distribución (sexo, edad) son similares a las de la población objeto.Se
seleccionaron las muestras de acuerdo al tamaño de la piara, calculada
según Cannon y Roe (1982) con un nivel de confianza (95%) precisión
obsoluta (5%) y una prevalencia esperada (variable de 30 a 50%). Piaras
menores de 175 animales, 438 muestras y en piaras mayores de 176
animales 290 muestras.
Se estudiaron sueros porcinos tomados durante 1993 y 1994 en varias regiones
M país y hacen parte del banco de sueros del Laboratorio de Enfermedades
Virales Porcinas del CEISA. Conservados a -30°C, los sueros presentaban buen
estado de conservación en el momento de la prueba, luego de ser
descongelados, se inactivaron a 56°C por 30 minutos.
Análisis: Básicamente el estudio consistió en un análisis epidemiológico
descriptivo. Para la comparación de resultados se utilizó la prueba de Chi
cuadrado, en todos los casos se trabajó con un nivel de confianza del 5%.
62
3.2. METODO:
Se siguió el descrito por Liess y Prager (1977); Snyder et. al (1981) y utilizado
en el laboratorio nacional de drogas. Básicamente consiste en la neutralización
M virus del cólera porcino por anticuerpos existentes en el suero, utilizando
cantidades variables de suero y fijas de antígeno. El antígeno no neutralizado
se replica en la monocapa celular durante el período de incubación y se detecta
con conjugado especifico anticólera porcino marcado, como fluorescencia
intracitoplasmática por medio del microscopio de Fluorescencia.
Del virus se emplearon 100 DICC, titulado cada vez que se realizaba la prueba.
Todos los sueros fueron probados inicialmente en dilución 1:8. Se mezclaron
partes iguales de suspensión del virus yde la dilución del suero, considerándose
así diluido el suero 1:16 y conservándose las 100 dosis del virus. Se hicieron
controles de los sueros problemas, también de sueros positivo y negativo al CP
como controles de la prueba.
Esta mezcla se incubó una hora a 37°C en baño maría(neutralización); luego se
adicionó 0.3 ml de suspensión a tubos Leighton dos por cada dilución
63
previamente lavados con PBS. Los tubos se incubaron una hora a 37°C
agitando cada 15 minutos. A cada tubo se agregó 1.7 ml de medio MEM luego
se incubaron a 37°C por 72 horas.
Se fijaron las laminillas por 20 minutos en acetona químicamente pura, se
colocaron en cámara húmeda y se cubrió la monocapa con 50 lil de conjugado,
se incubaron por 40 minutos a 37°C. Luego se lavaron cuidadosamente dos
veces con PBS, pH 7.2 (Anexo O) y una con agua destilada por 5 minutos cada
vez. Se cubrió cada laminilla con 50
lLl de
azul de Evans (colorante de contraste)
y se conservaron por 3 minutos, luego se lavaron como en el paso anterior. Las
laminillas se montaron en glicerina buiferada al 50% y se leyeron al microscopio
de luz fluorescente con objetivo de 25X y 40X. Ver Anexo H.
Aquellos sueros que fueron
positivos en la dilución 1:16, se titularon
posteriormente hasta la dilución 1:128, siguiendo exactamente el mismo
procedimiento.
41
am
3.3. INTERPRETACION:
Se consideró negativa (sin anticuerpos) la presencia de cualquier foco de
fluorescencia y la ausencia de fluorescencia como positiva. En la titulación de
sueros, la dilución más alta que neutralizaba el 100% de fluorescencia
corresponde al título del suero. Fotografía N°1 y NO2.
65
-....
j::.
-'-. •'- --•-
-•.'•-
_
-1
)
Fotografía N0 1. Fluorescencia positiva.
Fotografía N O2. Fluorescencia negativa.
[JI
4. RESULTADOS
4.1. GENERALES
Los 783 sueros estudiados se colectaron durante 18 meses (Enero de 1993 a
Julio de 1994) en ellos se detectó la presencia de un 63.2% (4951783) de sueros
negativos y un 36,8% (288/783) de sueros positivos. (se consideran negativos,
los sueros que no mostraron anticuerpos en la dilución 1:16).
La distribución de los sueros positivos por título de anticuerpos, Figura N°2,
Tabla N°1, establece que más del 75% de ellos tenía títulos inferiores a 1:32. El
promedio geométrico fué de 29.20. -
6!
Figura N°2: Distribución por títulos de sueros
positivos a Cólera Porcino sobre 268
sueros estudiados
iiii
145
5410% -
\1680%
160%
75001,"--.
45
58
20
TITULO DE ANTICUERPOS
0 1:169 1:32 0 1:849
:L.
l:1
68
Tabla N0 1. Porcentaje de distribución por títulos a cólera porcino sobre 268
sueros estudiados.
4.1.1.
Sexo.
Al observar la negatividad de los sueros, considerando la variable sexo,
encontramos que de 266 sueros de hembras estudiadas, 99 fueron negativos
(68,3%) y de 121 sueros de porcinos machos, 95 fueron negativos (78,5%), no
mostrando diferencia significativa.
La observación discriminada por sexo, muestra que en sueros de hembras,
sobre 46 positivos, se observó que más del 82% de los sueros tenían
anticuerpos menores de 1:32. Tabla NO2, Figura NO3.
69
I11J
Figura N 2 3: Comparación de sueros positivos a
Cólera Porcino según el sexo.
1:16
1:32
TITULO DE ANTICUERPOS
14
>1:125
70
Tabla NO2. Distribución de sueros de hembras porcinas positivas a cólera
porcino, por título sobre 46 sueros estudiados.
1:16
1:32
1:64
1:128
geomE
^
30
8
3
5
65.2
17.4
6.5
10.9
Aunque el número de sueros de machos estudiados es muy bajo 26, se aprecia
una distribución muy similar a la de los sueros hembras. Tabla NO 3. El promedio
geométrico de muestra que el sexo no influyo en la respuesta serológica.
Tabla No.3. Distribución de machos positivos al cólera porcino, por título, sobre
26 sueros.
1:16
1:32
1:64
^ 1:128
geom
19
2
o
5
73.1
7.7
0.0
19.2
71
4.1.2. Edad
Sobre 163 muestras pertenecientes a animales mayores de seis (6) meses, 107
fueron negativos (65,6%). Dentro de este mismo grupo sobre 56 sueros
positivos, la distribución por títulos corresponde en un 50% a la dilución 1:16.
Tabla N04. Promedio geométrico. 30.81
Tabla N04. El porcentaje de distribución de sueros porcinos positivos al CP
según título detectado.
El número de sueros estudiados dentro del grupo de animales menores de seis
(6) meses de edad, no permitió analizar este resultado.
72
4.2. TAMAÑO DE LA PIARA.
Existe un alto grado de correlación entre el tamaño de la piara y el nivel de
tecniflcación de las instalaciones.
En piaras con población superior a 175 animales se tomaron 290 sueros de los
cuales 168 (57,9%) fueron negativos. En 438 sueros de piaras con población
menor de 175 cerdos 308 (70,3%) no presentarón anticuerpos y 130 fueron
positivo (29.7%). Se encontró diferencia significativa entre porcentajes de sueros
negativos de animales procedentes de granjas con los dos diferentes tamaños
de población. Tabla N°5. Figura N°4.
Tabla N0 5. Porcentaje de sueros porcinos positivos y negativos al cólera porcino
hallados en granjas con diferente población.
Piaras con más de 176Piaras con menos de
175 cerdos
cerdos
RESULTADOS N°Sueros Porcentaje N°Suero Porcentaje
NEGATIVOS16857.930870.3
POSITIVOS12242.113029.7
I,!IJ
73
Figura N°4: Comparación de sueros positivos y
negativos a Cólera Porcino en granjas
de diferente población.
TECMFICACION O p tAaAs> 170 CERDOS
• PLNAS
80
70
1-
50
w
40
CL
ji AiI
<1:10110 1.32
104,1 1
TITULO DE ANTICUERPOS
ti
74
En piaras de más de 175 animales se detectaron 122 sueros con títulos al cólera
en piaras menores de 175 animales hubo 130, su distribución comparativa
aparece en la Tabla N 06. Figura N 04. El promedio geométrico en los dos tipos
de poblaciones no presentan diferencia significativa.
Tabla N06. Porcentaje de comparación de títulos serológicos al CP en
poblaciones porcinas de diferente tamaño poblacional.
Piaras con más de 176Piaras con menos de
175 cerdos
cerdos
TITULON°Sueros Porcentaje N°Suero Porcentaje
1:166553.37255.5
1:322722.12720.8
1:64 1310.77 5.4
^ 1:1281713.92418.5
Promedio geométrico: > 176: 28.27
<175: 29.21
4.2.1. Edad.
En piaras con poblaciones de más de 175 se estudió la influencia de la edad
encontrándose que en animales mayores de seis (6) meses y sobre 48 sueros
.111
75
estudiados, 34 fueron negativos (70,8%) y 14 positivos (29,2%). En granjas con
poblaciones menores de 175 cerdos se encontró que de 95 sueros estudiados,
60 fueron negativos (63,2%) y35 (36,8%) fueron positivos. Tabla N07.
Tabla N07. Porcentaje de distribución de sueros negativos y positivos en cerdos
mayores de seis meses procedentes de piaras de diferente tamaño.
Piaras con más de 176Piaras con menos de
175 cerdos
cerdos
RESULTADOS N°Sueros Total % N°Suero Total %
NEGATIVOS3448 70.86095 63.2
POSITIVOS1448 29.23595 36.8
En la Tabla N°8, Figura N 05., se observa la distribución de títulos a cólera
porcino, en cerdos mayores de seis meses, pertenecientes a piaras de diferente
tamaño.
r
;"f
Figura N°5: Comparación de sueros positivos en
porcinos mayores de 6 meses según la
tecnificación
EDAD
PIARA$<175CERDOS
PWS> 178 CERDOS
sol
40
w
14
z
W
o
Ét
O
lo
116
132
164
TITULO DE ANTICUERPOS
>1. 1
r
VA
Tabla N 0 8.
Porcentaje de distribución al CP de sueros porcinos mayores de seis
meses procedentes de granjas de diferente tamaño.
Piaras con más de 176Piaras con menos de
175 cerdos
cerdos
TITULON°Sueros Porcentaje N°Suero Porcentaje
1:16 857.11440
1:32 42861028.6
1:64 00.0514.3
>t
1:128214.3617.1
Promedio geométrico: > 176: 26.21
<175: 33.92
En las granjas con más de 175 animales no se tomaron muestras de animales
menores de seis meses.
En las granjas menores de 175 animales solamente se tomaron 13 sueros
pertenecientes a animales menores de seis meses de los cuales 9 fueron
negativos (69,2%).
L
78
4.2.2. Sexo.
La influencia del factor sexo dentro de granjas de diferente población aparece
en la Figura N06. En las granjas con más de 175 animales sobre 109 sueros
estudiados, hubo 56 hembras negativas (51,4%) y 53 machos negativos
(48,6%). En granjas menores de 175 animales, sobre 71 sueros estudiados
hubo 33 hembras negativas (46,5%) y38 machos negativos (53,5%).
4.3. DISTRIBUCION GEOGRAFICA.
Los sueros seleccionados se tomaron de 25 municipios en nueve (9)
departamentos del país. Figura N°7. El total de sueros tomados por
departamento, los negativos y su porcentaje, aparecen en la Tabla N09. Se
observa claramente que existen departamentos como Sucre, Córdoba y Meta
con mayores porcentajes de sueros negativos (72,7 a 91.8%). Los restantes
departamentos presentan porcentajes de negatividad más bajos, pero siempre
superiores al 50%.
im
79
Figura N 9 6: Porcentaje de negatividad al VCP según
sexo, de acuerdo a la tecnificación.
56
Tecnificado
fl
_
948609/10-1-
SEXO
HEMBRAS
MACHOS
33
,-4650%;
No Tecnificado
.5350%
Tabla N°9. Porcentaje de negatividad a cólera porcino en sueros porcinos según
distribución geográfica.
DPTO MCPIO PIARA SUEROS NEGATIVOS %
Clmarca8101367252.9
Valle3519412262.9
Caldas118562.5
Chocó4matader.664263.6
S!der23804455
Nquia91221913963.5
Meta1matader.11872.7
Sucre1matader.201890
Cordoba17494591.8
Fi
82
4.4. DISTRIBUCION TEMPORAL.
Al analizar los sueros durante el año y medio de estudio, se encontró la
siguiente distribución semestral. Tabla N°10. En el primer semestre de 1993 se
estudiaron 396 sueros de los cuales 271 (68,4%) fueron negativos, no se
observó diferencia significativa con los detectados durante el segundo semestre.
Sin embargo, si hay diferencia con el 51% hallado en el primer semestre del
94.Tabla N. 10.
Tabla N°10. Porcentaje de negatividad a GP de sueros porcinos colectados
durante 1993 y 1994.
1993
1994
PRIMER SEGUNDO PRIMER
SEMESTRESEMESTRESEMESTRE
Neg.Est.%Neg.Est.%Neg.Est.%
27139668.413520864.98115951
Los sueros positivos con títulos 1:16 fueron los más abundantes en cada
semestre de estudió. Llama la atención el mayor porcentaje de sueros con
títulos 1:128 detectados en el primer semestre del 94. Figura No. 8.
83
Figura N°8: Comparación de títulos a CP durante
1993y primer semestre de 1994.
w-) 4
z
w
o
ft
03
EL
1:16
1:32
1:64
11TULO DE ANTICUERPOS
>1:128
5. DISCUSION.
La detección de anticuerpos específicos de GP, es particularmente útil en piaras
sospechosas de estar infectadas con cepas de baja virulencia, para detectar
infecciones en las hembras de reproducción, en la fase terminal de la
erradicación, en períodos intereepizooticos o con baja incidencia de la
enfermedad, Liess et.al (1976), y son imperativos si un país desea ser
reconocido internacionalmente como libre de la enfermedad.
Vanas pruebas han sido descritas para el diagnóstico de la enfermedad: Doble
difusión en agar, Fijación de complemento modificado, Hemaglutinación pasiva,
lnmunoelectrofoosmoferesis,etc. sin embargo ellas no diferencian entre
anticuerpos contra virus de CP y de DVB. Los resultados positivos tienen que
ser confirmados por la técnica de neutralización (NT), Terpstra et.al (1984).
Ccrjro deCumcn:Ó(
CEISA
85
La NT fué considerada como la única prueba serológica válida en la comunidad
europea para los programas de control y erradicación del GP. Se realiza en
cultivos celulares empleando una cantidad constante de virus con varias
diluciones de suero; debido a que el virus de CP no produce efecto citopético,
cualquier virus no neutralizado tiene que ser diferenciado por el método de END,
Shimizu and Shimizu (1983), inmunofluorescencia, Ressang and Van Bekkun
(1973); Liess et.al (1984), o por Inmunoperoxidasa, Terpstra et.al (1984).
Un inconveniente en la interpretación de resultados obtenidos por la
neutralización (Nt), es que ocasionalmente los sueros de cerdos infectados con
el virus de DVB pueden reaccionar en bajas diluciones con antígeno de CP,
Liess et.al (1977); el grado de reactividad cruzada depende de la cepa infectante
de DVB, del intervalo entre la exposición y el muestreo y de la cepa de CP
usada para la neutralización, Liess et.al (1977).
En la industria porcina Colombiana, los diversos sistemas de manejo que se
practican facilitan las posibilidades de infección tanto con el virus del CP como
con el de DVB. En piaras tecnificadas se esperaría que el lechón recibiera su
primer estímulo a través de la vacuna del CP y que por practicarse el sistema
Irde granja cerrada, solo recibiera estímulos posteriores también con vacuna de
CP, lo cual permitiría tener la certeza de detectar exclusivamente anticuerpos
a este virus, sin embargo la tenencia de bovinos por los trabajadores de piaras
en sus viviendas, hacen que a través de fomites y del trabajador mismo,
contaminen indirectamente su lugar de trabajo con virus de DVB, de esta forma
el lechón se contaminaría desde el mismo momento del nacimiento con éste
virus.
En piaras no tecnificadas la situación es aún más complicada ya que existe
mayor posibilidad de infección con DVB cuando los propietarios o sus vecinos
tengan bovinos y se reconoce que en dichas piaras no se aplica la vacuna
contra CP.
En Colombia la infección en bovinos por el virus de la DVB ha sido comprobado
anteriormente y es reconocida la amplia e intensa promiscuidad entre especies.
Aunque se desconoce la virulencia de las cepas de CP presentes en diferentes
piaras, con base en la sospecha que son de reducida virulencia se realizó el
estudio inicial de cribado comenzando en la dilución 1:16. Al respecto Terpstra
87
et.al (1984) han sugerido que los altos niveles de anticuerpos contra GP luego
de una exposición a cepas de baja virulencia, permiten comenzar con diluciones
altas, de tal manera que se sobrepase la reactividad cruzada entre el antígeno
de GP y los anticuerpos de DVB.
La técnica de Neutralización de la Fluorescencia (NF) ha sido empleada
exitosamente en la detección de anticuerpos de CP, Liess, (1981): Loi et.al ,
(1986), no obstante, su uso rutinario en el laboratorio es restringido por lo
laborioso y delicado del procedimiento y por la presencia en algunos sueros
porcinos de anticuerpos contra el virus de la DVB, Liess, (1981). Para sortear
esos inconvenientes se han hechos modificaciones a la técnica y se han
desarrollado otras nuevas, Terpstra, (1991). La técnica de NT utilizada en este
estudio es la misma que las autoridades de los Estados Unidos emplearon en
la campaña de erradicación de la enfermedad en ese país y demuestra gran•
utilidad especialmente cuando los sueros porcinos presentan títulos bajos de
DVB. Esta técnica ha sido utiliza satisfactoriamente en estudios llevados a cabo
en este laboratorio.
88
Inicialmente cuando se estudia una gran parte de la población para detectar una
enfermedad la interpretación de la prueba se dirige hacia una mayor sensibilidad
en detrimento de la especificidad. Esto se debe a que las pruebas iniciales no
suelen ir encaminadas a lograr diagnósticos definitivos sino a detectar el mayor
número de posibles casos. Por lo tanto obtener una alta proporción de falsos
positivos (resultantes de una mayor sensibilidad) no es tan critico como obtener
una alta proporción de falsos negativos ( resultantes de una mayor
especificidad). La técnica de NT utilizada en este estudio ha demostrado una
afta sensibilidad, a pesar de los inconvenientes de su manejo el instrumento
fiable en estudios de sondeos como el presente.
En Colombia la presencia de CP se viene reconociendo desde hace más de 50
años; su diagnóstico se basó en la apreciación epidemiológica, clínica y en
algunos casos en las lesiones macroscópicas. Con la aparición de la Peste
Porcina Africana en el continente americano en 1971, se mejoraron
sustancialmente los mecanismos de diagnóstico a nivel de campo y de
laboratorio ampliando el conocimiento sobre el GP, al aumentar su casuística
general y la cobertura de la distribución geográfica. A pesar de ello, los casos
sospechosos de GP se siguen diagnosticando en el campo con base en la típica
89
forma aguda y hemorrágica de la enfermedad; por esta condición posiblemente
los casos de Cólera confirmados en el laboratorio son más bajos de los reales.
El reporte disminuido se ve agravado por el costo de las pruebas, necropsias,
transporte de carcasas y por la tendencia del dueño (especialmente de piaras
notecnificadas) a deshacerse rápidamente de aquellos animales que presentan
algunas signología de la enfermedad, sin recurrir a un diagnóstico.
La información existente sobre la epidemiología del CP se basa casi
exclusivamente en la casuística reportada por los centros de diagnóstico a
través de la división de sanidad animal del ICA. Además de los inconvenientes
anotados anteriormente, esta fuente de información adolece de otros factores
que deben considerarse cuando se toma como base el conocimiento de una
enfermedad: la ocurrencia clínica de la enfermedad, suficiente severidad para
buscar asistencia veterinaria, disponibilidad de oferta veterinaria, capacidad para
el diagnóstico, presencia de laboratorio de diagnóstico, colección y análisis de
la información. Considerando que estos factores se han mantenido estables en
el trascurso de los últimos 10 años, se ha observado en los informes la ausencia
de casos en varios departamentos del país y una fluctuación cíclica de 3 a 5
años. Desde 1989 cuando se presento un brote en el Valle del Cauca, el número
90
de casos disminuyo constantemente sin una explicación evidente; esta nueva
situación podría deberse a un aumento en el cubrimiento vacuna¡ de la
campaña, y por consiguiente de la proporción de sueros positivos y de sus
títulos, lo cual no pudo ser comprobado en el trabajo aquí reportado: de 783
sueros estudiados el 63.7% tenían títulos menores de 1:16. Además la titulación
de ellos muestra un reducido número de cifras iguales o superiores a 1:128 y en
cambio más del 78% presentaban títulos de 1:16 a 1:32. Una población porcina
con un porcentaje alto de sueros sin anticuerpos estaría expuesta a infectarse
con el virus y producir un gran brote de la enfermedad. Sin embargo la encuesta
también revelo que de las 38 granjas seleccionadas, ninguna era totalmente
negativa.
Existen factores importantes a considerar sobre esta situación: para evitar brotes
agudos clásicos, se desconoce el porcentaje de la población porcina que
debería estar protegida (inmunidad de la piara), la posible protección conferida
por anticuerpos específicos con títulos bajos Tersptra and Wensvoort (1987);
Van Bekkun (1966); la efectividad de la respuesta celular a nivel de campo para
prevenir la presencia de la enfermedad; y formas enzooticas atípicas no
reportados.
91
El número de sueros porcinos con anticuerpos específicos de GP, debe estar
dado por la vacunación, por los animales sobrevivientes a la infección con cepas
de baja virulencia, por aquellos infectados in-útero y por la tasa de supervivencia
de los anticuerpos. En el primer caso, el número de animales vacunados podría
estar relacionado con el grado de tecnificación e indirectamente con el tamaño
de la piara.
Para el control se han establecido programas de inmunización que han dado
buenos resultados, Shimizu, (1980); Terpstra,(1982), esto sugiere que la
vacunación puede ser un buen procedimiento para impedir que el virus de
campo circule y de esta manera cesen los brotes de GP. Lo opuesto se observo
en los Estados Unidos, durante la etapa de erradicación del cólera; cuando de
prohibió el uso de vacunas, el número de casos disminuyó considerablemente
indicando que la vacunación aumentaba el número de brotes, Dunne, (1975).
Con la vacunación generalmente se evita que ocurran brotes, sin embargo su
empleo no esta excento de efectos indeseables. El virus silvestre del Cólera y
el vacuna¡, pueden causar inmunosupresión del animal al multiplicarse en las
células del sistema retículo fagocitico mononuclear endotelial, Gudhay, (1976);
92
Jaeger et.al (1978) y Morilla (1985),ocasionan alteraciones marcadas en
órganos linfoides (médula ósea, timo, ganglio linfático), manifestados por
leucopenia ytrombocitopenia características de la infección. Estas alteraciones
hacen que la respuesta inmune hacia el virus y hacia otros microorganismos
disminuya considerablemente por lo que en el trascurso de la enfermedad se
presenten infecciones secundarias y septicemia.
En los animales que llegan a nacer cuando ocurren infecciones intrauterinas,
se establece un estado de tolerancia inmunológica; en este caso el virus es
capaz de multiplicarse en los lechones por períodos largos de tiempo sin
desarrollar anticuerpos ni respuesta inmune protectora.
Se ha observado que cuando hay inmunosupresión en los animales de la granja
por diversas causas (intoxicación por micotoxinas en el alimento) se presenta
exacerbación de la patogenicidad del virus del Cólera a nivel de campo así como
de las cepas vacunales ocasionando brotes de la enfermedad.
Durante el curso agudo o subagudo fatal del cólera porcino, se producen
anticuerpos, Mengeling and Packer (1969), en casos crónicos los animales que
93
finalmente mueren, también son capaces de desarrollar anticuerpos específicos
con detección simuttanea de virus, Mengeling and Packer, (1969). Los cerdos
con CP congénito persistente, rara vez, producen anticuerpos específicos y los
infectados post-natalmente no presentan respuesta normal de anticuerpos, los
neutralizantes pueden solamente ser detectables en forma temporal, Van
Oirschot (1981), presentar bajos títulos o estar ausentes Carbrey et.al (1977) ó
pueden ser detectados por otras pruebas, Corthier, et.al (1977); Van Oirschot
and Terpstra, (1977). Esta respuesta normal puede ser consecuencia de
infecciones con cepas de baja inmunogenicidad de reducida virulencia.
La existencia de una gran población porcina aparentemente desprotegida, sin
reporte de casos o con presentación muy reducida, se podría relacionar con
características propias del agente y/o del mercadeo, o quizas con factores
desconocidos en nuestro medio. Van Bekkun (1966), observo que los títulos
serológicos de cerdos inmunizados con vacuna de cristal violeta, en general
deben buena protección frente a un reto; sin embargo de 116 cerdos vacunados
que no tenían anticuerpos detectables, 33 (28%) resistieron el reto. Coggins etal
(1962) y Launais et.al (1978), han demostrado que algunos cerdos vacunados
94
que no tienen anticuerpos detectables pueden sobrevivir al reto, debido a la
rápida respuesta secundaria serológica.
Los resultados serológicos para el segundo semestre de 1994 apuntan a un
mayor porcentaje de sueros con anticuerpos y de sueros con títulos mayores,
y puesto que las campañas de vacunación no han aumentado el cubrimiento,
quizas la introducción de nuevas vacunas pueden ser el factor desencadenante
de esta observación, aunque podría haber relación con la actividad de cepas de
baja virulencia en el campo, o mejora en los servicios de atención al usuario
(diagnóstico de campo y de laboratorio). Este fenómeno se observo en otros
países cuando al aumentar la importancia dada por el médico veterinario de
campo y del porcicultor, aumentó. el número de casos reportados.
Los porcentajes de sueros sin anticuerpos fueron mayores en aquellas piaras
donde la población era menor de 175 animales. Aunque se demuestra una
diferencia significativa, los porcentajes de sueros negativos en granjas
tecnificadas también son altos (57.9%).
Corpc ko
Centro de Dccumentacj
ÇEISA
95
Es conocido que el sistema de producción, la densidad de la población porcina,
el tamaño, densidad y tipo de piaras en la región, determinan las características
de presentación del Cólera Porcino (Terpstra, 1987). Las medidas aplicadas a
su control (incluyendo vacunaciones) hacen parte del sistema de manejo
empleado por la piara, lo mismo quizás que la virulencia de las cepas de CP
actuantes y las características del sistema de transporte y mercadeo.
La variable sexo no demostró influencia en la distribución de los sueros
negativos: no hubo diferencia significativa cuando se estudio a nivel nacional,
lo mismo que cuando se hizo separadamente en granjas por población o por
tecnificación. Los factores que determinan la epizootiología del CP están
incidiendo en forma similar sobre los dos sexos.
En la distribución política (por departamento) se deben considerar factores de
confusión, sin embargo, existen claras diferencias en poblaciones sin
anticuerpos que bien podrían corroborar el hecho de que hay departamentos
que durante años no han enviado muestras sospechosas de CP para su
confirmación diagnóstica; siendo explicable su ausencia por los costos y
96
dificultades de toma y envío de muestras, por ausencia de centros de
diagnóstico o desconocimiento de la enfermedad entre otras.
Además del escaso cubrimiento en la vacunación por deficiencias institucionales
(campañas) o baja motivación del usuario, existen otros factores que disminuyen
•
la respuesta inmune:
1. Bajos títulos de la vacuna medida a nivel de laboratorio productor, aunque
este factor ha sido controlado permanentemente por el ICA, bajo las normas
establecidas son aprobados los lotes que en la prueba de potencia protejan al
80% de los animales.
2. La inactivación de la vacuna durante la cadena fría; la vacuna de GP se debe
mantener entre 2 y 4°C hasta su aplicación, el tiempo que transcurre entre su
producción, almacenaje o transporte antes de llegar a su destino final es
usualmente muy variable y puede ser una causa común de inactivación. Existen
recomendaciones muy precisas para su manejo, sin embargo se sospecha que
en muchos casos no se cumplen los requisitos mínimos.
0
97
3. En algunas ocasiones una vez aplicada la vacuna, los cerdos no desarrollan
una respuesta inmune aceptable, debido probablemente a que su calendario de
inmunización no fue adecuado ó a que los animales estaban inmunosuprimidos.
La edad para su aplicación ha sido muy variada y no obedece a estudios previos
de características ecológicas o microbiológicas del medio ambiente o
requerimientos de la piara regional. Vanos factores que inducen en los cerdos
estrés como el destete, cambios bruscos de temperatura, mezcla de animales
de diferentes edades y condiciones, alimentación restringida, exceso de ruido
o falta de espacio, presencia en la piara de cepas de CP de campo, infección
por virus de Aujeszky o por bacterias como Salmonella o Erisipela, así como
sustancias tóxicas en el alimento (micotoxinas), pueden también ocasionar
inmunosupresión a diferntes niveles en una población afectada.
6. ANTICUERPOS LIGADOS A LA PEROXIDASA
La existencia de cepas de baja virulencia del Virus del Cólera Porcino (VCP) que
causan infección crónica, atípica y algunas veces ¡naparente, ha estimulado el
desarrollo de métodos serológicos para su diagnóstico. Se implantaron
diferentes técnicas pero ninguna difenciaba entre anticuerpos contra Cólera
Porcino (CP) y Diarrea Vira¡ Bovina (DVB). El diagnóstico serológico más
confiable y clásico para el CP es la neutralización de la fluorescencia. Terpstra
et.al (1984).
Los anticuerpos de CPy DVB pueden ser diferenciados por ELISA anticuerpos
ligados a la peroxidasa que son las técnicas más comunmente usadas. Dos
diferentes procedimientos de peroxidasa han sido descritos: los anticuerpos
ligados a peroxidas (PLA) usada en células infectadas con virus del CP y fijadas
con acetona y la neutralización de peroxidasa (NPLA) que es similar a la técnica
de neutralización de la fluorescentes. La NPLA es reportada como la más
iz
específica, pero tanto la NPLA como la PLA poseen igual o mayor sensibilidad
que la neutralización de fluorescencia, Pearson,(1992).
La prueba de inmunoperoxidasa (PLA) es una técnica para detección de
anticuerpos contra los virus del Cólera Porcino y Diarrea Vira¡ Bovina, descrita
por Jensen en (1981) y modificada por Terpstra en (1984).
La prueba de lnmunoperoxidasa es sensible y específica. Los resultados
coinciden con otras técnicas de diagnóstico en un 65% de los casos; según los
resultados obtenidos por Schultheiss et.al (1993), trabajo con en herpesvirus
equino, la técnica de peroxidasa fue más efectiva que la fluorescencia sobre
tejidos. Patricia et.al (1993).
6.1. MATERIALES:
PBS.
Medio MEM.
Suero Fetal Bovino lrradido.
Suero equino.
100
Tubos de Leighton.J!IJOTECA AGOFEC1MM
rr CQWé4BJA
Pipetas eppendorf.
Virus: Se utilizó la misma cepa descrita para la técnica de Neutralización de la
Fluorescencia (NF). Pág. 60.
Suero positivo control: Idéntico a NF.
Suero negativo control: Igual que NF.
Conjugado específico: Anti p19 Ig G conjugada con peroxidasa (Sigma),
desarrollado en conejos.
Cultivo celular: Igual a la técnica de NF.
Sueros en estudio: Se tomaron 123 sueros negativos (1:32) y 32 sueros
positivos por la técnica de NF. Cada suero, incluyendo controles positivos y
negativos se trataron con Kaolín al 25%, pH 7.4 con el fin de eliminar
sustancias inespecíficas.(Anexo G).
Bloqueadores de peroxidasa endógena: Metano¡ absoluto más peróxido de
hidrógeno al 30%; suero de conejo diluido en tris salina; agua destilada; suero
normal de conejo diluido en tris. (Anexo F.)
Diluyente: para lavados y diluciones de suero y de peroxidasa, se utilizó tris
salina, pH 7.6 (Anexo E.).
9.
:Corp
Centro de Documentación
CEfS,ó
101
Sustrato: 3.3. diaminobencidina tetrahidrodoilda, (Sigma), diluida en tris, pH 7,6
y peróxido de hidrógeno al 30% (Anexo F).
Colorante de contraste: Hematoxilina de Meyer's. Luna (1968).
Deshidratantes: Agua amoniacal al 1%, alcohol etílico (absoluto, 90% y 80%)
y tres cambios en xilol absoluto.
6.2. MODIFICACIONES REALIZADAS A LA TECNICA
Para adaptar está técnica de PLA hubo que superar muchos obstaculos:
Escoger la línea celular más adecuada; para ello se probó con ST, MBDK,
PK1 5 y Fibroblastos de pollo (cultivo primario), las líneas diferentes a PK1 5
no dieron buenos resultados debido a que en los lavados se desprendían o
en su mantenimiento se degeneraban rapidamente. Terpstra et.al (1984).
Se realizó tratamiento de los sueros para eliminar inespecificidades; se
trataron con HCI, NaOH, Cloroformo, absorción con células usadas o en
suspensión y Kaolín al 25% paraa eliminar la coloración de fondo, ya que los
sueros no tratados (Kaolín) presentaron coloración café tanto en el núcleo
102
como en el citoplasma, mientras que los tratados no. Torres y González
(1993); Meador et.al (1986); Hanssen (1980).
Para diluirla peroxidasa se utilizarón diferentes soluciones con diversos tipos
de suero (porcino, cabra y conejo), el mejor resultado se obtuvo con el suero
de la misma especie en la que se produjó la Anti-lgG, en este caso suero de
conejo, Meador et.al (1986).
Como fijadores se ensayo formol al 4% y 10%, glutaraldehido, calor (70 a
80°C) y acetona al 67%, 20% y 37%; ellos fijaban las células pero parece que
interferian en reacción de la peroxidasa. La acetona al 37% no interfirió y
permitió un mejor resultado. Terpstra et.al (1984); OlE Manual (1990);
Hanssen (1980).
• Al iniciar el proceso se realizó la prueba en placas de poliestileno, Terpstra
et.al (1984), pero existió el problema que las células no se adherian o cuando
se lela la prueba no se podian interpretar por la gran coloración inespecífica
que tomaban los orificios correspondiente a los sueros problema y a algunos
103
controles; por último se decidió realizar la prueba en laminillas de vidrio (tubos
de leighton) ya que se eliminaba inespecífidad.
6.3. METODO:
Se siguió la metodología descrita por Tersptra (1984) con las modificaciones
descritas por Meador et.al (1986) para Brucella abortus sobre tejidos (Anexo 1):
No se emplearon bandejas de plástico, sino tubos de Leighton con laminilla.
El procedimiento fue idéntico al seguido para la NF antes de la infección de
la monocapa.
Infectar los tubos con 100 dosis TC de virus de CP.
Con cada prueba se hizo titulación de virus empleando 2 laminillas por
dilución para corroborar la Dl 50CC.
Incubar una hora a 37°C, agitando cada 15 minutos.
Adicionar a cada tubo 1.7 ml de MEM e incubar nuevamente, durante 72
horas a 37°C.
Retirar las laminillas y lavar una vez con PBS para inmunoperoxidasa.
Anexo E.
104
Fijar con acetona diluida en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Anexo E.
Lavar durante 10 minutos con agua desmineralizada y durante 30 minutos
con metano¡ y peróxido. Anexo F.
Lavar nuevamente en PBS durante 5 minutos y 10 minutos con tris-salina
buffer pH 7.6. Anexo E.
Sumergir en una dilución de suero de conejo en tris salina, por 20 minutos.
Anexo F.
Colocar las laminillas en cámara húmeda y adicionar a cada una 50
ILl
de
sueros controles y problemas (dos laminillas por titulación y dilución de suero
problema), incubar 1 hora a 4°C. Anexo O.
Lavar durante 10 minutos en Buffer Tris salina.
la Agregar a cada laminilla 50 pl de antilgG marcada con peroxidasa, diluida
1:200, e incubar 1 hora a 37°C, en cámara húmeda.
Lavar con tris salina por 10 minutos.
Cubrir con 50 1d de diaminobencidina diluida en solución de tris pH 7.6 yagua
oxigenada durante 5 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente.
Anexo F.
o Lavar con agua destilada por 10 minutos.
105
Colocar en hematoxilina de Meyer's durante 10 minutos, y lavar con agua
destilada por 10 minutos.
o Sumergir por agua amoniacal al 1% hasta que tome una coloración
ligeramente azul. Repetir el lavado con agua destilada por 10 minutos.
Deshidratar las laminillas en etanol absoluto, etanol al 90% y etanol al 80%,
cinco minutos cada vez.
Escurrir y fuego hacer tres cambios consecutivos en xilol y montar con
permaunt sobre portaobjetos
6.4. INTERPRETACION:
Se consideró un suero como positivo 1:32 (con anticuerpos) cuando el
citoplasma de las células infectadas presentó una coloración café, donde resalta
la presencia de gránulos de un tono, más intenso. El título del suero
corresponde a la dilución más alta que presente esta coloración.
Se consideró un suero negativo 1:32 (sin anticuerpos) cuando el citoplasma de
las células infectadas presentaba una coloración azul (coloración de contraste)
sin presentar gránulos. Ver Fotografía N°3 y 4.
flr
••
z.
*
fr4
1
_.4••_ ,_.c
--
-
-
-.
-£
Fotografía N°3. Peroxidasa Positiva.
r-- .—:
-,---
_.l.
Fotografía N04. Peroxidasa Negativa.
Centro de Docn1e0Ofl
çjSA
7. RESULTADOS Y DISCUSION INMUNOPEROXIDASA
De un total de 155 sueros estudiados por la prueba de Inmunofluorescencia 86
fueron positivos en diferentes diluciones así: 21 en 1:32, 3 en 1:64 y 8 en
>1:128 y 123 sueros fueron negativos ó presentan títulos inferiores a 1:32. Ver
tabla N°11 y Figura N°9.
Al analizar la prueba de peroxidasa sobres estos mismos sueros se hallo que 48
fueron positivos en dilución 1:32, 30 en 1:64, 29 en >1:128, 48 fueron negativos
o menores de 1:32.
Promedio geométrico: AF 34.82
PLA 47.41
Los promedios geométricos de los sueros analizados indican una diferencia
estadística significativa.
rr
riul
Figura N°9: Comparación de títulos por FAVN y PLA
TECNICAS
o Ac Fbocorto
•
&
6
5
w
LU
CC
2
<132
132
t64
TITULO DE ANTICUERPOS
'••
>1126
109
Tabla N°11. Porcentaje de comparación de títulos al GP por las técnicas de
anticuerpos fluorescentes y anticuerpos ligados a peroxidasa en 155 sueros
porcinos.
Anticuerpos Fluorescentes Peroxidasa
TITULON° SuerosPorcentajeN° Suero Porcentaje
> 1:3212379.34831.0
1:322113.54831.0
1:643 2.03019.3
>1:1288 5.22918.7
TOTAL155
155
En total se obtuvieron por la prueba de AF 32 sueros positivos12
y negativos.
Por la prueba de peroxidasa 107 sueros (69%) fueron positivos y 48 negativos
(31%).
Podemos observar por los resultados obtenidos que la prueba de peroxidasa
detecta mayor número de sueros positivos.
110
Tabla N°12. Coincidencia por títulos entre las técnicas de inmunofluorescencia
y anticuerpos ligados a peroxidasa, sobre 155 sueros analizados.
Por algún tiempo la detección de anticuerpos específicos del GP se basó en la
técnica de neutralización de la fluorescencia. Su uso se consideró de gran
utilidad en sondeos de poblaciones, sin embargo el hecho de ser una técnica
que requiere trabajo especializado y ciudadoso, de requerir un microscopio
específico y de reconocer la reacción cruzada con otros pestivirus, planteó la
necesidad de desarrollar nuevas técnicas que puedieran superar esos
obstáculos.
111
Como consecuencia de esas inquietudes se ha desarrollado una técnica que
basada fundamentalmente en los mismos principios es aparentemente fácil de
realizar y quizas sea más sensible y específica.
La sensibilidad, especifidad, reproducibilidad y precisión de cualquier enayo
inmunoenzimático depende de su diseño, anticuerpos, enzimas, método de
medición de la enzima y del conjugado (anticuerpo- enzima). Estos puntos
constituyen factores limitantes de tales pruebas.
La técnica de anticuerpos marcados con enzimas es similar en principio a la
técnica de inmunofluorescencia, pero usa gammaglobutina antiespecie unida en
forma covalente a la enzima peroxidasa, en vez de gammaglobulina antiespecie
unida con varios componentes fluorescentes.
Los resultados del desarrollo de la técnica de IP estudiados, permiten visualizar
la presencia del virus en forma de focos, lo que favorece un cálculo más preciso,
esta característica se observa con la fluorescencia y fué básicamente la
metodología sugerida por el departamento de Salud Animal en los Estados
Unidos.
112
La lectura se realiza bajo microscopio de luz, dando economicamente una
ventaja sobre la prueba de fluorescencia y tambien mantenidas a temperatura
ambiente pueden ser leídas por un tiempo prolongado; sin que se observe
deterioro en el color.
Una vez infectadas las laminillas, la técnica de peroxidasa se realiza en
condiciones de menos esterilidad.
Al igual que la técnica de fluorescencia la peroxidasa en cuestión, requiere
personal especializado para su realización.
Bajo condiciones específicas de ejecución la técnica de peroxidasa, se observó
una mayor sensibilidad en comparación con la técnica de la fluorescencia.
La mayor capacidad de la técnica para detectar sueros con bajos títulos
aseguraría la posobilidad de sobrepasar aquellos títulos producidos por
infecciones con el virus de DVB y ampliando su utilidad en nuestro país donde
la presencia del virus de DVB en bovinos y la promiscuidad de las especies es
muy frecuente.
1 cn", y o
C
111
Ir
n
Centro de DocumntaCiófl
CEISA
113
Sin embargo se hace necesario, continuar el mejoramiento de la técnica para
sugerir su empleo en forma rutinaria.
Se reconoce que para su ejecución es necesariop el uso de sustancias que
acarrean algun grado de peligro para el laboratorista, además de que en general
es más costosa que la fluorescencia. Se debería evitar el tratamiento de los
sueros a estudiar, e insistir en la implementación de la técnica en bandejas
plásticas de 96 orificios.
8. CONCLUSIONES GENERALES
La técnica de Neutralización de la Fluorescencia se emplea exitosamente, pero
su uso es restringido por lo laborioso y delicado del procedimiento.
El alto número de sueros negativos a la dilución seleccionada sugiere la
presencia de una población porcina expuesta a infectarse con el virus y a la
presentación de brotes de la enfermedad.
El sexo no influyó en la distribución de los sueros negativos, contrario a lo
observado en el estudio de la tecniflcación, en la piaras con poca tecnificación
presentaron mayores porcentajes de sueros sin anticuerpos.
115
Posiblemente existen otros mecanismos protectivos diferentes a los anticuerpos
específicos ó títulos bajos de anticuerpos que impiden alta mortalidad en las
piaras infectadas.
La técnica de inmunoperoxidasa es una posibilidad de remplazo de la
Neutralización de Fluorescencia, pero su realización es muy dispendiosa. Se
obtuvo mayor porcentaje de sueros positivos por esta prueba en comparación
a los obtenidos por Neutralización de la Fluorescencia, indicando una mayor
sensibilidad, sin embargo son necesarios mayores estudios para su aplicación
en el diagnóstico serológico del CP.
Las dos pruebas realizadas, peroxidasa y fluorescencia requieren mantener
cultivos celulares libres de antígeno y de anticuerpos contra Diarrea Vira¡
Bovina.
e18LIOTECA AGROPECUARIA
¶! ftCM#
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ANEXOS
129
ANEXO A. REACTIVOS PARA EL MEDIO DE CULTIVO
ANFOTERICINA
Formula:
Anfotericina
NaOH IN.
Agua destilada
Filtrar millipore.
0.0163 gr.
7.5 ml.
500 ml.
BICARBONATO
Formula:
Bicarbonato
Agua destilada
Autoclave 15 minutos.
Mantener en nevera.
37.5 gr.
500 ml.
GLtJTAMINA
Formula
Glutamina45 gr.
NaCI 12,75 gr.
Agua destilada1500 ml.
Filtrar millipore
HIDROXIDO DE SODIO IN.
Formula:
8gr.
NaOH
Agua destilada
200m1.
Mantener en nevera.
130
ANEXO B. REACTIVOS CULTIVO DE CELULAS
MEM
MEM
ANE
Anfotericina
Penicilina
Streptomicina
Bicarbonato
Agua destilada
10 sobres.
100 MI500 ml.
2000000
1 gr.
1 gr.
10L.
Filtrar millipore
Mantener en nevera.
Incubar 37°C por 72 horas.
PBS CONCENTRADO
NaCI
KCI
Na2HPO4
KH2PO4
Glucosa
Rojo fenol
NaHCO3
Agua destilada
320 gr.
16 gr.
1.92 gr.
2.4 gr.
80 gr.
0.800 gr.
12 gr.
4 L.
PBS DILUIDO
PBS concentrado 1 L.
Agua destilada9 L.
Fittrar millipore
Incubar 37°C por 72 horas.
131
ANEXO C. REACTIVOS.
PENICILINA - ESTREPTOMICINA
Formula:
Penicilina G sódica 20 frascos de 1000000 c/u.
Estreptomicina10 gr.
Agua destilada200 ml.
Filtrar millipore
Congelar.
TRIPSINA VERSENO
Formula:
NaCI 8 gr.
KCI
0.4 gr.
Na2HPO4 anhidro 0.04 gr.
KH2PO40.06 gr.
Glucosa2 gr.
Versene2 gr.
Tripsina3 gr.
NaHCO35 gr.
Rojo de fenol0.020 gr.
Agua destilada1000 ml.
Filtrar millipore
Mantener congelada.
132
ANEXO O. REACTIVOS FLUORESCENCIA
SOLUCION A:
NaH2PO4 H2027.6 gr.
Completar con Agua destilada a 1000 ml.
SOLUCION B:
28,4 gr.
Na2HPO4
Completar con Agua destilada a 1000 ml.
SOLUCION SALINA BUFERADA FOSFATADA (PBS), pH 7.2
140 ml.
Solución A
360 ml.
Solución B
Agua destilada 500 ml.
Ajustar pH a 7.2 - 7.4
Se recomienda preparar al momento de realizar la prueba.
GLICERINA BUFERADA
1 Parte de glicerina
1 Parte de PBS
AZUL DE EVANS
Solución madre:
Azul de Evans 5gr.
Agua destilada 200 ml.
Solución de trabajo:
Solución Madre1 ml.
PBS fluores. 49 ml.
133
ANEXO E. REACTIVOS DE PEROXIDASA
SALINA BUFERADA FOSFATADA (PBS) 0.011111 pH 7.6
Na2HPO42 gr.
NaH2PO4 H200.18 gr.
#NaCI8.5 gr.
Agua destiladaIL
Ajustar pH7.6
SOLUCION SALINA 0.85 % pH 7.6
NaCI8.5 gr.
Agua destilada1000 ml.
TRIS 0.05 M pH 7.6
Trizma
6.050 gr.
Agua destilada
1000 ml.
SOLUCION DE TRABAJO TRIS - SALINA pH 7.6
1 Parte Tris 0.05M
9 Partes Solución salina 0.85%
Ajustar pH 7.6
Se recomienda prepararlo en el momento de usar.
TRIS 1 M pH 7.6
Trizma
12.19 gr.
HCL2N35 ml.
Completar con agua destilada a 1000 ml.
Ajustar pH 7.6
SOLUCION FIJADORA
7 Partes de PBS pH 7.6
4 Partes de acetona
Lo
Centro de Dm e fl t0
CESA
ANEXO F. REACTIVOS DE PEROXIDASA
BLOQUEADORES DE PEROXIDASAS ENDOGENAS
1. SOLUCION DE BURNS
Peroxido de Hidrogeno1.3 ml.
Metano¡ absoluto38.7 ml.
2. SUERO DE CONEJO
Suero de Conejo0.52 ml.
Tris-Salina pH 7.640 ml.
SUSTRATO
Tris 1 pH 7.6 10 ml.
Peroxido de Hidrogeno10111.
Diaminobenzidina10 gr.
Filtrar.
Se recomienda preparar en la oscuridad, 10 minutos antes de su uso.
ACIDO CLORHIDRICO 2N
16.6 ml
HC1
Agua destilada 100 ml.
134
135
ANEXO G. TRATAMIENTO DE SUEROS PROBLEMA
SOLUCION DE VERONAL
Acido dietilbarbitu rico
Barbiturato de sodio
MgCl2 6H20
CaCl2 121-120
NaCI
Agua destilada
2.875 gr.
1.875 gr.
0.840 gr.
0.185 gr.
42.5 gr.
1000 ml.
Ajustar pH 7.4
Autoclavar 10 minutos a 10 libras de presión.
KAOLIN 25%
Kaolin
Solución veronal
SUEROS:
Dilución 1:4
100 lil de suero
300 lil de KaoIín.
25 gr.
100 ml.
136
ANEXO H. TECNICA DE FLUORESCENCIA
Sacar laminillas tubos de leighton
Lavar PBS
Fijar con acetona qumicamente pura
20 minutos a 4°C
Adicionar 50l de conjugado:
Anti-cólera porcino marcado
fluoresceina.
con tiocinato
íe
Incubar 40 minutos a 37°C
En camara húmeda
Lavar 2 veces con PBS
y 1 vez con agua destilada
por 5 minutos cada vez.
Adicionar 50l de Azul de Evans
dilución 1:20000 por 3 minutos
Repetir lavado anterior
Montar
(buffer glicerina)
( 'a
-j
4
1,
Contra de
Docurnnt1
137
C
ANEXO U. TECNICA DE PEROXIDASA
Sacar laminillas tubos de leighton.
Lavar en PBS
Fijar 20 minutos a temperatura ambiente
Lavar 10 minutos con agua destilada.
Bloquear metano¡
30 minutos
Lavar 5 minutos en PBS y 10 en TrisSaAmfla
Adicionar suero de conejo diluido en
Tris salina por 20 minutos a T.A.
Anticuerpo primario diluido en Tris- Salina
más 1% de suero de conejo
Incubar 1 hora a 4°C en camara humeda.
Lavar 1 vez con tus-salina 10 minutos.
Adicionar peroxidasa diluida
Incubar 1 hora a 37°C en camara humeda
Lavar tris-salina por 10 minutos
Adicionar sustrato por 5 minutos
Lavar agua destfda por 10 minutos
Pasar por Hematoxilia de Meyers por 10 mm.
Lavar con agua destilada
Pasar por agua amoniacal 5 minutos
Repetir lavado Deshidratar por alcoholes:
absoluto, 90%, 80%
Tres pases por
Montar en Permaunt.
OT4AGOPE
CUAIA