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Cjit,0 cía CE ISA PREVALENCIA DE ANTICUERPOS DE COLERA PORCINO EN COLOMBIA •J$I OTEC i oc*opECUARIA ADRIANA SOFIA ORTEGA GARZON ANA ROSA PUENTES MARTINEZ UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA, D.C. 1995 PREVALENCIA DE ANTICUERPOS DE COLERA PORCINO EN COLOMBIA ADRIANA SOFIA ORTEGA GARZON ANA ROSA PUENTES MARTINEZ Trabajo de Grado presentado como requisito para obtar al titulo de Bacterióloga y Laboratorista Clínico Director GUILLERMO GONZALEZ GARZON M.V.Z. Ph.D UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA BACTERIOLOGIA SANTAFE DE BOGOTA, 1995 Centro de Documentación CEISA U.- UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA 2 La UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA, respeta los conceptos emitidos por las estudiantes del PROGRAMA DE BACTERIOLOGIA en sus trabajos de Grado; vela porque en ellos se acate la Constitución, las Leyes de la República, la filosofía y políticas institucionales; no atenten contra la moral y las buenas costumbres, y sean un aporte a la solución de las necesidades del país. NOTA DE ACEPTACION CONCEPTO ASESOR A-Rl 7° £112' JURADOS y 0 H/b cc3ul wj.1/ 11;i, a-. Santafé de Bogotá ) D.C., Junio 1 de 1995 A Dios todopoderoso, por ser migran amigo y maestro. A mis padres y hermanos, por su apoyo y comprensión. ANA ROSA. Al Señor todopoderoso, por ser mí gula. A mis familiares y amigos, por su constante apoyo. ADRIANA SOFÍA. MW AGRADECIMIENTOS Las autoras expresan sus agradecimientos: Al Dr. GUILLERMO GONZALEZ G., profesional vinculado al Instituto Colombiano Agropecuario ICA-CEISA, por su colaboración, dedicación y empeño para culminar el presente proyecto. Ala Dra. MYRIAN LUCIA TORRES, vinculada al ICA-CEISA, por su dedicación, coordinación y orientación en la elaboración del presente trabajo. Al Dr. DARlO MOGOLLON, profesional del ICA-CEISA, por sus aportes e ideas. A la Dra. ESPERANZA RIVERA, decana de la Facuttad de Bacteriología de la UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA, por su apoyo. A la Dra.INES LOMBANA, coordinadora proyectos de investigación y al Dr. ANTONIO GARCIA asesor interno, por su orientación. A los Drs. JUAN FERNANDO GALLEGO Y ESPERANZA CORTES, por su ayuda en la realización del texto. A los Drs. ISAAC GALLEGO y RAFAEL NEIRA, por colaborar en la realización de fotográfias y filminas. .:... A los señores LEOPOLDO GARZON y ANCIZAR FERNANDEZ por su ayuda en la parte instrumental. A la Corporación Colombiana de Investigación (CORPOICA-CEISA) por la utilización de sus instalaciones y equipos. A todas aquellas personas que de una u otra forma colaboraron para la realización de la presente investigación. TABLA DE CONTENIDO RESUMEN......................................................7 1. INTRODUCCION ...............................................15 2. REVISION DE LITERATURA ..................................... 20 2.1. COLERA PORCINO. . ....................................... 22 2. 1.1 Propiedades físico- químicas del virus........................ 23 2.1.2. Cultivo del V ........................................... 24 2.1.3. Patogénesis. ........................ . .... . ........... .. 28 2.1.4. Signos................................................ 33 2.1.5. Epidemiología.......................................... 34 2.1.5.1. Huésped .......................................... 34 2.1.5.2. Transmisión........................................ 35 2.1.6. Profilaxis.............................................. 38 2.1.6.1. Control: . .............. .... ........... ............. 38 39 2.1.6.2. Vacunación......................................... 2.1.6.2.1. Inoculación simultánea........................... 40 2.1.6.2.2. Vacunas con virus inactivado....................... 40 2.1.6.2.3. Virus vivo modificado: ............................ 41 2.1.6.2.4. Suero Hiperinmune .............................. 42 2.1.6.2.5. Vacunación en Colombia.......................... 42 2.1.7. Reacción Inmune........................................ 44 2.2. DIARREA VIRAL BOVINA .................................... 46 2.3. REACCION CRUZADA ...................................... 47 2.4. DIAGNOSTICO ............................................ 52 2.5. COLERA PORCINO EN COLOMBIA............................ 54 2.5.1. Grado de tecnificación de la industria porcina.................. 54 2.5.2. Situación en Colombia ................................... 56 3. MATERIALES Y METODOS PARA LA TECNICA DE NEUTRALIZACION DE LA FLUORESCENCIA ............................................. 59 3. l. MATERIALES: 59 3.2. MET000 . .... ...................................... . ... 62 3.3. INTERPRETACION' ......................................64 4. RESULTADOS ................................................66 4.1. GENERALES ..............................................66 4 .1.1.Sexo .................................................68 4.1.2. Edad .................................................71 4.2. TAMAÑO DE LA PIARA. ... .............. . ...................72 4.2.1. Edad ....................... . ........ . .............. ..74 4.2.2. Sexo . .................... . ........ . .................. 78 4.3. DISTRIBUCION GEOGRAFICA. ............................... 78 4.4. DISTRIBUCION TEMPORAL . ................................. 82 5. DISCUSION ............................ . .... . ................. 84 6. ANTICUERPOS LIGADOS A LA PEROXIDASA .......................98 6.1. MATERIALES: .... . .... . ........................... . ........ 99 6.2. MODIFICACIONES REALIZADAS A LA TECNICA .................101 6.3. METODO . ................... . ............ . ............... 103 6.4. INTERPRETACION . ..... . ...... . ........................... 105 7. RESULTADOS Y DISCUSION INMUNOPEROXIDASA .................108 8. CONCLUSIONES GENERALES ...................................115 BIBLIOGRAFIA ..................................................117 ANEXOS....................................................... 129 LISTA DE TABLAS Tabla N01. Porcentaje de distribución por títulos a cólera porcino sobre 268 sueros estudiados....................................................68 Tabla NO2. Distribución de sueros de hembras porcinas positivas a cólera porcino, por título sobre 46 sueros estudiados ........................ ... ..... 70 Tabla NO3. Distribución de machos positivos al cólera porcino, por título, sobre 26 sueros............ .... .... .... .......................... . ....70 Tabla N14. El porcentaje de distribución de sueros porcinos positivos al CP según título detectado ................. . ............. . ................71 Tabla N05. Porcentaje de sueros porcinos positivos y negativos al cólera porcino hallados en granjas con diferente población ................. . ......... 72 Tabla N°6. Porcentaje de comparación de títulos serológicos al CP en poblaciones porcinas de diferente tamaño poblacional. ....... . ................... 74 Tabla N°7. Porcentaje de distribución de sueros negativos y positivos en cerdos mayores de seis meses procedentes de piaras de diferente tamaño . ....... 75 Tabla N08. Porcentaje de distribución al CP de sueros porcinos mayores de seis meses procedentes de granjas de diferente tamaño . ................. ..77 Tabla N09. Porcentaje de negatividad a cólera porcino en sueros porcinos según distribución geográfica .................................... . ...... 80 Tabla N°10. Porcentaje de negatividad a CP de sueros porcinos colectados durante 1993y1994...................................................82 Tabla N°11. Porcentaje de comparación de títulos al CP por las técnicas de anticuerpos fluorescentes y anticuerpos ligados a peroxidasa en 155 sueros porcinos......................................................110 Tabla N°12. Coincidencia por títulos entre las técnicas de inmunofluorescencia y anticuerpos ligados a peroxidasa, sobre 155 sueros analizados. ...... ..... 111 --: LISTA DE FIGURAS Figura N° 1. Vísceras positivas por anticuerpos fluorescentes a Cp en años 1984/1993..................................................... 58 Figura N° 2. Distribución por títulos de sueros positivos a Cólera Porcino sobre 268 sueros estudiados . ........................ . ........ . ............ 67 Figura N° 3. Comparación de sueros positivos a Cólera Porcino según el sexo. .. 69 Figura N°4. Comparación de sueros positivos y negativos a Cólera Porcino en granjas de diferente población . ............ . ..... . ........................ 73 Figura N°5. Comparación de sueros positivos en porcinos mayores de 6 meses según la tecnificación .................................................. 76 Figura N° 6. Porcentaje de negatividad al VCP según sexo, de acuerdo a la tecnificación....... ................ . ............................ 79 Figura N°7. 'bepartamentos con mayor riesgo. ...... ..................... 81 Figura N° 8. Comparación de títulos a CP durante 1993 y primer semestre de 199483 Figura N° 9. Comparación de títulos por la técnica de anticuerpos fluorescentes y anticuerpos ligados a la peroxidasa..... .......................... ..108 LISTA DE FOTOGRAFIAS Fotografía N0 1. Fluorescencia positiva.................................65 Fotografía NO2. Fluorescencia negativa . .................... . ....... ... 65 Fotografía N°3. Peroxidasa Positiva...................................106 Fotografía N14. Peroxidasa Negativa . ............... . ................. 106 RESUMEN Se realizó una encuesta seroepidemiológica en vanas regiones del país, por medio de la prueba de ¡nmunofluorescencia, tendiente a conocer la prevalencia de porcinos que han desarrollado anticuerpos contra el Cólera porcino (CP), ya sea post-vacunales o post-infección. Se estudiaron 783 sueros y se consideraron las siguientes variables: grado de tecnificación, edad y sexo. De este total se detecto la presencia de un 63.2% de sueros con títulos menores de 1:16 y un 36.8% de sueros con títulos mayores. Entre los sueros positivos se observo un mayor porcentaje con títulos 1:16 (54,5%), 1:32 (21.6%), 1:128 (16.8%) y el menor porcentaje fue 1:64 (7.5%). Las piaras tecniflcadas presentaron un 57.9% de negatividad «1;16), mientras que las no tecniflcadas un 70.3%. No se observó diferencia significativa entre los sexos. En los cerdos menores de seis meses se presentó un 61.5% de sueros sin anticuerpos, mientras que en los mayores de seis meses un 65.6%. Entre los departamentos estudiados se evidenció que Córdoba, Meta y Choco presentaban los más bajos porcentajes de sueros negativos o con títulos menores de 1:16, indicando que aparentemente existe un gran número de cerdos susceptibles a la enfermedad. El alto porcentaje de sueros porcinos sin anticuerpos, sugiere que existe un gran riesgo de presentación de brotes de la enfermedad a menos que se tomen medidas urgentes para proteger la población. Se estudió la técnica de anticuerpos ligados a la peroxidasa, para ser estudiar algunos sueros porcinos con y sin anticuerpos contra CP. A la técnica descrita se le hicieron una serie de modificaciones importantes que permiten su realización sobre cultivo de células PK15 en crecimiento sobre laminillas. La técnica permitió una clara y fácil lectura con base a las características de la coloración descrita en la literatura. El estudio inicial con 155 sueros positivos y negativos estudiados con la técnica de neutralización de la fluorescencia permitió observar mayor sensibilidad de la técnica de anticuerpos ligados a peroxidasa. Sin embargo su laboriosidad es un inconveniente que sugiere mayor consideración en estudios serológicos futuros. 1. INTRODUCCION El Cólera Porcino (CP), Peste Porcina o Fiebre Porcina Clásica, es una enfermedad contagiosa caracterizada en su forma aguda, por la presencia de hemorragias, necrosis e infartación de órganos internos con mortalidad entre el 90y 100%, también han sido descritas otras formas de presentación con baja mortalidad pero de indudable importancia epidemiológica. Liess (1981). En 1822 se presentó en Francia, distribuyendose más tarde por el resto de Europa (Alemania 1833, Inglaterra 1862). La primera descripción de la enfermedad en América se hizo en 1840 en los Estados Unidos (Tenesse, Kentucky e Indiana). Hanson (1957); Paasch et.al (1994). En la actualidad se considera endémica en todos los países productores de cerdos con excepción de los que han llevado a cabo programas de erradicación. 16 En Colombia el primer brote se presentó en Cúcuta en 1942, en animales que aparentemente provenían de Venezuela, mostrando un cuadro febril contagioso con mortalidad alta, el cual afectó a cerdos de todas las razas y edades. Manrique y Raye (1973). Desde entonces se viene trabando en programas de diagnóstico y control de la enfermedad. El seguimiento de la actividad del CP se ha restringido algunas veces a la sospecha clínica, al cuadro epidemiológico y a las lesiones macro y microscópicas. Las observaciones basadas sobre los resultados de vísceras de cerdos sacrificados en varios mataderos del país, sugieren la presencia de posibles portadores del virus ya sea de origen vacuna¡ o de cepas silvestres de baja virulencia. Estudios preliminares sobre el diferente grado de virulencia de las cepas aisladas han confirmado una amplia variación, observándose que algunas de ellas poseen la capacidad de sobrepasar la protección vacuna¡. (Villate, comunicación personal). A nivel de laboratorio se controla la antigenicidad, la esterilidad y potencia de la vacuna; se desconocen los efectos inmunosupresores y la exacerbación de gérmenes banales oportunistas y de patógenos específicos, la capacidad de producir portadores, el posible aumento en la difusión del agente, la reversión 0 17 a virulencia y la capacidad de producir reacciones alérgicas y problemas reproductivos. OPECUAFZ El análisis de tos resultados de los diagnósticos de Cólera Porcino en los últimos años, señala la existencia repetitiva de regiones con muy baja o nula casuística, durante varios años; disminución nacional del número de casos desde 1989 cuando se presentó en el Valle del Cauca una gran epidemia; un mayor número de cepas en piaras con pequeñas poblaciones, en todos los casos se obtuvo baja morbi-mortalidad. Llama la atención la disminución del número de casos reportados y diagnosticados dado que no se conoce incremento en el cubrimiento vacuna¡ ó en esfuerzos divulgativos sobre la bondad de vacunar. En Europa se ha demostrado que en la presentación del Cólera Porcino existen factores de mercadeo que determinan la presentación cíclica de la enfermedad, y en otras entidades infecciosas diferentes al Cólera, existiendo características propias del agente etiológico, de su epidemiología, que hacen que se reporte el fenómeno de ciclicidad. Como se desconoce en éste medio éste fenómeno, se pensó que la presencia de anticuerpos específicos contra CP podría ser el origen de la disminución de la casuística observada. 18 Actualmente se desconoce la prevalencia de porcinos que han desarrollado anticuerpos post-infección o post-vacunación, si estos son protectivos o nó; dificultando los mecanismos apropiados para la prevención de brotes, para el desarrollo de campañas de vacunación y para la movilización de animales. En respuesta a estos hechos la presente investigación se encaminó a conocer algunos aspectos de la epidemiología de la enfermedad bajo condiciones ecológicas propias, tomando como base la determinación de la prevalencia de anticuerpos por medio de pruebas de laboratorio específicas. A pesar de que por mucho tiempo en este laboratorio la técnica de neutralización de la fluorescencia ha demostrado todas sus bondades, se considero importante la implementación de otra técnica que augurara resultados más exactos, más económicos y menos laboriosos. La técnica de inmunoperoxidasa ha demostrado ser para muchos agentes infecciosos y desde luego para el CP, una técnica que llena tales requerimientos. 19 Objetivos específicos: Por medio de encuestas serológicas determinar la población porcina susceptible en el país, relacionada con la tecnificación de las piaras, la edad y el sexo. Implementación de la técnica de inmunoperoxidasa y comparación con la de Neutralización de la Fluorescencia. 2. REVISION DE LITERATURA La forma aguda del Cólera Porcino fue reconocida en Kentucky, Tennesse e Indiana (Estados Unidos) durante los primeros años de la década de 1840, Hanson (1957). Se ha sugerido que la enfermedad pudo haber existido en cerdos de esas áreas como una forma atípica por muchos años y que la presentación aguda podría haberse originado más como un cambio en la genética, nutrición y manejo de los cerdos, que como una alteración del virus. Se desconoce si éste fué transferido al cerdo a partir de un reservorio animal americano en algún momento precedente, o si fué inducido por cerdos foráneos. En la actualidad catorce países de América reportan el Cólera Porcino, todos ellos poseen una densa población porcina, (excepto Canadá, Estados Unidos y República Dominicana). * 21 En Colombia no se tienen datos de la existencia del Cólera Porcino (CP) antes de 1942; aunque se presentaron epizootias compatibles con la enfermedad en la especie porcina en los departamentos de la Guajira, Magdalena y Chocó, no se pudieron atribuir al Cólera Porcino porque no fueron confirmados por el laboratorio. Manrique y Ra ye (1973). El primer brote de la enfermedad se presentó en el mes de mayo de 1942 en Cúcuta, aparentemente los animales provenían de Venezuela, presentaban un cuadró febril, contagioso y altamente mortal el cual afectó a cerdos sin distinción de raza, género o edad. Manrique y Ra ye (1973). A partir de 1970 se empezaron a realizar trabajos sobre la patogénesis, transmisión y cultivos de Diarrea Vira¡ Bovina y Cólera Porcino; entre estos Borda (1975), hace referencia entre la relación antigénica del Cólera y la Diarrea Vira¡ Bovina. Otras investigaciones a este nivel han sido los realizados por Rico y Castro (1982), que hacen referencia a la evaluación inmunológica y patogénesis en cerdos vacunados contra el Cólera Porcino. Y el realizado en 1993 por Ramirez 22 sobre cultivos celulares y suero fetal bovino inactivado con BEl en el estudio del virus de la Diarrea Vira¡ Bovina, donde expone las dificultades del diagnóstico de la enfermedad a través del laboratorio por la alta contaminación que presentan los cultivos con cepas no citopáticas del virus de la Diarrea Vira¡ Bovina. Ramírez (1993), Rico y Castro (1982). El sistema de Diagnóstico en Colombia ha recibido especial cuidado, adoptando técnicas que permiten un diagnóstico confiable. La evaluación de estos resultados constata la presencia permanente de la enfermedad en la población porcina Colombiana y corroboran que el Cólera porcino debe considerarse como la entidad infecciosa más importante en esta industria. La presencia del virus se ha comprobado en todos los ecosistemas y tipos de manejo presentes en Colombia. 2.1. COLERA PORCINO El Cólera Porcino (CP) también llamado Peste Porcina o Fiebre Porcina Clásica, se define como una enfermedad altamente contagiosa, causada por un virus de 23 la familia Togaviridae, género Pestivirus, denominado Virus del Cólera Porcino. Dahie and Liess (1992), Gibbs (1981), Van Oirschot (1992), Cottral (1978). Según Dunne (1970) el Cólera presenta una mortalidad del 90 al 100 % en la forma aguda. Pero también se ha caracterizado por producir enfermedad de tipo crónico con baja mortalidad en animales adultos, abortos, muerte fetal y anomalías congénitas, Carbrey et.al . (1966) 2.1.1 Propiedades fisico- químicas del virus. El agente causal del Cólera Porcino es un virus ARN, de polaridad positiva, perteneciente al género Pestivirus, familia Togaviridae; con envoltura y simetría icosaédrica, y replicación citoplasmatica en las células infectadas. Westaway et.al (1985). El ARN del virus del Cólera Porcino tiene un coeficiente de sedimentación de 4045S en gradiente de sacarosa y un peso molecular de 40X10 Kd establecido por electroforesis en geles de poliacrilamida. El virus posee una sola cadena de ARN, su diámetro es de 40-50 nm, con una nucleocápside de 29 nm. Presenta 24 proyecciones como flecos de 6-8 nm en la superficie del virion. Van Oirschot (1992). El virus del Cólera Porcino posee tres polipeptidos estructurales: 2 glicoproteínas de envoltura El de 55.000 daltons y E2 de 46.000 daltons y una proteína del núcleo (CORE) no glicosilada de 36.000 daltons. Las proteínas de envoltura son las que poseen mayores determinantes antigénicos para los anticuerpos neutralizantes. Fenner (1992). La inactivación física del virus del Cólera Porcino depende del medio que contiene el virus, ejemplo: en los cultivos celulares se inactiva en 10 minutos a 60°C. El virus es estable a pH 5-10, por encima y por debajo de este rango la virulencia se pierde rápidamente. Los solventes como éter, etanol, cloroformo y desoxicolato lo inactivan rápidamente, porque actúan sobre los lípidos de la envoltura. Van Oirschot (1992). 2.1.2. Cultivo del Virus. Los cultivos celulares se derivan de células de un cultivo primario o de una línea, disgregadas por medios enzimáticos o químicos. Freshney (1987). 25 Los cultivos primarios consisten en células tomadas de un tejido u órgano, provenientes de un animal recién sacrificado, las cuales conservan una morfología similar a los de lss células del órgano que les dio origen. Dentro de un mismo cultivo se encuentran por lo general diferentes tipos de células que mantienen la distribución diploide de los cromosomas. Estos, a diferencia de las líneas celulares, no se propagan indefinidamente in-vitro. Freshney (1987). Las líneas celulares se obtienen de los cultivos primarios mediante un cambio defenotipo o transformación. Las líneas celulares continuas están formadas por células que se han diferenciado morfológica y genéticamente de las células originales. Una característica típica de estos cultivos es ser aneuploide y tener a menudo un complemento de cromosomas entre diploide ytriploide. Un número considerable de líneas están asociadas con transformaciones malignas como reducción en el enriquecimiento del suero, crecimiento en medio y aneuploidía. Freshney (1987). Considerando que cada tipo de cultivo celular animal tiene su aplicación en virología, la elección de las especies y tejidos, así como del cultivo (primario, 26 cepas celulares o línea celular) dependen del virus y de los objetivos experimentales. Stranostrom et.al (1974). La adsorción de los viriones a las membranas celulares ocurre a través de estructuras específicas que se localizan externamente a la envoltura vira¡. Estas estructuras han sido aisladas y corresponden a receptores (gp 53, gp 25) que al ser neutralizados por los anticuerpos, originan la no adsorción y la no penetración del virus a las células en los cerdos inmunizados. Sólo células de ciertas especies y ciertos tejidos muestran receptividad en mayor o menor grado. El virus del cólera porcino es pantotrópico. También se sabe que las concentraciones óptimas de cationes en el medio de cultivo favorecen la adsorción vira¡ a las células. Uno de los primeros intentos para cultivar el virus del CP en células renales del cerdo se hizo en 1960; las características de replicación, conservación de la patogénicidad y antigénicidad fueron determinantes para la ulterior popularidad de éste método. Rumenap et. al (1989). Se ha observado que la composición del medio de cultivo, el tampón y el tipo de células, determinan el desarrollo del efecto citopático del virus del cólera porcino 27 sobre el cultivo celular, el mecanismo que ejerce este fenómeno es desconocido, pero se conjetura que es el sistema enzimático celular el que se ve comprometido; en ocasiones el suero utilizado para el medio de cultivo puede contener anticuerpos que inhibirán la acción del virus, impidiendo el efecto citopático. King and Harkness (1975), Bolin (1985). A las cuatro horas postinoculación menos del uno por ciento de las células de la línea PK1 5 contienen antígeno vira¡, a las doce horas, el noventa y nueve por ciento de las células lo contienen. El antígeno únicamente está en el citoplasma de las células infectadas lo que sugiere que la replicación del virus del cólera es enteramente extranuclear. En cultivos de linfocitos y de monocitos, el virus puede replicarse satisfactoriamente, aunque pierde capacidad patógena para el cerdo. Rumenap et.al (1989). Para la investigación del virus se han utilizado diferentes tipos de células, mientras que para el diagnóstico existe la tendencia de usar la línea PK1 5, Terpstra et.al (1984). Se menciona que si la línea PKI 5 se mantiene infectada en forma continua, al cabo de cierto número de pases muestra alteraciones de tipo genético, pero existen controversias al respecto pues en otros estudios se 28 asegura que dicha infección persistente no afecta a las células PK1 5 aún cuando el virus pueda transmitirse de células madre a células hijas durante la mitosis. Se ha estimado que las células PK15 normales tienen un ciclo de reproducción de 15,2 horas; la síntesis de DNA se estima en un período de 6 a 9 horas, la fase postsíntesis de DNA y mitosis en 3,8 horas y la fase postmitótica en 4,5 horas. Estas células en condiciones de infección aguda o permanente con el virus del GP extienden el período de síntesis de DNA en 0,9 y 0,7 horas respectivamente. Se ha visto que el virus del GP puede replicarse con más éxito si las células PK1 5 son previamente tratadas con virus Senda¡ (virus parainfluenza) inactivado con beta-propiolactona. Dichas células desarrollan numerosos sincitios. También se ha determinado que las células infectadas con virus de GP incrementan la absorción de glucosa del medio y elevan la producción de glicógeno y de ácido pirúvico a las 36 horas postinfección. 2.1.3. Patogénesis. En condiciones naturales, el virus del GP infecta al cerdo por la vía oronasal. Van Oirschot and Terpstra (1989), Liess (1986), Van Oirschot (1986), Terpstra (1991). Ocasionalmente el virus puede entrar por vía conjuntiva¡, genital o por lesiones de la piel. Van Oirschot and Terpstra (1986). 29 Forma aguda: El virus tiene afinidad por los endotelios y el sistema reticuloendotelial. La invasión primaria del virus se realiza a través del epitelio, sin embargo el daño severo de las funciones del metabolismo es por alteración del endotelio vascular. Carbrey (1984), Ressang (1973). Siete horas después de la infección del virus del CP se detecta en las tonsilas que son el sitio primario de replicación, Carbrey (1984), Trautwein (1988); luego es transportado por vía linfática a los ganglios linfáticos, alcanza los vasos eferentes y se produce la viremia inicial, luego se localiza en el bazo, en la médula ósea, ganglios linfáticos viscerales y estructuras linfoides pequeñas en el epitelio intestinal. Debido alas células mononucleares y polimorfonucleares aumentan sus niveles. Probablemente el virus no invade los órganos parenquimatosos hasta la fase de viremia tardía. Ressang (1973), Ressang (1973 a), Van Oirschot and Terpstra (1989), Cheville and Mengeting (1969), Van Oirschot (1992). Las células de predilección del virus son las epiteliales, endoteliales y reticulares. Ressang (1973a). El tiempo que emplea el virus en su propagación está relacionado con la virulencia. El de alta virulencia puede ser detectado en los órganos cinco a seis 30 días después de la infección . Ressang (1973), Van Oirschot and Terpstra (1989). La trombocitopenia y alteracion en la síntesis del fibrinógeno son desórdenes debidos a la degeneración de las células endoteliales, que explican las múltiples hemorragias en la fase terminal del GP agudo. Trautwein (1988), Trigo (1985). Según Charley et.al (1980) se presentan cambios de reactividad inmune de los cerdos en la forma aguda del Cólera Porcino. Las infecdones persistentes Son causadas generalmente por virus de baja o moderada virulencia. Existen dos formas de persistencia: crónica y la de ataque tardío. Fase cróiica: Tiene tres fases, Van Oirschot (1992) y Van Oirschot and Terpstra (1989) Enfermedad aguda Mejoramiento clínico Exacerbación de la enfermedad aguda. 31 En la primera enfermedad aguda el virus se propaga más lentamente que en la aguda y sus concentraciones en suero y órganos son bajos. En el período de mejoramiento dínico, los títulos en el suero son bajos o ausentes y hay evidencia deformación excesiva de células plasmáticas y por lo tanto un aumento de gamma globulinas en el suero. Mientras tanto el antígeno vira¡ esta usualmente limitado a células del epitelio de las tonsilas, glándulas salivares, íleon y riñón. La desaparición temporal del virus del CP puede ser debida a la formación de anticuerpos específicos ola la escasa producción de virus en los glóbulos blancos. La circulación de complejos antígeno-anticuerpo puede ocasionar su acumulación en tos riñones, causando eventualmente glomerulonefritis. Cheville etal (1970), Van Oirschot (1992). Durante la tercera fase el virus se propaga nuevamente a través del organismo. Puede ser favorecida por una disminución de la respuesta inmune que se desarrolla en la infección crónica. Los cerdos pueden ser susceptibles a una infección bacteriana secundaria durante esta fase de la infección. Mengeling and Packer (1969), Trautwein (1988). 0 32 Ataque tardío: Inicialmente tiene un curso inaparente, puede aparecer vanos meses después M primer contacto con el virus. Esta infección es secuela del virus de baja virulencia durante la vida fetal. Van Oirschot and Terpstra (1977). Los cerdos pueden tener niveles de viremia altos, que pueden decrecer después de la ingestióna de anticuerpos calostrales. El sindrome se caracteriza por un largo período en que los animales no presentan signos de enfermedad, pero pocos meses después de la exposición primaria, los cerdos mueren o desarrollan anorexia leve, depresión, conjuntivitis, dermatitis, diarrea y disturbios en la locomoción con parálisis en el tren posterior. La temperatura corporal es normal. Los cerdos sobreviven más o menos seis meses pero todos eventualmente mueren. Los cerdos con persistencia de Cólera Porcino congénito desarrollan anticuerpos neutralizantes, por eso persiste la viremia. Van Oirschot and Terpstra (1989), Van Oirschot (1992). Por la diseminación sanguínea se puede explicar la frecuente infección trasplacental en cerdas preñadas. El virus se multiplica rápidamente en la placenta e infecta al feto (s). El efecto de la infección congénita está determinado por la edad de los fetos y la virulencia 33 específica del virus. Terpstra (1991). Dependiendo de está virulencia, se pueden encontrar o nó anticuerpos neutralizantes después de la infección postnatal. Van Oirschot (1992). Los cerdos en la fase crónica desarrollan anticuerpos y los cerdos con persistencia congénita son inmunotolerantes al virus. 2.1.4. Signos. Los signos clínicos son determinados por la virulencia del virus y por la susceptibilidad del huésped. Wensvoort and Terpstra (1985), Carbrey (1984), Shimizu and Shimizu (1983) yVan Oirschot( 1992). Mengeling and Packer (1969) describen tres fases del Cólera Porcino: Fase aguda: Se presenta Anorexia, depresión, aumento en la temperatura y leucopenia (Generalmente es persistente) semanas después de la infección, la apariencia general y el aspecto han disminuido. En la segunda fase las características clínicas generalmente mejoran. En la tercera fase los cerdos estan de nuevo anoréxicos, deprimidos y presentan temperatura elevada. 1 ® r, 2.1.5. Epidemiología. Corrxct Centro de Documentación 34 (EISA 2.1.5.1. Huésped. El cerdo es el huésped natural del Cólera y fuente de diseminación del virus. El contacto directo entre el huésped y los cerdos susceptibles, es el principal medio de transmisión, los cerdos infectados pueden difundir el virus antes que aparezca los signos de la enfermedad y durante ésta. Van Oirschot (1992). Los cerdos se recobran generalmente del GP desarrollando anticuerpos de baja especificidad. Los cerdos infectados con cepas virulentas pueden difundirlas de 10 a 20 días; cuando la infección post-natal es debida a una cepa de baja virulencia esta se caracteriza por cortos períodos de excreción del virus. Consecuentemente la cepa virulenta es difundida rápidamente en una piara e induce a una alta morbilidad. Los cerdos infectados crónicamente difunden continua o intermitentemente el virus hasta la muerte. Van Oirschot (1992). Cuando una cerda es expuesta a la cepa del virus del CP de baja virulencia la infección inicial puede pasar desapercibida, pero el virus es transmitido al feto in-útero. Tales infecciones congénitas usualmente producen fetos muertos y/o cerdos que mueren pocas semanas después del nacimiento. Debido a que el 35 virus del GP permanece en grandes cantidades en los fetos, el virus puede ser diseminado durante el parto. Van Oirschot and Terpstra (1977). El virus del CP puede sobrevivir en la carne de cerdo o productos cárnicos procesados. La supervivencia del virus se puede prolongar por meses cuando la carne se almacena en frío o por años en congelación. Los cerdos susceptibles pueden contraer la enfermedad cuando se alimentan con desperdicios de carne o sobrantes de la cocina que no han recibido ningún tratamiento apropiado. Terpstra (1991). 2.1.5.2. Transmisión: Vías.-Bajo condiciones experimentales el cerdo puede ser infectado por vía oral, nasal, aerogena, conjuntiva¡, genital y parenteral. Dunne et.al . (1960), Hughes et.al . (1960), Liess et.al. (1976). Las infecciones por estas vías ocurren en una u otra forma bajo condiciones naturales. Los cerdos infectados pueden difundir el virus durante la incubación. Ressang (1973). T,ansmLionporeIhcwnbre:Es de gran significado en áreas de alta densidad de cerdos; granjeros, inseminadores, equipo de vacunación y veterinarios pueden 36 transmitir el virus por instrumentos y drogas. El hombre es considerado el causante del 40% de la diseminación del virus del CP. Wachendofer et.al . (1978), es muy común que los veterinarios no cambien de aguja ni dejennga en el momento de la vacunación. Transmisión pcvaire:Los reportes son escasos. Hughes and Gustafson (1960). Transmisión por arfrópodos: Los artrópodos pueden contribuir, bajo ciertas condiciones, a la diseminación del Cólera. En 1919 Dorset et.aJ reportaron que la mosca doméstica y la mosca de establo podían contaminarse con el virus del GP a través de secreciones oculares o sangre de cerdos infectados. La transmisión a cerdos puede ser por inoculación de una suspensión u homogenizado de moscas domésticas o por la exposición a picaduras luego de 24 horas. Más recientemente Miller et.al (1974) aislaron el virus del GP de moscas y las mantuvo sin infectarse por 72 horas después de ser alimentadas con sangre contaminada. Stewari et.al (1975) aislaron el virus del GP de cerdos inoculados con un p001 de mosquitos; estos cerdos contrajeron el CP desarrollando una infección 37 crónica con una viremia persistente durante 30 o más días. Las especies de mosquitos utilizadas por Stewart fueron Aedes aegyptus y Culex tarsalis, sugiriendo la transmisión biológica y mecánica del virus. Fuentes de Infecdón: Los cerdos domésticos son la mayor fuente de virus, este se multiplica en diversos órganos y es excretado por el moco nasal, saliva y fluidos biológicos. Liess (1987). Los mecanismos de transmisión del virus del CP basados sobre 600 casos ocurridos en los EEUU indican que el trasporte o la movilización de cerdos infectados, constituyeron el 36% yel 25% fue ocasionado por otros mecanismos como préstamo o venta de equipos de porcicultura entre vecinos, cerdos extraviados, perdidos o vagabundos. Otras fuentes de infección se consideran dentro de las siguientes categorías: un 19% asociadas con el uso inadecuado de vacuna: 5% al uso de lavazas o desperdicios de cocina y el 15% restante se debe a una miscelánea de las causas antes mencionadas. USDA (1964). 38 En algunos países los brotes agudos de CP se han considerado como indicadores de infecciones inadvertidas en poblaciones porcinas. En ellas la prevalencia se determina al azar por pruebas serológicas en la piara de cría. Liess (1987). 2.1.6. Profilaxis. Para prevenir efectos los efectos devastadores de la enfermedad, algunos países han establecido medidas de prevención y control: 2.1.6.1. Control: La eliminación de todos los animales sospechosos y enfermos es el mejor método para evitar la difusión de la enfermedad en una granja, región o país. Los estudios de patogénicidad del virus del CP y las características epizootiológicas de la enfermedad demuestran que la principal forma de transmisión es por contacto directo y por portadores sanos. El incumplimiento de esta norma ha mantenido constante una alta incidencia de la enfermedad en muchas regiones del país, en las cuales se elaboran embutidos con carne procedente de animales enfermos, estos productos refrigerados protegen las características patogénicas del virus y frecuentemente 39 desencadenan brotes de la enfermedad en granjas que aún utilizan lavazas sin cocimiento en la alimentación del cerdo. Las medidas de prevención son básicamente las mismas que se toman para otras enfermedades porcinas contagiosas. Mogollón (1988): Evitar el envío de animales infectados o sin vacunar al matadero, a las ferias y a otros sitios de dispersión. Realizar limpieza y desinfección estricta de las instalaciones, vehículos y todos los objetos que hayan podido ser contaminados por cerdos infectados y sus excreciones. Evitar la alimentación de cerdos con lavazas no tratadas. Realizar cuarentenas y controles serológicos a todas las nuevas adquisiciones de la granja. Ejercer estrictas medidas de control de movilización a la piara. 2.1.6.2. Vacunación. Su objetivo es reducir el número de brotes agudos de la enfermedad. Si se usa en forma masiva puede ayudar a erradicarla. Se conocen cuatro procedimientos para la protección contra el CP. Fechner (1966): oMétodos de inoculación simultánea. 1ølJO1 A 40 Vacunación con virus inactivado. Vacunación con virus vivo modificado. •Inyección de suero hipennmune. 2.1.6.2.1. Inoculación simultánea: Este método se comenzó a aplicar en 1908 en EEUU y consistía en inyectar simultáneamente un virus virulento y suero hiperinmune. Dunne reportó en 1967 que el empleo de una cantidad suficiente de antisuero (un mililitro por libra de peso corporal hasta las treinta libras), junto con el virus virulento, eliminada prácticamente la posibilidad de que se produjera la enfermedad, y estimulaba una protección adecuada, sin embargo el uso excesivo de antisuero era capaz de interferir con el desarrollo de la inmunidad activa. 2.1.6.2.2. Vacunas con virus inactivado: Las vacunas preparadas con virus inactivado han sido tratadas con formalina, calor, cristal violeta, etc. La utilización de vacunas inactivadas produce títulos de anticuerpos relativamente bajos por pruebas de seroneutralización, Carbrey et.al (1969). 41 2.1.6.2.3. Virus vivo modificado: La atenuación de las propiedades patógenas de un virus sin perder su característica inductora de anticuerpos se puede conseguir por diversos procedimientos. Dunne (1967). Este método de vacunación utiliza productos preparados con virus vivo modificado por pasajes en conejos, cerdos, o cultivo de tejidos. Baker (1946), Mott (1961). La multiplicación in-vitro sobre cultivo de células permite manejos estériles mucho más satisfactorios que la utilización de animales, en los cultivos celulares se controlan contaminantes bacteriológicos, micoplásmicos o virales. Van Waveren (1956). En una investigación realizada por Terpstra y Tielen en 1976, se examinó en diversos grupos de edad la formación de anticuerpos en lechones de hembras inmunes y no inmunizadas después de la inoculación con la "Cepa China", además se estudio el efecto de una revacunación sobre el título sérico en hembras, que habían recibido uno o tres años antes una dosis única de virus C. Las mediciones de anticuerpos se efectuaron por la prueba de reducción en microplaca en células PK 15 y por la prueba de inmunofluorescencia indirecta, Ressang and Van Bekkun (1973). 42 Los lechones de cerdas no inmunes se vacunaron con éxito a partir de la segunda semana de vida. En estos animales persistieron los anticuerpos neutralizantes hasta la edad de matanza, a un nivel que se considera protectivo frente a un desafió. El estudio demostró que el virus C se puede difundir de lechones vacunados a sus madres no vacunadas y a sus hermanos de lechigada. Según Phillips (1966) el criterio más importante para considerar una vacuna inocua es que no produzca signos de Peste Porcina, tales como fiebre, inapetencia, muerte o lesiones macroscópicas. 2.1.6.2.4. Suero Hipennmune: Según Fechner (1966), el uso de suero hiperinmune contra la peste porcina fue introducido en Alemania por Uhlenhuth después de haber sido demostrado que el suero de animales convalecientes produce en los cerdos sanos una defensa frente a las infecciones naturales. 2.1.6.2.5. Vacunación en Colombia. Las cepas utilizadas para la fabricación de vacunas son: cepa GPE, Cepa PAV y Cepa China Lapinizada (LPC) 43 producidas en cultivos celulares; Cepa China (cepa C) y LPC, producidas en conejo. Aynaud (1988); Ogawa and Hatareyama (1984); Terpstra and Tielen (1976). La cepa LPC es utilizada en Colombia para la fabricación de vacunas contra la Peste Porcina. Esta vacuna se elabora con virus vivo modificado "Cepa China", preservado con sustancias tampones, liofilizado y mantenido en envases de vidrio, neutro sellado bajo condiciones de vacío. Esta vacuna tiene gran poder inmunógeno si se conserva en condiciones óptimas y se administra en cerdos sanos. Cada ampolleta contiene: 1000 dosis infectantes, penicilina y dihidroestreptomicina (como preservativos). El laboratorio recomienda aplicar la vacuna a cerdos mayores de tres semanas, garantizando inmunidad sólida desde el octavo día de su aplicación con refuerzo anual. La dosis para cada cerdo es de 2 ml. 44 Las vacunas inducen anticuerpos neutralizantes en cerdos. Terpstra and Wensvoort (1987). Se demuestra que existe relación directa entre el título de los anticuerpos neutralizantes y la protección que estos producen. Paasch etal (1994). Se reporta que títulos mayores o iguales de 1:25 de anticuerpos neutralizantes evitan que el animal muera cuando es desafiado con una cepa vira¡. Terpstra and Wensvoort (1987). También es necesario tener en cuenta que no solo los anticuerpos neutralizantes son los responsables de la protección, ya que un cerdo sin anticuerpos pude resistir un desafió vira¡. Paasch et.al (1994). 2.1.7. Reacción Inmune. Los cerdos recuperados del CP desarrollan anticuerpos contra el virus de CP. Ellos aparecen tardíamente en la circulación. Y pueden ser demostrados por técnicas de neutralización, inmunofluorescencia indirecta, inmunodifusión, fijación de complemento y de hemaglutinación pasiva, siendo las pruebas de neutralización las más específicas, por ejemplo se puede diferenciar entre 45 anticuerpos para los virus de el CP y la DVB. Bajos títulos de anticuerpos neutralizantes para CP pueden surgir de infecciones con DVB. Las pruebas de neutralización son más rápidas y se pueden aplicar a gran escala. Jensen (1981), Terpstra and Robijns (1984). Anticuerpos neutralizantes también pueden ser producidos durante el curso agudo y subagudo del CP, Mengeling and Packer (1969). Cerdos infectados con CP crónico, eventualmente tienen una respuesta específica de anticuerpos, con ocurrencia simultanea de virus y anticuerpos en la sangre. Mengeling and Packer (1969). Los anticuerpos para el virus de CP se forman solamente en la fase terminal del desarrollo fetal. Trautwein et.al (1977). Cerdos con CP congénito rara vez producen anticuerpos específicos: el tamaño de tales cerdos es normal, producen respuesta inmune para antígenos no relacionados con el virus de CP, quedando inmunotolerantes. Van Oirschot (1992). Cerdos que no desarrollan una respuesta de anticuerpos normal luego de un primer contacto con el Virus del Cólera Porcino (VCP) se pueden reexponer a este virus, dando así una hiperreactividad caracterizada por un período de incubación más corto y una infección más severa que en cerdos infectados 46 primariamente, pero permitiendo así una resistencia aumentada a las cepas virulentas. Se debe tener en cuenta que los cerdos infectados persistentemente con el CP de baja o moderada virulencia tienen una supervivencia prolongada cuando se inoculan con cepas de alta virulencia. Van Oirschot (1992). Las inmunoglobulinas representan del 49.2% al 75.9% de las proteínas calostrales del cerdo y la lgG del 65.3% al 89.3% de las inmunoglobulinas calostrales. La concentración de todas las inmunoglobulinas es más alta en el calostro que en el suero, pero su proporción es diferente. La inmunoglobulina A tiene más alta proporción en calostro que en suero. Porter (1969). 2.2. DIARREA VIRAL BOVINA La infección del ganado lechero con el virus de la Diarrea Vira¡ Bovina (DVB) fue descrita por primera vez en New York en 1946, se aisló en cultivo de células de riñón bovino en 1957. Este agente cuya distribución es mundial causa la 47 Enfermedad de las Mucosas (MD) en bovinos denominada comúnmente Diarrea Vira¡ Bovina. Paton et.al . (1992). Su transmisión se efectúa por contacto con alimentos, agua y desechos contaminados. Se presenta en forma aguda, crónica y subclínica, siendo esta última la más común. Bielefeldt (1983), Bolin (1990). La infección post-natal con el virus de DVB en cerdos tiene un curso subclínico y ocasionalmente aparecen infecciones pre-natales. La infección in-útero con este virus puede ocasionar muerte prenatal o perinatal. Los cerdos nacidos pueden aparecer clinicamente afectados, estar aparentemente sanos o pueden permanecer infectados persistentemente y desarrollar signos de enfermedad o anticuerpos tempranos o tardíos. Esto generalmente se observa en infecciones experimentales. Terpstra and Wensvoort (1988). 2.3. REACCION CRUZADA. La primera descripción de la relación antigénica entre el virus del GP y el de la DVB indica un alto grado de homogenicidad. Darbyshire (1960). Esto ha sido 48 confirmado por numerosos investigadores y la relación fue extendida a la enfermedad de la frontera. Moenning (1992). Antisueros policlonales contra pestivirus generalmente distinguen las diferentes cepas por pruebas de inmunofluorescencia o inmunodifusión. A través de ensayos de neutralización cruzada se diferencia el virus del CP y los pestivirus de los rumiantes. Los serotipos o serogrupos pueden ser completamente diferenciados. Aynaud et.al (1974), Neukirch et.al (1980). La envoltura vira¡ parece ser el sitio de mayor variación antigénica y el desarrollo de anticuerpos monoclonales directamente contra pestivirus, ofrece facilidades para un análisis detallado. Anticuerpos monodonales contra VCP son dirigidos contra la envoltura vira¡, glicoproteína (gp53) y la mayoría muestra neutralización M virus infectante, indicando que la glicoproteína 53 constituye una parte importante de la membrana del virion. Los anticuerpos monoclonales reaccionan con una especie homóloga aislada pero siempre neutralizándola completamente Greiser-Wilke et.al (1990). Estas observaciones indican que la función o papel de la conservación de epitopes neutralizantes del virus del Cólera Porcino puede variar de virus a virus. Moenning et.al (1989). 49 Los anticuerpos monodonales contra la mayor glicoproteína viral son útiles para el análisis de la composición antigénica de Ja superficie vira¡. Los Flavivirus, pestivirus ofrecen sitios antigénicos en la superficie de cada uno, incluyendo epitopes individuales. Heinz and Kunz (1981). Usando vanas técnicas Wensvoort (1989) realizó un mapeo topográfico y funcional de la gp 53 del VCP usando 13 anticuerpos monoclonales y reorganizando diferentes epitopes de la cepa Brescia homóloga. Cuatro sitios (A1-3, 8, C, O) fueron identificados por estudios competitivos, ensayos de captura de antígenos, neutralización y aislamiento de mutantes libres neutralizantes. El sitio Al y A2 puede ser conservado en todas las cepas del virus del CP. Los sitios A3, B, C, D, despliegan alguna variabilidad. El sitio A,B,C puede ser también importante en la inducción de anticuerpos neutralizantes. Una neutralización sinérgica puede observarse cuando se usan anticuerpos monodonales contra Al y B ó Al y C. Neutralización cruzada entre el virus del CP y pestivirus de rumiantes usando anticuerpos monodonales no están descritas. Esto en contraste con el resultado obtenido con antisueros policlonales con propiedades de neutralización cruzada; una exploración tentativa es la neutralización cruzada siendo efectiva y utilizada para más de una 50 especie de anticuerpos a diferencia de los anticuerpos monoclonales que tienen un solo sitio antigénico en la glicoproteína vira¡ mayor. En general los anticuerpos monoclonales con una extensa reactividad, son dirigidos contra la proteína no estructural p125. Peters et.al (1986), Edwards et.al (1989). Este resultado concuerda con la secuencia genómica de datos evaluables que indican una mayor homogeneidad (>80%) en las respectivas partes del genoma de los pestivirus. Collett et.al (1989) , Moormann et.al (1990). Dentro de la relación se encuentran varias analogías: FISICO-QUIMICAS Respuesta idéntica a la ultrafiltración y a la ultracentrifugación. Magnitudes similares y densidad débil. Sensibilidad comparable con respecto a temperatura, pH, éter, cloroformo, desoxicolato y tripsina. Los dos virus tienen una base de RNA y contienen lípidos esenciales. Notables analogías en microscopia electrónica en cuanto a morfología y dimensiones. 51 CULTURALES: Aunque se cultivan en sistemas celulares diferentes, el virus de DVB y el de CP se han podido adaptar a las células renales de bovinos. La velocidad de crecimiento es similar. El efecto citopatogénico es variable en las diferentes cepas de DVB yVCP. INMUNOLOGICAS: Se ha notado un fenómeno de interferencia entre los dos virus, el del GP inhibe el crecimiento de cepas citopatogénicas de la enfermedad de las mucosas adaptada en células PK15. Se cree que el fenómeno de respuesta hacia los dos virus es idéntico, es decir, que los sistemas enzimáticos de las células infectadas se movilizarían sobre el primer virus infectante y no podría actuar contra el segundo. Se considera que no es debido a la producción de interferón . Gibbs (1981), Maramorosch (1991), Saural et.al (1972). Por sus propiedades similares la detección de los virus se dificulta pues presentan reacciones cruzadas en las pruebas serológicas, una forma de diferenciarlas es realizar diluciones a la muestra analizada, pues el virus del CP 52 tiene un título mayor que el virus de la DVB, cuando se emplean antígenos homólogos. 2.4. DIAGNOSTICO Las técnicas de diagnóstico más usadas son: anticuerpos ligados a peroxidasa (PLA) y la inmunofluorescencia (IF), los cuales se utilizan para detectar antígenos o anticuerpos contra los virus den GP y DVB. En ambas se pueden emplear anticuerpos policlonales o monodonales, que ayudan en el diagnóstico diferencial de los diversos virus que conforman el género pestivirus. Dahie et.al (1991). Sin embargo en estudios realizados para evaluar las técnicas se ha concluido que la PLA es más sensible mientras que la lF es más fácil de realizar. Pejsak (1993). En general los pestivirus son difíciles de propagar en cualquier línea celular, pero el virus de GP es relativamente fácil de replicar en las células PKI 5 (células de riñón de cerdo), permitiendo así detectar anticuerpos en los sueros de los cerdos. Rivero et.al (1988). Centro de IJOC(irncfj;çj 53 CEIs, La seroneutralización en cultivo celular es el método más específico en el diagnóstico de CP. Consiste en mezclar cantidad constante de virus con diluciones variables de suero, inocular cultivos celulares y revelar el virus no neutralizado por inmunofluorescencia directa. Carbrey et.al (1969), Cortes et.al (1982). Esto también puede hacerse visible utilizando suero marcado con peroxidasa, Terpstra and Robijns (1984). Se presentan falsos positivos por seroneutralización, si el cerdo esta infectado con virus de DVB (por su similitud antigénica con el GP). Neukirch et.al (1980), Matthaeus (1981). La prueba de seroneutralizadón es oficial para la lucha y erradicación del GP en Europa. Todos los sueros que poseen la capacidad de neutralizar el virus de GP entre las diluciones 115 1140 deben ser sometidos a una prueba idéntica frente al virus de la diarrea vira¡ bovina. Broint et.al (1983), Jensen (1981), Liess (1981). La inmunofluorescencia indirecta: su especificidad es inferior a la de la seroneutralizadón pues no permite distinguir los anticuerpos inducidos por el virus del GP y por el virus de DVB. Ressang and Van Bekkun (1973). En el laboratorio para la propagación del virus de GP se utiliza cultivo celular PKI 5, 54 el cual debe ser suplementado con suero fetal bovino (SFB) libre de anticuerpos y antígeno de DVB, que son frecuentemente contaminantes de estos. Si el suero utilizado tiene anticuerpos contra el virus de DVB va a interferir haciendo que el virus del CP pierda habilidad para infectar las células. Si hay antígeno de DVB se van a presentar falsos positivos. Carbrey et.al (1984). 25. COLERA PORCINO EN COLOMBIA. 2.5.1. Grado de tecnificación de la industria porcina. Según el tamaño de la piara, se puede dividir en diferentes estratos del 1 al 4. Esta clasificación coincide con el grado de tecnificación teniendo en cuenta materiales de construcción, área, cantidad, grado de automatización, etc. Tecnología artesanal o simple: cobertizo rústico, comederes o bebederes equivalentes a una llanta ó balde, sitios de parición improvisados. Piaras estrato 1 (<25 animales). Tecnología media: cobertizos en teja, piso en cemento, comederes o bebederes de asbesto o cemento. Piaras estrato 2 (<175 animales). 55 Tecnología superior: Bebederes y comederes automáticos o semi automáticos, cerca eléctrica para pastoreo, corrales de ladrillo o cemento. Piaras estrato 3 (>175 animales). Tecnología especial: Planta de alimentos, de tratamiento de agua, jaulas parideras, de gestación y precebos. Piaras estrato 4 (>500 animales). Según los parámetros reproductivos y productivos los estratos 1 y 2 (no tecnificados), la edad de las cerdas para la primera monta varia entre 7,7 y 8,6 meses y el peso de ellas oscila entre 60 y 80 Kg., mientras que en piaras estrato 3y4 (tecnificado) la edad de monta es 7,3 y 7,6 meses y el peso es de 95 a 105 Kg.; siendo esta última la edad y peso adecuado para realizar la primera monta a las hembras de cija. Esto también va a influir en el número de partos por año y en la cantidad de lechones nacidos vivos y en el peso que tengan. En cuanto a la alimentación en los estratos 1 y 2 se utiliza una pequeña proporción de concentrado. La tendencia a usarlo aumenta a la medida que crece el tamaño de las explotaciones. 56 Tipo de explotación predominante: Las piaras de estracto bajo se caracteriza por ser cebadoras, en estratos medios predominan granjas de cria, pero a medida que el tamaño de la piara es mayor, existe una más alta participación de explotaciones integrales (cria, levante y ceba). Tamaño de explotación predominante: Las granjas no tecnificadas predominan en nuestro país en un 97.7% mientras que las granjas mayores de 500 animales corresponden a un 0,03% de las existentes en el país. La mayor proporción poblacional esta en los grupos correspondientes a explotaciones pequeñas, particularmente en el grupo de menos de 25 cabezas, el cual abarca el 70,3% de porcinos del país. 2.5.2. Situación en Colombia: El análisis de los registros del centro de diagnóstico de Bogotá y de los informes de la oficina de sanidad animal del ICA, dejan claro que las muestras sospechosas por diagnóstico dínico, patológico, corresponden en su mayoría a piaras con poblaciones hasta de 175 animales y que aún predios con poblaciones entre 2 y 25 animales, aportan el 53,7% de los casos de cólera. 57 Aparentemente, el problema del CP se presenta en el país en relación inversa al tamaño de la piara y por consiguiente a su tecniflcación. Se informa así mismo que hay baja morbilidad (10.1 a 34%) y baja mortalidad (9.1 a 28.3%). En todos estos reportes, se desconoce si se aplica vacuna, aunque se supone que es mínimo su uso. Esta baja morbi-mortalidad, junto con el bajo número de casos reportados por año, Figura N°1, y la limitada distribución de la enfermedad (1987, 15 departamentos; 1988,12; 1898,9; 1990,9; 1991, 10) podrían sugerir que las cepas del CP actuantes en Colombia son de baja virulencia y de baja capacidad de propagación (considerando desde luego la existencia de problemas inherentes a su reporte y diagnóstico). Se sugiere que el CP se presenta en forma soterrada y permanente, con bajo número de casos, con signologia atípica, en un número indeterminado de piaras cuyas características específicas se desconocen y que por condiciones del medio ambiente especiales se aumenta el número de casos y la virulencia, dando origen a epidemias con morbi-mortalidad, lesiones y signos característicos. w 58 i il 1 Figura N 9 1: Visceras positivas por anticuerpos fluorescentes a CP en años 1984/1993 VISC ERAS O MUESTRAS POR AÑO M POSITIVAS POR AÑO / 2 1 (1) 1(O w W ico o o w z lj "ia 1084 1085 1988 1987 1988 1980 1990 1991 1992 1998 AÑOS 3.MATERIALES Y METODOS PARA LA TECNICA DE NEUTRALIZACION DE LA FLUORESCENCIA 3.1. MATERIALES: PBS Medio MEM Tubos Leighton Suero Equino Suero Fetal Bovino Irradiado. Pipetas eppendorf 10, 25, 50, 200, 100 1. Virus: Cepa de GP aislada de un brote natural en el valle del Cauca y mantenida a nivel de laboratorios por pases en porcinos. Antígeno utilizado en el laboratorio de control de insumos pecuarios (LAN IP) del ICA. Título (dosis infectante cultivo celular 0,2 mi) DICG/mi. 60 Suero positivo control: Obtenido en el laboratorio LAN 1 a partir de un porcino vacunado y retado con la cepa de CP arriba mencionada. Suero negativo control: Obtenido de cerdos no vacunados, mantenidos en aislamiento, con resultados serológicos negativos al cólera porcino. Conjugado específico: Obtenido de la NADL (E.U) suero anti-HC conjugado con lsotiocianato de Fluoresceina. Cultivo celular: Células PKI 5, mantenidas en medio MEM, adicionado de suero fetal bovino irradiado a partes iguales con suero equino, además contenía Penicilina, Streptomicina, Anfotericina y Glutamina, Anexo A. Las laminillas en tubos Leighton se prepararon a partir de células de 48 horas de incubación a 37°C (desprendidas con tripsina verseno); las laminillas luego de 48 horas de incubación a 37°C se lavaron con PBS antes de ser infectadas. Anexo B. yC. sueros en estudio: La escogencia del cerdo a muestrear se hizo "intencionada" que es un método no probabilistico en la que las características cualitativos (nc o r p.c,Jc CI Centro de Documentación 61 CEISA de su distribución (sexo, edad) son similares a las de la población objeto.Se seleccionaron las muestras de acuerdo al tamaño de la piara, calculada según Cannon y Roe (1982) con un nivel de confianza (95%) precisión obsoluta (5%) y una prevalencia esperada (variable de 30 a 50%). Piaras menores de 175 animales, 438 muestras y en piaras mayores de 176 animales 290 muestras. Se estudiaron sueros porcinos tomados durante 1993 y 1994 en varias regiones M país y hacen parte del banco de sueros del Laboratorio de Enfermedades Virales Porcinas del CEISA. Conservados a -30°C, los sueros presentaban buen estado de conservación en el momento de la prueba, luego de ser descongelados, se inactivaron a 56°C por 30 minutos. Análisis: Básicamente el estudio consistió en un análisis epidemiológico descriptivo. Para la comparación de resultados se utilizó la prueba de Chi cuadrado, en todos los casos se trabajó con un nivel de confianza del 5%. 62 3.2. METODO: Se siguió el descrito por Liess y Prager (1977); Snyder et. al (1981) y utilizado en el laboratorio nacional de drogas. Básicamente consiste en la neutralización M virus del cólera porcino por anticuerpos existentes en el suero, utilizando cantidades variables de suero y fijas de antígeno. El antígeno no neutralizado se replica en la monocapa celular durante el período de incubación y se detecta con conjugado especifico anticólera porcino marcado, como fluorescencia intracitoplasmática por medio del microscopio de Fluorescencia. Del virus se emplearon 100 DICC, titulado cada vez que se realizaba la prueba. Todos los sueros fueron probados inicialmente en dilución 1:8. Se mezclaron partes iguales de suspensión del virus yde la dilución del suero, considerándose así diluido el suero 1:16 y conservándose las 100 dosis del virus. Se hicieron controles de los sueros problemas, también de sueros positivo y negativo al CP como controles de la prueba. Esta mezcla se incubó una hora a 37°C en baño maría(neutralización); luego se adicionó 0.3 ml de suspensión a tubos Leighton dos por cada dilución 63 previamente lavados con PBS. Los tubos se incubaron una hora a 37°C agitando cada 15 minutos. A cada tubo se agregó 1.7 ml de medio MEM luego se incubaron a 37°C por 72 horas. Se fijaron las laminillas por 20 minutos en acetona químicamente pura, se colocaron en cámara húmeda y se cubrió la monocapa con 50 lil de conjugado, se incubaron por 40 minutos a 37°C. Luego se lavaron cuidadosamente dos veces con PBS, pH 7.2 (Anexo O) y una con agua destilada por 5 minutos cada vez. Se cubrió cada laminilla con 50 lLl de azul de Evans (colorante de contraste) y se conservaron por 3 minutos, luego se lavaron como en el paso anterior. Las laminillas se montaron en glicerina buiferada al 50% y se leyeron al microscopio de luz fluorescente con objetivo de 25X y 40X. Ver Anexo H. Aquellos sueros que fueron positivos en la dilución 1:16, se titularon posteriormente hasta la dilución 1:128, siguiendo exactamente el mismo procedimiento. 41 am 3.3. INTERPRETACION: Se consideró negativa (sin anticuerpos) la presencia de cualquier foco de fluorescencia y la ausencia de fluorescencia como positiva. En la titulación de sueros, la dilución más alta que neutralizaba el 100% de fluorescencia corresponde al título del suero. Fotografía N°1 y NO2. 65 -.... j::. -'-. •'- --•- -•.'•- _ -1 ) Fotografía N0 1. Fluorescencia positiva. Fotografía N O2. Fluorescencia negativa. [JI 4. RESULTADOS 4.1. GENERALES Los 783 sueros estudiados se colectaron durante 18 meses (Enero de 1993 a Julio de 1994) en ellos se detectó la presencia de un 63.2% (4951783) de sueros negativos y un 36,8% (288/783) de sueros positivos. (se consideran negativos, los sueros que no mostraron anticuerpos en la dilución 1:16). La distribución de los sueros positivos por título de anticuerpos, Figura N°2, Tabla N°1, establece que más del 75% de ellos tenía títulos inferiores a 1:32. El promedio geométrico fué de 29.20. - 6! Figura N°2: Distribución por títulos de sueros positivos a Cólera Porcino sobre 268 sueros estudiados iiii 145 5410% - \1680% 160% 75001,"--. 45 58 20 TITULO DE ANTICUERPOS 0 1:169 1:32 0 1:849 :L. l:1 68 Tabla N0 1. Porcentaje de distribución por títulos a cólera porcino sobre 268 sueros estudiados. 4.1.1. Sexo. Al observar la negatividad de los sueros, considerando la variable sexo, encontramos que de 266 sueros de hembras estudiadas, 99 fueron negativos (68,3%) y de 121 sueros de porcinos machos, 95 fueron negativos (78,5%), no mostrando diferencia significativa. La observación discriminada por sexo, muestra que en sueros de hembras, sobre 46 positivos, se observó que más del 82% de los sueros tenían anticuerpos menores de 1:32. Tabla NO2, Figura NO3. 69 I11J Figura N 2 3: Comparación de sueros positivos a Cólera Porcino según el sexo. 1:16 1:32 TITULO DE ANTICUERPOS 14 >1:125 70 Tabla NO2. Distribución de sueros de hembras porcinas positivas a cólera porcino, por título sobre 46 sueros estudiados. 1:16 1:32 1:64 1:128 geomE ^ 30 8 3 5 65.2 17.4 6.5 10.9 Aunque el número de sueros de machos estudiados es muy bajo 26, se aprecia una distribución muy similar a la de los sueros hembras. Tabla NO 3. El promedio geométrico de muestra que el sexo no influyo en la respuesta serológica. Tabla No.3. Distribución de machos positivos al cólera porcino, por título, sobre 26 sueros. 1:16 1:32 1:64 ^ 1:128 geom 19 2 o 5 73.1 7.7 0.0 19.2 71 4.1.2. Edad Sobre 163 muestras pertenecientes a animales mayores de seis (6) meses, 107 fueron negativos (65,6%). Dentro de este mismo grupo sobre 56 sueros positivos, la distribución por títulos corresponde en un 50% a la dilución 1:16. Tabla N04. Promedio geométrico. 30.81 Tabla N04. El porcentaje de distribución de sueros porcinos positivos al CP según título detectado. El número de sueros estudiados dentro del grupo de animales menores de seis (6) meses de edad, no permitió analizar este resultado. 72 4.2. TAMAÑO DE LA PIARA. Existe un alto grado de correlación entre el tamaño de la piara y el nivel de tecniflcación de las instalaciones. En piaras con población superior a 175 animales se tomaron 290 sueros de los cuales 168 (57,9%) fueron negativos. En 438 sueros de piaras con población menor de 175 cerdos 308 (70,3%) no presentarón anticuerpos y 130 fueron positivo (29.7%). Se encontró diferencia significativa entre porcentajes de sueros negativos de animales procedentes de granjas con los dos diferentes tamaños de población. Tabla N°5. Figura N°4. Tabla N0 5. Porcentaje de sueros porcinos positivos y negativos al cólera porcino hallados en granjas con diferente población. Piaras con más de 176Piaras con menos de 175 cerdos cerdos RESULTADOS N°Sueros Porcentaje N°Suero Porcentaje NEGATIVOS16857.930870.3 POSITIVOS12242.113029.7 I,!IJ 73 Figura N°4: Comparación de sueros positivos y negativos a Cólera Porcino en granjas de diferente población. TECMFICACION O p tAaAs> 170 CERDOS • PLNAS 80 70 1- 50 w 40 CL ji AiI <1:10110 1.32 104,1 1 TITULO DE ANTICUERPOS ti 74 En piaras de más de 175 animales se detectaron 122 sueros con títulos al cólera en piaras menores de 175 animales hubo 130, su distribución comparativa aparece en la Tabla N 06. Figura N 04. El promedio geométrico en los dos tipos de poblaciones no presentan diferencia significativa. Tabla N06. Porcentaje de comparación de títulos serológicos al CP en poblaciones porcinas de diferente tamaño poblacional. Piaras con más de 176Piaras con menos de 175 cerdos cerdos TITULON°Sueros Porcentaje N°Suero Porcentaje 1:166553.37255.5 1:322722.12720.8 1:64 1310.77 5.4 ^ 1:1281713.92418.5 Promedio geométrico: > 176: 28.27 <175: 29.21 4.2.1. Edad. En piaras con poblaciones de más de 175 se estudió la influencia de la edad encontrándose que en animales mayores de seis (6) meses y sobre 48 sueros .111 75 estudiados, 34 fueron negativos (70,8%) y 14 positivos (29,2%). En granjas con poblaciones menores de 175 cerdos se encontró que de 95 sueros estudiados, 60 fueron negativos (63,2%) y35 (36,8%) fueron positivos. Tabla N07. Tabla N07. Porcentaje de distribución de sueros negativos y positivos en cerdos mayores de seis meses procedentes de piaras de diferente tamaño. Piaras con más de 176Piaras con menos de 175 cerdos cerdos RESULTADOS N°Sueros Total % N°Suero Total % NEGATIVOS3448 70.86095 63.2 POSITIVOS1448 29.23595 36.8 En la Tabla N°8, Figura N 05., se observa la distribución de títulos a cólera porcino, en cerdos mayores de seis meses, pertenecientes a piaras de diferente tamaño. r ;"f Figura N°5: Comparación de sueros positivos en porcinos mayores de 6 meses según la tecnificación EDAD PIARA$<175CERDOS PWS> 178 CERDOS sol 40 w 14 z W o Ét O lo 116 132 164 TITULO DE ANTICUERPOS >1. 1 r VA Tabla N 0 8. Porcentaje de distribución al CP de sueros porcinos mayores de seis meses procedentes de granjas de diferente tamaño. Piaras con más de 176Piaras con menos de 175 cerdos cerdos TITULON°Sueros Porcentaje N°Suero Porcentaje 1:16 857.11440 1:32 42861028.6 1:64 00.0514.3 >t 1:128214.3617.1 Promedio geométrico: > 176: 26.21 <175: 33.92 En las granjas con más de 175 animales no se tomaron muestras de animales menores de seis meses. En las granjas menores de 175 animales solamente se tomaron 13 sueros pertenecientes a animales menores de seis meses de los cuales 9 fueron negativos (69,2%). L 78 4.2.2. Sexo. La influencia del factor sexo dentro de granjas de diferente población aparece en la Figura N06. En las granjas con más de 175 animales sobre 109 sueros estudiados, hubo 56 hembras negativas (51,4%) y 53 machos negativos (48,6%). En granjas menores de 175 animales, sobre 71 sueros estudiados hubo 33 hembras negativas (46,5%) y38 machos negativos (53,5%). 4.3. DISTRIBUCION GEOGRAFICA. Los sueros seleccionados se tomaron de 25 municipios en nueve (9) departamentos del país. Figura N°7. El total de sueros tomados por departamento, los negativos y su porcentaje, aparecen en la Tabla N09. Se observa claramente que existen departamentos como Sucre, Córdoba y Meta con mayores porcentajes de sueros negativos (72,7 a 91.8%). Los restantes departamentos presentan porcentajes de negatividad más bajos, pero siempre superiores al 50%. im 79 Figura N 9 6: Porcentaje de negatividad al VCP según sexo, de acuerdo a la tecnificación. 56 Tecnificado fl _ 948609/10-1- SEXO HEMBRAS MACHOS 33 ,-4650%; No Tecnificado .5350% Tabla N°9. Porcentaje de negatividad a cólera porcino en sueros porcinos según distribución geográfica. DPTO MCPIO PIARA SUEROS NEGATIVOS % Clmarca8101367252.9 Valle3519412262.9 Caldas118562.5 Chocó4matader.664263.6 S!der23804455 Nquia91221913963.5 Meta1matader.11872.7 Sucre1matader.201890 Cordoba17494591.8 Fi 82 4.4. DISTRIBUCION TEMPORAL. Al analizar los sueros durante el año y medio de estudio, se encontró la siguiente distribución semestral. Tabla N°10. En el primer semestre de 1993 se estudiaron 396 sueros de los cuales 271 (68,4%) fueron negativos, no se observó diferencia significativa con los detectados durante el segundo semestre. Sin embargo, si hay diferencia con el 51% hallado en el primer semestre del 94.Tabla N. 10. Tabla N°10. Porcentaje de negatividad a GP de sueros porcinos colectados durante 1993 y 1994. 1993 1994 PRIMER SEGUNDO PRIMER SEMESTRESEMESTRESEMESTRE Neg.Est.%Neg.Est.%Neg.Est.% 27139668.413520864.98115951 Los sueros positivos con títulos 1:16 fueron los más abundantes en cada semestre de estudió. Llama la atención el mayor porcentaje de sueros con títulos 1:128 detectados en el primer semestre del 94. Figura No. 8. 83 Figura N°8: Comparación de títulos a CP durante 1993y primer semestre de 1994. w-) 4 z w o ft 03 EL 1:16 1:32 1:64 11TULO DE ANTICUERPOS >1:128 5. DISCUSION. La detección de anticuerpos específicos de GP, es particularmente útil en piaras sospechosas de estar infectadas con cepas de baja virulencia, para detectar infecciones en las hembras de reproducción, en la fase terminal de la erradicación, en períodos intereepizooticos o con baja incidencia de la enfermedad, Liess et.al (1976), y son imperativos si un país desea ser reconocido internacionalmente como libre de la enfermedad. Vanas pruebas han sido descritas para el diagnóstico de la enfermedad: Doble difusión en agar, Fijación de complemento modificado, Hemaglutinación pasiva, lnmunoelectrofoosmoferesis,etc. sin embargo ellas no diferencian entre anticuerpos contra virus de CP y de DVB. Los resultados positivos tienen que ser confirmados por la técnica de neutralización (NT), Terpstra et.al (1984). Ccrjro deCumcn:Ó( CEISA 85 La NT fué considerada como la única prueba serológica válida en la comunidad europea para los programas de control y erradicación del GP. Se realiza en cultivos celulares empleando una cantidad constante de virus con varias diluciones de suero; debido a que el virus de CP no produce efecto citopético, cualquier virus no neutralizado tiene que ser diferenciado por el método de END, Shimizu and Shimizu (1983), inmunofluorescencia, Ressang and Van Bekkun (1973); Liess et.al (1984), o por Inmunoperoxidasa, Terpstra et.al (1984). Un inconveniente en la interpretación de resultados obtenidos por la neutralización (Nt), es que ocasionalmente los sueros de cerdos infectados con el virus de DVB pueden reaccionar en bajas diluciones con antígeno de CP, Liess et.al (1977); el grado de reactividad cruzada depende de la cepa infectante de DVB, del intervalo entre la exposición y el muestreo y de la cepa de CP usada para la neutralización, Liess et.al (1977). En la industria porcina Colombiana, los diversos sistemas de manejo que se practican facilitan las posibilidades de infección tanto con el virus del CP como con el de DVB. En piaras tecnificadas se esperaría que el lechón recibiera su primer estímulo a través de la vacuna del CP y que por practicarse el sistema Irde granja cerrada, solo recibiera estímulos posteriores también con vacuna de CP, lo cual permitiría tener la certeza de detectar exclusivamente anticuerpos a este virus, sin embargo la tenencia de bovinos por los trabajadores de piaras en sus viviendas, hacen que a través de fomites y del trabajador mismo, contaminen indirectamente su lugar de trabajo con virus de DVB, de esta forma el lechón se contaminaría desde el mismo momento del nacimiento con éste virus. En piaras no tecnificadas la situación es aún más complicada ya que existe mayor posibilidad de infección con DVB cuando los propietarios o sus vecinos tengan bovinos y se reconoce que en dichas piaras no se aplica la vacuna contra CP. En Colombia la infección en bovinos por el virus de la DVB ha sido comprobado anteriormente y es reconocida la amplia e intensa promiscuidad entre especies. Aunque se desconoce la virulencia de las cepas de CP presentes en diferentes piaras, con base en la sospecha que son de reducida virulencia se realizó el estudio inicial de cribado comenzando en la dilución 1:16. Al respecto Terpstra 87 et.al (1984) han sugerido que los altos niveles de anticuerpos contra GP luego de una exposición a cepas de baja virulencia, permiten comenzar con diluciones altas, de tal manera que se sobrepase la reactividad cruzada entre el antígeno de GP y los anticuerpos de DVB. La técnica de Neutralización de la Fluorescencia (NF) ha sido empleada exitosamente en la detección de anticuerpos de CP, Liess, (1981): Loi et.al , (1986), no obstante, su uso rutinario en el laboratorio es restringido por lo laborioso y delicado del procedimiento y por la presencia en algunos sueros porcinos de anticuerpos contra el virus de la DVB, Liess, (1981). Para sortear esos inconvenientes se han hechos modificaciones a la técnica y se han desarrollado otras nuevas, Terpstra, (1991). La técnica de NT utilizada en este estudio es la misma que las autoridades de los Estados Unidos emplearon en la campaña de erradicación de la enfermedad en ese país y demuestra gran• utilidad especialmente cuando los sueros porcinos presentan títulos bajos de DVB. Esta técnica ha sido utiliza satisfactoriamente en estudios llevados a cabo en este laboratorio. 88 Inicialmente cuando se estudia una gran parte de la población para detectar una enfermedad la interpretación de la prueba se dirige hacia una mayor sensibilidad en detrimento de la especificidad. Esto se debe a que las pruebas iniciales no suelen ir encaminadas a lograr diagnósticos definitivos sino a detectar el mayor número de posibles casos. Por lo tanto obtener una alta proporción de falsos positivos (resultantes de una mayor sensibilidad) no es tan critico como obtener una alta proporción de falsos negativos ( resultantes de una mayor especificidad). La técnica de NT utilizada en este estudio ha demostrado una afta sensibilidad, a pesar de los inconvenientes de su manejo el instrumento fiable en estudios de sondeos como el presente. En Colombia la presencia de CP se viene reconociendo desde hace más de 50 años; su diagnóstico se basó en la apreciación epidemiológica, clínica y en algunos casos en las lesiones macroscópicas. Con la aparición de la Peste Porcina Africana en el continente americano en 1971, se mejoraron sustancialmente los mecanismos de diagnóstico a nivel de campo y de laboratorio ampliando el conocimiento sobre el GP, al aumentar su casuística general y la cobertura de la distribución geográfica. A pesar de ello, los casos sospechosos de GP se siguen diagnosticando en el campo con base en la típica 89 forma aguda y hemorrágica de la enfermedad; por esta condición posiblemente los casos de Cólera confirmados en el laboratorio son más bajos de los reales. El reporte disminuido se ve agravado por el costo de las pruebas, necropsias, transporte de carcasas y por la tendencia del dueño (especialmente de piaras notecnificadas) a deshacerse rápidamente de aquellos animales que presentan algunas signología de la enfermedad, sin recurrir a un diagnóstico. La información existente sobre la epidemiología del CP se basa casi exclusivamente en la casuística reportada por los centros de diagnóstico a través de la división de sanidad animal del ICA. Además de los inconvenientes anotados anteriormente, esta fuente de información adolece de otros factores que deben considerarse cuando se toma como base el conocimiento de una enfermedad: la ocurrencia clínica de la enfermedad, suficiente severidad para buscar asistencia veterinaria, disponibilidad de oferta veterinaria, capacidad para el diagnóstico, presencia de laboratorio de diagnóstico, colección y análisis de la información. Considerando que estos factores se han mantenido estables en el trascurso de los últimos 10 años, se ha observado en los informes la ausencia de casos en varios departamentos del país y una fluctuación cíclica de 3 a 5 años. Desde 1989 cuando se presento un brote en el Valle del Cauca, el número 90 de casos disminuyo constantemente sin una explicación evidente; esta nueva situación podría deberse a un aumento en el cubrimiento vacuna¡ de la campaña, y por consiguiente de la proporción de sueros positivos y de sus títulos, lo cual no pudo ser comprobado en el trabajo aquí reportado: de 783 sueros estudiados el 63.7% tenían títulos menores de 1:16. Además la titulación de ellos muestra un reducido número de cifras iguales o superiores a 1:128 y en cambio más del 78% presentaban títulos de 1:16 a 1:32. Una población porcina con un porcentaje alto de sueros sin anticuerpos estaría expuesta a infectarse con el virus y producir un gran brote de la enfermedad. Sin embargo la encuesta también revelo que de las 38 granjas seleccionadas, ninguna era totalmente negativa. Existen factores importantes a considerar sobre esta situación: para evitar brotes agudos clásicos, se desconoce el porcentaje de la población porcina que debería estar protegida (inmunidad de la piara), la posible protección conferida por anticuerpos específicos con títulos bajos Tersptra and Wensvoort (1987); Van Bekkun (1966); la efectividad de la respuesta celular a nivel de campo para prevenir la presencia de la enfermedad; y formas enzooticas atípicas no reportados. 91 El número de sueros porcinos con anticuerpos específicos de GP, debe estar dado por la vacunación, por los animales sobrevivientes a la infección con cepas de baja virulencia, por aquellos infectados in-útero y por la tasa de supervivencia de los anticuerpos. En el primer caso, el número de animales vacunados podría estar relacionado con el grado de tecnificación e indirectamente con el tamaño de la piara. Para el control se han establecido programas de inmunización que han dado buenos resultados, Shimizu, (1980); Terpstra,(1982), esto sugiere que la vacunación puede ser un buen procedimiento para impedir que el virus de campo circule y de esta manera cesen los brotes de GP. Lo opuesto se observo en los Estados Unidos, durante la etapa de erradicación del cólera; cuando de prohibió el uso de vacunas, el número de casos disminuyó considerablemente indicando que la vacunación aumentaba el número de brotes, Dunne, (1975). Con la vacunación generalmente se evita que ocurran brotes, sin embargo su empleo no esta excento de efectos indeseables. El virus silvestre del Cólera y el vacuna¡, pueden causar inmunosupresión del animal al multiplicarse en las células del sistema retículo fagocitico mononuclear endotelial, Gudhay, (1976); 92 Jaeger et.al (1978) y Morilla (1985),ocasionan alteraciones marcadas en órganos linfoides (médula ósea, timo, ganglio linfático), manifestados por leucopenia ytrombocitopenia características de la infección. Estas alteraciones hacen que la respuesta inmune hacia el virus y hacia otros microorganismos disminuya considerablemente por lo que en el trascurso de la enfermedad se presenten infecciones secundarias y septicemia. En los animales que llegan a nacer cuando ocurren infecciones intrauterinas, se establece un estado de tolerancia inmunológica; en este caso el virus es capaz de multiplicarse en los lechones por períodos largos de tiempo sin desarrollar anticuerpos ni respuesta inmune protectora. Se ha observado que cuando hay inmunosupresión en los animales de la granja por diversas causas (intoxicación por micotoxinas en el alimento) se presenta exacerbación de la patogenicidad del virus del Cólera a nivel de campo así como de las cepas vacunales ocasionando brotes de la enfermedad. Durante el curso agudo o subagudo fatal del cólera porcino, se producen anticuerpos, Mengeling and Packer (1969), en casos crónicos los animales que 93 finalmente mueren, también son capaces de desarrollar anticuerpos específicos con detección simuttanea de virus, Mengeling and Packer, (1969). Los cerdos con CP congénito persistente, rara vez, producen anticuerpos específicos y los infectados post-natalmente no presentan respuesta normal de anticuerpos, los neutralizantes pueden solamente ser detectables en forma temporal, Van Oirschot (1981), presentar bajos títulos o estar ausentes Carbrey et.al (1977) ó pueden ser detectados por otras pruebas, Corthier, et.al (1977); Van Oirschot and Terpstra, (1977). Esta respuesta normal puede ser consecuencia de infecciones con cepas de baja inmunogenicidad de reducida virulencia. La existencia de una gran población porcina aparentemente desprotegida, sin reporte de casos o con presentación muy reducida, se podría relacionar con características propias del agente y/o del mercadeo, o quizas con factores desconocidos en nuestro medio. Van Bekkun (1966), observo que los títulos serológicos de cerdos inmunizados con vacuna de cristal violeta, en general deben buena protección frente a un reto; sin embargo de 116 cerdos vacunados que no tenían anticuerpos detectables, 33 (28%) resistieron el reto. Coggins etal (1962) y Launais et.al (1978), han demostrado que algunos cerdos vacunados 94 que no tienen anticuerpos detectables pueden sobrevivir al reto, debido a la rápida respuesta secundaria serológica. Los resultados serológicos para el segundo semestre de 1994 apuntan a un mayor porcentaje de sueros con anticuerpos y de sueros con títulos mayores, y puesto que las campañas de vacunación no han aumentado el cubrimiento, quizas la introducción de nuevas vacunas pueden ser el factor desencadenante de esta observación, aunque podría haber relación con la actividad de cepas de baja virulencia en el campo, o mejora en los servicios de atención al usuario (diagnóstico de campo y de laboratorio). Este fenómeno se observo en otros países cuando al aumentar la importancia dada por el médico veterinario de campo y del porcicultor, aumentó. el número de casos reportados. Los porcentajes de sueros sin anticuerpos fueron mayores en aquellas piaras donde la población era menor de 175 animales. Aunque se demuestra una diferencia significativa, los porcentajes de sueros negativos en granjas tecnificadas también son altos (57.9%). Corpc ko Centro de Dccumentacj ÇEISA 95 Es conocido que el sistema de producción, la densidad de la población porcina, el tamaño, densidad y tipo de piaras en la región, determinan las características de presentación del Cólera Porcino (Terpstra, 1987). Las medidas aplicadas a su control (incluyendo vacunaciones) hacen parte del sistema de manejo empleado por la piara, lo mismo quizás que la virulencia de las cepas de CP actuantes y las características del sistema de transporte y mercadeo. La variable sexo no demostró influencia en la distribución de los sueros negativos: no hubo diferencia significativa cuando se estudio a nivel nacional, lo mismo que cuando se hizo separadamente en granjas por población o por tecnificación. Los factores que determinan la epizootiología del CP están incidiendo en forma similar sobre los dos sexos. En la distribución política (por departamento) se deben considerar factores de confusión, sin embargo, existen claras diferencias en poblaciones sin anticuerpos que bien podrían corroborar el hecho de que hay departamentos que durante años no han enviado muestras sospechosas de CP para su confirmación diagnóstica; siendo explicable su ausencia por los costos y 96 dificultades de toma y envío de muestras, por ausencia de centros de diagnóstico o desconocimiento de la enfermedad entre otras. Además del escaso cubrimiento en la vacunación por deficiencias institucionales (campañas) o baja motivación del usuario, existen otros factores que disminuyen • la respuesta inmune: 1. Bajos títulos de la vacuna medida a nivel de laboratorio productor, aunque este factor ha sido controlado permanentemente por el ICA, bajo las normas establecidas son aprobados los lotes que en la prueba de potencia protejan al 80% de los animales. 2. La inactivación de la vacuna durante la cadena fría; la vacuna de GP se debe mantener entre 2 y 4°C hasta su aplicación, el tiempo que transcurre entre su producción, almacenaje o transporte antes de llegar a su destino final es usualmente muy variable y puede ser una causa común de inactivación. Existen recomendaciones muy precisas para su manejo, sin embargo se sospecha que en muchos casos no se cumplen los requisitos mínimos. 0 97 3. En algunas ocasiones una vez aplicada la vacuna, los cerdos no desarrollan una respuesta inmune aceptable, debido probablemente a que su calendario de inmunización no fue adecuado ó a que los animales estaban inmunosuprimidos. La edad para su aplicación ha sido muy variada y no obedece a estudios previos de características ecológicas o microbiológicas del medio ambiente o requerimientos de la piara regional. Vanos factores que inducen en los cerdos estrés como el destete, cambios bruscos de temperatura, mezcla de animales de diferentes edades y condiciones, alimentación restringida, exceso de ruido o falta de espacio, presencia en la piara de cepas de CP de campo, infección por virus de Aujeszky o por bacterias como Salmonella o Erisipela, así como sustancias tóxicas en el alimento (micotoxinas), pueden también ocasionar inmunosupresión a diferntes niveles en una población afectada. 6. ANTICUERPOS LIGADOS A LA PEROXIDASA La existencia de cepas de baja virulencia del Virus del Cólera Porcino (VCP) que causan infección crónica, atípica y algunas veces ¡naparente, ha estimulado el desarrollo de métodos serológicos para su diagnóstico. Se implantaron diferentes técnicas pero ninguna difenciaba entre anticuerpos contra Cólera Porcino (CP) y Diarrea Vira¡ Bovina (DVB). El diagnóstico serológico más confiable y clásico para el CP es la neutralización de la fluorescencia. Terpstra et.al (1984). Los anticuerpos de CPy DVB pueden ser diferenciados por ELISA anticuerpos ligados a la peroxidasa que son las técnicas más comunmente usadas. Dos diferentes procedimientos de peroxidasa han sido descritos: los anticuerpos ligados a peroxidas (PLA) usada en células infectadas con virus del CP y fijadas con acetona y la neutralización de peroxidasa (NPLA) que es similar a la técnica de neutralización de la fluorescentes. La NPLA es reportada como la más iz específica, pero tanto la NPLA como la PLA poseen igual o mayor sensibilidad que la neutralización de fluorescencia, Pearson,(1992). La prueba de inmunoperoxidasa (PLA) es una técnica para detección de anticuerpos contra los virus del Cólera Porcino y Diarrea Vira¡ Bovina, descrita por Jensen en (1981) y modificada por Terpstra en (1984). La prueba de lnmunoperoxidasa es sensible y específica. Los resultados coinciden con otras técnicas de diagnóstico en un 65% de los casos; según los resultados obtenidos por Schultheiss et.al (1993), trabajo con en herpesvirus equino, la técnica de peroxidasa fue más efectiva que la fluorescencia sobre tejidos. Patricia et.al (1993). 6.1. MATERIALES: PBS. Medio MEM. Suero Fetal Bovino lrradido. Suero equino. 100 Tubos de Leighton.J!IJOTECA AGOFEC1MM rr CQWé4BJA Pipetas eppendorf. Virus: Se utilizó la misma cepa descrita para la técnica de Neutralización de la Fluorescencia (NF). Pág. 60. Suero positivo control: Idéntico a NF. Suero negativo control: Igual que NF. Conjugado específico: Anti p19 Ig G conjugada con peroxidasa (Sigma), desarrollado en conejos. Cultivo celular: Igual a la técnica de NF. Sueros en estudio: Se tomaron 123 sueros negativos (1:32) y 32 sueros positivos por la técnica de NF. Cada suero, incluyendo controles positivos y negativos se trataron con Kaolín al 25%, pH 7.4 con el fin de eliminar sustancias inespecíficas.(Anexo G). Bloqueadores de peroxidasa endógena: Metano¡ absoluto más peróxido de hidrógeno al 30%; suero de conejo diluido en tris salina; agua destilada; suero normal de conejo diluido en tris. (Anexo F.) Diluyente: para lavados y diluciones de suero y de peroxidasa, se utilizó tris salina, pH 7.6 (Anexo E.). 9. :Corp Centro de Documentación CEfS,ó 101 Sustrato: 3.3. diaminobencidina tetrahidrodoilda, (Sigma), diluida en tris, pH 7,6 y peróxido de hidrógeno al 30% (Anexo F). Colorante de contraste: Hematoxilina de Meyer's. Luna (1968). Deshidratantes: Agua amoniacal al 1%, alcohol etílico (absoluto, 90% y 80%) y tres cambios en xilol absoluto. 6.2. MODIFICACIONES REALIZADAS A LA TECNICA Para adaptar está técnica de PLA hubo que superar muchos obstaculos: Escoger la línea celular más adecuada; para ello se probó con ST, MBDK, PK1 5 y Fibroblastos de pollo (cultivo primario), las líneas diferentes a PK1 5 no dieron buenos resultados debido a que en los lavados se desprendían o en su mantenimiento se degeneraban rapidamente. Terpstra et.al (1984). Se realizó tratamiento de los sueros para eliminar inespecificidades; se trataron con HCI, NaOH, Cloroformo, absorción con células usadas o en suspensión y Kaolín al 25% paraa eliminar la coloración de fondo, ya que los sueros no tratados (Kaolín) presentaron coloración café tanto en el núcleo 102 como en el citoplasma, mientras que los tratados no. Torres y González (1993); Meador et.al (1986); Hanssen (1980). Para diluirla peroxidasa se utilizarón diferentes soluciones con diversos tipos de suero (porcino, cabra y conejo), el mejor resultado se obtuvo con el suero de la misma especie en la que se produjó la Anti-lgG, en este caso suero de conejo, Meador et.al (1986). Como fijadores se ensayo formol al 4% y 10%, glutaraldehido, calor (70 a 80°C) y acetona al 67%, 20% y 37%; ellos fijaban las células pero parece que interferian en reacción de la peroxidasa. La acetona al 37% no interfirió y permitió un mejor resultado. Terpstra et.al (1984); OlE Manual (1990); Hanssen (1980). • Al iniciar el proceso se realizó la prueba en placas de poliestileno, Terpstra et.al (1984), pero existió el problema que las células no se adherian o cuando se lela la prueba no se podian interpretar por la gran coloración inespecífica que tomaban los orificios correspondiente a los sueros problema y a algunos 103 controles; por último se decidió realizar la prueba en laminillas de vidrio (tubos de leighton) ya que se eliminaba inespecífidad. 6.3. METODO: Se siguió la metodología descrita por Tersptra (1984) con las modificaciones descritas por Meador et.al (1986) para Brucella abortus sobre tejidos (Anexo 1): No se emplearon bandejas de plástico, sino tubos de Leighton con laminilla. El procedimiento fue idéntico al seguido para la NF antes de la infección de la monocapa. Infectar los tubos con 100 dosis TC de virus de CP. Con cada prueba se hizo titulación de virus empleando 2 laminillas por dilución para corroborar la Dl 50CC. Incubar una hora a 37°C, agitando cada 15 minutos. Adicionar a cada tubo 1.7 ml de MEM e incubar nuevamente, durante 72 horas a 37°C. Retirar las laminillas y lavar una vez con PBS para inmunoperoxidasa. Anexo E. 104 Fijar con acetona diluida en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Anexo E. Lavar durante 10 minutos con agua desmineralizada y durante 30 minutos con metano¡ y peróxido. Anexo F. Lavar nuevamente en PBS durante 5 minutos y 10 minutos con tris-salina buffer pH 7.6. Anexo E. Sumergir en una dilución de suero de conejo en tris salina, por 20 minutos. Anexo F. Colocar las laminillas en cámara húmeda y adicionar a cada una 50 ILl de sueros controles y problemas (dos laminillas por titulación y dilución de suero problema), incubar 1 hora a 4°C. Anexo O. Lavar durante 10 minutos en Buffer Tris salina. la Agregar a cada laminilla 50 pl de antilgG marcada con peroxidasa, diluida 1:200, e incubar 1 hora a 37°C, en cámara húmeda. Lavar con tris salina por 10 minutos. Cubrir con 50 1d de diaminobencidina diluida en solución de tris pH 7.6 yagua oxigenada durante 5 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente. Anexo F. o Lavar con agua destilada por 10 minutos. 105 Colocar en hematoxilina de Meyer's durante 10 minutos, y lavar con agua destilada por 10 minutos. o Sumergir por agua amoniacal al 1% hasta que tome una coloración ligeramente azul. Repetir el lavado con agua destilada por 10 minutos. Deshidratar las laminillas en etanol absoluto, etanol al 90% y etanol al 80%, cinco minutos cada vez. Escurrir y fuego hacer tres cambios consecutivos en xilol y montar con permaunt sobre portaobjetos 6.4. INTERPRETACION: Se consideró un suero como positivo 1:32 (con anticuerpos) cuando el citoplasma de las células infectadas presentó una coloración café, donde resalta la presencia de gránulos de un tono, más intenso. El título del suero corresponde a la dilución más alta que presente esta coloración. Se consideró un suero negativo 1:32 (sin anticuerpos) cuando el citoplasma de las células infectadas presentaba una coloración azul (coloración de contraste) sin presentar gránulos. Ver Fotografía N°3 y 4. flr •• z. * fr4 1 _.4••_ ,_.c -- - - -. -£ Fotografía N°3. Peroxidasa Positiva. r-- .—: -,--- _.l. Fotografía N04. Peroxidasa Negativa. Centro de Docn1e0Ofl çjSA 7. RESULTADOS Y DISCUSION INMUNOPEROXIDASA De un total de 155 sueros estudiados por la prueba de Inmunofluorescencia 86 fueron positivos en diferentes diluciones así: 21 en 1:32, 3 en 1:64 y 8 en >1:128 y 123 sueros fueron negativos ó presentan títulos inferiores a 1:32. Ver tabla N°11 y Figura N°9. Al analizar la prueba de peroxidasa sobres estos mismos sueros se hallo que 48 fueron positivos en dilución 1:32, 30 en 1:64, 29 en >1:128, 48 fueron negativos o menores de 1:32. Promedio geométrico: AF 34.82 PLA 47.41 Los promedios geométricos de los sueros analizados indican una diferencia estadística significativa. rr riul Figura N°9: Comparación de títulos por FAVN y PLA TECNICAS o Ac Fbocorto • & 6 5 w LU CC 2 <132 132 t64 TITULO DE ANTICUERPOS '•• >1126 109 Tabla N°11. Porcentaje de comparación de títulos al GP por las técnicas de anticuerpos fluorescentes y anticuerpos ligados a peroxidasa en 155 sueros porcinos. Anticuerpos Fluorescentes Peroxidasa TITULON° SuerosPorcentajeN° Suero Porcentaje > 1:3212379.34831.0 1:322113.54831.0 1:643 2.03019.3 >1:1288 5.22918.7 TOTAL155 155 En total se obtuvieron por la prueba de AF 32 sueros positivos12 y negativos. Por la prueba de peroxidasa 107 sueros (69%) fueron positivos y 48 negativos (31%). Podemos observar por los resultados obtenidos que la prueba de peroxidasa detecta mayor número de sueros positivos. 110 Tabla N°12. Coincidencia por títulos entre las técnicas de inmunofluorescencia y anticuerpos ligados a peroxidasa, sobre 155 sueros analizados. Por algún tiempo la detección de anticuerpos específicos del GP se basó en la técnica de neutralización de la fluorescencia. Su uso se consideró de gran utilidad en sondeos de poblaciones, sin embargo el hecho de ser una técnica que requiere trabajo especializado y ciudadoso, de requerir un microscopio específico y de reconocer la reacción cruzada con otros pestivirus, planteó la necesidad de desarrollar nuevas técnicas que puedieran superar esos obstáculos. 111 Como consecuencia de esas inquietudes se ha desarrollado una técnica que basada fundamentalmente en los mismos principios es aparentemente fácil de realizar y quizas sea más sensible y específica. La sensibilidad, especifidad, reproducibilidad y precisión de cualquier enayo inmunoenzimático depende de su diseño, anticuerpos, enzimas, método de medición de la enzima y del conjugado (anticuerpo- enzima). Estos puntos constituyen factores limitantes de tales pruebas. La técnica de anticuerpos marcados con enzimas es similar en principio a la técnica de inmunofluorescencia, pero usa gammaglobutina antiespecie unida en forma covalente a la enzima peroxidasa, en vez de gammaglobulina antiespecie unida con varios componentes fluorescentes. Los resultados del desarrollo de la técnica de IP estudiados, permiten visualizar la presencia del virus en forma de focos, lo que favorece un cálculo más preciso, esta característica se observa con la fluorescencia y fué básicamente la metodología sugerida por el departamento de Salud Animal en los Estados Unidos. 112 La lectura se realiza bajo microscopio de luz, dando economicamente una ventaja sobre la prueba de fluorescencia y tambien mantenidas a temperatura ambiente pueden ser leídas por un tiempo prolongado; sin que se observe deterioro en el color. Una vez infectadas las laminillas, la técnica de peroxidasa se realiza en condiciones de menos esterilidad. Al igual que la técnica de fluorescencia la peroxidasa en cuestión, requiere personal especializado para su realización. Bajo condiciones específicas de ejecución la técnica de peroxidasa, se observó una mayor sensibilidad en comparación con la técnica de la fluorescencia. La mayor capacidad de la técnica para detectar sueros con bajos títulos aseguraría la posobilidad de sobrepasar aquellos títulos producidos por infecciones con el virus de DVB y ampliando su utilidad en nuestro país donde la presencia del virus de DVB en bovinos y la promiscuidad de las especies es muy frecuente. 1 cn", y o C 111 Ir n Centro de DocumntaCiófl CEISA 113 Sin embargo se hace necesario, continuar el mejoramiento de la técnica para sugerir su empleo en forma rutinaria. Se reconoce que para su ejecución es necesariop el uso de sustancias que acarrean algun grado de peligro para el laboratorista, además de que en general es más costosa que la fluorescencia. Se debería evitar el tratamiento de los sueros a estudiar, e insistir en la implementación de la técnica en bandejas plásticas de 96 orificios. 8. CONCLUSIONES GENERALES La técnica de Neutralización de la Fluorescencia se emplea exitosamente, pero su uso es restringido por lo laborioso y delicado del procedimiento. El alto número de sueros negativos a la dilución seleccionada sugiere la presencia de una población porcina expuesta a infectarse con el virus y a la presentación de brotes de la enfermedad. El sexo no influyó en la distribución de los sueros negativos, contrario a lo observado en el estudio de la tecniflcación, en la piaras con poca tecnificación presentaron mayores porcentajes de sueros sin anticuerpos. 115 Posiblemente existen otros mecanismos protectivos diferentes a los anticuerpos específicos ó títulos bajos de anticuerpos que impiden alta mortalidad en las piaras infectadas. La técnica de inmunoperoxidasa es una posibilidad de remplazo de la Neutralización de Fluorescencia, pero su realización es muy dispendiosa. Se obtuvo mayor porcentaje de sueros positivos por esta prueba en comparación a los obtenidos por Neutralización de la Fluorescencia, indicando una mayor sensibilidad, sin embargo son necesarios mayores estudios para su aplicación en el diagnóstico serológico del CP. Las dos pruebas realizadas, peroxidasa y fluorescencia requieren mantener cultivos celulares libres de antígeno y de anticuerpos contra Diarrea Vira¡ Bovina. e18LIOTECA AGROPECUARIA ¶! ftCM# BIBLIOGRAFIA AYNAUD, J. M. (1988). Principies of vaccination. In: Classical Swine Fever and related vira¡ infections. ed. by Liess, MartinusNijhoff publishing. Boston. 165 - 180. AYNAUD, J. M., RIGAUD, C., LE TURRU, Y., GALICHER, C., LORBARD, J., CORTHIER, G., LAUD, H. (1974). Peste Porcine Classique: les variations Serologiques du virus en France et leur raledans l'evolution de la maladie sous sa forme subclinique ou chronique sur le terrain. Ann. Rech. Vet. 5, 57-85 BAKER, J. C., (1946). Serial passaje of Hog Cholera Virus in rabbits.Proc. Exper. Biol. Med. (E. U.). 63, 183 - 187. BIELEFELDT OHMANN,H. (1983). pathogenesis of bovine vira¡ diarrheamucosal disease: distribution and significance of BVDV antigen in deseased calves. Res. Vet. Sc. 34, 5- 10 BOLIN, S. R. (1985). 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WESTAWAY, E. G. et.aI. (1985). Togaviridae. lntervirology. 24, 125 - 139. 128 ANEXOS 129 ANEXO A. REACTIVOS PARA EL MEDIO DE CULTIVO ANFOTERICINA Formula: Anfotericina NaOH IN. Agua destilada Filtrar millipore. 0.0163 gr. 7.5 ml. 500 ml. BICARBONATO Formula: Bicarbonato Agua destilada Autoclave 15 minutos. Mantener en nevera. 37.5 gr. 500 ml. GLtJTAMINA Formula Glutamina45 gr. NaCI 12,75 gr. Agua destilada1500 ml. Filtrar millipore HIDROXIDO DE SODIO IN. Formula: 8gr. NaOH Agua destilada 200m1. Mantener en nevera. 130 ANEXO B. REACTIVOS CULTIVO DE CELULAS MEM MEM ANE Anfotericina Penicilina Streptomicina Bicarbonato Agua destilada 10 sobres. 100 MI500 ml. 2000000 1 gr. 1 gr. 10L. Filtrar millipore Mantener en nevera. Incubar 37°C por 72 horas. PBS CONCENTRADO NaCI KCI Na2HPO4 KH2PO4 Glucosa Rojo fenol NaHCO3 Agua destilada 320 gr. 16 gr. 1.92 gr. 2.4 gr. 80 gr. 0.800 gr. 12 gr. 4 L. PBS DILUIDO PBS concentrado 1 L. Agua destilada9 L. Fittrar millipore Incubar 37°C por 72 horas. 131 ANEXO C. REACTIVOS. PENICILINA - ESTREPTOMICINA Formula: Penicilina G sódica 20 frascos de 1000000 c/u. Estreptomicina10 gr. Agua destilada200 ml. Filtrar millipore Congelar. TRIPSINA VERSENO Formula: NaCI 8 gr. KCI 0.4 gr. Na2HPO4 anhidro 0.04 gr. KH2PO40.06 gr. Glucosa2 gr. Versene2 gr. Tripsina3 gr. NaHCO35 gr. Rojo de fenol0.020 gr. Agua destilada1000 ml. Filtrar millipore Mantener congelada. 132 ANEXO O. REACTIVOS FLUORESCENCIA SOLUCION A: NaH2PO4 H2027.6 gr. Completar con Agua destilada a 1000 ml. SOLUCION B: 28,4 gr. Na2HPO4 Completar con Agua destilada a 1000 ml. SOLUCION SALINA BUFERADA FOSFATADA (PBS), pH 7.2 140 ml. Solución A 360 ml. Solución B Agua destilada 500 ml. Ajustar pH a 7.2 - 7.4 Se recomienda preparar al momento de realizar la prueba. GLICERINA BUFERADA 1 Parte de glicerina 1 Parte de PBS AZUL DE EVANS Solución madre: Azul de Evans 5gr. Agua destilada 200 ml. Solución de trabajo: Solución Madre1 ml. PBS fluores. 49 ml. 133 ANEXO E. REACTIVOS DE PEROXIDASA SALINA BUFERADA FOSFATADA (PBS) 0.011111 pH 7.6 Na2HPO42 gr. NaH2PO4 H200.18 gr. #NaCI8.5 gr. Agua destiladaIL Ajustar pH7.6 SOLUCION SALINA 0.85 % pH 7.6 NaCI8.5 gr. Agua destilada1000 ml. TRIS 0.05 M pH 7.6 Trizma 6.050 gr. Agua destilada 1000 ml. SOLUCION DE TRABAJO TRIS - SALINA pH 7.6 1 Parte Tris 0.05M 9 Partes Solución salina 0.85% Ajustar pH 7.6 Se recomienda prepararlo en el momento de usar. TRIS 1 M pH 7.6 Trizma 12.19 gr. HCL2N35 ml. Completar con agua destilada a 1000 ml. Ajustar pH 7.6 SOLUCION FIJADORA 7 Partes de PBS pH 7.6 4 Partes de acetona Lo Centro de Dm e fl t0 CESA ANEXO F. REACTIVOS DE PEROXIDASA BLOQUEADORES DE PEROXIDASAS ENDOGENAS 1. SOLUCION DE BURNS Peroxido de Hidrogeno1.3 ml. Metano¡ absoluto38.7 ml. 2. SUERO DE CONEJO Suero de Conejo0.52 ml. Tris-Salina pH 7.640 ml. SUSTRATO Tris 1 pH 7.6 10 ml. Peroxido de Hidrogeno10111. Diaminobenzidina10 gr. Filtrar. Se recomienda preparar en la oscuridad, 10 minutos antes de su uso. ACIDO CLORHIDRICO 2N 16.6 ml HC1 Agua destilada 100 ml. 134 135 ANEXO G. TRATAMIENTO DE SUEROS PROBLEMA SOLUCION DE VERONAL Acido dietilbarbitu rico Barbiturato de sodio MgCl2 6H20 CaCl2 121-120 NaCI Agua destilada 2.875 gr. 1.875 gr. 0.840 gr. 0.185 gr. 42.5 gr. 1000 ml. Ajustar pH 7.4 Autoclavar 10 minutos a 10 libras de presión. KAOLIN 25% Kaolin Solución veronal SUEROS: Dilución 1:4 100 lil de suero 300 lil de KaoIín. 25 gr. 100 ml. 136 ANEXO H. TECNICA DE FLUORESCENCIA Sacar laminillas tubos de leighton Lavar PBS Fijar con acetona qumicamente pura 20 minutos a 4°C Adicionar 50l de conjugado: Anti-cólera porcino marcado fluoresceina. con tiocinato íe Incubar 40 minutos a 37°C En camara húmeda Lavar 2 veces con PBS y 1 vez con agua destilada por 5 minutos cada vez. Adicionar 50l de Azul de Evans dilución 1:20000 por 3 minutos Repetir lavado anterior Montar (buffer glicerina) ( 'a -j 4 1, Contra de Docurnnt1 137 C ANEXO U. TECNICA DE PEROXIDASA Sacar laminillas tubos de leighton. Lavar en PBS Fijar 20 minutos a temperatura ambiente Lavar 10 minutos con agua destilada. Bloquear metano¡ 30 minutos Lavar 5 minutos en PBS y 10 en TrisSaAmfla Adicionar suero de conejo diluido en Tris salina por 20 minutos a T.A. Anticuerpo primario diluido en Tris- Salina más 1% de suero de conejo Incubar 1 hora a 4°C en camara humeda. Lavar 1 vez con tus-salina 10 minutos. Adicionar peroxidasa diluida Incubar 1 hora a 37°C en camara humeda Lavar tris-salina por 10 minutos Adicionar sustrato por 5 minutos Lavar agua destfda por 10 minutos Pasar por Hematoxilia de Meyers por 10 mm. Lavar con agua destilada Pasar por agua amoniacal 5 minutos Repetir lavado Deshidratar por alcoholes: absoluto, 90%, 80% Tres pases por Montar en Permaunt. OT4AGOPE CUAIA