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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
TÍTULO:
“CARACTERIZACIÓN DE LAS CASCADAS BIOQUÍMICAS DE
SEÑALIZACIÓN QUE REGULAN A LA CORRIENTE DE POTASIO
NEURONAL IKV”
Tesis
Que para obtener el grado de
Doctor en Ciencias Fisiológicas
PRESENTA:
M. en C. Eduardo Iván Acosta Gómez.
ASESOR:
Dr. Humberto Cruzblanca Hernández.
Colima, Col., Agosto de 2007.
DEDICATORIAS
A MIS PADRES
Por su apoyo incondicional, en cada una de las desiciones que he tomado y sus
consejos que han servido de guía en este duro y solitario viaje.
A ALEJANDRA, MI PRECIOSA ESPOSA
Por darme esa tranquilidad, paz, amor, compañía y control que la caracteriza, y
que tanto me hacen falta. Por esperar y esperar mí regreso.
A MI HERMOSA HIJA, XIMENA
Por ser un angelito en mi vida que me alienta a seguir adelante con sus risas y
sus sorpresas.
“No basta saber, se debe también aplicar. No es suficiente querer, se debe también hacer.”
-Johann Wolfgang.-
AGRADECIMIENTOS
A mis padres
Por todo lo que me han dado sin pedir nada a cambio, por su apoyo en los
momentos más difíciles, por darme todos esos consejos que me han llevado por
buen camino. A lo cual les debo todo lo que soy.
Al Dr. Humberto Cruzblanca.
Por haber sido mi asesor de tesis, por haberme tenido paciencia y dedicación en
las dudas y errores que haya tenido, por sus consejos y enseñanzas durante
tanto tiempo, por enseñarme lo que sé respecto a esta maravillosa área, la
fisiología celular.
A la Dra. Elena Castro.
Por su simpatía, disponibilidad para dar consejos y ayudarme en lo referente a
las técnicas utilizadas en biología molecular.
A mis sinodales.
Por sus valiosos comentarios y observaciones sobre el trabajo realizado
A mis compañeros y amigos.
Por sus consejos, por los buenos momentos que hicieron más liviano y pasadero
este largo viaje. Por todas aquellas personas que me aceptaron tal cual como
soy, que me brindaron su amistad, su cariño y su compañía incondicionalmente.
Tantos momentos, tantas personas, nunca los olvidaré.
Al CONACyT
Por su apoyo económico durante todo el tiempo que duraron mis estudios de
posgrado. El cual fui orgullosamente becario con número de registro: 171306.
Además del apoyo otorgado para la culminación de mis estudios el cual fue el de
formación doctoral con # de registro 55589.
Al fondo Ramón Álvarez Buylla y al proyecto CONACyT.
Ya que la presente tesis fue desarrollada gracias al apoyo de este fondo y del
proyecto CONACyT con # 44933Q
ÍNDICE
I. FIGURAS, TABLAS Y ANEXOS.
1
II. ABREVIATURAS.
2
III. RESUMEN.
4
IV. INTRODUCCIÓN.
6
IV. 1 Control neuronal de la presión arterial.
6
IV. 2 El reflejo barorreceptor.
8
IV. 3 Control hormonal de la presión arterial: El Sistema ReninaAngiotensina y su interacción con el sistema nervioso simpático.
V. ANTECEDENTES.
9
15
V.1 Rutas bioquímicas que participan en la modulación de los
canales M.
17
V.2 Rutas bioquímicas que participan en la modulación de IKV.
21
VI. HIPÓTESIS.
22
VII. OBJETIVO GENERAL.
22
VII.1 Objetivos particulares.
23
VIII. MÉTODOS.
23
VIII.1 Cultivo Celular.
23
VIII.2 Electrofisiología.
24
VIII.3 Microinyección.
25
VIII.4 RT-PCR en célula individual.
26
VIII.5 Amplificación.
27
VIII.6 Electroforesis.
28
IX. RESULTADOS.
31
IX.1 Las neuronas GSC expresan varios tipos de subunidades G. 31
IX.2 La vía del AMPc no parece participar en la modulación
de la IKV.
32
IX.3 Efecto del Ester de forbol, PMA, un activador directo
de la PKC, sobre IKV y su modulación por Angio II.
IX.4
Participación
de
la
proteína
angiotensinérgica y muscarínica de IKV.
Gq/11
34
en
la
modulación
36
IX.4.1 Efecto del TEA sobre IKM en neuronas que sobre expresan
KCNQ2.
36
IX.4.2 La sobre expresión de la proteína de fusión EGFP-RGS2 no
bloquea el efecto modulador de la IKM por la estimulación muscarínica.
37
IX.4.3 La sobre expresión de RGS2 reduce la modulación
muscarínica de IKM.
39
IX.4.4 La sobre expresión de RGS2 reduce la modulación
angiotensinérgica de IKV.
40
IX.4.5 La sobre expresión de RGS2 también reduce la modulación
de IKV.
41
IX.5 El inhibidor de la fosfoinositido 3 cinasa (PI3K), Wortmanina,
disminuye el aumento de la IKV por la Angio II.
42
IX.6 Posible participación de tirosino cinasas en la modulación
angiotensinérgica de IKV.
IX.6.1
El
inhibidor
44
general
de
tirosino
cinasas
de
tipo
citoplasmático, erbastatina, reduce la modulación angiotensinérgica de la IKV. 44
IX.6.2 El inhibidor específico de tirosino cinasas de tipo
citoplasmático Src, PP2, no reduce la modulación angiotensinérgica de la IKV. 45
X. DISCUSIÓN.
47
XI. CONCLUSIONES.
54
XII. PERSPECTIVAS.
55
XIII. ANEXOS.
56
XIV. BIBLIOGRAFÍA.
57
I. FIGURAS, TABLAS Y ANEXOS.
FIGURA 1: Núcleos centrales que participan en el control del tono simpático.
7
FIGURA 2: El SRA y sus efectos.
10
FIGURA 3: Participación de las corrientes iónicas en el PA.
14
FIGURA 4: La Angio II incrementa la excitabilidad de las neuronas GSC.
15
FIGURA 5: Efecto de los agonistas Oxo-M, Angio II y BK sobre la IKV.
17
FIGURA 6: Modulación de los canales M (Kv 7.2/Kv7.3) que generan la IKM por
los receptores muscarínicos, M1 y a la Angio II, AT1.
18
FIGURA 7: La inhibición muscarínica de la IKM es simultánea a la hidrólisis del
PIP2.
19
FIGURA 8: Modulación de la IKM (Kv 7.2-Kv 7.3) por el receptor B2.
21
FIGURA 9: Protocolo de pulsos comando para generar a la IKV e IKM.
25
FIGURA 10: Neuronas microinyectadas intranuclearmente.
26
FIGURA 11: Las neuronas GSC expresan varias subunidades G.
31
FIGURA 12: Efecto de la Angio II sobre la IKV en células inyectadas con el
péptido NF449.
32
FIGURA 13: Efecto del VIP y de la Oxo-M sobre la IKV.
33
FIGURA 14: Efecto agudo del PMA sobre la IKV.
35
FIGURA 15: Efecto crónico del PMA sobre la modulación de IKV.
35
FIGURA 16: Efecto del TEA sobre la IKM en células microinyectadas con KCNQ2. 37
FIGURA 17: Efecto de la Oxo-M sobre la IKM en células transfectadas con
EGFP-RGS2.
38
FIGURA 18: Inhibición promedio de la IKM en neuronas expresando la
proteína de fusión EGFP-RGS2.
39
FIGURA 19: Efecto de la Oxo-M sobre la IKM en neuronas transfectadas
con PCI-RGS2.
40
FIGURA 20: Efecto de la Angio II sobre la IKV en neuronas transfectadas
con PCI-RGS2.
41
FIGURA 21: Efecto de la proteína RGS2 sobre la modulación muscarínica
de la IKV.
42
1
FIGURA 22: Efecto de la Wortmanina sobre la modulación de la IKV.
43
FIGURA 23: Efecto de la erbastatina sobre la modulación de la IKV.
45
FIGURA 24: Modulación angiotensinérgica de la IKV en células tratadas
con un inhibidor especifico de Src.
46
FIGURA 25: Modelo propuesto sobre la modulación de la IKV por Angio II.
52
TABLA 1: Modulación de canales iónicos por la Angio II en el SNC.
11
TABLA 2: Soluciones Fisiológicas.
29
TABLA 3: Iniciadores de proteínas G.
30
Anexo 1: Efecto de la forskolina sobre la IKV.
56
Anexo 2: Efecto directo del LY294002 sobre la IKV.
56
II. ABREVIATURAS.
Angio II: Angiotensina II.
AT1: Receptor a la angiotensina II subtipo 1.
B2: Receptor a la bradicinina subtipo 2.
BK: Bradicinina.
CaM: Calmodulina.
CHO: Células de ovario de Hámster.
DAG: Diacilglicerol.
DMSO: Dimetil sulfóxido.
DNAc: Ácido desoxirribonucleico codificante.
EGFP-RGS2: Proteína de fusión GFP-RGS2.
GAPDH: Gliceraldehido 3’-fosfato deshidrogenasa.
G: Subunidad alfa de las proteínas G.
GFP: Proteína verde fluorescente.
GSC: Ganglio superior cervical.
IKM: Corriente de potasio tipo M.
IKV: Corriente de potasio tipo rectificador tardío.
IML: Columna intermedio lateral de la médula espinal.
2
IP3: Inositol trifosfato.
KCNQ2: Uno de los correlatos moleculares de la IKM.
M1: Receptor muscarínico del tipo 1.
M2: Receptor muscarínico del tipo 2.
M4: Receptor muscarínico del tipo 4.
NA: Noradrenalina.
NGS: Neuronas ganglionares simpáticas.
NTS: Núcleo del tracto solitario.
Oxo-M: Oxotremorina M
PA: Potenciales de acción.
pA/pF: Densidad de corriente en pico amperes sobre pico faradios.
PCI-RGS2: Plásmido que contiene la secuencia que codifica para RGS2.
PI: Fosfatidil inositol.
PI3K: Fosfoinositido 3 cinasa.
PIP2: Fosfatidil inositol 4-5 bifosfato.
PKC: Proteína cinasa C.
PLC: Fosfolipasa C.
PTX: Toxina pertussis.
PVN: Núcleo paraventricular del hipotálamo.
RGS2: Proteína reguladora de proteínas Gq/11.
RNAm: Ácido ribonucleico mensajero.
RT: DNA polimerasa dependiente de RNA.
SFB: Suero fetal bovino.
SFO: Órgano subfornical.
SNS: Sistema nervioso simpático.
SRA: Sistema Renina-Angiotensina.
TA: Temperatura de Alineamiento.
TEA: Tetraetil amonio.
TTX: Tetrodotoxina.
VIP: Péptido intestinal vasoactivo.
3
III. RESUMEN.
La regulación a largo plazo de la presión arterial está dada por una compleja
interacción entre los componentes simpático y parasimpático del sistema nervioso
autónomo y por el sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona. En las neuronas
simpáticas del ganglio superior cervical, el péptido Angiotensina II (Angio II) o la
acetilcolina promueven el aumento en la frecuencia de disparo de potenciales de
acción. Este efecto se debe a la modulación de la corriente de K+ tipo M y
posiblemente del tipo rectificador tardío, IKV. En esta tesis se aborda: a) el estudio de
la identidad de la(s) ruta(s) bioquímica(s) empleada(s) por la Angio II para modular a
la IKV y b) se exploran los posibles paralelismos entre los efectos de la Angio II y la
acción colinérgica. Los resultados sugieren que la cascada de señalización de la
fosfolipasa C (PLC) tiene un papel relevante en la modulación de IKV; en particular
se propone a la vía del diacilglicerol/proteína cinasa C (DAG/PKC) como mediadora
de la acción de la Angio II. Esta conclusión se basa en que: 1) el activador de la
PKC, el éster de forbol PMA, mimetizó y posteriormente ocluyó el efecto estimulante
de la Angio II sobre la IKV; 2) el bloqueo de la señalización de Gq/11 por la sobre
expresión de la proteína RGS2, redujo el incremento de la IKV. Un similar efecto se
observó sobre la modulación muscarínica de la IKV. Por otra parte, el inhibidor de la
fosfoinositido 3 cinasa (PI3K), wortmanina, redujo la estimulación de la IKV. Este
hallazgo sugiere la participación de la vía de la PI3K, sin embargo, no se descarta
que el efecto de la wortmanina se deba a la reducción en la concentración de PIP2,
ya que este fármaco también es un inhibidor de la enzima PI4K. Por último, se
encontró que el inhibidor general de las tirosino cinasas, erbastatina, reduce la
modulación angiotensinérgica de la IKV. En conclusión, además de la vía de la PLC,
la Angio II podría estar activando otras vías paralelas de proteínas cinasas (PI3K y
tirosino cinasas), que contribuyen a la modulación de la IKV.
4
ABSTRACT.
The long-term regulation of the arterial pressure is giving by a complex
interaction between the sympathetic and parasympathetic components of the
autonomous nervous system and the Rennin-Angiotensin-Aldosteron enzymatic
system. In superior cervical sympathetic ganglion neurons, the peptide Angiotensin II
peptide (Angio II) or acetylcholine acting on muscarinic receptors, increase the
probability of repetitive firing of action potentials. This effect is due to modulation of
the M-type K+ current and possibly of the delayed rectifier, IKV, as well. In this thesis I
was searching for the biochemical identity of the signaling pathways used by Angio II
to modulate IKV. Moreover, It was addressed the parallelism between the Angio II and
muscarinic receptor cascades. The results suggest that the phospholipase C (PLC)
signaling pathway has a major role on IKV modulation; especially it is proposed that
the diacilglicerol/protein kinase C (DAG/PKC) branch as the main mediator of the
Anigio II action. This conclusion is based on: 1) the direct activator of PKC, the forbol
ester PMA, mimicked and further occluded the stimulant effect of Angio II on IKV; 2)
the blockade of the Gq/11 signaling by the over-expression of the RGS2 protein,
reduced the angiotensinergic enhancement of IKV. A similar effect was observed on
the muscarínic modulation of IKV. On the other hand, the phosphoinositide 3-kinase
(PI3K) inhibitor, wortmannin reduced the stimulation of the IKV. This finding suggests
the participation of PI3K, nevertheless, so far there is no way to discard that the
wortmaninn-induced less modulation of IKV was due to inhibition of the kinase PI4K,
thereby reducing the availability of PIP2 at the plasma membrane. Finally, it was
found that the general inhibitor o tyrosine kinases, erbastatin, reduced the
angiotensinérgic modulation of IKV. In conclusion, besides the PLC pathway, Angio II
might be activating other parallel routes of proteins kinases that contribute to the
modulation of IKV.
5
IV. INTRODUCCIÓN.
Una característica común a las células es la capacidad de coordinar
constantemente su actividad en respuesta a los cambios ambientales. Esta función
de comunicación celular con el entorno, se inicia con la detección del mensaje
externo y es llevada a cabo por proteínas receptoras. Una vez captado el estímulo,
éste se traduce en un mensaje interno a través de distintos mecanismos de
señalización celular.
El estudio de las vías de señalización intracelular ha experimentado un
extraordinario desarrollo en los últimos años y constituye en la actualidad una de las
fronteras de la investigación biomédica, tanto en el sector académico como en el de
las
empresas
farmacéuticas
(Nahorski,
2006).
Estos
conocimientos
están
permitiendo avanzar en el diseño de nuevas estrategias de diagnóstico y
terapéuticas en muy diversas patologías.
Comprender cómo la célula recibe y coordina señales del entorno inmediato y
de otras células del organismo, es esencial para entender los procesos fisiológicos
básicos celulares como la proliferación, diferenciación, metabolismo y muerte celular,
la migración de las células y su organización en tejidos o la propia percepción
sensorial. Este conocimiento a nivel celular es indispensable para comprender cómo
se regulan variables fisiológicas sistémicas como podrían ser la presión arterial o la
osmolaridad del plasma sanguíneo.
IV. 1 Control neuronal de la presión arterial.
La presión arterial es regulada por una compleja interacción entre los
componentes simpático y parasimpático del sistema nervioso autónomo y el sistema
renina-angiotensina (SRA), así como por sistemas locales de autorregulación en las
arterias. En el control neuronal de la presión arterial juega un papel relevante el
centro presor del bulbo raquídeo (Figura 1). Sus neuronas tienen actividad
6
marcapaso y reciben aferentes tanto del núcleo del tracto solitario (NTS), la ruta de
entrada al sistema nervioso central de la información conducida por los
barorreceptores del seno carotideo y del callado de la aorta, así como también del
hipotálamo (Figura 1). Por esta razón, el centro presor es el principal núcleo
integrador de los reflejos cardiovasculares y del tono simpático impuesto por vías
descendentes del telencéfalo (Guyenet, 2006). Eventualmente, esta información
(traducida en cambios en la frecuencia de disparo) es enviada, vía las proyecciones
reticuloespinales del centro presor, que hacen contactos monosinápticos con las
motoneuronas de la columna intermedio lateral (IML) de la médula espinal, las que a
su vez envían sus proyecciones colinérgicas a las neuronas ganglionares simpáticas
(NGS).
FIGURA 1: Núcleos centrales que participan en el control del tono simpático. El núcleo
integrador que genera el tono simpático es el centro presor localizado en la porción rostro-ventrolateral
del bulbo raquídeo. Las neuronas de este núcleo tienen actividad marcapaso y hacen contactos
monosinápticos con las motoneuronas de la columna intermedio-lateral (IML) de la médula espinal.
Estas a su vez, envían proyecciones colinérgicas a las neuronas ganglionares simpáticas (azul, NGS)
las cuales liberan NA a sus órganos blanco. El centro presor recibe aferentes del hipotálamo y del
núcleo del tracto solitario (NTS). A través del NTS se integran, por ejemplo, los reflejos
cardiovasculares, mientras que la inervación que el centro presor recibe de las neuronas
preautonómicas del núcleo paraventricular del hipotálamo regula su actividad marcapaso (centro
presor). La Angio II circulante tiene efectos excitatorios en núcleos como el órgano subfornical (SFO),
órgano laminar vascular terminal (OVLT) y área postrema (AP) y en las mismas NGS, pero también la
Angio II sintetizada centralmente ejerce efectos en el hipotálamo, el mismo centro presor y el NTS.
(Modificado de Guyenet, 2006).
7
IV. 2 El reflejo barorreceptor.
En condiciones normales la presión arterial es mantenida en un rango de 120
y 80 milímetros de mercurio. Este rango de presión es eficazmente censado por las
neuronas del centro presor del bulbo raquídeo, las cuales reducen su frecuencia de
disparo de una manera lineal conforme aumenta la presión arterial hasta 160
milímetros de mercurio (Longhurst, 2003). Cambios rápidos en la presión arterial, por
ejemplo, debido a la adopción de posturas distintas (ej. levantarse súbitamente de la
cama o agacharse para tocarse la punta de los pies) son compensados rápidamente
por reflejos de retroalimentación negativa. Para el sistema cardiovascular este tipo de
retroalimentación es ejemplificado por el reflejo barorreceptor, el cual contribuye a
mantener la presión arterial en el rango normal. Los baroreceptores cardiovasculares
son terminales nerviosas sensibles a la presión, localizadas en el arco aórtico y el
seno carotideo. Las fibras aferentes barorreceptoras del arco aórtico forman el nervio
depresor aórtico el cual se une al nervio vago mientras que las fibras aferentes que
constituyen los barorreceptores del seno carotideo forman el nervio del seno
carotideo, el cual se une al nervio glosofaríngeo. Ambos tipos de barorreceptores
proyectan a distintas áreas del NTS. La función de estos barorreceptores consiste en
censar continuamente la presión sanguínea y traducir esta variable sistémica en
cambios en su frecuencia de disparo de potenciales de acción. Así por ejemplo,
cuando el cuerpo adopta la posición horizontal (acostarse) aumenta la presión
arterial en el seno carotideo, respondiendo sus barorrecepores con aumento en su
frecuencia de disparo. Esta señal es conducida al NTS y eventualmente la
información aferente es traducida en inhibición del centro presor del bulbo raquídeo,
La respuesta final es la disminución del gasto cardiaco y de la presión arterial. Por el
contrario, al adoptarse la posición vertical disminuye la presión arterial en el seno
carotídeo y esto conduce a la remoción de la inhibición del centro presor del bulbo
raquídeo y por tanto, en aumento del gasto cardiaco y de la presión arterial.
8
IV. 3 Control hormonal de la presión arterial: El Sistema ReninaAngiotensina y su interacción con el sistema nervioso simpático.
A largo plazo, la presión arterial es regulada por la interacción entre el SRA y
el sistema nervioso simpático (SNS). Este tipo de interacción es positivo ya que el
SRA tiende a reforzar el efecto presor del SNS y cuyo principal neurotransmisor es la
noradrenalina (NA).
Estímulos como la hipotensión, hiponatremia o hipovolemia activan al SRA
induciendo la liberación de la enzima renina por el aparato yuxtaglomerular renal
(Figura 2). En la circulación, la renina cataliza la ruptura de un enlace peptídico del
angiotensinógeno (proteolisis) en su extremo aminoterminal, generando un
decapéptido denominado angiotensina I. Este decapéptido sirve de substrato para la
enzima convertidora de angiotensina (ECA), la cual corta los últimos dos residuos del
carboxilo terminal generando así el octapéptido angiotensina II (Angio II). La Angio II
es un octapéptido biológicamente activo y al actuar sobre su principal blanco, el
músculo liso vascular, induce una potente vasoconstricción que compensa la caída
de la presión arterial. Otros efectos de la Angio II se describen en la figura 2.
Además de su efecto vascular, la Angio II es un potente estimulante del SNS y
por ende de la liberación de NA (Figura 2). Esta retroalimentación positiva ocurre por
dos mecanismos: 1) estimulación directa de la liberación de NA por las neuronas
ganglionares simpáticas (Figura 1) y; 2) aumento del tono simpático. A continuación
se abordan los mecanismos celulares que parecen intervenir en estos dos tipos de
retroalimentación positiva.
9
FIGURA 2: EL SRA y sus efectos. Diferentes estímulos provocan la secreción de la enzima renina
por el riñón. La renina corta al angiotensinógeno, el cual es sintetizado por el hígado, para producir
Angiotensina I. La ECA, producida y secretada principalmente por el tejido pulmonar y el endotelio
vascular, corta a la Angiotensina I para sintetizar a la Angiotensina II (Angio II). Este octapéptido es un
potente vasoconstrictor pero además incrementa la actividad simpática y es un potente estimulante
para la secreción de aldosterona que posteriormente aumenta la presión sanguínea. La aldosterona
así como la Angio II promueven la reabsorción de Na+ y Cl- en el riñón. También estimula el lóbulo
posterior de la pituitaria para la posterior secreción de la hormona antidiurética. La retención de agua y
sal, el incremento del volumen circulante y el aumento de la perfusión del aparato yuxtaglomerular
tienen como efecto una señal inhibitoria sobre riñón para que no siga secretando más renina
(Documento electrónico http://pt.wikipedia.org/wiki/Sistema_renina_angiotensina_aldosterona).
En el efecto central de la Angio II juegan un papel relevante el órgano
subfornical (SFO), el órgano laminar vascular (OVLT) y el área postrema (AP) (Figura
1), ya que en estas áreas del cerebro no hay una verdadera barrera
hematoencefálica por lo que sus neuronas pueden ser estimuladas por la Angio II
circulante. En el SFO la Angio II despolariza a las neuronas e incrementa su
frecuencia de disparo (Ono y cols., 2001). La estimulación de las neuronas del SFO
se traduce en una señal central excitatoria que eventualmente se propaga en
dirección caudal hacia las motoneuronas de la IML de la medula espinal. En esta ruta
descendente participan las neuronas parvocelulares preautonómicas del núcleo
paraventricular del hipotálamo (PVN). Este grupo de neuronas hipotalámicas regulan
el tono simpático debido a que sus proyecciones terminan, en orden jerárquico, en el
10
centro presor del bulbo raquídeo, en la IML de la médula espinal y en el NTS (Hardy,
2001; Pyner y Coote, 2000). La inyección de Angio II en el PVN aumenta la presión
arterial y los reflejos simpáticos cardiovasculares (Sasaki y Dampney, 1990; Zhu y
cols., 2002), siendo estos efectos bloqueados por el antagonista del receptor AT1,
losartan (Tagawa y Dampney, 1999; Zhu y cols., 2002). Por su parte, las neuronas
del centro presor del bulbo raquídeo son en su mayoría adrenérgicas pero también
tienen una alta densidad de receptores a la Angio II (Aldred y cols., 1993; Hu y cols.,
2002; Song y cols., 1992). La inyección de la Angio II en esta área produce efectos
presores (Sasaki y Dampney, 1990) e incrementa la liberación de glutamato y
aspartato (transmisores excitatorios) en la IML de la médula espinal (Hu y cols.,
2002). Finalmente, en las motoneuronas de la IML la Angio II también produce
efectos excitatorios los cuales se asemejan a los descritos en el centro presor, es
decir, la Angio II incrementa la frecuencia de disparo. En resumen la Angio II al
aumentar la excitabilidad en las anteriores áreas del sistema nervioso central
provoca el aumento del tono simpático. Este aumento en la excitabilidad,
comúnmente mediado por el receptor AT1, se debe a la modulación de distintas
corrientes iónicas, tal y como se resume en la tabla 1.
Tabla 1: Modulación de canales iónicos por la Angio II en el SNC.
Área del SNC
SFO
Efecto sobre el
Vm
Despolarización y
 frec. de disparo
SFO
PVN
 frec. de disparo
por desinhibición
presináptica
Área C1 del
Despolarización y
bulbo raquídeo
 frec. de disparo
Motoneuronas de Despolarización y
la IML
 frec. de disparo
Efecto sobre canales
Iónicos
Inducción de una
corriente catiónica
 (14%) de la
corriente de Ca2+
 (30%) de la
corriente de K+, IA
PVN
Referencia
Ono y cols. 2001.
Washburn y
Ferguson, 2001.
Li y Ferguson, 1996.
Li y cols. 2003.
Supresión de la
corriente de K+, IKleak
Supresión de la
corriente de K+, IKleak
11
Li y Guyenet, 1996.
Oz y Renaud, 2002.
Respecto al mecanismo periférico mediante el cual la Angio II estimula
directamente la liberación de NA por las neuronas ganglionares simpáticas (Figura 1)
(Boehm y Kubista 2002; Dendorfer y cols., 2002), se postula que este efecto se debe
a receptores presinápticos del tipo AT1, y que la activación de la proteína cinasa C
(PKC) estaría estimulando la maquinaria de exocitosis (Boehm y Kubista 2002). Sin
embargo, es muy posible que la acción estimulante de la Angio II también se origine
en la membrana somato dendrítica de las neuronas ganglionares simpáticas, porque
este compartimiento celular también contiene receptores a la Angio II (Castrén y
cols., 1987). Se sabe que la activación de estos receptores despolariza al soma
neuronal y promueve el disparo de potenciales de acción (PA), mimetizando el efecto
de los agonistas colinérgicos muscarínicos sobre este tipo de neuronas simpáticas
(Brown y cols., 1980). El efecto excitador de la Angio II sobre el soma neuronal
puede tener mayor impacto sobre la liberación de NA que en las terminales, porque
se ha estimado que de los PA que invaden las terminales simpáticas, solo el 3% son
efectivos para evocar la liberación de NA (Boehm y Kubista 2002). Por lo anterior, es
de interés de la presente tesis abordar la siguiente pregunta: ¿Cuáles son las
corrientes iónicas moduladas por la Angio II en las neuronas simpáticas? La mayor
parte del conocimiento que se tiene al respecto se basa en estudios realizados en las
neuronas del ganglio superior cervical (neuronas GSC). Por lo anterior, en la parte
final de esta introducción se describen brevemente las corrientes iónicas (y su
contraparte molecular) que intervienen en su potencial de reposo, de acción y en la
regulación de su patrón de disparo, mientras que en la sección de antecedentes se
hace una revisión sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la modulación
angiotensinérgica de los canales iónicos.
El potencial de reposo de las neuronas GSC es de  -60 mV y está
determinado por dos corrientes: una catiónica activada por la hiperpolarización
(Lamas, 1998) y la otra es la corriente de K+ tipo M (IKM); los canales de K+ tipo M son
heterómeros formados por las subunidades KCNQ2/KCNQ3 (Kv7.2/Kv7.3) (Wang y
cols., 1998). IKM no sólo contribuye al potencial de reposo sino también impone el
patrón de disparo fásico de estas células. Este papel está determinado por sus
12
propiedades biofísicas; es decir, IKM es una corriente activada por la despolarización
en el rango de -60 mV a -10 mV (Wang y cols., 1998). La activación es relativamente
lenta ( = 165 ms, a –20 mV; Stansfeld y cols., 1993) y debido a que IKM no presenta
inactivación los canales M sólo se cierran al repolarizar a la membrana. La
desactivación puede describirse con dos constantes de tiempo, a –50 mV, una rápida
de 67 ms y otra lenta de 277 ms (Stansfeld y cols., 1993). Estas propiedades
biofísicas determinan que los canales M no contribuyan a la repolarización del PA
(Lechner y cols., 2003; Yue y Yaari 2004). Sin embargo, su rango de activación
subumbral genera una conductancia de “fuga” que eficientemente amortigua el efecto
excitatorio provocado por la apertura de canales de Na+ y Ca2+, reduciendo así la
probabilidad de disparo sostenido de PA (Adams y cols., 1982; Golomb y cols., 2006;
Yue y Yaari 2004). Además de IKM, las neuronas GSC generan otras corrientes de
K+, incluyendo; a) la corriente de K+ tipo rectificador tardío, IKV; b) la corriente
transitoria de rápida activación e inactivación, IA; c) dos tipos de corrientes de K+
activadas por Ca2+ (IK-Ca), una del tipo BK y la otra del tipo SK (IAHP).
Una descripción general de las corrientes iónicas que contribuyen al PA en el
soma es la siguiente: a) la fase despolarizante es generada por una corriente
entrante de Na+ sensible a la tetrodotoxina y otra de Ca2+, que en su mayor parte
(90%) es del tipo N (ICa-N) (Plummer y cols., 1989); b) a la fase temprana de la
repolarización contribuyen IA y el componente BK de IK-Ca (Davies y cols., 1996;
Marsh y Brown 1991; Wang y McKinnon 1995;); c) el rectificador tardío IKV tiene
mayor contribución sobre la fase final de la repolarización y en la rápida posthiperpolarización (Marsh y Brown 1991); d) la post-hiperpolarización tardía se debe a
la IAHP (Wang y McKinnon 1995). Esta última corriente de K+ es selectivamente
activada por la entrada de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ tipo N (Davies y
cols., 1996). En las neuronas GSC tanto IKM como IAHP contribuyen a reducir la
probabilidad de disparo repetitivo, la cual se manifiesta como una conducta eléctrica
conocida como adaptación a la frecuencia (Brown y Constanti 1980; Davies y cols.,
1996; Wang y McKinnon 1995).
13
Estudios de RT-PCR indican que las neuronas GSC expresan las siguientes
subunidades Kv: Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv2.2, Kv3.4,
Kv4.1 y Kv4.2 y las subunidades  Kv1 y Kv2 (Dixon y McKinnon 1996). El
laboratorio de J. Nerbonne ha abordado el problema de identificar la composición
molecular de los canales de K+ que generan a la IA e IKV, empleando mutantes de Kv
con propiedades de dominante negativo (DN). De esta manera IA es eliminada en
neuronas expresando los DN de Kv4.2 (70%) y Kv1.5 (Malin y Nerbonne 2000,
2001). Estos resultados indican que canales de K+ homoméricos formados por cada
una de estas subunidades (principalmente Kv4.2) contribuyen a la IA (Malin y
Nerbonne, 2000, 2001). Por su parte, la co-expresión de los DN para Kv2.1 y Kv2.2
elimina en el 75% de las neuronas GSC a IKV y dado que estas subunidades no coinmunoprecipitan, se concluye que Kv2.1 o Kv2.2 también forman canales
homoméricos que contribuyen a la IKV (Malin y Nerbonne 2002).
A
B
FIGURA 3: Participación de las corrientes iónicas en el PA. Se muestran potenciales de acción
característicos de neuronas. En A se aprecian las partes que conforman al PA como lo son:
despolarización, repolarización e hiperpolarización. B muestra las principales corrientes iónicas para
generar un PA en neuronas GSC. Tenemos que en la despolarización se encuentran involucradas
corrientes entrantes (INa+ e ICa2+). En la repolarización e hiperpolarización, corrientes salientes de K+
IA, IK activadas por Ca2+ e IKV, IKM y corrientes de K+ activadas por Ca2+ respectivamente (Modificado
de Itri y cols., 2005).
14
V. ANTECEDENTES.
Como se ilustra en la Figura 1, las neuronas ganglionares simpáticas reciben
primordialmente inervación colinérgica de las motoneuronas de la IML de la médula
espinal. La acetilcolina (ACh) liberada por dichas neuronas espinales despolariza a
las neuronas GSC generando un componente rápido (milisegundos) debido a la
activación de receptores nicotínicos y otro lento (segundos), debido a la estimulación
de receptores muscarínicos. La Angio II también produce la despolarización lenta y
promueve el disparo de PA (Brown y cols., 1980; Zaika y cols., 2006) (Figura 4).
Estos hallazgos sugieren que tanto la ACh como la Angio II tienen efectos
equivalentes sobre la excitabilidad y fisiología de las neuronas GSC. Como se indica
a continuación este efecto común parece ser mediado por un número reducido de
receptores acoplados a proteínas G, y sus respectivas cascadas de señalización, los
cuales modulan a un conjunto exclusivo de canales iónicos.
A
B
FIGURA 4: La Angio II incrementa la excitabilidad de las neuronas GSC. Se muestra registros
característicos de PA en neuronas GSC, bajo la configuración de fijación de corriente, antes (A) y
después de la estimulación con Angio II (B). Se aprecia que la estimulación con Angio II (500 nM),
promueve un aumento en los PA registrados en estas células (Tomado de Zaika y cols., 2006).
Las neuronas GSC expresan los receptores muscarínicos M1, M2 y M4 (Brown
y cols., 1995) y el receptor a la Angio II tipo AT1 (Castrén y cols., 1987), entre otros
tipos de receptores 7-TM. De éstos, se sabe que los receptores M1 y AT1 inhiben a
IKM (Berheim y cols., 1992; Hamilton y cols., 1997; Shapiro y cols., 1994). Estos
15
receptores también inhiben a ICa-N (Berheim y cols., 1992; Shapiro y cols., 1994) y
dado que ICa-N es responsable de la activación de IAHP (Davies y cols., 1996), la
estimulación de estos receptores también estaría inhibiendo indirectamente a dicha
corriente de K+. ¿Cuál es el impacto funcional de la modulación muscarínica y
angiotensinérgica de IKM, ICa-N e IAHP sobre la excitabilidad de las neuronas GSC?
Acorde con las propiedades biofísicas de IKM se puede afirmar que su inhibición es la
principal responsable de la despolarización lenta de la membrana y del aumento de
la resistencia de entrada. Estos efectos son suficientes para llevar a la célula al
umbral de disparo de PA. Pero además, la inhibición de IKM e IAHP es el principal
mecanismo iónico que cambia el patrón de disparo de un modo fásico a otro tónico
(Adams y cols., 1982; Brown y Constanti, 1980; Davies y cols., 1996; Wang y
McKinnon 1995). Con base en lo anterior es razonable afirmar que los receptores M1
y AT1 promueven la liberación de NA (Dendorfer y cols., 2002; Koh y Hille, 1997;
Lechner y cols., 2003) a través del cambio en el patrón de disparo, secundario a la
inhibición de IKM, ICa-N e IAHP.
Como ya se mencionó, las neuronas GSC expresan el rectificador tardío rápido
IKV generado por las subunidades Kv 2.1 y Kv 2.2 (Dixon y McKinnon., 1996; Malin y
Nerbonne, 2002). Poco se sabe sobre el papel de IKV en la regulación de la
excitabilidad de las neuronas GSC. Evidencia farmacológica indica que IKV participa
en la fase final de la repolarización del PA así como en la rápida posthiperpolarización (Marsh y Brown, 1991) (Figura 3), y la eliminación genética de Kv
2.1 o Kv 2.2, reduce la probabilidad de disparo tónico del PA (Malin y Nerbonne,
2002).
Por lo anterior, en este laboratorio se decidió investigar si IKV se encuentra bajo
regulación de los agonistas muscarínicos, a la Angio II y a la bradicinina (BK). La
respuesta es afirmativa y el efecto consiste en que estos agonistas aumentan la
amplitud de la IKV (Figura 5). Nuestros datos indican que los receptores que median
este efecto son el muscarínico tipo M2/4 (Cruzblanca 2006) y el de la Angio II tipo AT1
(Acosta y cols., 2007). Antes de abordar lo que se sabe sobre la(s) cascadas de
señalización que intervienen en la modulación de IKV, se hace una breve revisión de
las rutas bioquímicas que participan en la modulación de IKM.
16
A
B
C
Oxo-M
Angio II
1 nA
BK
1 nA
20 ms
Control
Control
20 ms
1 nA
Control
20 ms
FIGURA 5: Efecto de los agonistas Oxo-M, Angio II y BK sobre la IKV. Trazos característicos de la
IKV, obtenidos a 0 mV a partir de un voltaje de mantenimiento de -50 mV, antes (Control trazos
inferiores) y 1.5 minutos después de la estimulación con: A, Oxo-M (1 M), B Angio II (500 nM) y C BK
(200 nM). En los tres casos se aprecia que hay aumento notable de la amplitud de IKV. (Tomado de
Acosta 2004; Cruzblanca 2006; Acosta y cols., 2007).
V. 1 Rutas bioquímicas que participan en la modulación de los canales
M.
En la actualidad se sabe con precisión el mecanismo y las cascadas de señalización
que participan en la inhibición de IKM. Como ya se mencionó la modulación
muscarínica de IKM se debe al receptor M1. Esta conclusión se basa en las siguientes
observaciones: 1) la inhibición de IKM es bloqueada por el antagonista del receptor
M1, pirenzepina, pero no por el antagonista del receptor M2, himbacina (Berheim y
cols., 1992; Marrion y cols., 1989); 2) en el ratón knock-out para el gene del receptor
M1 desaparece la inhibición de IKM pero persiste la inducida por la Angio II (Hamilton
y cols., 1997). El análisis de las proteínas G involucradas en la modulación
muscarínica de la IKM mostró que el principal mediador es la proteína Gq/11 ya que la
inhibición de IKM fue reducida en células inyectadas con un anticuerpo generado
contra el C-terminal de G11/q (Haley y cols., 1998). No obstante que Gq y G11
estimulan a la PLC, con la consecuente producción de DAG, inositol trifosfato (IP3)
y liberación de Ca2+, estos segundos mensajeros no parecen intervenir en la
inhibición muscarínica de IKM (Cruzblanca y cols., 1998; del Rio y cols. 1999).
Evidencia reunida en los últimos años apoya solidamente la idea que la señal que
inhibe a los canales M es la disminución de la concentración del fosfatidilinositol 4, 5-
17
bifosfato (PIP2) (Figuras 6 y 7), (Suh y Hille, 2002; Suh y cols., 2004; Zhang y cols.,
2003; Zaika y cols., 2006; Winks y cols., 2005).
FIGURA 6: Modulación de los canales M (Kv7.2/Kv7.3) que generan la IKM por los receptores
muscarínico, M1 y a la Angio II, AT1. Los receptores M1 y AT1 se acoplan a la proteína Gq, la cual por
medio de la subunidad G activa a una PLC. Esta enzima hidroliza al PIP2, causando su depleción en
la membrana. Dado que los canales M requieren de su interacción con el PIP2 para activarse con la
despolarización, la ausencia de este fosfolípido ocasiona el cierre de los canales M y por ende la
disminución de la IKM. Por otro lado, la fosforilación de los canales M por la PKC desestabiliza la unión
del PIP2 con los canales M (Modificado de Delmas y Brown 2005).
Uno de los experimentos que llevaron a aceptar que la depleción del PIP2 es
el mecanismo primario que subyace a la inhibición muscarínica de IKM consistió en
monitorear en tiempo real la hidrólisis del PIP2. Esto se logró combinando el patchclamp con técnicas de microscopia cuantitativa de fluorescencia y biología molecular.
Para esto se usó una proteína de fusión constituida por la proteína verde
fluorescente (GFP) y el dominio PH de la PLC (PLC-PH); este último es un módulo
proteico que tiene la propiedad de unirse a la parte polar (molécula de inositol) del
PIP2. Por lo anterior, es de esperarse que cuando se estimula al receptor M1, con la
ulterior activación de Gq/11 y la PLC, la hidrólisis del PIP2 debe observase como un
aumento de la fluorescencia en el citosol de la célula (reflejando la difusión del IP3) y
18
una simultanea disminución de la fluorescencia adyacente a la membrana (reflejando
la disminución del PIP2) (Figuras 7A y 7B). Al registrar simultáneamente IKM y la
fluorescencia emitida por la proteína de fusión, se observó que la inhibición de la IKM
ocurre con latencia y curso temporal igual a la reducción de la fluorescencia en la
membrana (Figura 7C). Este experimento sin duda deja claro que la depleción del
PIP2 es la señal moduladora de la IKM por agonistas muscarínicos (Delmas y Brown,
2005; Suh y cols., 2004).
A
B
C
FIGURA 7: La inhibición muscarínica de la IKM es simultánea a la hidrólisis del PIP2. En A y B se
detecta la hidrólisis del PIP2 en tiempo real mediante la redistribución de la fluorescencia generada por
la proteína de fusión GFP-PLC-PH. Nótese que antes de estimular el receptor M1 con el agonista
Oxo-M la proteína de fusión interacciona con el PIP2 y por ello la fluorescencia se concentra en la
membrana de las neuronas simpáticas (imagen en A). Posteriormente la aplicación de Oxo-M
estimula al receptor M1 que a su vez activa a la PLC, hidrolizando al PIP2 y el IP3 formado y unido a
la proteína de fusión difunde en el citosol. Este proceso es revelado como un aumento en la
fluorescencia en el citosol y la paralela disminución en la membrana (imagen en B). Nótese en C que
la inhibición de IKM sucede con la misma latencia y rapidez que la caída en la fluorescencia de la
membrana (Modificado de Delmas y Brown, 2005).
19
Recientemente en un estudio realizado por Zaika y colaboradores (2006), en
células CHO transfectadas con las subunidades Kv7.2 y Kv7.3 y el receptor AT1, se
concluye que la modulación angiotensinérgica de la IKM también se debe a la
depleción del PIP2 (Figura 6). Sin embargo los autores muestran que al utilizar un
inhibidor de la bomba de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, la tapsigargina, su uso
eventualmente lleva al vaciamiento de los almacenes internos de calcio también se
ve reducida significativamente la inhibición de IKM. Posiblemente ya que la PLC
encargada de hidrolizar el PIP2 requiere de Ca2+ para su activación. Este resultado
es inquietante porque IKM también es inhibida por el Ca2+, sin embargo por otro
mecanismo (ver siguiente párrafo).
Respecto a la modulación de IKM por la BK se sabe que un antagonista
selectivo del receptor B2, el Hoe 140 reduce el efecto inhibitorio de la BK sobre IKM
(Jones y cols., 1995). En esta cascada de señalización también se encuentra
involucrada la proteína Gq/11 porque el anticuerpo contra la subunidad Gq/11 reduce
el efecto de la BK. Más aun, posiblemente sea la proteína G11 la involucrada porque
en el ratón knock-out para Gq el anticuerpo contra Gq/11 bloquea el efecto inhibitorio
de la BK (Haley y cols., 2000a).
El mecanismo empleado por la BK para inhibir a la IKM requiere de la liberación
de Ca2+ desde depósitos internos sensibles al IP3, por la subsecuente hidrólisis del
PIP2 (vía la PLC4; Haley y cols., 2000b) en DAG e IP3 (Cruzblanca y cols. 1998).
Una vez liberado el Ca2+, forma el complejo Ca2+-Calmodulina (Ca2+-CaM), el cual es
el mensajero final que inhibe a los canales M (Gamper y Shapiro, 2003) (Figura 8).
Esta conclusión se alcanzó porque expresando un mutante de la CaM con propiedad
de dominante negativo, en neuronas GSC, se bloqueo el efecto modulador del
receptor B2 sobre la IKM (Gamper y Shapiro, 2003).
20
FIGURA 8: Modulación de la IKM (Kv 7.2-Kv 7.3) por el receptor B2. Se muestra la cascada de
señalización que subyace a la estimulación de B2, donde se aprecia que hay la activación de la
proteína Gq/11, la cual por medio de la subunidad G activa a la PLC. Esta enzima hidroliza al PIP2 en
DAG e IP3. Este último libera Ca2+ formando el complejo Ca2+-CaM el cual es el mensajero final que
produce el cierre del canal M (Modificado de Delmas y Brown, 2005).
V. 2 Rutas bioquímicas que participan en la modulación de IKV.
Como ya se mencionó, los receptores que estimulan a la IKV son el
muscarínico tipo M2/4 (Cruzblanca, 2006) y el de la Angio II tipo AT1 (Acosta y cols.,
2007). Por ahora se sabe que la modulación de la IKV tiene las siguientes
propiedades; a) es sensible al inhibidor general de las proteínas G, GDPβS; b) los
receptores M2/4 y AT1 se acoplan a una proteína G insensible a la toxina pertussis
(PTX); c) la estimulación del receptor M2/4 ocluye la acción del AT1 y viceversa; d) la
modulación muscarínica y angiotensinérgica es reducida por el análogo no
hidrolizable del ATP (AMP-PNP). Estos hallazgos sugieren que ambos receptores
podrían estar empleando la misma cascada de señalización para modular a IKV.
21
Por otra parte, al comparar la rapidez de la modulación de IKV e IKM por el
receptor AT1, hemos encontrado que: a) el curso temporal de la modulación de IKV
(= 29.3 ± 2.8 s) es significativamente mas lento que la modulación de IKM (= 10.8 ±
0.5 s) y b) el AMP-PNP reduce la potenciación de IKV pero no afecta la inhibición de
IKM (Suh y Hille, 2002). Estos hallazgos sugieren que en las neuronas GSC el
receptor AT1 puede estar activando distintas cascadas de señalización para modular
a dichas corrientes de K+.
Por lo anterior, la meta de la presente tesis doctoral consiste en identificar la
cascada de señalización que interviene en la modulación de IKV a través de la
activación de los receptores M2 y AT1 y por lo expuesto en los antecedentes del
proyecto se plantea la siguiente hipótesis y objetivos.
VI. HIPÓTESIS.
En la modulación de IKV por los receptores M2 y AT1 participa una cascada de
señalización diferente a la que interviene en la inhibición de IKM por el receptor AT1 y
M 1.
VII. OBJETIVO GENERAL.
El objetivo general de este proyecto consiste en identificar los elementos de la
cascada bioquímica de señalización que modula a la IKV y determinar los posibles
niveles de convergencia o divergencia con la cascada bioquímica que interviene en
la modulación de IKM mediada por la activación de los receptores M2 y AT1.
22
V. II. 1 Objetivos Particulares
a) Identificar la(s) proteína(s) G involucrada(s) (G11, G12, G13, Gs, Gz) en la
modulación de IKV por la activación de los receptores AT1 y M2/4.
b) Identificar las enzimas y los segundos mensajeros que intervienen en la
modulación de la IKV por los receptores AT1 y M2/4.
c) Esclarecer si la dependencia de la modulación de IKV al ATP, involucra a
proteínas cinasas de residuos serina/treonina o a la participación de
tirosino cinasas.
VIII. MÉTODOS.
V. III. 1 Cultivo Celular: Los experimentos se realizaron en neuronas
del GSC, mantenidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las
ratas se anestesiaron con cloroformo y posteriormente se sacrificaron por
decapitación y se disecaron rápidamente ambos ganglios, los cuales se encuentran a
nivel de la bifurcación de las arterias carótidas. Una vez extraídos, los ganglios se
limpiaron y se descapsularon cuidadosamente para evitar dañar a las neuronas
contenidas en ellos. Con el fin de facilitar la difusión de las enzimas durante la etapa
de dispersión enzimática, se realizaron varios cortes transversales del GSC. Las
enzimas que se emplearon en la dispersión fueron: papaína (Roche; 20 U/ml),
colagenasa (Sigma; 1.8 mg/ml) y dispasa II (Roche; 5 mg/ml), disueltas en solución
de Hanks modificada (Tabla 2); las soluciones fueron mantenidas frías y
continuamente oxigenadas hasta antes de su uso, ya que esto permite una mayor
sobrevivencia de las neuronas. Después de incubar con las enzimas, los trozos de
ganglio se pasaron repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas pulidas al
calor, con el fin de facilitar la disociación mecánica de las células. Una vez lograda la
disociación del tejido, las enzimas se diluyeron añadiendo medio DMEM (Dulbecco’s
23
Modified Eagle Médium; GIBCO); la suspensión se centrifugó a 1500 rpm durante 3
min. Se resuspendieron las neuronas con sumo cuidado en medio fresco
conteniendo además 10% de suero bovino fetal (SFB), para la inactivación total de
las enzimas utilizadas en la dispersión celular, posteriormente se centrifugó por
segunda ocasión a 1500 rpm durante 3 min. Después, las neuronas fueron
nuevamente
resuspendidas
en
una
pequeña
cantidad
de
volumen,
para
posteriormente ser sembradas en pedazos de vidrio ( 4 x 4 mm) tratados
previamente con polilisina (500 ng/ml) (SIGMA); se dejaron reposar durante 2 horas
para que las células se adhieran al vidrio. Después de este periodo a las neuronas se
les adicionó DMEM + 10% SFB + una mezcla de antibiótico y antimicótico (ver
soluciones) y se incubaron por lo menos durante 8 h. La incubación se llevó acabo a
37oC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta antes de su empleo para los
experimentos electrofisiológicos.
V. III. 2 Electrofisiología: Para el registro de la IKV se transfirió uno de
los fragmentos de vidrio conteniendo neuronas a una cámara de registro de
capacidad de 200 l y se bañaron con solución Ringer Normal (Tabla 2) a una tasa
de 2.5 ml/min. La IKV se registró mediante la técnica de “patch-clamp” en la
configuración de “célula entera”, utilizando pipetas de vidrio (VWR53432-808) con
una resistencia de 1-1.4 M. Los registros se realizaron con el amplificador EPC7
(HEKA Helektronik) y un sistema de adquisición analógico-digital de 12 bits (Indec
Systems).
Para el registro de la IKV se bloquearon previamente las corrientes de Na+ y
Ca2+ con 500 nM de Tetrodotoxina (TTX) y 200 M de CdCl2, respectivamente,
siendo ésta la solución control (Tabla 2). La IKV se generó con pulsos comando
despolarizantes de 100 ms de duración, en el rango de -50 a 0 mV (el voltaje de
sujeción fue de -50 mV) (Figura 9A). Antes de su adquisición a 5 KHz, la IKV se filtró
a 1 kHz. En los experimentos donde se registró la IKM, su análisis se hizo a partir de
un potencial de mantenimiento de -25 mV a un pulso comando de -60 mV, durante
500 ms, cada 4 s, para generar la corriente de cola (Cruzblanca y cols. 1998) (Figura
24
9B). La amplitud de la IKM fue medida apartir del promedio de los primeros 10 ms y el
promedio de los últimos 50 ms de la corriente de cola. Todos los experimentos se
efectuaron a temperatura ambiente. Para el análisis de IKV su amplitud a 0 mV se
obtuvo de la diferencia entre el promedio de la corriente basal (2 ms) y el promedio
del nivel de la corriente alcanzada al final del pulso comando, promediándose los 5
últimos ms. Lo anterior se hizo después de haber restado la corriente de fuga. Por
otro lado el efecto de la Angio II o la oxo-M sobre la IKV se cuantificó midiendo la
densidad de corriente (pA/pF) en la condición control y en presencia de alguno de los
agonistas.
A
IKV
B
0
IKM
-25
-25
mV
-50
25 mV
-50
mV
-60
200 ms
FIGURA 9: Protocolo de pulsos comando para generar a la IKV e IKM. La IKV se generó a partir de
un voltaje de sujeción de -50 mV durante 1 segundo, al cual se dio un pulso despolarizante a 0 mV
durante 100 ms, posteriormente para volver al voltaje de mantenimiento de -50 mV (A). En B se
muestra el protocolo de pulsos para registrar la desactivación de la IKM. Los canales M son abiertos
por un voltaje de mantenimiento de -25 mV después se da un pulso hiperpolarizante a -60 mV durante
500 ms para cerrar los canales M y regresar nuevamente a -25 mV. En ambos casos estos pulsos de
voltaje se repitieron cada 4 s.
V. III. 3 Microinyección: Se utilizo el sistema de Eppendorf constituido
por un micromanipulador automático (5171) acoplado al inyector programable (5246).
Las pipetas utilizadas para la microinyección fueron de boro silicato (1B120F-4 WPI),
se llenaron con una solución 0.05%-0.02% de Dextran-Fluoresceína (DF) como
marcador de la microinyección (citoplasma o núcleo) y con los plásmidos
correspondientes. Se microinyectaron dos grupos de neuronas: por un lado sólo con
el plásmido que contiene el gen de la GFP (Control reportero) y en el otro se cotransfectó la GFP con el gene exógeno en cuestión. En ambos casos los
experimentos de “patch-clamp” se hicieron 8-12 h en aquellas neuronas que
emitieron fluorescencia después de la microinyección intranuclear o citoplasmática.
En la figura 10 se muestran neuronas recién microinyectadas intranuclearmente con
25
DF (0.2%) y con los plásmidos (GFP y PCI-RGS2), observadas bajo contraste de
fase (Figura 101/2/3) o con epifluorescencia (Figura 104/5/6). La iluminación con UV
indica que la microinyección fue exitosa cuando se ve más fluorescente el núcleo de
la células, posteriormente las neuronas que sobreviven a este procedimiento y
expresan los genes contenidos en los plásmidos, se observan 12 h más tarde y si se
encuentran completamente fluorescentes como las neuronas mostradas en la figura
18B1/2. En estas condiciones, se procede a evaluar el efecto modulador de la Angio II
o de la Oxo-M sobre la IKV y/o IKM.
FIGURA 10: Neuronas microinyectadas intranuclearmente. Se muestran neuronas GSC en cultivo
primario observadas con contraste de fase (1, 2 y 3) o epifluorescencia (4, 5 y 6). Se puede apreciar el
núcleo bien delimitado y más fluorescente que el citoplasma celular, debido a la microinyección con
0.2% de DF (4) y con DF más los plásmidos con las secuencias de DNAc que codifican para GFP (5)
y GFP+RGS2 (6). Después de 12 h de incubación las neuronas metabolizan el DF y esta
fluorescencia desaparece por lo cual sólo queda la fluorescencia para aquellos casos donde se
microinyectó el DNAc a la GFP.
V. III. 4 RT-PCR en célula individual: La RT-PCR es una técnica
usada para amplificar copias de ácido desoxiribonucleico codificante (DNAc)
obtenidos a partir de ácido ribonucleico mensajero (RNAm), el cual en este trabajo se
obtuvo de neuronas individuales. Primero se convierte el RNAm de una sola hebra a
un templado de DNAc por medio de la DNA polimerasa dependiente de RNA
26
(reverso-transcriptasa o RT). Luego empleando pequeñas secuencias específicas de
nucleótidos (primers), junto con la enzima Taq polimerasa, el DNAc es amplificado
por PCR.
La obtención de las neuronas se llevó a cabo manteniéndolas en una solución
libre de calcio (Tabla 2) hasta llevar a cabo la succión de la célula, esta solución en
particular se preparó con agua DEP. El Buffer para RT-PCR se preparó a partir del
stock-1 que contiene: 100 μl de buffer 2X del kit SuperScript One-step RT-PCR
(Invitrogen), 10 μl de primer F y R especifico para las G, 10 μl MgSO4 (5mM), 5 μl
de DTT (0.1 M), 35 μl de agua DEP. Por cada 5.6 μl de stock-1 se agregaron 0.4 μl
de inhibidor de RNAsas (Roche 40u/μl). Se realizó la succión con mucho cuidado
para no romper la célula con una pipeta de “patch-clamp” previamente llenada con 6
μl de buffer para RT-PCR. Una vez hecho lo anterior la pipeta fue rota en el interior
de un tubo para PCR libre de RNAsas, se centrifugo el tubo con la muestra para
tener el contenido en el fondo del tubo, posteriormente se le adicionó 0.5 μl de
TRITON X-100 al 1% para disolver las membranas y con esto liberar el RNAm. En
caso de proceder inmediatamente con la RT-PCR, se agregaron al tubo 12 μl del
mismo buffer y 0.5 μl de la mezcla de enzimas RT-Taq; de no ser así, las muestras
se almacenaron a -80 °C hasta el momento de ser utilizadas. Las pipetas se
elaboraron con capilares de hematocrito (VWR) colocadas en un estirador horizontal
(Sutter Instruments, P87) y la succión de la célula se realizó con la ayuda de un
micromanipulador (Eppendorf, Patchman). Se usó una pipeta por cada neurona y
todo el proceso se llevó a cabo con guantes y tapabocas para minimizar la
contaminación con RNAsas.
V. III. 5 Amplificación: Las secuencias de RNAm de las G, se
obtuvieron del banco de genes del NCBI. Las secuencias de los primers específicos
para cada G, así como sus respectivas temperaturas de alineamiento (TA) y
tamaño del amplificado se muestran en la tabla 3. Los genes reportero utilizados
fueron el del gliceraldeido 3’-fosfato deshidrogenasa (GADPH) y la β-actina.
27
Cada reacción fue sometida al siguiente protocolo de temperaturas en un
termociclador iCycler (BIO-RAD):

1 ciclo de 50 °C por 30 minutos.

1 ciclo 94 °C 2 minutos.

40 ciclos de 94 °C por 15 segundos, TA (ver tabla 3) por 30 segundos y 72 °C
45-55 segundos.

1 ciclo de 72 °C por 10 minutos.
V. III. 6 Electroforesis: Los amplificados de G obtenidos por la
técnica de RT-PCR, se corrieron en geles de agarosa al 2% preparados con buffer
TBE 1X (Tris-borato 0.9mM, EDTA 0.2mM), por aproximadamente durante 3 h.
Posteriormente para observar los amplificados en el gel de agarosa se tiñeron con
bromuro de etidio y se observaron las bandas obtenidas con ayuda de un
transiluminador con lámpara ultra violeta (BioRad).
Se utilizaron los siguientes compuestos: Tetrodotoxina (TTX), Tetraetilamonio
(TEA), Angiotensina II, péptido intestinal vasoactivo (VIP), péptido NF449,
Erbastatina, Forskolina, 2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-bensopirano-4-uno (LY294002),
Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), análogo no activo del PMA (4-forbol),
Wortmanina, 4-amino-5-(4-clorofenol)-7-(t-butil)pirasolo(3,4-d)pirimidina (PP2), 4amino-7-fenilpirasol(3,4-d) pirimidina (PP3), Oxotremorina-M (Oxo-M), acido 1,2bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N’,N’-tetraacético)
(BAPTA),
acido
etilendiamino-
tetraacético (EDTA), acido etileno glicol-bis(2-aminoetil éter)-N,N,N’,N’-tetraacético
(EGTA), Dextran-Fluoresceína. Plásmidos con la secuencia que codifican para
KCNQ2, GFP-RGS2, GFP y PCI-RGS2.
28
Soluciones Fisiológicas (Tabla 2)
Reactivo
Hanks (mM)
Ringer (mM)
Control (mM)
NaCl
137
160
160
KCl
KH2PO4
NaH2PO4
HEPES
CaCl2
MgCl2
Glucosa
Tetrodo toxina
Cd2+
EGTA
PH
5.4
0.44
0.34
5
5
-
2.5
10
5
1
8
-
2.5
10
5
1
8
0.0005
0.1
7.4
7.4
7.4
Solución
Antibiótico-Antimicótico
(100X):
Penicilina
G
Solución
Libre Ca2+
160
2.5
10
1
8
0.1
7.4
sódica:
10.000
unidades/ml, Sulfato de Estreptomicina 10.000 g/ml y Anfotericina B 25 g/ml en
0.85% de solución salina.
Solución Interna estándar de la pipeta para el registro de la IKV (mM): KCl, 175;
MgCl2, 5; HEPES, 5; Na2-ATP, 3; Na-GTP, 0.1; BAPTA, 0.1; Leupeptina, 0.08; pH 7.4
con KOH.
Solución de microinyección: Dextran-Fluoresceina, 0.02% + compuesto a inyectar.
29
Iniciadores de proteínas G (Tabla 3).
Proteína
GAPDH
Primers
59
59 °C
146
65 °C
731
59 °C
403
60 °C
563
64 °C
483
61 °C
118
64 °C
636
F: 5’-GAGAACGAGAAGCACGGGATG-3’
R: 5’-GTGCTTCTTAATGCTCACCGA-3’
G13
61 °C
F: 5’-CTGCCTCGGCAACAGTAAGAC-3’
F: 5’-CACCTGGAACTTGGTCTCAAAG-3’
G12
539
F: 5’-AGAGGCACCCATCCTGTGTC-3’
F: 5’-GGCGGTCAATTCTCCTCGAC-3’
Gs
57 °C
F: 5’-GGTCAGAGCTATGGACACTCTC-3’
R: 5’-GCTCTCCTCCATTCGGTTCTC-3’
Gz
1006
F: 5’-GATGATCGACCGCAACTTGC-3’
R: 5’-CTTTGGCCACCTACATCAAAC-3’
Gq
57 °C
F: 5’-GTCTACAGCAACACCATCCAG-3’
R: 5’-GATCGCTGACCACCCACATC-3’
Gi3
(pB)
F: 5’-CTGCTCGTGCGGATGATGCTC-3’
R: 5’-CGTCCGTTACAGCATCGAACAC-3’
Gi2
(TA)
F: 5’-CAAGACGCTGTGGAGTGACC-3’
R: 5’-CGCAGCACATCCTGCTGGG-3’
Gi1
amplificado
F: 5’-CACCCTTGACCATCTGCTTTC-3’
R: 5’-CAGCTGCGTCTTCATAGGTG-3’
G11
alineamiento
F: 5’-GATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3’
R: 5’-CCAGACAGCACTGTGTTGGC-3’
Go
Tamaño del
F: 5’-GCATCTTCTTGTGCAGTGCCA-3’
R: 5’-CCACCCTGTTTGCTGTAGCC-3’
β-actina
Temperatura
57 °C
572
F: 5’-GTGCTGTCCGTGTGCTTCC-3’
R: 5’-CCGGTACTCCAAGTTTATCC-3’
30
57 °C
534
IX. RESULTADOS
IX. 1 Las neuronas GSC expresan varios tipos de subunidades G.
Dado que la modulación angiotensinérgica de la IKV es insensible a la toxina
de B. pertussis (Acosta y cols. 2007) es muy posible que alguna(s) proteína(s) G
resistente(s) a esta toxina intervenga en la modulación de esta corriente de K+. Para
explorar la identidad de esta(s) proteína(s) G, primero fue necesario conocer los tipos
de subunidades G que expresan las neuronas GSC. La figura 11 muestra los
productos de amplificación obtenidos con la técnica de RT-PCR en célula única.
Nótese que este tipo de neuronas simpáticas expresan prácticamente todos los
miembros de la familia Gi incluyendo los miembros PTX-sensibles Go, Gi1, Gi2,
Gi3 (Figura 11A), además de Gz, el único miembro de esta familia que es PTXinsensible (Figura 11C). Las otras subunidades PTX-insensibles detectadas fueron:
Gq, G11, Gs (Figura 11A) y G12 (Figura 11B) pero no de G13. En resumen, las
neuronas GSC expresan niveles significativos de transcritos para las subunidades
PTX-insensibles Gq, G11, Gs, G12 y Gz.
A
B
H
MW ADP 11
G
o i1 i2 i3 q s
C
MW -actin
2322
2027
12
MW
z
-actin
400
2322
2027
300
564
483
146
636
200
564
572
118
FIGURA 11: Las neuronas GSC expresan varias subunidades G. En estos geles, se muestran los
productos de amplificación. El primer carril comenzando por la izquierda corresponde al marcador de
número de bases (ADN del fago λ cortado con Hind III). A la izquierda se indica el número de bases
de algunas bandas de este marcador y de algunos productos de amplificación (flechas). El segundo
carril de ambos geles muestra la expresión del gene constitutivo GAPDH (A), en B β-Actina y en C los
últimos carriles son para la -Actina. El resto de los carriles revela la expresión de las siguientes
subunidades (A) G: G11, Go, Gi1, Gi2, Gi3, Gq y Gs; (B) G12; (C) Gz.
31
IX. 2 La vía del AMPc no parece participar en la modulación de IKV.
En las neuronas simpáticas son dos las principales vías de señalización que
parecen intervenir en la estimulación, dependiente de receptor, de la liberación de
NA: una es la vía del AMPc y la otra es la de la PLC (Boehm y Kubista 2002). Se
decidió evaluar primero la vía del AMPc porque esta cascada de señalización es
comúnmente empleada por los receptores 7-TM para modular canales iónicos, por
mecanismos de fosforilación. Se ha visto que el AMPc promueve el incremento de la
síntesis de canales iónicos como lo hace con el Kv 1.1 ( Levin y cols., 1995; Ivanina y
cols., 1994) o incrementa las corrientes generadas por Kv 1.2, Kv 1.5 o Kv 2.1 por
fosforilación del extremo C-Terminal (Aiello y cols., 1995; Huang y cols., 1995; Wilson
y cols., 1994). Dado que una de las proteínas G PTX-insensibles que expresan las
neuronas GSC es precisamente Gs, se decidió evaluar su posible participación en la
modulación de IKV. Para ello, se probó el efecto de la Angio II (500 nM) en neuronas
inyectadas en el citoplasma con el péptido que bloquea la señalización por Gs,
NF449. En la figura 12A, se muestra que el NF449 no bloqueó el aumento de la IKV
inducido por la Angio II, es decir, el incremento de la IKV fue similar en neuronas
inyectadas sólo con el marcador fluorescente 11.7 ± 4.4 pA/pF, n= 4 y en aquellas
inyectadas con el NF449 11.9 ± 2.7 pA/pF, n= 5 (Figura 12B).
A
Angio II (500 nM)
90
B
20
Incremento de IKV (pA/pF)
IKV (pA/pF)
85
80
75
70
65
0
20
40
60
80
100
Tiempo (s)
16
Angio II (500nM)
4
5
12
8
4
0
CTRL
NF449
FIGURA 12: Efecto de la Angio II en células inyectadas con el péptido NF449. En (A) se grafica la
amplitud de la IKV antes (círculos negros) y durante la estimulación con Angio II 500 nM (círculos
blancos), en una neurona inyectada con NF449 (10 M en la pipeta de inyección). Nótese que la
Angio II aumenta la amplitud de la IKV. (B) muestra el resumen de los datos obtenidos: el aumento de
la IKV en el grupo experimental fue de 11.9 ± 2.7 pA/pF (n= 5) mientras que en el grupo control el
efecto fue de 11.7 ± 4.4 pA/pF (n= 4).
32
Una segunda manera de explorar la posible participación del AMPc fue tomar
ventaja de que en las neuronas GSC el receptor al VIP se acopla a Gs para modular
a la corriente de Ca2+ tipo N (Zhu e Ikeda, 1994) y vía el AMPc estimula la liberación
de NA (Bohem y Kubista, 2002). La hipótesis a probar aquí es simple, es decir, si la
vía del AMPc interviene en la modulación de la IKV, entonces el VIP (1 M) debe
aumentar a esta corriente de K+, mimetizando el efecto modulador ya sea de la Angio
II o de los agonistas muscarínicos. En la figura 13A se puede apreciar que el VIP
prácticamente no tuvo afecto sobre la amplitud de esta corriente de K+ (círculos
vacíos) en comparación con el notable incremento inducido por la Oxo-M 10 M
(triángulos llenos). En la gráfica de barras de la figura 13B se resume el porcentaje
de aumento de la IKV obtenido con VIP el cual fue de 2.9 ± 1.8 % (n= 5) y para la OxoM de 20.1 ± 2.3 %, (n= 5).
A
B
84
Oxo-M (10 M)
24
5
80
20
% Incremento de IKV
IKV (pA/pF)
76
72
Lavado
68
VIP (1 M)
64
16
12
8
5
60
4
56
0
50
100
150
200
0
Tiempo (s)
VIP
Oxo-M
FIGURA 13: Efecto del VIP y de la Oxo-M sobre la IKV. En (A) se muestra la amplitud de la IKV antes
(círculos llenos), durante la secuencial aplicación de VIP (círculos vacíos) y Oxo-M (triángulos llenos),
y después del lavado del agonista (triángulos vacíos). Nótese que el VIP no muestra algún efecto
sobre la corriente de K+. En (B) se muestra el resumen de los datos obtenidos por la estimulación con
VIP y Oxo-M. Se puede apreciar que la estimulación con VIP es casi nula (2.9 ± 1.8 %, n= 5), en
comparación al significativo efecto de la Oxo-M (20.1 ± 2.3 %, n= 5); P< 0.05.
Se sabe que la forskolina es un activador directo de la adenilato ciclasa y con
ello induce un incremento de los niveles de AMPc. Por ello, se probó a la forskolina
como una tercera estrategia para evaluar la participación de este mensajero en la
modulación de IKV. Sin embargo al llevar a cabo estos experimentos se encontró que
la forskolina (20 M) redujo la amplitud de la IKV. La rapidez con que la forskolina
33
redujo la IKV así como su rápida recuperación al lavar el fármaco sugiere que éste
bloquea directamente a los canales de K+ que generan a la IKV, esto se puede
observar en el Anexo 1 ya que es un resultado que escapa a nuestro interés en esta
tesis.
IX. 3 Efecto del éster de forbol PMA, un activador directo de la PKC,
sobre IKV y su modulación por Angio II.
Un efecto común de los agonistas muscarínicos, así como de los péptidos BK
y Angio II en las neuronas GSC es estimular la hidrólisis de fosfoinosítidos (BofillCardona y cols., 2000; del Rio y cols., 1999; Strömberg y cols., 1991). Este efecto
comúnmente ocurre mediante la participación de las proteínas Gq y/o G11 y la
subsecuente activación de la PLC, la cual hidroliza al PIP2 para sintetizar a los
segundos mensajeros DAG e IP3. Dado que las neuronas GSC expresan Gq y G11
(Figura 11) y que en estas neuronas la estimulación del receptor AT1 no genera
transitorios de Ca2+ (Shapiro y cols., 1994), se decidió evaluar la participación de la
rama DAG/PKC en la modulación de IKV. Para poder llevar a cabo lo anterior se
utilizo un activador directo de la PKC, el éster de forbol PMA (30 nM). La aplicación
aguda de PMA provoco un incremento de la IKV, mimetizando la acción de la Angio II
sobre esta corriente de K+. La posterior aplicación del neuropéptido no ocasionó un
aumento significativo, en comparación al encontrado con el PMA (Figura 14A). En
resumen, el aumento en la densidad de corriente de IKV producido por el PMA fue de
10 ± 1.1 pA/pF (n= 7) y del análogo no activo del PMA, el 4 -forbol (30 nM) fue sólo
de 0.9 ± 0.5 pA/pF (n= 6) siendo esta diferencia estadísticamente significativa; (P<
0.05). Por su parte el efecto de la Angio II en células no expuestas y previamente
tratadas con PMA fue de 11.1 ± 1.4 pA/pF (n= 8) y 2.5 ± 1.2 pA/pF (n= 7),
respectivamente, siendo esta diferencia también estadísticamente significativa (P<
0.05) (Figura 14B). Para confirmar la participación de la PKC se decidió incubar a las
neuronas por toda la noche con PMA (30 nM), con el propósito de inducir su
regulación a la baja (Goode y cols., 1995; Favaron y cols., 1990) y 10 h después se
evaluó el efecto de la Angio II sin PMA (Figura 15A). El resumen del incremento de la
34
IKV se puede apreciar en la figura 15B, donde en células no incubadas e incubadas
crónicamente con PMA el incremento por Angio II fue de 11.8 ± 1 pA/pF (n= 7) y 3.5
± 1.1 pA/pF (n= 8) respectivamente (significativamente diferentes ambos grupos; P<
0.05). Estos hallazgos indican que el efecto de la Angio II es ocluido por la activación
de la PKC y que su regulación a la baja también provoca un menor efecto de la Angio
II. Por lo tanto se sugiere que esta proteína cinasa contribuye a la modulación
angiotensinérgica de la IKV.
A
B
63
14
8
60
12
PMA (30 nM)
Angio II
(500 nM)
54
Incremento de IKV (pA/pF)
IKV (pA/pF)
57
51
48
45
10
42
39
7
8
6
7
4
2
0
50
100
150
200
250
300
6
0
350
Angio II
PMA
Tiempo (s)
4 -forbol
Angio II despues
de PMA
FIGURA 14: Efecto agudo del PMA sobre la IKV. (A) El PMA (30 nM) provocó un incremento de la IKV
(círculos vacíos) mimetizando la acción de la Angio II (500 nM) sobre esta corriente de K+. La posterior
aplicación del neuropéptido no ocasionó un aumento significativo de ella (triángulos llenos). (B)
resume los resultados de este tipo de experimento. Los números sobre las barras indican la cantidad
de células para cada condición experimenta.
A
B
62
16
14
Incremento de IKV (pA/pF)
IKV (pA/pF)
60
Angio II (500 nM)
58
56
54
Angio II (500 nM)
7
12
10
8
6
8
4
2
52
0
20
40
60
80
100
0
120
CTRL
Tiempo (s)
Incubadas 10 hrs.
con PMA
FIGURA 15: Efecto crónico del PMA sobre la modulación de IKV. A muestra que en neuronas
incubadas 10 hrs. con PMA (30 nM) la posterior estimulación con Angio II 500 nM (círculos blancos)
no produce un incremento significativo de la IKV, en comparación con el efecto observado en las
neuronas no tratadas con PMA. Esto se puede apreciar mejor en B, donde los incrementos fueron:
para el grupo control (CTRL) 11.8 ± 1 pA/pF (n= 7) e incubadas con PMA, 3.5 ± 1.1 pA/pF (n= 8); P<
0.05.
35
IX.
4
Participación
de
la
proteína
Gq/11
en
la
modulación
angiotensinérgica y muscarínica de IKV.
En virtud de que la rama DAG/PKC parece intervenir en la modulación de IKV,
es probable que las proteínas Gq y G11 participen en la modulación de esta corriente
ya que ellas comúnmente estimulan a la PLC. Recientemente se ha demostrado
que la proteína RGS2 es un regulador selectivo de la señalización mediada por estas
proteínas G (Hepler 2003) y, en efecto, su sobre expresión en las neuronas GSC
bloquea la vía de la PLC (Suh y cols., 2004). Por lo tanto se procedió a estudiar la
modulación de IKV en neuronas transfectadas con la proteína RGS2. Un primer paso
fue estandarizar las condiciones de transfección por microinyección intranuclear de
neuronas y para ello se decidió sobre-expresar la subunidad KCNQ2 del canal M
porque ésta confiere una alta sensibilidad a IKM al bloqueo por TEA, un efecto que
debe obtenerse si las neuronas GSC son transfectadas exitosamente (Shapiro y cols.
2000).
IX. 4. 1 Efecto del TEA sobre IKM en neuronas que sobre expresan
KCNQ2.
En las neuronas GSC los canales M están formados por un heterómero de las
subunidades KCNQ2 (Kv7.2) y KCNQ3 (Kv7.3) y por lo tanto IKM es poco sensible al
clásico bloqueador de canales de K+ Tetraetilamonio (TEA) (Shapiro y cols., 2000).
Esto se debe a que la subunidad KCNQ3, pero no KCNQ2, carece en la posición 284
del residuo tirosina, análogo a la tirosina de la posición 449 en los canales tipo
shaker y que les confiere alta sensibilidad al TEA. Por lo anterior, la sobre expresión
de KCNQ2 debe manifestarse como un aumento en la sensibilidad de IKM al TEA. La
figura 16 muestra el efecto del bloqueador en una neurona transfectada con la GFP
(20 ng/l) y en otra co-transfectada con GFP y un plásmido con el DNAc para la
subunidad KCNQ2 (50 ng/l). En la célula control el TEA (1 mM) tuvo un efecto
menor sobre la amplitud de la corriente de cola, como también sobre la corriente de
36
sujeción, a la cual también contribuye IKM (Figura 16A). Al respecto, nótese que la
corriente de sujeción (en pA/pF) registrada en la neurona co-transfectada con
KCNQ2 es mayor que en la célula control, indicando una mayor expresión de canales
M. Esta mayor densidad de canales M puede reflejar la presencia de canales
formados solo por KCNQ2. Tal predicción es consistente con el hecho de que en la
neurona inyectada con el plásmido de KCNQ2, el efecto del TEA fue notablemente
mayor (Figura 16B). El resumen de estos resultados se muestran en la figura 16C,
donde en neuronas GFP+KCNQ2 la inhibición fue 37.3 ± 2.2 % (n= 9) y de 20. ± 2.8
% (n= 6) para el grupo transfectado sólo con GFP.
A
B
C
50
TEA (1 mM)
9
GFP
KCNQ2
1
1
2
5 pA/pF
100 ms
5 pA/pF
2
% Inhibición de IKM
40
30
6
20
10
100 ms
0
GFP
GFP+KCNQ2
FIGURA 16: Efecto del TEA sobre la IKM en células microinyectadas con KCNQ2. En las figuras A
y B se muestran registros de la IKM (La línea punteada indica el nivel cero de corriente) antes (1) y
durante la aplicación de TEA 1 mM (2), en una neurona microinyectada sólo con el gene de la GFP
(20 ng/l) (A) y en otra célula co-transfectada con el gene que codifican a la subunidad KCNQ2 (50
ng/l) (B). La supresión de la IKM en esta última neurona es mayor que en la neurona expresando sólo
GFP. Los valores promedio inhibitorios en ambos grupos de neuronas se muestran en la figura C, en
donde el porcentaje de inhibición fue de 20 ± 2.8 % (n= 6) para el grupo control (GFP) y 37.7 ± 2.2 %
(n= 9), para el grupo sobre-expresando KCNQ2. Esta diferencia es estadísticamente significativa (P<
0.05).
IX. 4. 2 La sobre expresión de la proteína de fusión EGFP-RGS2 no
bloquea el efecto modulador de la IKM por la estimulación muscarínica.
Una vez que se comprobó que la técnica de transfección por microinyección
intranuclear es viable, a continuación se procedió a evaluar el efecto de sobreexpresar la proteína de fusión EGFP-RGS2 (plásmido gentilmente donado por el Dr.
Ulises Meza) sobre la modulación de la IKM. Se escogió este ejemplo de modulación,
37
como control positivo, porque está bien establecido que Gq y G11 participan en la
inhibición de IKM por el receptor muscarínico M1 (Haley y cols. 1998, 2000a). Una vez
microinyectadas las neuronas con el plásmido EGFP-RGS2 (1 g/l). 12 h después
se realizaron los registros de patch-clamp. Esperaríamos que en las células
microinyectadas con la proteína de fusión la inhibición de la IKM por Oxo-M (200 nM)
fuera menor, sin embargo, como se puede apreciar en los registros representativos
mostrados en la figura 17, la inhibición muscarínica de IKM fue similar tanto en una
neurona no inyectada (Figura 17A) como en aquellas transfectadas con GFP (Figura
17B) o con la proteína de fusión EGFP-RGS2 (Figura 17C). La inhibición promedio
de IKM en estos tres grupos fue de 45.9 ± 3.7 % (n = 5), 42.2 ± 1.7 % (n = 6) y 38.4 ±
5.9 (n = 5), respectivamente (Figura 18A). La falta de efecto de la proteína de fusión
EGFP-RGS2 fue un resultado inesperado, sin embargo, nos llamó la atención que la
fluorescencia emitida por las neuronas transfectadas con esta proteína de fusión
mostrara un patrón granuloso (Figura 18B inferior derecha), distinto a la fluorescencia
homogénea que presentan las neuronas transfectadas con GFP (Figura 18B superior
derecha). Una posible interpretación del patrón granular de fluorescencia es que la
proteína de fusión está quedando atrapada en algún compartimiento del aparato
secretor de las neuronas y por tanto no alcanza la membrana celular.
B
A
C
GFP
CTRL
EGFP-RGS2
1
1
1
5 pA/pF
2
100 ms
5 pA/pF
5 pA/pF
100 ms
2
2
100 ms
FIGURA 17: Efecto de la Oxo-M sobre la IKM en células transfectadas con EGFP-RGS2. Registros
representativos de la IKM (corrientes de cola), antes (1) y durante (2) la aplicación de Oxo-M (200 nM),
en una célula no inyectada (control) (A) y en otras transfectadas la GFP (B) o con la proteína de fusión
EGFP-RGS2 (C). Como se puede apreciar no se observan cambios notables en la eficacia del
agonista muscarínico para inhibir a la IKM. La línea discontinua indica el nivel cero de la corriente.
38
A
B
60
50
Oxo-M (200 nM)
2
3
4
5
6
% Inhibición de IKM
1
5
40
30
20
10
0
CTRL
GFP
EGFP-RGS2
FIGURA 18: Inhibición promedio de la IKM en neuronas expresando la proteína de fusión EGFPRGS2. En (A) se grafican los porcentajes de inhibición y fueron: para el grupo no inyectado (CTRL)
45.9 ± 3.7 % (n= 5), GFP 42.2 ± 1.7 % (n= 6) y EGFP-RGS2 38.4 ± 5.9 % (n= 5). En B se muestran
neuronas que fueron microinyectada intranuclearmente 12 h antes de tomar las imágenes, con la
secuencia que codifica para la GFP (1, 2) y con la proteína de fusión EGFP-RGS2 (3, 4). Las
imágenes fueron tomadas con contraste de fases (panel izquierdo) o epifluorescencia (panel derecho).
IX. 4. 3 La sobre expresión de RGS2 reduce la modulación
muscarínica de IKM.
Dado que es posible que la variante de la proteína GFP fusionada al extremo
amino-terminal con la proteína RGS2, estuviese interfiriendo con la traslocación de
esta última a la membrana celular, se procedió a co-transfectar a las neuronas con
GFP (20 ó 70 ng/l) y otro plásmido (PCI-RGS2, 120 ng/l) conteniendo sólo el DNAc
para RGS2 (gentilmente donado por el Dr. Bertil Hille). En la figura 19A se muestra el
efecto de la Oxo-M (1 M) sobre IKM en una célula expresando sólo la GFP y en la
figura 19B en otra neurona co-transfectada con GFP y RGS2. Se puede apreciar que
en esta última la inhibición de IKM fue notoriamente menor que en la célula control. El
resumen de estos resultados se muestra en la figura 19C. En el grupo GFP la
inhibición muscarínica de IKM fue de 78.9 ± 3 % (n= 8) mientras que en las neuronas
co-transfectadas con GFP y RGS2 el efecto sólo fue del 33.4 ± 4.5 % (n= 8). Esta
diferencia además de reproducible fue estadísticamente significativa (P< 0.05). La
proteína RGS2 también disminuyó la inhibición de la IKM inducida por la Angio II (500
nM), de 55.8  4.1% (n = 8) a 35.3  4.8% (n = 8).
39
A
B
C
100
GFP
% Inhibición de IKM
80
PCI-RGS2
1
1
5 pA/pF
2
2
100 ms
Oxo-M (1M)
8
60
8
40
20
5 pA/pF
100 ms
0
CTRL
PCI-RGS2
FIGURA 19: Efecto de la Oxo-M sobre la IKM en neuronas transfectadas con PCI-RGS2. Se
muestran registros representativos de la IKM antes (1) y durante la aplicación de Oxo-M 1 M (2) en
una neurona expresando sólo la GFP (A) y en otra co-transfectada con la proteína RGS2 (B). La línea
discontinua indica el nivel cero de la corriente. Se puede apreciar que la inhibición de la IKM es
notablemente menor en la célula expresando RGS2. Los resultados obtenidos se resumen en C, los
cuales fueron los siguientes: para el grupo expresando sólo la GFP (CTRL) la supresión fue del 78.9 ±
3 % (n= 8), mientras que para las neuronas transfectadas con PCI-RGS2 la inhibición fue de sólo 33.4
± 4.5 % (n= 8). Esta diferencia fue estadísticamente significativa (P< 0.05).
IX. 4. 4 La sobre expresión de RGS2 reduce la modulación
angiotensinérgica de IKV.
Los
resultados
anteriores
indican
que
el
plasmido
PCI-RGS2
es
completamente funcional para bloquear la señalización por proteínas Gq/11. Una vez
sabido esto se quiso evaluar la posible participación de la proteína Gq/11 sobre la
modulación angiotensinérgica de la IKV. En la figura 20 se muestran registros de la IKV
control y después de permitir el paso de la Angio II (500 nM) al baño de perfusión, en
una célula expresando solo la GFP (Figura 20A) y en otra co-transfectada con GFP y
RGS2 (Figura 20B). Se puede apreciar que en esta última el incremento de la IKV fue
notoriamente menor, en comparación con la célula control. El resumen de estos
experimentos se muestra en la figura 20C. En el grupo control el incremento por
Angio II sobre la IKV fue de 8.3 ± 1 pA/pF (n= 11) mientras que en las neuronas
transfectadas con ambos plasmidos el incremento fue de 2.7 ± 0.7 pA/pF (n= 7). Se
encontró que esta diferencia fue estadísticamente significativa (P< 0.05).
40
A
B
GFP
C
Angio II (500 nM)
PCI-RGS2
10
2
11
1
20 ms
1
10 pA/pF
20 ms
Incremento de IKV (pA/pF)
2
10 pA/pF
8
6
4
7
2
0
GFP
PCI-RGS2
FIGURA 20: Efecto de la Angio II sobre la IKV en neuronas transfectadas con PCI-RGS2. Se
muestran registros representativos de la IKV antes (1) y durante la aplicación de Angio II 500 nM (2), en
una neurona microinyectada con el plásmido de la GFP (A) y en otra co-trasnfectada con RGS2 (B).
En cada panel las líneas discontinuas indican el nivel cero de la corriente después de la resta de la
corriente de fuga, a un voltaje de membrana de 0 mV. Se puede apreciar que el efecto de la Angio II
es menor en la célula expresando RGS2. El resumen de los resultados obtenidos se muestran en C,
los cuales para el grupo GFP y co-transfectado con PCI-RGS2 fueron, 8.3 ± 1 pA/pF (n= 11) y 2.7 ±
0.7 pA/pF (n= 7) respectivamente. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (P< 0.05).
VI. 4. 5 La sobre expresión de RGS2 también reduce la modulación
muscarínica de IKV.
Recientemente en nuestro laboratorio se ha reportado que la modulación
muscarínica de la IKV tiene las mismas propiedades que la inducida por la Angio II. Es
decir, ambas son insensibles a la PTX, dependen de ATP, y una ocluye a la otra
(Cruzblanca, 2006; Acosta y cols., 2007). Por lo anterior, se decidió evaluar si RGS2
también reduce el efecto de la Oxo-M sobre la IKV. Los resultados obtenidos se
pueden apreciar en la figura 21 (A, B), donde se muestran registros de la IKV control
(trazos 1) y en presencia de la Oxo-M (1 M) (trazos 2). Se puede observar
claramente que en la neurona expresando RGS2 el incremento de la IKV fue menor,
que en la célula control (GFP). En la figura 21C se muestra el resumen de estos
experimentos, donde en el grupo control el incremento por Angio II sobre la IKV fue de
9.1 ± 1 pA/pF (n= 8) mientras que en las neuronas transfectadas con ambos
plásmidos fue de 2.9 ± 1 pA/pF (n= 8).
41
A
B
GFP
C
PCI-RGS2
12
2
10 pA/pF
1
1
20 ms
10 pA/pF
20 ms
Incremento de IKV (pA/pF)
2
10
Oxo-M (1 M)
8
8
6
8
4
2
0
GFP
PCI-RGS2
FIGURA 21: Efecto de la proteína RGS2 sobre la modulación muscarínica de la IKV. Registros
representativos de la IKV antes (1) y en presencia de Oxo-M 1 M (2), en una célula expresando sólo la
GFP (A) y en otra co-transfectada con la proteína RGS2 (B). En cada panel las líneas discontinuas
indican el nivel cero de la corriente después de la resta de la corriente de fuga, a un voltaje de
membrana de 0 mV. Se puede apreciar que RGS2 también reduce el efecto estimulante de la Oxo-M
sobre la IKV. El resumen de los resultados se aprecia en C, los cuales fueron: 9.1 ± 1 pA/pF (n= 8) para
el grupo control (GFP) y 2.9 ± 1 pA/pF (n= 8) para el grupo experimental (PCI-RGS2). Esta diferencia
fue estadísticamente significativa (P< 0.05).
IX. 5 El inhibidor de la fosfoinositido 3 cinasa (PI3K), wortmanina,
disminuye el aumento de IKV por la Angio II.
La enzima PI3K es un importante regulador de distintos procesos celulares
como la migración y la supervivencia celular, a través de la vía PI3K/PDK1/Akt
(Cantrell 2001), pero también esta cinasa participa en la modulación de canales
iónicos. Por ejemplo, parte del efecto vasoconstrictor de la Angio II sobre el músculo
liso vascular se debe a la estimulación de la corriente de Ca2+ tipo L, a través de una
cascada de señalización en donde participa la PI3K (Quignard y cols., 2001; Seki y
cols., 1999; Viard y cols., 1999). Por lo anterior se decidió evaluar si la PI3K pudiera
estar participando en la modulación angiotensinérgica de IKV. Para ello se estudió el
efecto de la Angio II en neuronas tratadas por 10 min con el inhibidor de la PI3K
wortmanina (20 M).
Los registros de IKV de la figura 22 muestran que en la célula incubada con
wortmanina (Figura 22C) el aumento de la IKV inducido por la Angio II fue menor que
en las célula control (Figura 22A) o en aquella incubada con el vehículo (Figura 22B)
dimetilsulfoxido (DMSO). En la figura 22D se resumen estos resultados: el aumento
de la IKV fue similar entre el grupo no tratado (CTRL) o incubado con DMSO (15.5 ±
42
2.2 pA/pF, n= 15 y 13.9 ± 2.3 pA/pF, n= 4, respectivamente). Sin embargo la Angio II
tuvo un efecto significativamente menor en el grupo tratado con wortmanina, 4.3 ± 1
pA/pF, (n= 5).
El efecto de la wortmanina fue sólo sobre la modulación angiotensinérgica de
la IKV ya que el fármaco no alteró su densidad de corriente basal. Estos datos se
muestran en la Figura 22E, en donde los valores para los grupos control, con DMSO
y wortmanina fueron: 49.1 ± 2.9 pA/pF, 51.6 ± 6.7 pA/pF y 47.7 ± 5.7 pA/pF
respectivamente. No hay diferencia estadísticamente significativa entre estos grupos.
A
B
CTRL
C
DMSO
2
1
20 ms
20 ms
1
D
10 pA/pF
20 ms
E
Angio II (500nM)
20
5
15
4
50
12
8
5
Densidad de IKV (pA/pF)
16
4
60
15
Incremento de IKV (pA/pF)
2
10 pA/pF
20 pA/pF
1
Wortmanina
2
4
40
30
20
10
0
0
CTRL
DMSO
CTRL
Wortmanina
DMSO
Wortmanina
FIGURA 22: Efecto de la Wortmanina sobre la modulación de la IKV. A, B y C muestran registros
de IKV en neuronas, antes (1) y en presencia (2) de Angio II (500 nM), en una célula control (A),
incubada con DMSO (B) o con Wortmanina (20 M) (C). Se puede apreciar claramente que la
Wortmanina reduce el efecto de la Angio II. El resumen del efecto de la Angio II en los tres grupos de
neuronas se muestra en (D), y dio los siguientes datos: grupo no tratado (CTRL) 15.5 ± 2.2 pA/pF (n=
15), DMSO 13.9 ± 2.3 pA/pF (n= 4) y Wortmanina 4.3 ± 1 pA/pF (n= 5). El menor efecto de la Angio II
en el grupo tratado con Wortmanina fue estadísticamente significativo (P< 0.05). (E) Muestra el
resumen de la densidad de corriente basal de IKV de estos tres grupos: grupo no tratado (CTRL) 49.1 ±
2.9 pA/pF (n= 15), e incubadas con DMSO 51.6 ± 6.7 pA/pF (n= 4) o Wortmanina 47.7 ± 5.7 pA/pF (n=
5).
43
La wortmanina a la concentración de 20 M también es un inhibidor de la
fosfoinositido 4 cinasa (PI4K), una de las enzimas que participa en la re-síntesis del
PIP2 (Suh y Hille 2002). Por ello se decidió probar otro inhibidor más selectivo de la
PI3K, el LY294002. Sin embargo, se encontró que este fármaco, potentemente
disminuyó la amplitud basal de la IKV cuando fue aplicado a una concentración 10 M
o a una dosis diez veces menor (Anexo 2). La inhibición de IKV por 10 M LY294002
fue de 88.8 ± 2.6 %(n= 3). En resumen, aunque el efecto de la wortmanina sobre la
modulación angiotensinérgica de IKV sugiere la participación de la PI3K (ver
discusión), no es suficiente esta evidencia farmacológica.
IX. 6 Posible participación de tirosino cinasas en la modulación
angiotensinérgica de IKV.
IX. 6. 1 El inhibidor general de tirosino cinasas de tipo
citoplásmico, erbastatina, reduce la modulación angiotensinérgica de la IKV.
Otro tipo de proteínas cinasas que son mediadores de la señalización del
receptor AT1, son las proteínas tirosino-cinasas de tipo citosólico (Yin y cols., 2003).
Por lo anterior, se decidió evaluar el efecto del inhibidor general de este tipo de
cinasas, erbastatina (5 M), sobre la modulación de la IKV. Para ello se incubaron las
neuronas durante 15 minutos con el inhibidor y posteriormente se estimularon las
células con Angio II.
En los registros de IKV de la figura 23 se muestra el efecto de la Angio II en
una neurona control (Figura 23A) y en otra incubada con erbastatina (Figura 23B).
Nótese que el efecto de la Angio II fue menor en la segunda. En promedio, el
aumento de la IKV por la Angio II se redujo de 11.5 ± 1.4 pA/pF (n= 12) obtenido en el
grupo control, a solo 4.7 ± 1 pA/pF (n= 10) del grupo tratado con erbastatina (Figura
23C), siendo esta diferencia estadísticamente significativa (P< 0.05).
44
B
CTRL
16
2
2
10 pA/pF
1
C
Erbastatina
1
20 ms
14
10 pA/pF
20 ms
Incremento de IKV ( pA/pF)
A
Angio II (500nM)
12
12
10
8
10
6
4
2
0
CTRL
Erbastatina
FIGURA 23: Efecto de la erbastatina sobre la modulación de la IKV. Se muestran trazos
representativos de la IKV antes (1) y con Angio II 500 nM (2) de una neurona control (A) y otra
incubada durante 15 minutos con erbastatina 5 M (B). En cada panel las líneas discontinuas indican
el nivel cero de la corriente después de la resta de la corriente de fuga, a un voltaje de membrana de 0
mV. En C se muestra el resumen del aumento de la IKV por Angio II. Nótese que el fármaco disminuyo
significativamente (P< 0.05) el efecto de la Angio II de 11.5 ± 1.4 pA/pF (n= 12), obtenido en el grupo
no tratado (CTRL) a solo 4.7 ± 1 pA/pF (n= 10).
IX. 6. 2 El inhibidor específico de tirosino cinasas de tipo
citoplásmico Src, PP2, no reduce la modulación angiotensinérgica de la IKV.
Una de los posibles candidatos de las tirosino cinasas que pudieran estar
involucradas son las del tipo citosolico Src. Se ha visto en células de Schwan que
estas cinasas producen la activación de canales de K+ tipo rectificadores tardíos
(Sobko y cols., 1998). Con el propósito de profundizar sobre el tipo de tirosino cinasa
involucrada en la modulación angiotensinérgica de la IKV, se exploró el efecto del
inhibidor específico de la proteína Src, PP2 (1 M), y de su análogo inactivo PP3 (1
M). La figura 24 muestra el efecto de la Angio II sobre la IKV en una neurona control
(CTRL, figura 24A) y en células incubadas con PP3 (Figura 24B) o PP2 (Figura 24C).
Nótese que el PP2 no produce un claro efecto inhibitorio sobre la modulación
angiotensinérgica de la IKV. Al cuantificar el aumento de la IKV en las tres anteriores
condiciones experimentales se encontró que la Angio II aumenta la densidad de
corriente de la IKV en 14.2  2.3 pA/pF (n= 5), 14.6  0.8 pA/pF (n= 10) y 12.2  1.5
(n= 4) respectivamente (Figura 24D), siendo este último valor, aunque menor,
estadísticamente no significativo (P< 0.05).
45
Con el fin de evaluar si la falta de efecto del PP2 sea debido a que se requiere
una mayor concentración del inhibidor de Src se efectuó otra serie de experimentos
con una dosis 10 M. En estas condiciones el aumento de la IKV fue de 16.6  1.4
pA/pF (n= 8) y 12.5  1.3 pA/pF (n= 9) con PP3 y PP2, respectivamente (Figura 24E),
una diferencia que tampoco resultó estadísticamente significativa (P< 0.05).
A
B
C
PP3 (1 M)
CTRL
PP2 (1 M)
2
2
2
20 pA/pF
20 pA/pF
20 pA/pF
1
1
20 ms
20 ms
20 ms
1
D
E
20
Angio II (500 nM)
20
Angio II (500 nM)
8
10
15
Incremento de IKV (pA/pF)
Incremento de IKV (pA/pF)
5
4
10
5
0
15
9
10
5
0
CTRL
PP3
PP2
PP3
PP2
FIGURA 24: Modulación angiotensinérgica de la IKV en células tratadas con un inhibidor
específico de Src. Registros de la IKV antes (1) y con Angio II en una célula control (A) y en neuronas
incubadas con el inhibidor inactivo (PP3 1 M) (B) y activo (PP2 1 M) (C) de la proteína cinasa Src.
En cada panel las líneas discontinuas indican el nivel cero de la corriente después de la resta de la
corriente de fuga, a un voltaje de membrana de 0 mV. En D se muestra el resumen de estos
resultados donde se encontró que la Angio II produjo un incremento similar en las tres condiciones
14.2  2.3 pA/pF (n= 5), 14.6  0.8 pA/pF (n= 10) y 12.2  1.5 (n= 4), respectivamente. E muestra el
resumen de el efecto Angio II sobre la IKV en neuronas incubadas con PP3 y PP2 a una concentración
mayor (10 M), los cuales fueron de 16.6  1.4 pA/pF (n= 8) y 12.5  1.3 pA/pF (n= 9) respectivamente
(P< 0.05). Los incrementos fueron estadísticamente no significativos. Nótese que el PP2 no bloqueó
completamente la modulación de la IKV.
46
X. DISCUSIÓN
Estudios realizados por Mendoza (2003) demostraron que la Angio II al
estimular su receptor AT1 aumenta la amplitud del rectificador tardío IKV, en las
neuronas simpáticas del ganglio superior cervical de la rata. Además, en trabajos
previos de este laboratorio se encontró que la estimulación angiotensinérgica de IKV
tiene las siguientes propiedades: 1) es insensible a la toxina pertussis, pero es
bloqueada al inhibir a las proteínas G con el GDPS; 2) depende de la presencia de
ATP en el medio intracelular y 3) hay un efecto de oclusión entre la acción
estimulante de los receptores AT1 con la potenciación muscarínica de IKV (Acosta y
cols., 2007; Acosta 2004). La presente tesis de doctorado aporta evidencias sobre la
identidad molecular de los elementos de la cascada de señalización que interviene
en la modulación angiotensinérgica, y muscarínica, de IKV.
Para abordar el enigma sobre el tipo de proteínas G que participan en la
modulación de IKV, primero fue necesario conocer los tipos de subunidades G que
expresan las neuronas GSC. El estudio de RT-PCR en célula individual demostró
que estas neuronas expresan las siguientes subunidades G PTX-insensibles G11,
Gq, Gs, G12 y Gz. No se encontró evidencia de G13 (Figura 11) y no se evaluó
la presencia de G14, G15 y G16 ya que la expresión de la primera, se restringe a
tejido de pulmón fetal y riñón (Rubio y cols., 1999). Además, en el roedor el gen de la
G16 corresponde al de la G15 (Wilkie y cols., 1992) y que su expresión sólo se
restringe a pulmón y vaso de adulto (Contos y cols., 2002).
Una vez realizado el análisis de RT-PCR se encontró que Gs es una de las
subunidades G resistentes a la PTX que expresan las neuronas GSC. Por lo
anterior, primero se exploró si la vía del AMPc participa en la modulación de IKV: esto
fue porque: a) en las terminales nerviosas simpáticas la Angio II estimula la liberación
de NA por un mecanismo dependiente del AMPc (Bohem y Kubista, 2002); b) esta
cascada de señalización es comúnmente usada para modular canales iónicos. Los
resultados obtenidos con el péptido antagonista de Gs (Figura 12) y con el VIP
(Figura 13) sugieren que esta proteína G y por tanto la vía del AMPc no tiene un
papel relevante en la modulación de IKV. No se logró evaluar con más detalle la
47
participación de esta cascada de señalización porque el activador directo de la
adenilato ciclasa forskolina bloqueó a IKV de neuronas GSC (Anexo 1). Este hallazgo
es consistente a lo observado por Hoshi y cols., (1988) y por Garber y cols., (1990),
quienes describen que la forskolina altera directamente el “gating” de canales de
potasio dependientes de voltaje por un mecanismo independiente a la activación de
la adenilato ciclasa. Revisando en la literatura, no se encontró más reportes de este
efecto sobre otras corrientes tipo rectificador tardío, y mucho menos en neuronas del
GSC, por lo que es un hallazgo nuevo, sin embargo, el mecanismo de bloqueo
escapa de los intereses de esta tesis. No obstante, datos sobre el efecto directo de
fármacos como la forskolina o el LY294002 (Ver anexos) sobre IKV, y posiblemente
sobre otras corrientes iónicas en otras neuronas, son un efecto que debe tomarse en
cuenta en particular en estudios donde se aborda el papel de la vía del AMPc o de la
PI3K, sobre el patrón de disparo de las neuronas o la actividad sináptica.
Otras subunidades G reveladas por el análisis de RT-PCR fueron Gq y G11
y dado que estas proteínas G comúnmente estimulan la vía de la PLC, se procedió
a evaluar la participación de esta cascada de señalización celular. Esto es también
porque en las neuronas GSC el receptor AT1, estimula la hidrólisis del PIP2 y con ello
la síntesis de IP3 y DAG (Strömberg y cols., 1991). Los resultados obtenidos con el
activador directo de la PKC, PMA, sugieren que la ruta DAG/PKC juega un papel
relevante en la modulación angiontensinérgica de la IKV. Esto se infiere porque se
encontró que el PMA, pero no el 4-forbol, mimetizó el efecto de la Angio sobre IKV, y
la estimulación con Angio II en neuronas previamente tratadas con PMA no produjo
un incremento significativo de la corriente (Figura 14). Además, la incubación
prolongada de las neuronas con PMA, para inducir la regulación a la baja de la PKC,
también redujo el efecto de la Angio II sobre IKV (Figura 15). Sin embargo, no se
puede excluir que el menor efecto de la Angio II en las células incubadas por toda la
noche con el PMA, se deba a la internalización del receptor AT1 como resultado de
su fosforilación por la PKC.
Una prueba alternativa para evaluar la participación de la vía de la PLC fue
estudiar el efecto de la Angio II sobre IKV, en neuronas transfectadas con la proteína
48
RGS2, ya que la sobre expresión de RGS2 al acelerar la actividad GTP-asa de Gq/11
o actuar como antagonista de su efector, evita la activación de la PLC.
Para poder llevar a cabo lo anterior fue necesario hacer experimentos control
para optimizar la técnica de microinyección intranuclear de plásmidos, un
procedimiento empleado para transfectar las neuronas GSC. Respecto a lo anterior
se logró sobre expresar la subunidad KCNQ2 de los canales M, la cual resultó en un
incremento en la sensibilidad al TEA de la IKM (Figura 16); dicho resultado va acorde
a lo encontrado por Shapiro y cols. (2000), en donde la corriente generada por la
sobre-expresión de KCNQ2 es altamente sensible al TEA.
Una vez que se corroboró la funcionalidad de la técnica de transfección,
primero se estudió el efecto de la Angio II sobre IKM en neuronas que sobre-expresan
a RGS2. Para ello se emplearon dos plásmidos: a) uno que codifica a la proteína de
fusión EGFP-RGS2 y b) otro que sólo tiene la secuencia de expresión para RGS2. El
primero dio resultados negativos (Figura 17), quizá debidos a defectos en su tráfico
hacia la membrana plasmática (Figura 18). Por el contrario, cuando se cotransfectaron RGS2 y GFP en plásmidos separados se encontró que RGS2 ahora sí
bloqueó la modulación muscarínica o angiotensinérgica de IKM (Figuras 19 y 20).
Previamente, sólo se había demostrado que RGS2 inhibe la modulación muscarínica
de las corriente generada por KCNQ2/KCNQ3 en células tsA-201 (Suh y cols., 2004).
En este contexto, los resultados de este trabajo demuestran que RGS2 tiene el
mismo efecto sobre la modulación muscarínica de la IKM endógena generada por una
neurona, pero además, demuestran esta acción inhibitoria sobre la modulación
angiotensinérgica de IKM.
De manera relevante fue el hallazgo que la sobre-expresión de RGS2 redujo
la modulación tanto angiotensinérgica (Figura 20) como muscarínica de la IKV (Figura
21). Estos resultados indican que Gq/11 participa en la modulación de IKV
y son
consistentes con los resultados del activador directo de la PKC. Previamente nuestro
laboratorio ha aportado evidencia farmacológica sugiriendo que el receptor que
interviene en la modulación muscarínica de IKV es del tipo M2/4 (Cruzblanca, 2006).
Si bien estos receptores comúnmente se acoplan a miembros de la familia Gi
(Alexander y Mathie, 2006), no es esta familia de proteínas G la que interviene en la
49
modulación muscarínica de IKV. Esto se sugiere porque: 1) el efecto de la Oxo-M
sobre IKV no es bloqueado por la toxina pertussis (Cruzblanca, 2006); 2) el bloqueo
de la modulación muscarínica de IKV por la proteína RGS2 (Figura 21) indica que
Gq/11 tiene una participación relevante en este tipo de modulación. Lo anterior sugiere
que el receptor M2/4, saliéndose del paradigma, también se acopla a Gq/11. No hay por
el momento evidencia bioquímica o molecular de que esta interacción efectivamente
ocurra en neuronas, sin embargo, el potencial acople no es imposible porque
recientemente se ha demostrado, en células CHO, que el receptor M2 puede
estimular directamente a Gq y con ello el metabolismo de los fosfoinosítidos (Michal y
cols. 2007). Por lo anterior, los resultados de esta tesis con la proteína RGS2 podrían
constituir un primer ejemplo en donde el receptor M2/4 señaliza vía Gq/11 para modular
corrientes iónicas endógenas (en este caso a IKV).
Finalmente, aun cuando los resultados indican una clara participación de Gq/11
en la modulación angiotensinérgica y muscarínica de IKV. No se descarta que Gz, el
único miembro de la familia Gi que es insensible a la toxina pertussis pudiera estar
involucrada en estas modulaciones. Esto es poco probable ya que estudios
involucran a Gz principalmente en mecanismos de señalización correspondientes a
secreción o en procesos cancerigenos (Meng y Casey, 2002; Fields y Casey, 1997).
Otra proteína G que se expresa en las neuronas GSC al igual que la Gz, y que
pudiera contribuir en la modulación angiotensinérgica y muscarínica de IKV es la G12
(Figura 11). Se desconoce mucho sobre su función, sin embargo se le relaciona en el
control del reacomodo del citoesqueleto como la retracción de las neuritas, sobre
expresión de genes, transformación de fibroblastos, en la modulación del
intercambiador de Na+-H+, por una vía dependiente de Rho (Kvachnina y cols., 2005;
Yau y cols., 2003; Hall, 1998; Fields y Casey, 1997).
No se abordó el estudio de Gz y G12, ya que se enfocó principalmente en el
estudio de Gs y Gq/11, estas últimas están relacionadas con varios receptores en la
modulación de canales iónicos de Ca2+ tipo N y K+ tipo M en neuronas GSC. Fue
razonable pensar que en la modulación angiotensinérgica y muscarínica de la IKV,
probablemente utilizara una de estas proteínas G y no a Gz y G12; la sobre expresión
de RGS2, redujo aproximadamente en un 70 % dichas modulaciones, la cual implica
50
a Gq/11 como la principal responsable en llevar a cabo la modulación
angiotensinérgica y muscarínica de la IKV.
Otro hallazgo por demás intrigante
fue
que
la
wortmanina
redujo
significativamente la modulación angiotensinérgica de la IKV (Figura 22). Dado que la
wortmanina es un inhibidor tanto de la PI3K como de la PI4K, este hallazgo por si
solo no permite distinguir si la menor potenciación angiotensinérgica de IKV se debe
a: 1) inhibición de la PI3K y su subsecuente cascada de señalización (cualquiera que
sea) o; 2) menor disponibilidad de PIP2, y por lo tanto menor síntesis de DAG,
resultado de la inhibición de la PI4K. Este último mecanismo no se descarta si
consideramos cómo es el metabolismo del PIP2; brevemente, una vez que el PIP2 es
hidrolizado por la PLC, el IP3 es desfosforilado hasta dar lugar al inositol; después el
inositol es unido al ácido fosfatídico (producto de la otra rama biosintética) para
generar el fosfatidil-inositol (PI). Finalmente el PI es secuencialmente fosforilado por
la PI4K y PI5K, regenerando el PIP2. Al respecto, se ha reportado que el tratamiento
con wortmanina (10 M) por 14 minutos de las células SH-SY5Y, es suficiente para
reducir el nivel de PIP2 hasta un 83% (Willars y cols. 1998). Desafortunadamente no
se logró avanzar en la evaluación sobre la posible participación de la PI3K porque el
inhibidor selectivo de esta enzima, el LY294002, bloqueó directamente a IKV (Anexo
2). Sin duda, el uso del dominante negativo de la PI3K aclarará la posible
participación de la PI3K en la modulación de IKV.
En la presente tesis también se obtuvo evidencia de la participación de tirosino
cinasas en la modulación angiotensinérgica de la IKV. Esto se infiere porque el
inhibidor general de este tipo de cinasas, erbastatina, redujo el efecto de la Angio II
sobre IKV (Figura 23). Una de estas tirosino cinasas podría ser Src porque hay
bastante evidencia que muestra la participación de esta enzima en la acción celular
de los receptores muscarínicos o a la Angio II. Por ejemplo se ha observado que los
receptores M2 modulan corrientes de calcio tipo L, vía Src (Callaghan y cols., 2004) y
en neuronas GSC la sobre-expresión de c-Src inhibe a IKM (Gamper y cols., 2003).
Sin embargo el inhibidor especifico de Src, PP2, no bloqueó significativamente el
efecto modulador de la Angio II sobre la IKV (Figura 24). Para poder descartar
51
completamente a Src, es necesario probar otros inhibidores específicos de esta
misma enzima y/o usar estrategias de biología molecular.
Los resultados obtenidos hasta el momento pueden estar reflejando una
contribución diferencial de más de una proteína cinasa actuando en serie y/o en
paralelo, para modular a IKV. Una de estas rutas es la vía DAG/PKC, y por otro lado
tirosino cinasas por ahora no identificadas y que pudieran tener entre cruzamiento
entre ambas proteínas cinasas (PKC/Tyr cinasas), no esta claro como se da esta
interacción. Sin embargo evidencia muestra que la activación de la PI3K tipo I, que a
su vez fosforila el PIP2 para formar PIP3 y que este último se ha relaciona con la
activación de PKC atípicas o nuevas (Wang y cols., 1999), las cuales incrementan la
actividad de tirosino cinasas del tipo Src para llevar acabo la modulación de canales
de Ca2+ (Callaghan y cols., 2004; Brandt y cols., 2003; Wang y cols., 1999).
Un posible modelo de trabajo que relaciona a la potencial participación de
estas proteínas cinasas se muestra en la figura 25.
FIGURA 25: Modelo propuesto sobre la modulación de la IKV por Angio II. Se muestra que el
receptor AT1 al acoplarse a Gq/11 estimula la PLC, la cual al hidroliza al PIP2 produce IP3 y DAG. Este
último activa la PKC el cual por un lado directamente produce el incremento de la IKV (experimentos
con PMA). Paralelamente la PKC puede activar tirosino cinasas (experimentos con Erbastatina) que
contribuyen a la modulación de la IKV. El modelo postula que la PI3K puede participar en la modulación
de IKV a través del dímero G de Gq/11 o de alguna otra proteína G insensible a la PTX.
52
Como se mencionó en la sección de Antecedentes, la Angio II y la BK
comparten mucho de los efectos que tienen los agonistas muscarínicos, sobre la
excitabilidad y metabolismo de las neuronas simpáticas El análisis de la evidencia
bioquímica y electrofisiológica reportada para la modulación de IKM y la obtenida en la
presente tesis con la modulación de IKV, permiten concluir que en las neuronas GSC
la vía de la PLC y todos sus potenciales mecanismos de señalización son activados
eficientemente para aumentar la excitabilidad celular. Así, los receptores M1 y AT1,
vía Gq/11, estimulan la hidrólisis del PIP2 y su depleción es la señal primaria que
inhibe a IKM. Por su parte, el receptor a la BK, vía Gq/11, estimula la hidrólisis del PIP2
y una vez sintetizado el IP3, éste provoca la liberación de Ca2+, formándose el
complejo Ca2+-CaM que también inhibe a IKM. Finalmente los hallazgos de la
presente tesis indican que los receptores M2/4 y AT1 (y posiblemente el receptor a la
BK), vía Gq/11, estimulan la rama DAG-PKC de la PLC para modular a la IKV. Este es
el primer ejemplo, en donde todas las ramas de una cascada de señalización ejercen
una acción moduladora sobre los canales M (vía depleción del PIP2, señal Ca2+-CaM)
y sobre la IKV (vía PKC).
53
XI. CONCLUSIONES.
1. En la modulación de IKV no está involucrada una proteína Gs y por ende la vía
del AMPc.
2. La sobre-expresión de RGS2 bloquea tanto la modulación angiotensinérgica
como muscarínica de IKM, por lo que se sugiere que en ambas modulaciones
está involucrada la proteína Gq/11.
3. La sobre-expresión de RGS2 bloquea tanto la modulación angiotensinérgica
como muscarínica de IKV, por lo que se sugiere que Gq/11 juega un papel toral
en la modulación de IKM e IKV.
4. El activador directo de la PKC, PMA, incrementa la IKV y después ocluye la
acción de la Angio II, lo que sugiere que la PKC es parte de la cascada de
señalización usada por el receptor AT1.
5. La modulación angiotensinérgica de IKV posiblemente también requiere de la
activación de la PI3K y de tirosino cinasas.
54
XII. PERSPECTIVAS.
1. Corroborar si la PI3K contribuye a la modulación de IKV. Esto se abordará en
neuronas transfectadas con el dominante negativo de esta enzima.
2. Corroborar la participación de la enzima tirosino cinasa Src en la modulación
de IKV, utilizando otros inhibidores ya sea para el tipo Src u otro tipo de tirosino
cinasas.
3. Discriminar entre Gq o G11 como la proteína G que participa en la modulación
muscarínica o angiotensinérgica de IKV.
4. Identificar el receptor a la BK que interviene en el aumento de IKV y determinar
los niveles de convergencia y/o divergencia con la modulación por el receptor
M2 y AT1.
5. Utilizar dominantes negativos de las subunidades Kv 2.1 y Kv 2.2 y con esto
ver si estas subunidades son parte del correlato molecular de la IKV que es
modulada por la Angio II y por agonistas muscarínicos.
6. Determinar cuál es el impacto de la modulación de IKV sobre la excitabilidad de
las neuronas GSC.
7. Determinar los cambios en las propiedades biofísicas del canal de K+
modulado por los anteriores receptores.
55
XIII. ANEXOS.
B
A
1
80
3
Forskolina (20 M)
70
1 nA
Lavado
IKV (pA/pF)
60
2
50
40
30
20
0
100
200
300
400
50 ms
Tiempo (s)
ANEXO 1: Efecto de la forskolina sobre la IKV. (A) Curso temporal de la supresión de IKV por la
forskolina (círculos blancos). Nótese la rápida instalación del efecto inhibitorio y de su recuperación
(triángulos). En 3 células tratadas con forskolina la supresión fue de 45.7 ± 10.3%. (B) Registros de IKV
(sin resta del “leak”) en la situación control (1), al estar aplicando forskolina (2) y después del lavado
del fármaco (3); se puede apreciar una aparente inactivación de IKV inducida por la forskolina (2) y una
recuperación casi total de la IKV al lavar el fármaco (3). La línea discontinua sólo indica el nivel de la
corriente de sujeción en este registro.
A
B
35
LY294002 (10M)
30
Lavado
IKV (pA/pF)
25
20
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
Tiempo (s)
ANEXO 2: Efecto directo del LY294002 sobre IKV. (A) Curso temporal de la inhibición de IKV por el
LY294002 (círculos blancos), y su recuperación después del lavado del fármaco (triángulos llenos). En
3 neuronas tratadas con el fármaco, el bloqueo de la corriente fue de 88.7 ± 2.6 %. B Trazos de IKV de
otra neurona, antes (Control) y 40 s (LYa) y 80 s (LYb) después de la aplicación de LY294002. Se
puede apreciar que el fármaco induce una robusta reducción de IKV y el desarrollo de una aparente
inactivación. En presencia del fármaco la Angio II no tuvo efecto estimulante (LY+Angio II).
56
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