Download Díaz de Arce, H. y Pérez, LJ (2008). Detection of

AGO1014_REDVET
Virus de la peste porcina clásica: una amenaza vigente
Avila Sánchez, M.1, Fernández López, M.G2 y Barrera Valle, M.1
RESUMEN
La Peste Porcina Clásica (PPC), es la enfermedad viral más importante de la producción
porcina mundial, debido a su gran poder de diseminación y elevada morbilidad y mortalidad,
que provoca grandes pérdidas económicas. Es una enfermedad altamente contagiosa y a
menudo fatal, que afecta a cerdos domésticos y jabalíes. Es causada por el virus de la peste
porcina clásica (VPPC), que pertenece a la Familia Flaviviridae, género Pestivirus. El VPPC
provoca severa leucopenia, trombosis, daño endotelial e inmunosupresión, predisponiendo a
infecciones secundarias. La enfermedad se caracterizada por fiebre alta, lesiones
hemorrágicas y petequias de los órganos. El virus puede cruzar la placenta de cerdas
gestantes y está presente en la mayoría de las secreciones y excreciones incluyendo el
semen de verracos, por lo que resulta muy importante el diagnóstico rápido de esta
enfermedad. El aislamiento viral y la detección de anticuerpos que neutralizan al VPPC
requieren cultivo de células y por tanto, tiempo para obtener los resultados; los ensayos
inmunoenzimáticos están mejor disponibles para el monitoreo de un gran número de
muestras. Otros métodos para el diagnóstico rápido del VPPC son los inmunohistoquímicos
y la Reacción en Cadena de la Polimerasa por Reverso Transcriptasa (RT-PCR, siglas en
inglés). La RT-PCR es el método más sensible para la detección del VPPC. Se han descrito
varios métodos para la detección de ácidos nucleicos por Real time RT-PCR, los más
usados son los que emplean SYBR Green y las sondas TaqMan. Es muy importante para el
control de la PPC el desarrollo y uso de vacunas marcadas.
Palabras clave: virus de la peste porcina clásica, diagnóstico virológico, PCR
Classical Swine Fever Virus: a current threat
SUMMARY
Classical swine fever (CSF) is the most important viral disease of pig worldwide production,
due to its widespread distribution and the hight morbility and mortality which cause
substantial economical losses. CSF is highly contagious and often a fatal viral disease of
domestic pigs and wild boar. It is caused by the Classical Swine Fever Virus (CSFV)
belonging to the family Flaviviridae, genus Pestivirus. CSFV causes a severe leukopenia,
thrombosis, endothelial damage and immunosuppression leading to secondary infections.
The disease is characterized by high fever, haemorrhagic lesions and petechiation of organs.
The virus can cross the placenta in pregnant sows and it is present in most secretions and
excretions, including the boar semen; hence the rapid diagnostic of CSFV is very important.
The virus isolation and detection of virus neutralising antibodies requiere cell cultures, hence
are time-consuming for obtaining the results, enzyme immuno-assays are better suited for
screening large series of samples. Other methods for a rapid diagnostic are
immunohistochemistry and the reverse transcription-polymerase chain reaction. RT-PCR is
the most sensitive method for the detection of CSFV. Many methods have been developed
for detecting acid nucleic for real time RT-PCR. The most used are those using SYBR Green
and TaqMan probes. For the control of CSF, the development and use of marker vaccines
are very important.
Key words: classical swine fever virus, virological diagnostic, PCR
INTRODUCCIÓN
1
La Peste Porcina Clásica (PPC) es la enfermedad viral más importante de la producción
porcina mundial, debido a su gran poder de diseminación, su carácter transfronterizo y la
elevada morbilidad y mortalidad que provoca, afectando al ganado porcino tanto doméstico
como salvaje (Paton y Greiser-Wilke, 2003; de Rolo et al., 2004). Los primeros reportes de
esta enfermedad datan del año 1830 en Midwestern, Estados Unidos (Hanson, 1957).
El agente etiológico es el virus de la peste porcina clásica (VPPC), que pertenece a la
familia Flaviviridae, género Pestivirus, en el que se encuentran, además, el virus de la
diarrea viral bovina tipos 1 y 2 (VDVB-1 y VDVB-2) y el virus de la enfermedad de la frontera
(VEF) (Fauquet et al., 2005; Thiel et al., 2005). La estrecha relación antigénica entre estos
agentes virales, así como la susceptibilidad de los cerdos a ellos puede complicar el
diagnóstico de laboratorio, por lo que en un ensayo inmunoenzimático sobre fase sólida
(ELISA, siglas en inglés) es necesario el empleo de un anticuerpo monoclonal específico
contra el VPPC (Wensvoort et al., 1988; Leforban et al., 1990; van Rijn, 2007).
El diagnóstico de laboratorio del VPPC está basado en la identificación del agente infeccioso
por aislamiento viral en cultivos celulares. La detección de antígenos virales se puede
realizar mediante la IFD, la IPD y también se emplea la técnica de ELISA. La Reacción en
Cadena de la Polimerasa-Reverso Transcripción (RT-PCR, siglas en inglés) permite la
detección del ácido nucleico y es considerado el método más sensible para la detección del
VPPC (Dewulf et al., 2004; Handel et al., 2004). Se han descrito varios métodos para la
detección de ácidos nucleicos por Real-time PCR, los más usados son los que emplean el
marcaje directo de los productos de amplificación con SYBR Green y las sondas TaqMan
(Greiser-Wilke et al., 2007).
Dos técnicas sensibles usadas para la detección de anticuerpos contra el VPPC son la virus
neutralización ligada a la fluorescencia (FAVN, siglas en inglés) y la prueba de
neutralización ligada a la peroxidasa (NPLA, siglas en inglés) (Wensvoort et al., 1988). Sin
embargo, no son fácilmente aplicables para el monitoreo de un gran número de muestras
porque requieren necesidades de cultivos de células, y por tanto consumen mucho tiempo
(Manual de la OIE, 2008a)
Para la selección de la técnica a emplear se debe tener en cuenta la situación
epidemiológica del lugar y los programas de vacunación que se aplican (Islas et al., 1997).
La detección de anticuerpos por ELISA en el caso del VPPC ha sido ampliamente utilizada
para el monitoreo de animales infectados en países libres donde no se vacuna, así como, en
los programas de erradicación para la evaluación de la presencia de anticuerpos durante y
después de un brote una vez que se levanta la vacunación (de Smit et al., 1999) y para el
monitoreo de las infecciones de PPC en jabalíes (Vengust et al., 2006). También se ha
utilizado para determinar la proporción de seroreactores en cerdos vacunados con la
proteína E2, como medida del estatus inmune del rebaño (Tepstra y Wensvoort, 1987) y en
jabalíes vacunados con la vacuna atenuada “C” (Kaden et al., 2000).
En Cuba, la PPC es endémica y para su control se aplica un programa basado en la
vacunación con una cepa viva atenuada (Labiofam S.A) el cual logró un silencio epizoótico
de más de 25 años, hasta que en 1993 la enfermedad reemergió ante condiciones
económicas desfavorables (Díaz de Arce et al., 1999).
El presente trabajo tiene como objetivo abarcar todo lo relacionados con el VPPC, reunir el
nuevo conocimiento publicado sobre la PPC relacionado con su agente etiológico,
epidemiología, patogénesis, control, con un mayor énfasis en el diagnóstico. Poder transmitir
los aspectos de mayor interés y que se conozcan los avances más recientes internacionales
como nacionales en esta temática. Pretendemos que este texto se convierta en una fuente
actualizada de consulta, que ayude a enriquecer los aspectos tratados y sea útil para los
interesados en el tema.
2
DESARROLLO
1. Virus de la Peste Porcina Clásica.
1.1. Clasificación taxonómica.
El Virus de la Peste Porcina Clásica (VPPC), junto al Virus de la Diarrea Viral Bovina tipo 1 y
2 (VDVB-1 y VDVB-2) y el Virus de la Enfermedad de la Frontera (VEF) integran el género
Pestivirus (Becher et al., 2003; ICTV, 2006; Le Potier et al., 2006), antes clasificado dentro
de la familia Togaviridae (Westaway et al., 1985). La homología entre secuencias, la
polaridad y organización del genoma, además de la estrategia de replicación, ha permitido
incluir el género Pestivirus en la familia Flaviviridae, junto con los géneros Flavivirus y
Hepacivirus (Francki et al., 1991; Garry y Dash, 2003). Pestivirus caracterizados de oveja,
jirafa y otros rumiantes indican diversidad adicional dentro del género. En efecto, un
pestivirus de jirafa (cepa H38) ha sido incluido como especie tentativa del género Pestivirus
(Thiel et al., 2005). El VPPC está dividido en tres genotipos (1, 2 y 3), y cada uno de ellos
está dividido en tres o cuatro subgrupos (1.1-1.3, 2.1-2.3, 3.1-3.4) (Paton et al., 2000; Tu et
al., 2001 y Li et al., 2006).
1.2. Características biológicas.
El VPPC es envuelto, esférico, tiene un diámetro de 40-60 nm y una nucleocápsida de
simetría icosahédrica (Knipe et al., 2001). El material genético consiste en una molécula de
ácido ribonucleico (ARN) de simple cadena de polaridad positiva (ARNss(+)), con un tamaño
aproximado de 12,3 kb (Lazar et al., 2003; Reimann et al., 2004).
Es un virus muy estable en el rango de pH entre 5-10, a temperaturas de -20 ºC y -70 ºC y
liofilizado. Es sensible a la acción de radiación ultravioleta y las enzimas proteolíticas; la
tripsina produce una inactivación moderada de la infectividad (Terpstra, 1991).
Debido a la presencia de la envoltura lipídica, el virus se inactiva rápidamente con solventes
orgánicos como cloroformo, éter y con los detergentes Nonidet P-40, desoxicolato y
saponina (van Oirschot, 1999).
1.3. Organización del genoma.
El genoma posee un único marco abierto de lectura (ORF, siglas en inglés), flanqueado por
dos regiones no codificadoras (UTR, siglas en inglés), una en el extremo 5´ (5´UTR) y la otra
en el extremo 3´ (3´UTR). La 5´UTR contiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES,
siglas en inglés), importante para la iniciación de la traducción (Ruggli et al., 2003). El ORF
codifica para una poliproteína de aproximadamente 3900 aminoácidos, la cual se somete a
procesamientos co- y post-traduccional (Rice, 1996) por proteasas virales y celulares, para
rendir 12 proteínas maduras (Meyers y Thiel, 1996, Reimann et al., 2004), de las cuales, 4
corresponden a proteínas estructurales y 8 a proteínas no estructurales, dispuestas en el
orden siguiente: NH2 / Npro / C / Erns / E1 / E2 / p7 / NS2-3 / NS4A / NS4B / NS5A-B / COOH,
donde NS2-3 puede ser procesada para rendir NS2 y NS3 (Meyers y Thiel, 1996).
Los genes que codifican para las proteínas estructurales se encuentran hacia el extremo 5´
del genoma. Por el contrario, los genes que codifican para las proteínas no estructurales
están localizados hacia la región 3´ (Liu et al., 1998) y según un estudio realizado por Wong
et al., (1998) con el VPPC cepa LPC, esta región consta de 3431 nucleótidos que codifican
para una secuencia aminoacídica conservada entre los representantes del género Pestivirus
con un 85 a un 95% de identidad.
3
1.4.
1.4.1.
Proteínas virales.
Proteínas no estructurales.
La primera proteína codificada en el ORF del VPPC es la Npro que tiene actividad
autoproteolítica (Rümenapf et al., 1998). Es una cisteína proteasa de 19-23 kDa, que corta
entre los aminoácidos Cys-168 y Ser-169 de la poliproteína viral, lo cual genera el extremo
amino terminal de la proteína C de la cápsida (Stark et al., 1993; Mayer et al., 2004).
Funciona como un antagonista de la inducción de interferón α/β, independientemente de la
presencia de otros elementos virales (La Rocca et al., 2005; Hilton et al., 2006).
Las proteínas no estructurales NS2 y NS3 proceden de la maduración del precursor NS2-3
de 120 kDa (Thiel et al., 1991). NS2 es una autoproteasa que se asocia con una chaperona
celular llamada Jiv (J-domain protein interacting with viral protein, siglas en inglés) y separa
la proteína NS2-3 en NS2 y NS3 (Lackner et al., 2004), además tiene una función
reguladora de la replicación, impidiendo la acumulación incontrolada del ARN en la célula
hospedante (Moser et al., 1999). La proteína NS3 es una proteasa que utiliza como cofactor
a la NS4A, la cual se asocia al extremo N-terminal de NS3 para escindir las proteínas virales
consecutivas (Tautz et al., 2000).
La proteína NS5A tiene propiedades hidrofóbicas (Ganges et al., 2005) y la proteína NS5B
ha sido identificada como una ARN polimerasa ARN dependiente. Esta última tiene tres
dominios conservados: i) dominio con actividad metil transferasa ii) dominio de unión de
nucleótidos y iii) dominio de unión de la polimerasa (Wong et al., 1998).
1.4.2.
Proteínas estructurales.
La proteína C de la cápsida, con un peso molecular de 14 kDa, representa una importante
diana de la reacción inmune del hospedante y también se le atribuyen funciones en la
regulación de la expresión y maduración del virión (Liu et al., 1998). A continuación, se
localiza una secuencia que codifica para un péptido señal que media la translocación de las
tres glicoproteínas estructurales que le siguen: Erns (44-48 kDa), E1 (33 kDa) y E2 (51-55
kDa) (Thiel et al., 1991).
La proteína Erns se sitúa en la envoltura del virus, carece de dominio de anclaje
transmembrana y se secreta en grandes cantidades por las células infectadas,
principalmente como un homodímero de 100 kDa, estabilizado por puentes disulfuro
(Branza–Nichita et al., 2004). Se le considera la segunda glicoproteína que media la
neutralización viral (Lazar et al., 2003). Presenta actividad ribonucleasa y estudios in vitro
han mostrado que la Erns extracelular induce la apoptosis en los linfocitos, lo que indica que
contribuye a la acción inmunosupresora de los Pestivirus (Bruschke et al., 1997). Posee
además, la capacidad de translocación a través de la membrana de las células eucariota
debido a su dominio C-terminal y la capacidad de provocar inhibición de la respuesta celular
inducida por el ARN de doble cadena (Iqbal et al., 2004).
La proteína E1 presenta dominios transmembrana y generalmente forma heterodímeros con
la proteína E2. Tiene propiedades hidrofóbicas y puede funcionar como anclaje para la E2
(Weiland et al., 1990). La glicoproteína E2 se considera esencial para la replicación del
VPPC ya que mutantes que contienen una parcial o completa delección del gen E2 no se
replican (van Gennip et al., 2002).
1.4.2.1. Características de la glicoproteína E2.
4
La proteína E2 se considera la principal glicoproteína presente en la envoltura del VPPC. Se
encuentra localizada entre los residuos de aminoácidos 690 al 1060 del ORF viral (Meyers
et al., 1989; Moormann et al., 1990). Se puede encontrar formando un heterodímero con E1
o un homodímero E2-E2, ambos estabilizados por puentes disulfuros (Weiland et al., 1990).
Muchos de los puentes disulfuros intramoleculares de E2 se forman durante la traducción en
la cadena del polipéptido naciente, mientras que los puentes disulfuros intermoleculares se
forman más tardíamente (Branza-Nichita et al., 2001). La E2 es la proteína más
inmunogénica de las presentes en la envoltura viral e induce una respuesta inmune
suficiente para conferir protección frente al VPPC en cerdos (König et al., 1995; Dong y
Chen, 2007).
La glicoproteína E2 nativa tiene una estructura terciaria compleja, con cuatro puentes
disulfuro intracatenarios, seis sitios potenciales de glicosilación y muchos puentes disulfuro
intracatenarios que estabilizan la estructura antigénica conformacional y homodimérica (van
Rijn et al., 1994; Ganges et al., 2005; Risatti et al., 2005). Utilizando un panel de anticuerpos
monoclonales contra la proteína E2 de la cepa Brescia del VPPC, se han identificado cuatro
dominios antigénicos denominados desde la A hasta la D. Estos dominios se localizan hacia
el extremo N-terminal de la E2. El extremo N-terminal queda muy expuesto en la superficie
del virión y se considera fundamental en la neutralización del virus (Wensvoort, 1989).
El domino A se divide en los subdominios A1, A2, y A3, de los cuales A1 y A2 están muy
conservados en casi todas las cepas del VPPC, mientras que el A3 es más variable
(Wensvoort, 1989). El subdominio A1 y los dominio B, C son neutralizantes. Recientemente,
han sido identificados epítopes neutralizantes lineales en estos dominios (Dong y Chen,
2006a, 2006b; Dong et al., 2006; Zhang et al., 2006).Las secuencias correspondientes a los
dominios B, C y D son menos conservadas entre las distintas cepas del VPPC (Paton et al.,
1992; van Rijn et al., 1993).
Las cisteínas localizadas en el extremo N-terminal de la proteína E2 son esenciales para la
conformación de los epítopes neutralizantes y están conservadas en casi todos los
Pestivirus. Se ha propuesto que la estructura antigénica de esta proteína consiste en dos
subunidades estructurales independientes. Una formada por el subdominio A1 y los
dominios B, C (B/C), los cuales son neutralizantes, y la otra, constituida por los subdominios
restantes del dominio A, y el domino D (A/D). La unidad estructural B/C, está estabilizada
por puentes disulfuros entre las cisteínas más próximas al extremo N-terminal: 693 y 737,
mientras que la unidad A/D se estabiliza debido a dos puentes disulfuros entre las cisteínas
792-856 y 818-828 (van Rijn et al., 1994). Ambas unidades estructurales de E2 contienen
epítopes que son reconocidos por anticuerpos monoclonales neutralizantes e inducen por
separado respuestas inmunes protectivas frente al desafío con cepas virulentas del VPPC
(van Rijn et al., 1999).
El extremo C-terminal de la proteína E2 no se encuentra expuesto en la superficie del virión
y contiene una región altamente hidrofóbica muy conservada entre los Pestivirus (Yu et al.,
1996). Esta región del extremo C-terminal constituye un dominio transmembrana (Garry y
Dash, 2003) y su pérdida no afecta la reactividad con anticuerpos monoclonales que
reconocen el extremo N-terminal de la proteína (van Rijn et al., 1993). Esta forma de E2
carente de región hidrofóbica induce respuestas inmunes protectoras frente a un desafío con
cepas virulentas del VPPC (van Rijn et al., 1996).
1.5. Replicación viral.
Los Pestivirus, a través de las glicoproteínas de la envoltura se unen a receptores
específicos de la célula hospedante. Estos receptores no están completamente
caracterizados; entre los principales candidatos se encuentran un par de proteínas de 60 y
93 kDa, una proteína de superficie celular de 50 kDa, glucosaminoglucanos y las
lipoproteínas de baja densidad (Schelp et al., 1995; Knipe et al., 2001). Todas estas
suposiciones están sustentadas en la unión independiente de las proteínas E2 y Erns, y en
5
que se bloquea la entrada del virus a la célula con el uso de anticuerpos monoclonales
contra estos receptores celulares (Hulst y Moormann, 1997; Knipe et al., 2001).
Los Pestivirus penetran a la célula por endocitosis mediada por receptores. La disminución
del pH en el interior del endosoma, inicia el proceso de fusión entre la envoltura viral y la
membrana endosomal, lo que impulsa la nucleocápsida hacia el citosol, donde el genoma
ARNss(+) es liberado. El IRES del 5´UTR se une a la subunidad 40S del ribosoma,
independientemente de los factores de iniciación de la traducción (Sizova et al., 1998;
Pestova y Hellen, 1999) y se traduce el único ORF en una poliproteína, la cual es procesada
co- y post-traduccionalmente por proteasas virales y celulares (Knipe et al., 2001). La
helicasa viral y la ARN polimerasa ARN dependiente viral, asociado con cofactores,
producen ARN de simple cadena y polaridad negativa, el cual sirve de molde para la
producción del nuevo ARNss(+) (Behrens et al., 1996). Este ácido nucleico progenie se
encapsida en las proteínas de la nucleocápsida. El ensamblaje de los viriones ocurre en el
retículo endoplasmático y en el Complejo de Golgi donde adquieren, al salir del sistema
membranoso por gemación, su envoltura lipídica que tiene insertada las proteínas virales
maduras. Finalmente, los virus alcanzan el compartimiento extracelular por transporte
vesicular (exocitosis) (Knipe et al., 2001).
2.Epidemiología de la enfermedad.
2.1. Distribución geográfica.
La PPC es enzoótica en áreas de Centroamérica y el Caribe, Sudamérica, Sudeste Asiático
y Europa del Este. En la actualidad constituye un problema económico para los países
afectados, pues influye en el deterioro de la situación económica y social de naciones en
vías de desarrollo (Edwards et al., 2000). Reportes en China (Chundi y Yinguo, 2000),
Indonesia (Satya et al., 2000), Vietnam (Dzung, 2000) y Hong Kong (Ellis et al., 2000)
demuestran que la PPC es un gran problema zoosanitario en Asia. A pesar de la aplicación
de programas estrictos para su control, ha sido especialmente grave en la mayoría de los
países, con brotes en Slovenia, República de Macedonia y Russia (Manual de la OIE,
2008b). La Unión Europea es considerada como una zona de alto riesgo de reemergencia
de la enfermedad debido a la alta densidad de la población porcina, a la política de novacunación y a su cercanía geográfica con los países de Europa del Este donde la
enfermedad es enzoótica. Uno de los problemas que se han asociado a la reemergencia de
la enfermedad en esta región, es la presencia de jabalíes y cerdos salvajes con infecciones
endémicas de PPC (Laddomada, 2000).
2.2.Transmisión.
La transmisión del VPPC se produce fundamentalmente por la vía oronasal por contacto
directo con los animales infectados, por comida contaminada (Fritzemeier et al., 2000),
también puede ocurrir por contacto indirecto a través de camiones, jaulas, material
veterinario, ropas y calzados contaminados (Edwards et al., 2000). Además, puede ocurrir
por vía transplacentaria (Moennig et al., 2003) y a través del semen de reproductores
infectados (Floegel et al., 2000).
2.3.Patogenia y síntomas clínicos.
La PPC es una enfermedad que se presenta en una amplia variedad de síntomas clínicos en
dependencia del grado de virulencia de la cepa, la edad y el estado inmunológico de los
animales infectados (Depner et al., 1997). De forma general, la enfermedad transcurre con
un curso clínico agudo con mortalidad cercana al 100% aunque cada vez son más
frecuentes los cuadros clínicos atípicos que dan lugar a enfermedades crónicas o a
infecciones inaparentes (subclínicas).
6
Los signos clínicos iniciales son fiebre, anorexia, letargo, conjuntivitis, nódulos linfáticos
agrandados y decolorados, síntomas respiratorios y constipación seguida de diarrea. Se
observa tambaleo al caminar, debilidad en las patas traseras, incoordinación de los
movimientos y convulsiones. Las hemorragias en la piel se observan usualmente durante la
segunda y tercera semana post-infección hasta la muerte (Laevens et al., 1999).
En el examen post-mortem a menudo se observan cambios patológicos en los nodos
linfáticos, bazo y riñón. Los nodos linfáticos se inflaman, la hemorragia de los riñones puede
variar de petequias a hemorragias equimóticas. También pueden observarse petequias en la
vejiga urinaria, laringe, epiglotis, corazón y puede expandirse sobre la capa serosa del
abdomen y pecho. A menudo se presenta una encefalitis no purulenta (Gruber et al., 1995).
Aunque el curso de la infección en cerdas es a menudo subclínico, el VPPC puede atravesar
la placenta e infectar al feto durante cualquier etapa de gestación, provocar abortos,
malformaciones fetales, mortinatos, crías con infecciones persistentes e inaparentes las
cuales se convierten en fuentes de diseminación del virus (Moennig y Plagemann, 1992;
Moennig et al., 2003).
3. Control y vacunas.
La política de control para la PPC depende de la incidencia y prevalencia de la infección en
las poblaciones de cerdos (Moennig, 2000). En países libres de PPC un caso de la
enfermedad oficialmente confirmado o sospechoso, se controla por sacrificio de los cerdos
infectados y sus contactos y deben tomarse medidas especiales para limitar o prevenir la
propagación de la enfermedad en la población de cerdos salvajes y la transmisión a cerdos
domésticos (Kaden et al., 2006).
Los rápidos esfuerzos para detener la transportación de cerdos, apoyado con la
implantación de medidas sanitarias apropiadas, deben limitar la introducción del VPPC a los
criaderos de cerdos durante los brotes. Además, la sensibilidad y especificidad de los
métodos de diagnóstico disponibles y su capacidad para examinar la población de cerdos en
un área cerrada permite determinar la duración y extensión de una epizootia. Si un virus es
introducido dentro de una población de cerdos de alta densidad, todos estos aspectos
pueden ser ajustados para controlar la propagación del virus en un período limitado (de Smit
et al., 1999).
En países donde la PPC es endémica se emplean programas de control basados en la
vacunación. Las vacunas más empleadas son las que utilizan el virus vivo atenuado, donde
la cepa China lapinizada (cepa C) es la más usada (Blome et al., 2006).
La vacuna atenuada basada en la cepa C induce altos títulos de anticuerpos neutralizantes y
es segura cuando se usa en cerdas preñadas. Sin embargo, tiene la desventaja que los
métodos para detección de anticuerpos no pueden distinguir animales vacunados de
infectados con el virus (Moennig, 2000), lo que puede traer graves consecuencias, ya que al
país que adopte el programa de vacunación debe prohibírsele el comercio internacional de
cerdos por 18 meses (Moennig et al., 2003).
Lo anteriormente expuesto, ha llevado a desarrollar las vacunas marcadoras, basadas en
subunidades de una proteína viral, lo que permite diferenciar con el empleo de un medio de
diagnóstico acompañante, los anticuerpos post vacunales de los inducidos post infección (de
Smit et al., 2001; Moennig et al., 2003). El desarrollo de una vacuna marcadora contra el
VPPC puede contribuir al control de un brote, limitar su duración, extensión y costos, lo que
reduciría el número de cerdos que tienen que ser sacrificados y destruidos. Además, puede
ser útil en un programa de control en países en los cuales la enfermedad es endémica
(Bouma et al., 2000).
7
Se han desarrollado vacunas marcadoras basadas en la proteína E2 del VPPC, que inducen
anticuerpos neutralizantes solamente contra esta proteína (van Rijn et al., 1996; Sánchez,
2008; Toledo et al., 2008) y como ensayo discriminatorio se ha usado un ELISA para la
detección de la glicoproteína Erns, en caso de ser positivo, entonces el animal ha estado
expuesto al VPPC (de Smit et al., 2001). Las vacunas marcadoras inducen buena inmunidad
contra la PPC (Bouma et al., 1999), aunque la transmisión transplacentaria del VPPC
solamente puede ser prevenida después que las cerdas hayan recibido una vacunación de
refuerzo (de Smit et al., 2000a).
4. Diagnóstico de la enfermedad.
4.1. Diagnóstico clínico y patológico.
Históricamente, la PPC ha sido diagnosticada sobre la base de los signos clínicos, pero la
variabilidad de la enfermedad hace que este método sea poco confiable (Clavijo et al.,
1998). Sin embargo, la observación de lesiones en la necropsia es una prueba más segura
(Elbers et al., 2003; Elbers et al., 2004). Por lo tanto, la combinación de signos clínicos y
análisis patológicos constituye una herramienta de gran valor para el diagnóstico temprano
de la enfermedad (Greiser-Wilke et al., 2007). Los cerdos sospechosos de presentar PPC,
deben ser confirmados por el examen de muestras con métodos de diagnósticos específicos
(de Smit et al., 1999).
4.2. Identificación del agente infeccioso.
4.2.1. Aislamiento viral en cultivos celulares.
El aislamiento viral se considera el “estándar de oro” para la detección del VPPC y la técnica
confirmatoria en caso de dudas. Sin embargo, con este método se consume mucho tiempo
para la obtención de los resultados y requiere de facilidades de cultivos celulares. Como el
virus es no citopático, se necesita de un método de marcaje inmunológico con peroxidasa o
fluoresceína para su detección (Manual de la OIE, 2008a). Esta técnica se realiza por
inoculación de cultivo de células permisivas como las obtenidas a partir de riñón de cerdo
PK-15 y SK-6, con suspensión de órganos clarificada, plasma o células sanguíneas
(Grummer et al., 2006).
4.2.2. Detección de antígenos virales.
Las técnicas más comunes para la detección de antígenos virales son la
inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa directas, que pueden realizarse en criosecciones
de tejidos, con el empleo de anticuerpos monoclonales o policlonales. La principal ventaja
de estos métodos es la rápida obtención de los resultados, sin embargo, frecuentemente
ocurren tinciones inespecíficas, por lo que los resultados no pueden ser conclusivos y
además requiere de personal con elevada experiencia (de Smit et al., 2000b).
También se emplean para la detección de antígenos virales, los ensayos ELISA de captura
tipo sandwich de doble anticuerpo que usan monoclonales y/o policlonales contra una
variedad de proteínas virales presentes en suero, fracciones de leucocitos sanguíneos o
sangre con anticoagulante (Depner et al., 1995). Es un método simple, rápido, los resultados
se obtienen en aproximadamente 4 horas y puede ser totalmente automatizable, pero su
sensibilidad es baja comparado con el aislamiento viral o la RT-PCR (Artois et al., 2002;
Dewulf et al., 2004).
4.2.3. Detección de ácido nucleico viral.
8
La RT-PCR es el método más sensible para la detección del VPPC y permite su diagnóstico
rápido (Dewulf et al., 2004; Handel et al., 2004). Además de ser una herramienta necesaria
para el diagnóstico, es imprescindible para la genotipificación del virus y permite investigar el
origen de los brotes y la evolución del virus (Ciglenecki et al., 2008; Le Dimna et al., 2008).
Se han descrito varios métodos para la detección de ácidos nucleicos por PCR en tiempo
real, los más usados son los que emplean el marcaje directo de los productos de
amplificación con SYBR Green y las sondas TaqMan.
Los ensayos de RT-PCR múltiples son valiosas herramientas para la detección múltiple y
diferencial de los virus que afectan al cerdo a partir de una muestra clínica con el
consiguiente incremento en la rapidez del diagnóstico diferencial y un menor costo. Estos
ensayos exigen cuidadosas selección de los cebadores y estandarización de las condiciones
de la reacción (Fernández et al., 2008).
Agüero et al., (2004), desarrollaron y estandarizaron un nuevo ensayo de RT-PCR múltiple
para el diagnóstico diferencial y simultáneo de la fiebre porcina africana y la PPC, que
emplea dos parejas de cebadores, cada una específica al virus correspondiente. Estudiaron
150 muestras de campo positivas de varios brotes de PPC y fiebre porcina africana y
demostraron la disponibilidad del método para un diagnóstico diferencial rápido, altamente
sensible y específico a partir de muestras clínicas.
Un novedoso “hot-star” PCR múltiple fue desarrollado y subsecuentemente evaluado para
analizar su eficacia en la detección múltiple de cinco infecciones virales que afectan al
cerdo. Se emplearon parejas de cebadores específicas e independientes para cada uno de
los cinco genomas virales correspondientes al: VPPC, virus de la fiebre porcina africana,
circovirus porcino tipo 2, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino y parvovirus
porcino. La sensibilidad de este ensayo con respecto al PCR simple, para la detección
individual del VPPC, PCV2 y PPV fue idéntica. Este PCR múltiple en comparación con el
PCR simple para la detección del PRRSV resultó ser de 1 log menor y para el caso del virus
de la peste porcina africana de 2 log menores (Giammarioli et al., 2008).
Actualmente, un nuevo ensayo de PCR múltiple fue diseñado para la detección simultánea
de cuatro virus que afectan el sistema reproductivo y respiratorio en cerdos: circovirus
porcino tipo 2, parvovirus porcino, VPPC y virus del síndrome reproductivo y respiratorio
porcino. Es un método rápido, sensible y constituye una herramienta diagnóstica costobeneficio efectiva para la vigilancia de infecciones virales en cerdos (Jiang et al., 2010).
4.3. Técnicas serológicas.
4.3.1. Ensayo de neutralización del VPPC.
La NPLA se considera el “estándar de oro” para la detección de anticuerpos contra el VPPC.
Es una técnica confiable y sensible (Clavijo et al., 2001), pero muy laboriosa, consume
mucho tiempo, necesita cultivos celulares y no es automatizable, por lo que no es adecuada
para el análisis de un gran número de muestras. Este método es incapaz de diferenciar
entre anticuerpos adquiridos por la infección en campo de los animales o como resultado de
la inmunización por vacunas vivas o modificadas (Greiser-Wilke et al., 2007; Manual de la
OIE, 2008a).
4.3.2. Ensayo inmunoenzimático sobre fase sólida.
Los ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA, son técnicas sensibles, rápidas, económicas,
automatizables, con capacidad para el procesamiento de un gran número de muestras y no
necesitan de cultivos celulares (Kaden et al., 2005; Greiser-Wilke et al., 2007). La utilización
de los anticuerpos monoclonales en formatos de competición o bloqueo, permite la
9
detección específica de anticuerpos contra el VPPC (Wensvoort et al., 1988; Leforban et al.,
1990) debido a la presencia de anticuerpos inducidos por infecciones mediante otros
Pestivirus en los cerdos (Loeffen, 2005).
La detección de anticuerpos al VPPC es muy usada para la vigilancia de la enfermedad en
un área aparentemente libre o para el monitoreo en un programa de erradicación (Clavijo et
al., 2001). Se han desarrollado diversos ELISAs para la detección de anticuerpos al VPPC
con el empleo de virus completo (Have, 1984) o antígenos recombinantes (Colijn et al.,
1997; Wong et al., 1998). Estos ensayos son idóneos para monitorear la efectividad de un
programa de control una vez que se levante la vacunación (Kaden et al., 2005; GreiserWilke et al., 2007). Además, para la evaluación de anticuerpos durante y después de un
brote (de Smit et al., 1999) y para el monitoreo de las infecciones de PPC en cerdos salvajes
(Vengust et al., 2006).
Otros autores como Tepstra y Wensvoort, (1987) y Bouma et al., (2000), emplearon un
ELISA bloqueante de captación de complejos (CTB-ELISA, siglas en inglés) para determinar
la proporción de animales seroreactores, la evaluación de la inmunidad en cerdas y su
descendencia (Lipowski et al., 2000) y en jabalíes salvajes vacunados con la vacuna
atenuada encapsulada (Kaden et al., 2000). Koenig et al., (2007), emplearon el ELISA de
bloqueo para evaluar la cinética de anticuerpos después de la vacunación, esta cinética fue
muy semejante con la de anticuerpos neutralizantes obtenida mediante la NPLA.
La proteína recombinante E2 del VPPC, producida en el sistema baculovirus, se ha
empleado en el desarrollo de ELISAs para la detección de anticuerpos contra el VPPC
(Moser et al., 1996; Colijn et al., 1997). Clavijo et al., (2001), desarrollaron un ELISA
competitivo con el empleo de la proteína recombinante E2 truncada, para el recubrimiento
de las placas de ELISA. En contraste con el VPPC completo, la proteína recombinante tiene
la ventaja de no ser infecciosa, y por tanto los ensayos se pueden realizar sin requerir de un
laboratorio especializado y facilidades de contención biológica. Además, la producción y
purificación del antígeno, se ha demostrado que es difícil para el virus completo (Moennig y
Plagemann, 1992), sin embargo, es más eficiente en el caso de una proteína recombinante.
En el desarrollo de un ELISA para la detección de anticuerpos contra el VPPC, el antígeno
de elección es la glicoproteína principal presente en la envoltura viral, la E2. Esta es la
proteína inmunodominante y contra la cual están dirigidos la mayoría de los anticuerpos
neutralizantes, que protegen a los cerdos de las infecciones por este agente (König et al.,
1995; Dong y Chen, 2007). El empleo de la proteína E2, obtenida por vía recombinante
garantiza la obtención de proteína pura sin contaminantes de otras proteínas virales. Existen
juegos comerciales de ELISA basados en esta proteína, pero obtenida de sobrenadante de
cultivos de células de insecto infectadas con Baculovirus recombinantes (Colijn et al., 1997),
los cuales se comercializan a precios elevados.
Los animales de granja altamente productores de leche como ovejas, cabras y vacas, han
sido ampliamente utilizados para expresar proteínas nutricionales de interés farmacéutico
(Houdebine et al., 2002; Houdebine, 2004). Estas proteínas son sintetizadas por las células
epiteliales de la glándula mamaria y posteriormente, son secretadas a la leche, donde el
proceso de purificación es relativamente fácil (Sánchez et al., 2004).
La transfección directa in vivo de la glándula mamaria es catalogada como la alternativa más
rápida y económica para la expresión de genes heterólogos (Patton et al., 1984). Mediante
esta técnica la glándula mamaria se ha transducido con vectores adenovirales (Fan et al.,
2002; Russell et al., 2003) y retrovirales (Thompson et al., 1998). La transducción adenoviral
de la glándula mamaria ha sido desarrollada como un método simple y rápido para la
producción de altos niveles de proteína recombinante en leche de rumiantes (Sánchez et al.,
2004; Han et al., 2006; Toledo et al., 2006) la cual pudiera ser empleada como antígeno en
un ELISA de bloqueo para la detección de anticuerpos contra el VPPC.
10
Varios ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA de bloqueo han sido realizados para la
detección de anticuerpos contra el VPPC. Wensvoort et al., (1988), desarrollaron un CTBELISA para la detección de anticuerpos contra el VPPC, con el empleo de dos anticuerpos
monoclonales que reconocen dos epítopes diferentes específicos del VPPC. El ensayo
detectó bajos niveles de anticuerpos que pueden ser detectados tempranamente después
de la infección con cepas del virus de baja virulencia, o en sueros tomados post vacunación.
Este ensayo es muy específico para el VPPC, y no detectó anticuerpos del VDVB y el VEF.
Un ensayo de ELISA de bloqueo para la diferenciación serológica fue descrito por Leforban
et al., (1990), con el empleo de tres cepas diferentes de Pestivirus. Para esto incorporaron
en el estudio antígenos del VPPC, VDVB y del VEF. El ELISA desarrollado, permitió
diferenciar entre anticuerpos contra el VPPC de anticuerpos dirigidos a otros Pestivirus los
cuales pueden infectar al cerdo. Por otra parte, Koenig et al., (2007), emplearon un ELISA
de bloqueo comercial para detectar anticuerpos en cerdos salvajes vacunados.
4.4 Diagnóstico de la enfermedad en Cuba.
En nuestro país, el diagnóstico de PPC ha transitado desde no disponer de herramientas de
diagnóstico cuando el resurgimiento de la enfermedad en 1993, hasta la disponibilidad de
métodos bajo procedimientos normalizados de operaciones (PNO) con sus respectivos
registros (RPNO) y materiales de referencia propios, todo bajo un sistema de calidad con
vistas a la futura acreditación de las técnicas que se emplean.
El diagnóstico primario de la enfermedad mediante la inmunofluorescencia directa con un
conjugado específico al VPPC, se realiza rutinariamente, en el Centro de Diagnóstico y
Epizootiología del Instituto de Medicina Veterinaria, para la confirmación del diagnóstico
clínico epizootiológico de la presencia y recuperación de focos de la enfermedad.
Como parte de un proyecto de investigación entre el Centro Nacional de Sanidad
Agropecuaria (CENSA) y el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB), se
obtuvo la proteína recombinante E2-his en la leche de cabras, transducidas con un vector
adenoviral AD-E2-his (Toledo et al., 2008). Esta proteína ha sido evaluada éxitosamente
como candidato vacunal y se prevé su utilización dentro del programa de control de la PPC
en un futuro inmediato. Se realizan investigaciones para el desarrollo de un juego de
diagnóstico por ELISA basado en las proteína recombinante E2-his que permitirá de forma
rápida y automatizable la evaluación del estatus inmune en los rebaños vacunados con el
producto E2-his recombinante en un futuro inmediato y con la vacuna viva atenuada, cepa
China latinizada, en uso actualmente, a través del análisis de la proporción de
seroreactores.
El aislamiento viral se considera el “estándar de oro” para la detección del VPPC y es la
técnica confirmatoria que empleamos además, en caso de dudas con alguna muestra. La
presencia de anticuerpos al VPPC para el monitoreo del programa de vacunación con el
candidato vacunal E2-his (Toledo et al., 2008) se detectan mediante la NPLA. Ambas
técnicas se realizan según el Manual para el diagnóstico del VPPC, Hannover, 2002).
Los ensayos de RT-PCR muestran mayor sensibilidad analítica en comparación con los
otros ensayos de diagnóstico. Es importante destacar que en comparación al aislamiento
viral en cultivo de células, el ácido nucleico viral puede ser detectado en etapas tempranas
después de la infección y por un largo período en casos donde los cerdos se recuperan
(Dewulf et al., 2004; Greiser-Wilke et al., 2007). Otra ventaja del RT-PCR es que debido a
su elevada sensibilidad, grupo de muestras pueden ser evaluadas lo que reduce los costos y
el tiempo para obtener los resultados. Además, son recomendados para la detección de
cerdos infectados con cepas de campo del VPPC de baja virulencia (Greiser-Wilke et al.,
2007)
11
En el Laboratorio de Virología Animal del CENSA, contamos con un ensayo simple de RTPCR para detectar rápidamente, y con elevada sensibilidad y especificidad el VPPC en
sobrenadante de cultivo de células y muestras clínicas (Díaz et al., 1998). Recientemente,
Díaz de Arce y Pérez (2008), desarrollaron y estandarizaron un ensayo de RT-PCR para la
detección específica de pestivirus en suero, basado en una pareja de cebadores que
amplifica un fragmento de 119 pb de una región altamente conservada en el extremo 5´UTR
del genoma ARN del virus. El ensayo resultó altamente específico, sensible y repetible en la
detección de estos virus en muestras de suero procedentes de dos ensayos inter-laboratorio
de PPC (2006 y 2007) conducidos por el Laboratorio de Referencia de la Comunidad
Europea para esta enfermedad, Hannover, Alemania (Díaz de Arce y Pérez, 2008).
Como todas las especies de Pestivirus pueden infectar cerdos, la detección y diferenciación
rápida de pestivirus es una medida de control muy importante para los rebaños de cerdos.
Por tanto, para la detección simultánea y diferencial de Pestivirus y el VPPC en muestras
clínicas, en nuestro laboratorio se desarrolló y evaluó un ensayo de RT-PCR mútiple,
novedoso, altamente sensible y específico. El método emplea dos juegos de cebadores
específicos, uno para el virus de la PPC y otro panpestivirus que amplifican fragmentos de
ADN de diferente talla lo que permitió la detección diferencial basada en gel. La detección
universal de pestivirus se alcanzó a través de la selección de cebadores que se alinean en
la región 5´ no codificante del genoma viral, considerada altamente conservada, a partir de
secuencias de nucleótidos disponibles en el GenBank. Para la detección diferencial de PPC
se emplearon cebadores que definieron un fragmento del gen NS5B altamente conservada
para PPC pero divergente para cepas de otros pestivirus. El ensayó resultó ser específico y
sensible (Díaz de Arce et al., 2009).
El Laboratorio de Virología Animal del CENSA ha participado en ensayos interlaboratorios
conducidos por el Laboratorio de Referencia de la Unión Europea y de la Organización
Mundial de Sanidad Animal para el diagnóstico de la PPC en Hannover, Alemania.
Participamos en un ensayo interlaboratorio a nivel regional en el 2005 y aceptados a
participar en dos de carácter internacional en el 2006 y el 2007, obteniendo el
reconocimiento de la actividad del Laboratorio de Virología Animal en el diagnóstico del
VPPC. Como resultado más importante está la demostración de la confiabilidad del
laboratorio para el diagnóstico de la PPC en los ensayos, tanto por técnicas convencionales
como por RT-PCR (Frías et al., 2007).
CONCLUSIONES
La peste porcina clásica (PPC) es una enfermedad altamente contagiosa que ocasiona un
impacto socio-económico severo en los sistemas de producción porcina tanto en países
industrializados como en desarrollo de casi todo el mundo, por tanto, es de notificación
obligatoria a la Organización Internacional para la Sanidad Animal. Por esto, resulta de gran
utilidad estudiar y comprender todo lo relacionado con el agente etiológico del VPPC, la
epidemiología de la enfermedad que produce, con especial interés en su diagnóstico, que
permitan enfrentar un brote de la enfermedad con la mayor brevedad posible y así minimizar
los daños que pudiera provocar. En este trabajo se hizo una revisión actualizada del tema,
haciendo énfasis en su diagnóstico. Así los interesados en la temática pueden conocer las
herramientas que existen para aplicar un sistema eficiente para el diagnóstico rápido y
específico de la enfermedad.
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