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Universidad Autónoma de Madrid
Papel de los receptores de kainato en la
regulación de la transmisión sináptica
gabaérgica
Antonio Rodríguez Moreno
Tesis de Doctorado
Facultad de Ciencias
Director:
Dr. Juan Lerma Gómez
2000
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN....................................................................................................................1
1
1. RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO.....................................
2 .
4
1.1. RECEPTORES DE NMDA...............................................................................................4
5
1.2. RECEPTORES DE AMPA...............................................................................................5
6
1.3. RECEPTORES DE KAINATO.......................................................................................6
7
1.3.1. Biología Molecular de los receptores de kainato........................................
A. La familia de subunidades de los receptores de
kainato: GluR5-7, KA1 y KA2.............................................................................7....7
B. Distribución de las subunidades de los receptores de kainato............................... 7
C. Diversidad estructural................................................................................................ 8
10
1.3.2. Propiedades funcionales de los receptores de kainato............................
A. Propiedades biofísicas. Propiedades de los receptores
10
de kainato a nivel de canal único........................................................................10
B. Propiedades de activación y de desensibilización
11
de los receptores de kainato..................................................................................11
C. Propiedades farmacológicas de los receptores de kainato...................................... 13
13
C.1. Agonistas......................................................................................................13
C.2. Antagonistas.......... ....................................................................................... 14
1515
D. Papeles fisiológicos de los receptores de kainato....................................
OBJETIVOS...............................................................................................................................17
17
MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................18
18
1. CULTIVOS NEURONALES...........................................................................................18
18
Microcultivos de neuronas........................................................................................................
18
2. RODAJAS DE CEREBRO...............................................................................................18
18
19
3.REGISTROS ELECTROFISIOLÓGICOS...............................................................1
3.1. Cultivos...................................................................................................................................19
19
21
3.2. Rodajas....................................................................................................................................21
4. ANÁLISIS DE LOS REGISTROS................................................................................2
23
24
5. SOLUCIONES........................................................................................................................24
24
5.1. Cultivos....................................................................................................................................24
5.2. Rodajas.......................................................................................................................................... 24
6. EXPERIMENTOS IN VIVO................................................................................................. 25
RESULTADOS................................................................................................................................ 26
1. La activación de los receptores de kainato produce una depresión
de la transmisión sináptica GABAérgica en el hipocampo de rata................26
1.1. Kainato produce una depresión de la transmisión
GABAérgica.................................................................................................................................
1.2. La modulación de la transmisión GABAérgica por kainato es de
origen presináptico.....................................................................................................................
1.3. El efecto de kainato no se debe a la activación de los receptores
metabotrópicos de glutamato..................................................................................................
1.4. CNQX antagoniza el efecto de kainato de forma dosis-dependiente..........................
1.5. Kainato no actúa sobre otro tipo de receptores descritos
que regulan la liberación de neurotransmisor.....................................................................
1.6. El agonista endógeno de los receptores de kainato, glutamato,
ejerce el mismo efecto que kainato sobre las eIPSCs.......................................................
1.7. Kainato deprime la transmisión GABAérgica en la región CA1 del
hipocampo in vivo......................................................................................................................
26
29
31
32
32
33
35
2. La modulación de la liberación de GABA por los receptores
de kainato involucra una función metabotrópica.................................................. 37
2.1. La activación de una proteína G sensible a toxina pertúsica
y de proteína kinasa C son necesarias para que se produzca
la disminución de liberación de GABA mediada por la activación
de receptores de kainato.........................................................................................................
2.2. Kainato activa una población particularde PKC.............................................................
2.3. La acción de kainato es independiente de la actividad
del receptor como canal iónico.............................................................................................
2.4. AMPA no activa una cascada similar................................................................................
2.5. La activación de los receptores metabotrópicos de tipo I
no ocluye la acción de kainato.............................................................................................
2.6. La activación de los receptores de kainato modula la señal de calcio.....................
37
40
42
43
43
44
3. Las interneuronas de hipocampo presentan dos poblaciones
de receptores de kainato con mecanismos de
señalización diferentes.......................................................................................................
46
3.1. El aumento de actividad espontánea y el descenso de amplitud de las
respuestas evocadas son efectos producidos por la activación
de receptores de kainato diferentes......................................................................
46
4. La modulación de la liberación de GABA mediada por la
activación de los receptores de kainato presinápticos
es un
fenómeno común
a diferentes zonas del cerebro
4.1. Hipocampo................................................................................................................................
4.2. Cerebelo.....................................................................................................................................
4.3. Neocorteza................................................................................................................................
DISCUSIÓN.................................................................................................................................
1. La acción de kainato es presináptica....................................................................................
2. La curva dosis-respuesta para el efecto de kainato y de glutamato
presenta forma de campana...................................................................................................
3. La depresión de las corrientes inhibidoras mediada por activación de
receptores de kainato requiere una cascada metabotrópica...........................................
4. ¿Son las proteínas exocitóticas los efectores de una población
específica de PKC?....................................................................................................................
5. En las interneuronas de hipocampo coexisten las dos
poblaciones de receptores de kainato con sistemas
de señalización diferentes........................................................................................................
6. La modulación de la liberación de GABA mediada por la activación de
receptores de kainato presinápticos es un fenómeno común a
diferentes áreas del cerebro....................................................................................................
7. Relevancia fisiológica del bloqueo de la liberación de GABA mediada por
receptores de kainato...............................................................................................................
53
53
54
56
58
59
60
60
61
63
65
66
CONCLUSIONES...................................................................................................................
68
BIBLIOGRAFÍA.....................................................................................................................
69
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS.
AMPA: ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico
AMPc:
adenosín monofosfato cíclico
ATP:
adenosín trifosfato
ATPA:
ácido (RS)-α-amino-3-hidroxi-5-tert-butil-4-isoxazolepropiónico
BIS:
bisindolilmaleimida
Ca2+:
ion calcio
CA:
Cornus ammonis (nombre de las subcapas del hipocampo)
CNQX: 6-ciano-7-nitorquinoxalín-2,3-diona
CV:
Coeficiente de Variación
D-AP5: ácido D-2-amino-5-fosfopentanoico
DNA:
DRG:
ácido desoxirribonucleico
ganglios de la raíz dorsal
EEM:
error estándar de la media
EGTA:
ácido etilenglicol-bis-(β-aminetiléter)-N, N, N’, N’-tetracético.
eIPSCs: corrientes postsinápticas inhibidoras evocadas
EPSPs:
potenciales postsinápticos excitadores de campo
GABA: ácido γ-aminobutírico
GTP:
guanosín trifosfato
HEK:
Human embryonic kidney cells (células embrionarias de riñón humano)
HEPES: N-(2-hidroxietil) piperacina-N-(2-ácido etanosulfónico)
Hz:
Hercio
iGluR:
receptor de glutamato ionotrópico
IP3:
inositoltrifosfato
K+:
ion sodio
KBPs:
kainate binding proteins (proteínas que unen kainato)
KDa:
Kilodalton
LTD:
long Term Depression (Depresión de larga duración)
LTP:
long Term Potentiation (Potenciación de larga duración)
MΩ:
megaohmios
Mg2+ :
ion magnesio
mGluR: receptor de glutamato metabotrópico
i
mIPSCs: corrientes postsinápticas inhibidoras miniatura
mM:
milimolar
mOsm:
miliosmoles
mRNA:
ácido ribonucleico mensajero
ms:
milisegundo
mV:
milivoltio
+
Na :
ion sodio
NMDA:
N-metil-D-aspartato
pA:
picoamperio
PKA:
proteína kinasa A
PKC:
proteína kinasa C
PLC:
fosfolipasa C
pS:
picosiemens
PTx:
toxina pertúsica
sIPSCs: corrientes postsinápticas inhibidoras espontáneas
SNC:
Sistema Nervioso Central
TEA:
tetraetilamonio
TTX:
tetrodotoxina
µM:
micromolar
ii
Introducción
INTRODUCCIÓN.
Han pasado 46 años desde que se demostró por primera vez que la aplicación de
glutamato monosódico en la corteza cerebral inducía depolarizaciones masivas (Hayashi,
1954). A esta observación puntual indicando un posible papel del glutamato como agente
excitador del Sistema Nervioso Central (SNC), le siguieron estudios electrofisiológicos más
detallados demostrando efectos depolarizantes tanto del glutamato como del aspartato en
neuronas aisladas del SNC de vertebrados y que éstos eran el resultado de un aumento de
la conductancia de la membrana a sodio.
En la década de los 70 se realizaron los trabajos demostrativos de que el glutamato
cumplía la mayor parte de los criterios para ser considerado neurotransmisor en el SNC de
los mamíferos. La presencia de receptores para glutamato en las membranas neuronales
(Evans et al., 1979), la liberación de glutamato por las terminales nerviosas tras la
excitación (Hamberger et al., 1979), así como la existencia de sistemas de transporte
específicos de alta afinidad tanto en células gliales como en terminales nerviosas (Logan y
Snyder, 1972), apoyaron fuertemente la hipótesis de que el glutamato era el
neurotransmisor excitador por excelencia en el SNC. Además, el conocimiento de la
existencia de rutas metabólicas biosintéticas y degradativas de glutamato en neuronas así
como la presencia de un transportador dependiente de ATP implicado en el almacenaje de
glutamato en vesículas sinápticas, igualmente sirvieron para consolidar esta conclusión.
En la actualidad, está bien establecido que el glutamato es el agente neurotransmisor
usado en la mayoría de las sinapsis excitadoras del Sistema Nervioso Central de los
mamíferos. Además de la función del glutamato como mediador de la transmisión sináptica,
este aminoácido participa durante la formación del sistema nervioso en procesos de
crecimiento y maduración neuronal, en la formación y eliminación de sinapsis y, en
determinadas áreas y de forma dependiente de actividad, en la formación de patrones
precisos de conectividad sináptica. Igualmente desencadena cambios duraderos en la
eficacia sináptica, fenómenos conocidos como LTP (potenciación de larga duración, “longterm potentiation”) y LTD (depresión de larga duración, “long-term depression”), que se
consideran el correlato celular de los procesos de aprendizaje y formación de la memoria.
1
Introducción
Además, alteraciones de la neurotransmisión glutamatérgica están implicadas en el daño
neuronal observado después de episodios de isquemia y de hipoglucemia, así como en la
etiología de una serie de estados neurológicos patológicos que incluyen la epilepsia y las
enfermedades de Alzheimer, de Parkinson, la corea de Huntington y la esclerosis lateral
amiotrófica.
El glutamato realiza sus funciones mediante la activación de varias moléculas
receptoras. Los receptores que el glutamato activa se han dividido en dos familias:
receptores metabotrópicos y receptores ionotrópicos. Los receptores metabotrópicos
(mGluRs) están acoplados a proteínas G (proteínas que unen GTP) y regulan la producción
de mensajeros intracelulares (Pin y Duvoisin, 1995). Esta superfamilia está formada por 8
genes diferentes (mGluR1-8), cada uno de los cuales da lugar a distintos mRNAs por
mecanismos de ayuste (splicing) alternativo. Según el nivel de conservación de su
secuencia aminoacídica estos receptores se han subdividido en tres grupos (tipos I, II y III)
(Nakanishi, 1992), con dos posibles mecanismos de transducción (adenilato-ciclasa y
fosfolipasa C). Estos tres grupos presentan también propiedades farmacológicas propias.
Por el contrario, los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluRs) forman un canal
catiónico con diferente selectividad iónica según el tipo de receptor, siendo permeables a
sodio (Na+), potasio (K+) y, en ocasiones, a calcio (Ca2+) (Nakanishi, 1992; Hollmann y
Heinemann, 1994).
1. RECEPTORES IONOTRÓPICOS DE GLUTAMATO.
Se estima que en el SNC de los mamíferos, el glutamato es el neurotransmisor
empleado en el 90 % de las sinapsis excitadoras rápidas, donde actúa sobre receptores
ionotrópicos (iGluR). En función del agonista que produce la activación de éstos con
mayor afinidad o selectividad, los receptores ionotrópicos de glutamato se han clasificado
en tres tipos: receptores de NMDA (ácido N-metil-D-aspártico), receptores de AMPA
(ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico) y receptores de kainato.
Desde el punto de vista molecular, los receptores ionotrópicos de glutamato son
proteínas integrales de membrana formadas, probablemente, por cuatro subunidades que
2
Introducción
GLUTAMATO
NMDA
EXTRACELULAR
Zn
GLU
AMPA
KAINATO
mGluR I, II, III
GLY
PA
Mg
G
INTRACELULAR
NR2A
NR2B
SUBUNIDADES NR1+
NR2C
NR2D
GluR5-7
KA1, KA2
GluR1-4
AdC
PLC
IONOTRÓPICOS
mGluR1-8
METABOTRÓPICOS
Figura 1. Los receptores de glutamato se dividen en ionotrópicos (canales iónicos) y
metabotrópicos (acoplados a proteínas G). Los receptores ionotrópicos se subdividen en función
de su activación selectiva por los agonistas NMDA, AMPA y kainato. Por su parte, los
metabotrópicos se subdividen con respecto a la homología de sus secuencias en los grupos I, II y
III. En la figura se incluyen también los nombres de las subunidades conocidas a la fecha para
cada uno de los diferentes tipos de receptor y, en el receptor de NMDA, se indican los diferentes
sitios de modulación que se conocen. AdC, adenilato ciclasa; PLC, fosfolipasa C; PA,
poliaminas.
A
NH2
Sitio R/G
flip/flop
Glu
1
Sitio Q/R/N
Sitio I/V
Sitio Y/C
2
3 4
B
NH 2
C
Canal Iónico
Glu
1 2 3 4 5 6 7
COOH
COOH
M2
Figura 2. Topología de los receptores de glutamato. A) Los tres tipos de receptores ionotrópicos
poseen tres dominos transmembranales (1, 3 y 4) y un segmento hidrofóbico que se introduce en la
membrana de manera incompleta (2) formando la pared del canal iónico. El sitio de unión del
glutamato está formado por aminoácidos de la región N-terminal y del asa entre el tercero y el
cuarto dominios transmembranales. También se muestra la posición de los diferentes sitios
modificados por la edición y el procesamiento o ayuste alternativo de los RNA mensajeros que
codifican estos receptores y que se discuten en el texto. B) Los receptores metabotrópicos poseen
siete dominios transmembranales análogos a los observados en otras familias de receptores
acoplados a proteínas G. El sitio de unión de glutamato está formado por aminoácidos del
segmento N-terminal exclusivamente. C) La disposición en el plano de la membrana de las
subunidades que conforman un receptor ionotrópico revela que se trata de un tetrámero en el que
el segmento hidrofóbico M2 se ubica hacia el centro de la molécula formando el poro del canal.
3
Introducción
forman un tetrámero (Rosenmund et al., 1998). Estas subunidades son cadenas
polipeptídicas de aproximadamente 900 aminoácidos (≈100 KDa), las cuales están
formadas por tres dominios transmembranales (M1, M3 y M4) y un dominio
intramembranal (M2); con el extremo carboxiterminal intracelular y el aminoterminal
situado en el lado extracelular. Se han identificado 28 subunidades distintas, codificadas
por, al menos, 17 genes diferentes. Tal variedad se genera porque los RNAs pueden ser
modificados mediante mecanismos de ayuste alternativo. Además, se conocen variantes
generadas por edición del RNA, lo que incrementa el número de isoformas.
1.1. RECEPTORES DE NMDA.
De los tres tipos de receptores ionotrópicos de glutamato, el mejor conocido es el
receptor de NMDA, debido sobre todo, a la rápida disponibilidad de ligandos selectivos,
como el agonista NMDA (N-metil-D-aspartato) y los antagonistas D-AP5, MK801 o
ketamina. Los receptores de NMDA son canales catiónicos que permiten el paso a su
través de Na+, K+ y Ca2+. Funcionalmente, se caracterizan por poseer una alta
permeabilidad a Ca2+ (Ascher y Nowak, 1988), presentar dependencia de voltaje debida al
bloqueo del canal por concentraciones fisiológicas de magnesio (Mg2+)(Nowak et al., 1984;
Mayer y Westbrook, 1987), un tiempo de apertura largo (Nowak et al., 1984) y una
cinética de activación y de deactivación relativamente lenta (Lester et al., 1990).
Además de los sitios de unión para el agonista, el receptor de NMDA presenta
diversos lugares de regulación alostérica, que son diana para compuestos tanto endógenos
como exógenos. Estos sitios de unión incluyen: un sitio de alta afinidad para glicina
(Johnson y Ascher, 1987; Klecner y Dingledine, 1998; Lerma et al., 1990); un sitio
localizado en la luz del canal donde se unen el Mg2+ y moléculas como las fenciclidinas
(PCP), el MK801, TCP o ketamina (Macdonald et al., 1991; Lerma et al., 1991); además
de un sitio adicional en el que actúa Zn2+ inhibiendo las respuestas inducidas por el agonista
de forma independiente de voltaje (Peters et al., 1987; Westbrook y Mayer, 1987).
Finalmente, es conocido que las poliaminas espermina y espermidina potencian de forma
alostérica el receptor de NMDA (Lerma, 1992). Igualmente, se ha descrito que los
receptores de NMDA son sensibles a altas concentraciones extracelulares de H+ (i.e. son
sensibles al pH) (Traynelis y Cull-Candi, 1990) y son susceptibles a los estados de
4
Introducción
oxidación-reducción (Aizenman et al., 1989).
A nivel estructural estos receptores están formados por, al menos, dos tipos de
subunidades: NR1 (Moriyoshi et al., 1991) y NR2 (Monyer et al., 1992; Meguro et al.,
1992). Esta última consta de cuatro isoformas, NR2A, NR2B, NR2C y NR2D. La
subunidad NR1 presenta 8 variantes generadas por ayuste alternativo (Sugihara et al.,
1992; Nakanishi et al., 1992), que tienen diferentes propiedades farmacológicas.
Expresando en sistemas heterólogos la subunidad NR1 con cualquiera de las cuatro
subunidades NR2, se obtienen receptores de NMDA con características funcionales
similares a los nativos. La subunidad NR1 parece ser el constituyente común de los
receptores de NMDA, puesto que ninguna de las cuatro subunidades NR2 es capaz de
generar receptores funcionales por sí misma. Dependiendo de la subunidad NR2 que se
ensamble, los receptores heteroméricos NR1-NR2 tienen características propias.
La subunidad NR1 se encuentra expresada en prácticamente todas las neuronas
(Moriyoshi et al., 1991) mientras que las distintas subunidades NR2 muestran patrones de
expresión espacio-temporales característicos en el cerebro y en la médula espinal,
sufriendo alteraciones durante el desarrollo (Watanabe et al., 1992; Monyer et al., 1994).
Los receptores de NMDA están involucrados en procesos fisiológicos complejos del SNC.
Además de participar en la transmisión normal de la información, la activación de los
receptores de NMDA se requiere para la generación de algunas formas de LTP (Nicoll et
al., 1988). Igualmente, la alta permeabilidad a calcio de los receptores de NMDA hace que
estos jueguen un importante papel en procesos de muerte celular por excitotoxicidad.
1.2. RECEPTORES DE AMPA.
La familia de los receptores de AMPA está formada por cuatro subunidades que
presentan una homología entre ellas del 68 al 75 %. Se denominan GluR1-4 o GluRA-D,
según el criterio seguido por el grupo que las clonó. Cada una de las cuatro subunidades
presenta dos variantes generadas por procesamiento alternativo de los mRNAs,
denominadas “flip” o “flop”. Un determinante molecular importante para las propiedades
de canal de los receptores de AMPA es el aminoácido situado en la posición 586 (sitio
Q/R). En tres de las cuatro subunidades del receptor de AMPA (GluR1, 3 y 4) esta
posición está ocupada por una glutamina (Q). Los canales formados por cualquiera de estas
5
Introducción
subunidades presentan una marcada rectificación entrante: dejan pasar más corriente en
sentido entrante (potenciales de membrana negativos) que en sentido saliente (potenciales
de membrana positivos) y son significativamente permeables a calcio (Hollman et al.,
1991; Verdoorn et al., 1991; Burnashev et al., 1992). Por el contrario, la subunidad GluR2
presenta una arginina (R) en esta posición. Este cambio hace que estos receptores
presenten rectificación saliente (dejan pasar más corriente a potenciales de membrana
positivos que negativos) y no permeen calcio. La subunidad GluR2 es fenotípicamente
dominante, determinando el comportamiento del canal.
De forma contraria a los receptores de NMDA, que poseen varios sitios de
modulación, los receptores de AMPA carecen, aparentemente, de esta compleja
farmacología. En 1990 se describió que la sustancia Aniracetam potenciaba las respuestas
de quisqualato a través de los receptores de AMPA (Ito et al., 1990). Investigaciones
posteriores demostraron que una familia de compuestos, las benzotiodiacidas, eran capaces
de reducir la desensibilización de los receptores de AMPA. En este sentido, los diazóxidos,
clínicamente usados como antidepresivos, son un orden de magnitud más potentes que el
aniracetan. El compuesto más efectivo de esta familia es la ciclotiacida que reduce
notablemente la desensibilización rápida de los receptores de AMPA, aumentando las
corrientes postsinápticas (Yamada et al., 1993; Patneau et al., 1993; Trussell et al, 1993).
Los receptores de AMPA se distribuyen por todo el cerebro, existiendo cambios de
expresión según la etapa del desarrollo y el tipo de subunidad. De forma general, estos
receptores se encuentran altamente expresados en el hipocampo y en las capas
superficiales de la corteza. Por el contrario, las capas profundas de la corteza y el
caudado/putamen expresan niveles intermedios.
Además de participar en la transmisión rápida de la información sináptica, estos
receptores también han sido involucrados en algunas formas de plasticidad sináptica.
Asimismo, una excesiva entrada de calcio a su través en condiciones patológicas también
contribuye a la muerte de las neuronas.
1.3. RECEPTORES DE KAINATO.
El receptor de kainato es el componente del sistema de señalización de glutamato que
6
Introducción
se ha mostrado más elusivo a los investigadores. La falta de herramientas farmacológicas
específicas ha impedido la detección de este tipo de receptores en neuronas del Sistema
Nervioso Central (SNC), así como la determinación de sus papeles fisiológicos. Hasta la
clonación de las subunidades que forman los receptores de kainato, la evidencia de su
existencia como receptores independientes era inexistente y sólo recientemente se han
definido los procesos en los que estos receptores están involucrados (Lerma, 1997a).
1.3.1. Biología molecular de los receptores de kainato.
A. La familia de subunidades de receptores de kainato: GluR5-7, KA1 y KA2.
La familia de subunidades que puede contribuir a la formación de receptores de
kainato nativos se puede dividir en dos subfamilias. Una primera incluye las subunidades
GluR5, GluR6 y GluR7 y muestran entre sí un grado de homología del 75-80 %. Todas
estas subunidades generan canales funcionales homoméricos, conteniendo lugares de baja
afinidad para la unión de kainato. La otra subfamilia la constituyen las subunidades KA1 y
KA2, las cuales, aunque no forman canales homoméricos por sí mismas, generan lugares de
alta afinidad para la unión de kainato cuando se expresan en células de mamíferos.
Mientras que las secuencias aminoacídicas de estas subunidades muestran un grado de
homología entre sí del 70 %, sólo presentan un 45 % de homología con las de la otra
subfamilia. De
forma similar a las subunidades de otros receptores de glutamato, las
subunidades de los receptores de kainato se componen de aproximadamente 900
aminoácidos (≈100 KDa) y tienen una topología de membrana similar a la descrita para las
subunidades de los receptores de AMPA y de NMDA.
B. Distribución de las subunidades del receptor de kainato.
Estudios de hibridación in situ han revelado que los receptores de kainato se
encuentran ampliamente distribuidos en el sistema nervioso. Sin embargo, los patrones de
expresión de las distintas subunidades son bastante heterogéneos (Wisden y Seeburg, 1993;
Bahn et al, 1994). Así, el tránscrito de GluR5 se encuentra presente sobre todo en neuronas
de los ganglios de la raíz dorsal (DRG), el subiculum, el núcleo septal, el córtex piriforme y
cingulado así como en las células de Purkinje del cerebelo (Bettler et al., 1990); GluR6 es
abundante en las células granulares del cerebelo, en el giro dentado y en la región CA3 del
hipocampo, al igual que en el estriado. La subunidad GluR7 está presente con bajos niveles
en el cerebro pero, se expresa en particular en las capas profundas del córtex cerebral, el
7
Introducción
estriado, y en las neuronas inhibidoras de la capa molecular del cerebelo. KA1 se restringe
de forma casi exclusiva a la región CA3 del hipocampo, aunque también se expresa en
bajos niveles en el giro dentado, en la amígdala y en el córtex entorrinal (Werner et al.,
1991). Por el contrario, el mensajero de KA2 se encuentra prácticamente en todos los
núcleos del sistema nervioso.
Aunque las diferentes subunidades de los receptores de kainato están ya presentes a
nivel embrionario, la expresión emerge durante el período postnatal. Así, la cantidad de
mRNA de GluR5 alcanza un pico entre P0 y P5, y luego comienza a declinar hasta los
valores adultos. Esto ocurre también con otras subunidades.
C. Diversidad estructural.
Los receptores de kainato tienen la misma topología transmembrana y la misma
estequiometría que los receptores de AMPA y de NMDA. Es decir, son tetrámeros en los
cuales cada monómero lleva su propio lugar de unión y contribuye con una secuencia de
aminoácidos específica a la formación del lumen del canal, llamado segmento M2. Ese
segmento está compuesto por residuos hidrofóbicos que entran en la membrana formando
una estructura en forma de horquilla. Además de esta secuencia hidrofóbica, cada
subunidad posee tres segmentos transmembrana (M1, M3 y M4) distribuidos de tal forma
que el dominio N-terminal de la proteína se sitúa extracelularmente y la región C-terminal
está localizada intracelularmente (Hollmann et al., 1994; Roche et al., 1994; Taverna et
al., 1994; Wo y Oswald, 1994; Bennet y Dingledine, 1995). Por analogía con los datos
disponibles para los receptores de AMPA, se supone que el sitio de unión a glutamato en
los receptores de kainato está formado por residuos distribuidos entre el dominio Nterminal y el lazo extracelular existente entre los segmentos M3 y M4 (Stern-Bach et al.,
1994). Sin embargo, la estructura real del bolsillo de unión a kainato debe presentar
diferencias significativas entre los distintos receptores de glutamato, que podrían ayudar a
explicar, entre otras cosas, porqué los receptores de AMPA pueden unir kainato con alta
afinidad mientras que algunos receptores de kainato no son capaces de unir AMPA.
Algunas subunidades de los receptores de kainato se presentan como isoformas
generadas por ayuste alternativo (e.g. Sommer y Seeburg, 1992). La subunidad GluR5 fue
inicialmente descrita en dos formas moleculares que difieren en la presencia (GluR5-1) o
8
Introducción
ausencia (GluR5-2) de un fragmento de 15 aminoácidos en el extremo N-terminal (Bettler
et al., 1990). Análisis adicionales revelaron la existencia de dos formas moleculares
adicionales para GluR2 (Sommer et al., 1992), que difireren en regiones del extremo
carboxiterminal, por lo que la subunidad GluR5-2 puede presentar 3 regiones o dominios
C-terminal diferentes. Estas isoformas se denominaron GluR5-2a (la más corta), GluR-2b y
GluR5-2c (la más larga). Se desconoce si estas isoformas presentan el mismo
comportamiento farmacológico, puesto que es la subunidad GluR5-2a la que se ha
estudiado más, debido a que es la más eficiente a la hora de expresarse cuando se
transfecta en células de mamíferos (Sommer et al., 1992). La existencia de ayuste o
procesamiento aternativo no se ha descrito para las subunidades GluR6, KA1 y KA2. Por
el contrario, recientemente se ha descrito que la subunidad GluR7 existe en dos variantes
generadas por ayuste alternativo del extremo C-terminal, denominadas GluR7a y GluR7b.
(Schiffer et al., 1997).
Aunque se ha demostrado que las variantes por ayuste alternativo de otros receptores
de glutamato son fundamentales para la función del receptor, las implicaciones funcionales
de estas variaciones de los receptores de kainato todavía están por determinar. Se podría
hipotetizar que estas variantes con diferentes secuencias C-terminales podrían
interaccionar con diferentes proteínas del citoesqueleto dotando al receptor de un
mecanismo de interacción diferencial con distintos sistemas de señalización (e.g.
Nishimune et al., 1998; Osten et al., 1998; Ehlers et al., 1996).
De forma similar a otros muchos receptores de neurotransmisores (ver Swope et al.,
1992 para revisión), las subunidades de los receptores de kainato contienen sitios consenso
de fosforilación para diversas proteínas kinasas. Así, un residuo de serina en la posición
684 parece ser el principal sitio de fosforilación para la proteína kinasa A (PKA).
Se dispone de algunas subunidades clonadas de pollo, sapo o peces que no forman
canales funcionales ni receptores heteroméricos con otras subunidades cuando se expresan
en sistemas recombinantes. Estas subunidades han sido designadas proteínas que unen
kainato (KBP, kainate-binding proteins), (ver Henley, 1994 para revisión).
La edición de los mRNA es una fuente de heterogeneidad molecular para
9
Introducción
determinadas proteínas (Cattaneo, 1991; ver Sommer y Seeburg, 1992 para revisión). Las
subunidades GluR5 y GluR6, pueden sufrir edición postranscripcional del mRNA en un
sitio localizado en la posición 590 (GluR6) o 591 (GluR5), conocido como sitio
glutamina/arginina (Q/R). Es conocido que las propiedades de rectificación de los
receptores de kainato están controladas exclusivamente por el sitio Q/R, de forma análoga
a lo observado para los receptores de AMPA (Herb et al., 1992, Egebjerg y Heinemann,
1993; Köler et al., 1993). La versión no editada codifica para una glutamina (Q) y muestra
una clara rectificación entrante, mientras que la versión editada codifica para una arginina
(R) en esta posición y no rectifica (Egebjerg y Heinemann, 1993). GluR6 puede sufrir
también edición en dos sitios adicionales localizados en el primer dominio transmembrana,
donde una isoleucina puede ser sustituida por una valina (sitio I/V) y una tirosina puede ser
sustituida por una cisteína (sitio Y/C). La edición del RNA en estas posiciones tiene
consecuencias funcionales en los canales GluR6 homoméricos. Se ha visto que la
permeabilidad a calcio de los canales GluR6 es modulada por el sitio Q/R, cuando los sitios
I/V y Y/C del primer dominio transmembrana están editados (Khöler et al., 1993). El
alcance de la edición es regulado durante el desarrollo. A diferencia de la subunidad GluR2
de los receptores de AMPA, una proporción significativa de subunidades de receptores de
kainato no editadas está presentes tanto en el cerebro embrionario como en el adulto
(Paschen et al., 1997; Bernard y Khrestchatisky, 1994). Igualmente, se ha observado la
edición parcial de las subunidades GluR5 en el sitio Q/R también en neuronas individuales
de hipocampo de rata adulta (Mackler y Eberwine, 1993). Aproximadamente el 60 % de
los mRNAs de GluR5 se encuentran editados en tejido adulto, mientras que para GluR6 la
proporción encontrada es del 80 %.
1.3.2. Propiedades funcionales de los receptores de kainato.
A. Propiedades biofísicas. Propiedades de los receptores de kainato a nivel de canal
único.
Los receptores homoméricos editados GluR6(R) y GluR5(R) presentan una
conductancia unitaria del orden de femtosiemens. La edición del sitio Q/R altera de forma
drástica la conductancia de canal único, en el sentido que la forma no editada (Q) presenta
una conductancia unitaria mucho mayor. La combinación de las subunidades GluR5 (R) o
GluR6 (R) con KA2 produce receptores heteroméricos que tienen 2-3 veces mayor
10
Introducción
conductancia que sus respectivos homoméricos en la forma R, pero muestran menor
afinidad por su agonista (Howe, 1996; Swanson et al., 1996). Sin embargo, GluR6(Q)/KA2
presenta características de canal único que son indiferenciables de las que presentan los
receptores homoméricos GluR6 (Q), aunque la coexpresión de KA2 y GluR5 (Q) acorta la
duración de las respuestas cuando se compara con los canales homoméricos (Swanson et
al., 1996). Este efecto está de acuerdo con el hecho de que los mRNAs de las subunidades
KA1 y KA2 no son susceptibles de ser editados y ambos llevan una Q en el lugar Q/R.
En células embrionarias de riñón (HEK) que expresan la forma Q de GluR5 o de
GluR6 en receptores homoméricos (o heteroméricos con KA2), se realizaron registros de
corrientes en la configuración de parches de membrana escindidos, que permitieron
resolver tres niveles de subconductancias (Swanson et al., 1996).
Recientemente, se ha descubierto que la corriente de canal único media de los
receptores de glutamato también depende de cuántos de los sitios de unión para agonista
están ocupados (Rosemund et al., 1998) mientras el receptor no entre en estado
desensibilizado.
B. Propiedades de activación y de desensibilización de los receptores de kainato.
Un sello de identidad de los receptores de kainato es que en presencia continuada del
agonista, la corriente que fluye a través de los canales activados decae rápidamente. Ello se
debe a la desensibilización del receptor. En neuronas de hipocampo en cultivo el desarrollo
de la desensibilización sigue una curva exponencial única (Lerma et al., 1993; Paternain et
al., 1998), aunque también se ha observado procesos que se ajustan mejor a una
exponencial doble (Lerma et al., 1993; Wilding y Huettner, 1997). La conclusión que
permiten alcanzar los datos observados por algunos autores en diferentes preparaciones es
que la desensibilización de los receptores de kainato es un proceso rápido y muy marcado.
La desensibilización del receptor sigue una exponencial con una constante de tiempo de
11-13 ms tanto en neuronas de hipocampo como en canales GluR6 recombinantes (Lerma
et al, 1993; Paternain et al, 1998). La velocidad de desensiblización estimada para
receptores GluR6 en parches de membrana escindidos es más rápida (5-8 ms; Heckmann et
al., 1996; Traynelis y Wahl, 1997), pero no muy diferente a los valores medidos en
condiciones de célula completa.
11
Introducción
Por el contrario, la recuperación de la desensibilización de los receptores de kainato es
muy lenta. La recuperación total de la respuesta inducida por glutamato en neuronas de
hipocampo se obtiene después de 15 segundos de una aplicación inicial, aunque la
velocidad de recuperación depende del agonista usado para desensibilizar el receptor
(Paternain et al, 1998). Es necesario esperar 1 minuto para recuperar la amplitud inicial en
células de hipocampo, cuando se usa kainato para desensibilizar el receptor. En general la
recuperación de la desensibilización sigue una exponencial simple, con una constante de
tiempo que depende del tipo de subunidades que componen el receptor. Por ejemplo, los
receptores homoméricos GluR5 cuando son desensibilizados con (S)-5-IW se recuperan en
2.5 minutos, mientras que los receptores heteroméricos GluR5/KA2 se recuperan de la
desensibilización con una constante de tiempo de 12 segundos (Swanson et al. 1998).
Independientemente del tipo de subunidad estudiada, estos datos implican que los
receptores de kainato tienden a estar largos períodos de tiempo en el estado desensibilizado
y que este estado puede ser considerado como un estado absorbente ya que el equilibrio
está casi completamente desplazado en este sentido. El análisis de las curvas dosisrespuesta para el agonista endógeno, ya sea para receptores nativos o recombinantes,
permiten concluir que los receptores de kainato no tienen una alta afinidad por glutamato.
Sin embargo, en términos de desensibilización en el estado estacionario, los receptores de
kainato son muy sensibles a la concentración ambiente de agonista. Estos receptores son
aproximadamente dos órdenes de magnitud más sensibles al agonista para su
desensibilización que para su activación.
El cálculo de la desensibilización en el estado estacionario para los receptores de
kainato expresados por las neuronas de hipocampo en cultivo da un valor de IC50, (i.e. la
concentración de agonista a la cual el 50 % de los receptores se desensibilizan), de
aproximadamente 3 µM para glutamato (Paternain et al., 1998). Esto significa que a
concentraciones de glutamato incapaces de producir activación, los receptores están
desensibilizados. Lo mismo ocurre cuando se usa kainato como agonista. Esta diferencia de
sensibilidad entre activación y desensibilización también se encontró en receptores GluR6
recombinantes (Heckmann et al., 1996; Paternain et al., 1998). Curiosamente, los
receptores GluR6 recombinantes son más sensibles a la desensibilización por glutamato
(IC1/2 de 0.3 µM) que los nativos. Por el contrario, son menos sensibles a la activación por
12
Introducción
glutamato (EC50 de 500-700 µM).
C. Propiedades farmacológicas de los receptores de kainato.
El principal obstáculo para el estudio de los receptores de kainato ha sido la falta de
agonistas y antagonistas específicos. El desarrollo de agonistas y antagonistas específicos
de los receptores de NMDA ha permitido determinar numerosos procesos en los cuáles
estos receptores están involucrados. Sin embargo, la separación funcional de los receptores
nativos de kainato y de AMPA en neuronas ha sido dificultosa ya que ambos receptores se
activan por la misma colección de agonistas, y durante mucho tiempo se denominaron
genéricamente receptores de tipo No-NMDA. Por ejemplo, el AMPA carece de efecto
sobre los receptores de kainato recombinantes (Egebjerg et al., 1991; Herb et al., 1992)
dado que es completamente inactivo sobre GluR6 y GluR7 y presenta una EC50 de 3 mM
para GluR5 (Sommer et al., 1992). De forma similar, AMPA no activa los receptores de
kainato nativos en cultivos de neuronas de hipocampo, y sólo a altas concentraciones a los
presentes en células de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de la médula espinal (Huettner,
1990; Lerma et al., 1993; Wong et al., 1994). Sin embargo, kainato, aunque con menor
afinidad que para los receptores de kainato, activa todos los tipos de receptores de AMPA
a dosis relativamente bajas.
C.1. Agonistas.
La afinidad de kainato por sus receptores varía según la composición de subunidades
de los mismos. Los valores de EC50 calculados para las distintas subunidades en sistemas
recombinantes corresponden a 33.6 µM para GluR5 (Sommer et al., 1992), 299 µM para
GluR6 (Paternain et al., 1998) y >1 mM para GluR7. Una situación similar se encontró
cuando se usó glutamato como agonista (631 µM para GluR5, 270-762 µM para GluR6 y
5.9 mM para GluR7). Estos datos nos indican que los receptores de kainato no muestran
alta afinidad ni por kainato ni por glutamato.
Además de kainato y glutamato, se han encontrado algunas moléculas capaces de
activar los receptores de kainato con cierto grado de especifidad. El domoato, una toxina
que se aisló de mejillones contaminados con algas, tiene 20-25 veces mayor preferencia por
los receptores de kainato que por los de AMPA en células de DRG y en receptores GluR5
recombinantes (Huettner et al., 1990; Sommer et al., 1992), aunque es inactivo sobre
13
Introducción
GluR7 (Schiffer et al., 1997).
El ácido (RS)-α-amino-3-hidroxi-5-tert-butil-4-isoxazolepropiónico (ATPA), un
derivado de AMPA, ha sido descrito como agonista selectivo de receptores recombinantes
GluR5. La EC50 para ATPA es 0.6 µM para receptores nativos en neuronas de DRG y de
2.1 µM para receptores GluR5 recombinantes, un orden de magnitud mayor que kainato
(Clarke et al., 1997). Al mismo tiempo su afinidad por los receptores de AMPA es unas
500 veces más baja.
El derivado de willardina, (S)-5-iodo-wilardina, muestra una selectividad de unas 130
veces mayor para los receptores de kainato que para los de AMPA. Su EC50 es 140 nM.
C.2. Antagonistas.
La búsqueda de antagonistas de los receptores de kainato no ha sido tan exitosa como
la búsqueda de agonistas. La primera generación de antagonistas de los receptores de
glutamato de tipo No-NMDA, las quinoxalinodionas (CNQX; DNQX y NBQX), son
incapaces de discriminar entre los receptores de AMPA y los de kainato. El compuesto
denominado NS102, otro antagonista de receptores de tipo No-NMDA, fue descrito como
un producto que, en membranas de corteza, inhibe completamente la unión de kainato
(Johansen et al., 1993). Además, NS102 antagoniza parcialmente las respuestas generadas
por activación de receptores GluR6 en células embrionarias de riñón (HEK) con un IC50 de
2.2 µM (Verdoorn et al., 1994). Sin embargo, NS102 también es activo sobre los receptores
de AMPA, aunque de forma menos potente. Por ello, esta droga se consideró ineficaz para
separar las actividades mediadas por ambos receptores (Paternain et al., 1996; Wilding y
Huettner, 1996).
El desarrollo de las 2,3-benzodiazepinas como antagonistas de los receptores de
AMPA (ver Vizi et al., 1996 para revisión), y la posterior demostración de que estos
compuestos son selectivos para estos receptores (Paternain et al., 1995; Wilding y
Huettner, 1995), ha sido crucial para el entendimiento de la función de los receptores de
kainato. En particular GYKI 53655 (LY300168 según el código de Elli Lilly) es un
antagonista no competitivo de los receptores de AMPA, capaz de bloquear completamente
estos receptores a una concentración de 100 µM. A esta concentración, no ejerce
14
Introducción
antagonismo sobre los receptores de kainato, y por ello ha sido usado para desenmascarar
las corrientes de kainato en neuronas maduras (Paternain et al., 1995; Wilding y Huettner,
1997). Aunque GYKI 53655 es la mezcla racémica, presenta una IC50 de ∼1µM para
antagonizar los receptores de AMPA (Paternain et al., 1995; Wilding y Huettner, 1997),
siendo el isómero activo, LY303070, más potente.
Recientemente, se ha desarrollado una nueva serie de compuestos que muestran una
diferente sensibilidad para los receptores de AMPA y de kainato. LY293558 inhibe GluR5
pero no GluR6. Sin embargo, este compuesto también antagoniza las respuestas mediadas
por los receptores de AMPA (Bleakman et al., 1996). Otro derivado, LY294486, muestra
mayor selectividad para GluR5, y más recientemente se ha demostrado que el compuesto
LY382884 es específico para antagonizar la unión a los receptores GluR5, no presentando
afinidad significativa por las subunidades de los receptores de AMPA GluR1,2,3 ni por las
de kainato GluR6, GluR7 y KA2 (Simmons et al., 1998).
1.3.3. Papeles fisiológicos de los receptores de kainato.
La primera evidencia acerca de la existencia de receptores de kainato se obtuvo en el
sistema nervioso periférico. Los primeros estudios mostraron que los nervios periféricos de
la raíz dorsal de ratas inmaduras, específicamente las fibras de tipo C, se depolarizaban con
kainato, un efecto que luego se observó que se debía a la inactivación de canales de sodio
dependientes de voltaje (Davies et al., 1979; Agrawal y Evans, 1986). Estudios posteriores
demostraron que la aplicación de kainato en células disociadas de los DRG inducía
respuestas que se desensibilizaban rápidamente (Huettner et al., 1990), un efecto
sorprendente puesto que, el conocido hasta ese momento, se correspondía con una
respuesta a kainato sostenida debido a la activación de los receptores de AMPA por
kainato. La posterior demostración de que los receptores de kainato producían respuestas
desensibilizantes cuando se expresaban en sistemas heterólogos así como la localización de
subunidades de receptores de kainato en células de DRG, condujeron a la aceptación de
que las respuestas observadas se debían, efectivamente, a la activación de receptores de
glutamato de tipo kainato. Este constituyó la primera evidencia de la presencia de
receptores de kainato específicos.
La disponibilidad del GYKI53655 como antagonista selectivo de los receptores de
15
Introducción
AMPA, hizo posible el estudio de la participación de los receptores de kainato en la
transmisión sináptica excitadora. Los primeros experimentos en cultivos de neuronas de
hipocampo indicaban que, al contrario que los de AMPA, estos receptores no participaban
en la transmisión sináptica excitadora. Aunque se demostró que las neuronas estudiadas
tenían receptores de kainato, no fue posible provocar corriente postsináptica alguna en
presencia de antagonistas de los receptores de AMPA y de NMDA (Lerma et al., 1997b).
Sin embargo, estudios posteriores en rodajas de hipocampo han permitido identificar una
serie de sinapsis donde los receptores de kainato parecen mediar una fracción pequeña de
la corriente sináptica. En este sentido, se ha demostrado que se pueden inducir corrientes
excitadoras postsinápticas (EPSCs) con características farmacológicas propias de los
receptores de kainato en las sinapsis formadas por la fibras musgosas y las neuronas
piramidales de CA3 (Castillo et al., 1997; Vignes y Collingridge, 1997). Sin embargo, estas
respuestas sólo se observan en circunstancias de actividad presináptica repetitiva y podrían
reflejar disposición extrasináptica de los receptores.
La corriente inducida por estos trenes de estímulos está ausente en ratones a los que se
les ha anulado el gen GluR6 (Mulle et al., 1998), lo que indica que los receptores de
kainato que contienen la subunidad GluR6 participan en la transmisión sináptica a nivel
fibra musgosa-neurona de CA3. Además del hipocampo, se ha identificado la presencia de
receptores postsinápticos de kainato en neuronas de la amígdala lateral (Li y Rogawski,
1998), en neuronas del asta dorsal de la médula espinal (Li et al., 1999) (posiblemente
implicados en nocicepción), en algunas células bipolares de la retina (DeVries y Schwartz,
1999) y en el córtex cerebral (Kidd e Isaac, 1999).
16
Objetivos
OBJETIVOS.
Teniendo en cuenta la disponibilidad del antagonista específico de los receptores de AMPA,
GYKI53655, se planteó determinar el papel de los receptores de kainato en la fisiología
cerebral. Para ello, en la presente tesis se han abordado los siguientes objetivos generales:
1. Determinar el papel de los receptores de kainato en la modulación de la transmisión
sináptica inhibidora en el hipocampo.
2. Determinar el/los mecanismos mediante los cuáles estos receptores interfieren con la
transmisión inhibidora.
17
Materiales y Métodos
MATERIALES Y MÉTODOS.
1. CULTIVOS NEURONALES.
Microcultivos de neuronas.
Las neuronas de hipocampo se cultivaron en condiciones de microcultivo (Fotografía
1), según el protocolo descrito por Bekkers y Stevens (1991) con algunas modificaciones
(Lerma et al., 1997b). Las células se disociaron de hipocampos aislados de embriones de 1718 días de gestación y se sembraron a una densidad de 100 células/mm2 en placas de Petri de
35 mm (Nunc). Cuarenta y ocho horas antes de comenzar el cultivo, el fondo de las placas de
Petri fue recubierto con una fina capa de agarosa estéril (0.2 %) que se dejó secar en el
interior de un incubador a 37 ºC. Antes de comenzar la disociación, se pulverizó sobre la
agarosa una solución que contuvo poli-D-lisina (100 µg/ml) y laminina (16 µg/ml), con el
objeto de producir múltiples microgotas de sustrato permisivo. La pulverización se ajustó para
obtener islas con un diámetro de aproximadamente 100 µm, con una densidad de 30-50
gotas/mm2.
El medio de cultivo usado fue Neurobasal con suplemento B27 al 4 %, (ambos de
Gibco) (Brewer et al., 1993) al que se añadió glutamina (0.5 mM), mercaptoetanol (25 µM)
(Grill y Pixley, 1993), penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). En los días
de cultivo 4, 7, 14 y 21 un 40 % del medio de cultivo de cada placa se reemplazó con medio
fresco. Tras una semana de cultivo, la distribución aleatoria de las neuronas en las placas
permitió encontrar numerosas islas ocupadas por una sóla neurona así como microgotas
conteniendo dos o más células. En aquellas gotas que sólo albergaban una neurona, esta al
crecer y desarrollarse termina estableciendo contactos sinápticos con ella misma (autapsis) y
en aquellas gotas en las cuáles se encuentran dos neuronas estas establecen contacto entre sí y
así se obtuvieron conexiones heterosinápticas.
2. RODAJAS DE CEREBRO.
Las rodajas de hipocampo fueron preparadas de acuerdo con los procedimientos
descritos (Stuart et al., 1993), a partir de ratas Wistar de 14-16 días de edad. Brevemente, tras
sacrificar el animal por decapitación, el cerebro fue sumergido en una solución fría
18
Materiales y Métodos
conteniendo (en mM) 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3 y
10 glucosa (300 mOsm). El cerebro completo conteniendo los dos hipocampos se posicionó
sobre la platina de un vibratomo (Word Precision Instruments, VSLM1) y se seccionó para
obtener rodajas transversales de 350 µm. Las rodajas fueron transferidas a una cámara de
incubación conteniendo la solución descrita que se mantuvo oxigenada continuamente (95 %
O2, 5 % CO2, pH=7.4). Así se mantuvieron a temperatura ambiente durante, al menos, una
hora antes de ser usadas para los registros electrofisiológicos.
Las rodajas de cerebelo fueron obtenidas usando igual metodología que en el caso de
las rodajas de hipocampo, salvo que en este caso se posiciona sobre la platina del vibratomo
sólo el cerebelo que ha sido previamente separado del resto del cerebro, el cual se orientó de
forma que al seccionar se obtuvieron rodajas sagitales del mismo.
Las rodajas de corteza se obtuvieron usando igual metodología y soluciones que las
descritas para la obtención de rodajas de hipocampo.
3. REGISTROS ELECTROFISIOLÓGICOS.
3.1. Cultivos.
Se hicieron registros de actividad sináptica entre pares de neuronas interconectadas
entre sí y también en neuronas que establecen conexiones sinápticas consigo mismas. En los
pares de neuronas, una de ellas se utilizó como célula presináptica y la otra como neurona
postsináptica, de forma que se hizo disparar la neurona presináptica (aplicándole pulsos
depolarizantes) y las corrientes así evocadas se registraron en la célula postsináptica. En el
caso de las conexiones autápticas la misma neurona se usó como pre y postsináptica.
Los registros se obtuvieron usando las técnica de patch clamp en su configuración de
célula completa (whole cell) en condiciones de fijación de voltaje (Hamill et al., 1981) para la
célula postsináptica, para lo cual se usó un amplificador Axopatch-200A y en condiciones de
fijación de corriente para la célula presináptica, para lo cual se usó un amplificador
Axoclamp-2A. Para el caso de los registros obtenidos de conexiones autápticas se usó un
amplificador Axopatch-200A y se obtuvieron los registros en condiciones de fijación de
corriente.
19
Materiales y Métodos
Fotografía 1. Dos neuronas creciendo en microcultivo. Estas neuronas establecen
contactos sinápticos entre sí y consigo mismas. La imagen corresponde a neuronas de un
cultivo de aproximadamente 21 días.
20
Materiales y Métodos
Las micropipetas se fabricaron a partir de capilares de borosilicato en un estirador de
pipetas horizontal (Sutter P-81), y tuvieron una resistencia de 2.5-5 MΩ cuando se llenaron
con la solución interna. Con el fin de minimizar los cambios en el potencial de punta del
electrodo cuando se intercambiaron las soluciones, el baño se conectó al amplificador
mediante un puente salino de agar (2 %; NaCl 135 mM) y mediante un hilo de plata
previamente clorurado en una solución de ácido clorhídrico 1 N.
Las respuestas fueron supervisadas continuamente con un osciloscopio (Tektronix
TDS 310). Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 ºC).
Las señales electrofisiológicas se filtraron a 1-2 KHz, se digitalizaron mediante un
convertidor analógico-digital (Lab-Master TM-40, Axon Instruments, USA) y se almacenaron
en un ordenador personal usando el programa de adquisión de datos Clampex (versión 5.5.1,
pClamp 5.6, Axon Instruments, USA). El programa Clampex igualmente permitió generar
protocolos de estimulación que fueron usados para imponer cambios de voltaje a las células a
través del amplificador.
3.2. Rodajas.
Las rodajas se transfirieron a una cámara de registro, montada sobre un microscopio
(Axioscop, Zeiss) y se mantuvieron en posición mediante una rejilla de hilos de nylon con un
armazón de platino. Esta cámara se perfundió a razón de 3-4 ml/min con una solución externa
igual a la descrita para la obtención de las rodajas. Las células de las rodajas se visualizaron
por videomicroscopía infrarroja de contraste interdiferencial (IR-DIC) (Stuart et al., 1993) a
través de un objetivo de inmersión en agua 40x. Las soluciones se aplicaron por gravedad
cambiando entre cuatro líneas de perfusión mediante una electroválvula de multiples vías.
Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 ºC).
En el hipocampo, las corrientes inhibidoras postsinápticas (IPSCs) se indujeron
mediante pulsos eléctricos aplicados con un electrodo bipolar colocado en el stratum oriens, a
50-150 µm del lugar de registro. Los electrodos se fabricaron con capilares de borosilicato
presentando una resistencia de 5-10 MΩ cuando se llenaron con la solución interna. Las
corrientes se registraron en el soma de neuronas de la capa CA1 o CA3 en la configuración de
célula completa tras el establecimiento de sellos >1 GΩ.
21
Materiales y Métodos
Registro
Estimulación
CA1
St. Oriens
St. Radiatum
CA3
Figura 3. Diseño experimental para la obtención de
registros de las células de la región CA1 del hipocampo.
Como se observa en la figura, el electrodo de estimulación
se coloca en el stratum oriens y la pipeta de registro en las
neuronas de la capa CA1 del hipocampo.
Para obtener respuestas inhibidoras al registrar el soma de células de Purkinje se
estimuló (con un electrodo igual al descrito para hipocampo) en la zona de la capa molecular
cerca de la capa de células de Purkinje. Para obtener respuestas inhibidoras en las células de
los núcleos profundos del cerebelo se estimuló en la zona de los terminales axónicos de las
células de Purkinje y se registró en el soma de las células de los núcleos profundos del
cerebelo.
En las rodajas de corteza, se obtuvieron registros de los somas de la neuronas
piramidales situadas en la capa V, estimulando las interneuronas situadas en las proximidades
de estas neuronas piramidales.
En todas los casos usó un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments). La
resistencia de acceso fue monitorizada continuamente durante los registros, los cuales fueron
rechazados si durante un experimento sufrió un cambió >15 %. Las señales electrofisiológicas
se filtraron a 1-2 KHz, se digitalizaron y se almacenaron en el disco duro de un ordenador
personal.
Las corrientes elementales (miniatura, mIPSCs) fueron registradas durante periodos de
180-360 segundos bajo cada situación experimental en presencia de tetrodotoxina (TTX; 0.522
Materiales y Métodos
1µM). Estas respuestas miniatura fueron adquiridas usando el programa Axotape 2.0 (Axon
Instruments) y almacenados en el disco duro del ordenador.
4. ANÁLISIS DE LOS REGISTROS.
Los registros se analizaron con el programa Clampfit, versión 6.02 (Axon Instruments,
USA). Las respuestas miniatura se analizaron, además de con Clampfit, con Fetchan 6.02 y
con el programa de análisis de corrientes elementales Snap, diseñado en el Instituto Cajal por
el Dr. Imanol Martínez-Padrón. El análisis estadístico se realizó usando los programas
SigmaPlot y Origin, versiones 2.0 y 3.5, respectivamente.
El grado de inhibición (o de incremento) de la amplitud de las respuestas se calculó
como [1-(IPSCtest /IPSCcontrol)] ∗100. Donde, IPSCtest representa la amplitud de las corrientes
(en pA) tras aplicar kainato, glutamato o cualquier otra sustancia, según el caso, a las células
en cultivo o a las rodajas y IPSCcontrol representa la amplitud (en pA) de las corrientes antes de
aplicar alguna sustancia a las células cultivadas o a las rodajas.
El Coeficiente de Variación libre de ruido (CV) de las corrientes inhibidoras se calculó
como:
CV =
σ 2 ( IPSC ) − σ 2 ( ruido)
amplitud IPSC
donde σ2(IPSC) y σ2(ruido) son la varianza de las respuestas de corriente y la varianza del ruido
basal, respectivamente. La razón de CV en ambas situaciones (CVR) se obtuvo para cada
neurona como CVka/CVcontrol. La gráfica comparando la variación en la amplitud media de las
IPSCs (M) con respecto al estadístico 1/CV2 que refleja el cambio en la varianza de la
amplitud de las respuestas, se construyó como se describe en Bekkers y Stevens (1990) y
Malinow y Tsien (1990; ver también Siegelbaum y Kandel, 1991 para una mayor
explicación).
Las corrientes miniaturas fueron analizadas tras ser detectadas usando un programa de
detección. Este calculó la primera derivada de la corriente registrada, teniendo en cuenta sólo
23
Materiales y Métodos
aquellas respuestas que sobrepasan un umbral aleatorio, (típicamente 1.5 veces la amplitud
del ruido; i.e. 8-12 pA). En algunos casos, la detección se hizo bajo control visual. Con el fin
de comprobar si las condiciones de registro influenciaron las variaciones en la amplitud
espontánea de las mIPSCs, se representaron tanto el tiempo de subida frente al tiempo de
caída de los eventos registrados en cada célula. Estos dos parámetros no mostraron ningún
tipo de correlación significativa por lo que se conluyó que el filtro electrotónico no fue una
fuente importante de variación. La frecuencia de mIPSCs fue calculada mediante la
exponencial de las distribuciones cumulativas tanto de los intervalos como de las amplitudes.
Las distribuciones obtenidas tras la aplicación de kainato o de glutamato se compararon
estadísticamente con las obtenidas en condiciones control usando el test de KolmogorovSmirnov.
5. SOLUCIONES.
5.1. Cultivos.
Solución extracelular.
La solución externa usada consistió (en mM) en: 165 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2
MgCl2, 20 Glucosa y 10 HEPES. La solución se ajustó a un pH de 7.4 con NaOH. La
osmolaridad, medida con un osmómetro de presión de vapor (Wescor 5500), se ajustó a 320330 mOsm mediante la adición de sacarosa, cuando fue necesario.
Solución intracelular.
Las pipetas de registro se llenaron con la siguiente solución (en mM):
130 K-metanosulfonato, 20 CsCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 4 mM ATP-Mg, 10 EGTA y 10
HEPES. Esta solución se ajustó a un pH de 7.3 con KOH. La osmolaridad se ajustó a 315320 mOsm, siempre entre 5 y 10 mOsm inferior a la solución externa.
5.2 Rodajas.
Soluciones extracelulares.
Las solución externa usada en la mayoría de los experimentos estuvo compuesta por
(en mM): 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3 y 10 glucosa
(300 mOsm) (1).
24
Materiales y Métodos
En los experimentos en los que el calcio extracelular se varió, los componentes fueron
los mismos, salvo que las concentraciones de CaCl2 se ajustaron a 0.5 o 10 mM.
En algunos experimentos la concentración de Na+ se modificó, ajustándose a 60 mM,
37.5 y, en algún caso, 0 mM, de forma que la solución (1) se modificó para obtener estas
condiciones, la osmolaridad se ajustó a 300 mOsm usando N-metil-Glucamina y HCl.
Los agonistas o antagonistas que se emplearon se prepararon con estas soluciones a
partir de soluciones madre altamente concentradas.
Soluciones intracelulares.
En los experimentos realizados en condiciones de fijación de voltaje (voltaje clamp)
la solución interna usada estuvo compuesta por (en mM): 120 CsCl, 20 QX-314, 8 NaCl, 1
MgCl2, 0.2 CaCl2, 10 HEPES y 2 EGTA (pH=7.3, 287 mOsm). En los experimentos
realizados en condiciones de fijación de corriente, la solución interna usada estuvo compuesta
por (en mM): K-gluconato 120, 8 NaCl, 1 MgCl2, 0.2 CaCl2, 10 HEPES y 2 EGTA (pH=7.3).
6. EXPERIMENTOS IN VIVO.
En colaboración con el Dr. Oscar Herreras del Departamento de Investigación del
Hospital Ramón y Cajal, se realizaron algunos experimentos in vivo con el fin de comprobar
el efecto de kainato sobre la excitabilidad hipocámpica en el circuito intacto. Los
experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley de 200-250 g de peso, anestesiadas con
uretano (1-2 g/kg), cuya temperatura se mantuvo a 37 ºC usando una manta eléctrica. Los
métodos quirúrgicos y estereotáxicos usados han sido descritos previamente por el grupo (ver
Largo et al., 1996). Brevemente, se implantó un electrodo bipolar concéntrico en el lado
homolateral de CA3 para estimular ortodrómicamente las colaterales de Schaffer y un
electrodo de registro en la capa piramidal de CA1 con el fin de registrar el potencial de
campo. El estímulo consistió en pulsos de 0.1 ms a una frecuencia de 0.1 Hz y a una
intensidad que fue supramáxima para evocar una espiga poblacional. Igualmente, se implantó
una sonda de microdiálisis, (diámetro externo, 220 µm; longitud 0.8-1 mm) manufacturada de
la forma descrita (Herreras et al., 1994; Largo et al., 1996), la cual se usó para introducir
kainato (3 µM) en el fluido extracelular. La sonda se bajó hasta una posición en la que toda la
extensión dorso-ventral de CA1 quedó expuesta a la diálisis.
25
Resultados
RESULTADOS.
1. La activación de los receptores de kainato produce una depresión de la
transmisión sináptica GABAérgica en el hipocampo de rata.
1.1. Kainato produce una depresión de la transmisión GABAérgica.
En microcultivos de neuronas hipocámpicas y en condiciones de bloqueo de los
receptores de AMPA (con GYKI 53655, 100 µM) y de NMDA (con D-AP5, 50 µM), la
aplicación de bajas concentraciones de kainato provocó una disminución de las respuestas
inhibidoras postsinápticas (IPSCs) (Figura 4). Una concentración de kainato de 0.6 µM produjo
una disminución del 43.0 ± 11.5 % (n=5). En nuestras condiciones de microcultivo, sólo el 25
% de los pares de células estaban conectados sinápticamente y menos del 20 % de estas
conexiones eran inhibidoras. Por lo tanto, este modelo no permitió hacer un análisis exhaustivo
del efecto de kainato sobre la inhibición sináptica. Sin embargo, se registraron un total de 6
pares, uno de los cuales fue descartado debido a que las respuestas inhibidoras mostraban una
marcada disminución de la amplitud con el tiempo (rundown) que hizo imposible cualquier tipo
de cuantificación. En el resto de los casos, se observó de forma clara un aumento en el número
de fallos en la liberación de neurotransmisor (se genera un potencial de acción en la célula
presináptica pero no se produce liberación de neurotransmisor) y en dos de estos pares se
observó un aumento en la latencia de las IPSCs en presencia de kainato. En dos casos
adicionales se evaluó el efecto de 0.6 µM de kainato en IPSCs autápticas (obtenidas en
neuronas que establecen conexiones sinápticas consigo mismas). Kainato no tuvo ningún efecto
en uno de estos casos, en el cual se comprobó la falta de receptores de kainato en la membrana,
pero disminuyó la amplitud de las IPSCs en el otro. Para descartar una posible interacción del
GABA con su receptor se examinó la respuesta a 100 µM GABA en presencia y en ausencia de
kainato en neuronas de hipocampo en cultivo. La magnitud de las respuestas mediadas por
GABA fue similar en ambas condiciones indicando que la acción de kainato sobre las IPSCs no
se debe a una interacción del kainato con los receptores de GABA postsinápticos.
Con el interés de extender estos resultados a modelos experimentales más fisiológicos,
se pasó a realizar el estudio en rodajas de hipocampo de rata, las cuales retienen en gran medida
las conexiones sinápticas originales. Para ello, las interneuronas GABAérgicas se estimularon
con un electrodo emplazado en el stratum oriens del área CA1 y se registraron las corrientes
26
Resultados
A
Dos células en una isla
Post
Pre
B
Control
Bicuculina
100
pA
40 ms
C
Control
Kainato 0.6 µM
Lavado
100
pA
40 ms
Vm=-30 mV
Figura 4. Kainato inhibe las eIPSCs mediadas por GABA en
microcultivos de neuronas de hipocampo. En una microisla se registraron
dos neuronas conectadas entre sí (A) y se generó un potencial de acción en
una de ellas para evocar una respuesta sináptica en la otra.
B) Las corrientes postsinápticas fueron sensibles a bicuculina (100 µM). Los
registros son el promedio de 10 respuestas.
C) La aplicación de kainato redujo de forma reversible la transmisión
inhibidora, aumentando el número de fallos. Nótese, que durante la perfusión
de kainato, la latencia de las eIPSCs aumenta ligeramente. Resultados
similares se obtuvieron en 4 pares adicionales de células.
inhibidoras en células piramidales de CA1 usando la técnica de patch-clamp en su
configuración de célula completa. Estas células fueron identificadas visualmente mediante
microscopía de infrarrojos. Para evitar la activación de los otros receptores ionotrópicos de
glutamato, se incluyeron en el líquido de perfusión, de manera sistemática, el antagonista
específico no competitivo de receptores de AMPA, GYKI 53655 (100 µM) y el antagonista de
los receptores de NMDA, D-AP5 (50 µM).
Debido a que la concentración de Cl- en la pipeta coincidió con la del líquido de
perfusión (e.g. igual concentración de Cl- en el interior y en el exterior celular) la apertura de
los canales de Cl- determinó la salida de este ion al exterior celular, observándose como
corrientes entrantes. Las IPSCs así registradas se abolieron completamente en presencia de
bicuculina, el antagonista específico de los receptores de GABA del tipo A, lo que demostró
que sólo son responsables de las mismas receptores de este tipo.
27
Resultados
Los estímulos se aplicaron a una frecuencia de 0.1-0.2 Hz (un estímulo cada 10 ó cada 5
segundos) y tras la estabilización de la amplitud de las eIPSCs se adicionó kainato a la cámara
de registro a diferentes concentraciones (0.3-300 µM). Como muestra la figura 5A, durante la
perfusión de kainato la amplitud de las eIPSCs decreció, recuperándose la amplitud original
tras la retirada del kainato en la mayoría de los casos. Las concentraciones más efectivas de
kainato fueron 0.3-10 µM (fig.5B), concentraciones mayores o menores a éstas fueron menos
eficaces para disminuir las eIPSCs. De esta forma, la curva dosis-respuesta presentó forma de
campana.
Control
Control
Kainato
0.3 µM
B
Lavado
50
pA
Kainato
10 µM
Lavado
50
pA
Control
Kainato
200 µM
Lavado
Inhibicion de eIPSCs (%)
A
IC1/2=0.37 µM
80 EC50=20 µM
60
40
Incluso a bajas concentraciones,100
kainato indujo
una corriente de membrana en dirección
20
pA
1 10 100 1000
entrante, indicando que tuvo un efecto depolarizante. Sin0.1
embargo,
este efecto fue variable de
100 ms
(µM)de kainato usada.
célula a célula y no se observó una correlación evidente con laKainato
concentración
Figura 5. Efecto de kainato sobre la transmisión sináptica inhibidora en la capa CA1
del hipocampo en rodajas de cerebro de rata. A) Las corrientes sinápticas inhibidoras
(IPSCs) fueron registradas en neuronas piramidales de CA1 y provocadas por estimulación
del stratum oriens. A -60 mV de potencial de membrana, las IPSCs fueron entrantes
debido a la concentración simétrica de cloro. B) Curva dosis-respuesta para la inhibición de
las IPSCs inducida por kainato. El grado de inhibición se calculó como [1(IPSCKA/IPSCControl]·100 y se representó gráficamente frente a la concentración de kainato.
Cada punto corresponde a un experimento. La línea continua representa la curva dosisrespuesta en estado estacionario para los receptores de kainato con parámetros
determinados en células cultivadas de hipocampo. Ésta se calculó de acuerdo con la
expresión:
I=

[KA]
1 +
ni
 ( IC1 / 2 )
ni
1
+C
  (EC50 )na 
 ⋅ 1 +
[KA]n a 
 
con los siguientes parámetros: EC50= 20 µM; IC1/2= 0.37 µM; ni= 0.8 and na= 1.2. La
curva resultante fue escalada para ajustar con los valores máximos, añadiendo un 25 % de
“offset”.
28
Resultados
Incluso a bajas concentraciones, kainato indujo una corriente de membrana en dirección
entrante, indicando que tuvo un efecto depolarizante. Sin embargo, este efecto fue variable de
célula a célula y no se observó una correlación evidente con la concentración de kainato usada.
Por ejemplo, a 0.5, 10 y a 200 µM, la amplitud fue de 23 ± 3.4, 27 ± 5.4 y de 30 ± 3.5 pA,
respectivamente, presentando un valor medio para las células estudiadas de 31.9 ± 3.1 pA
(n=54).
1.2. La modulación de la transmisión GABAérgica por kainato es de origen presináptico.
Para determinar si la modulación de las respuestas inhibidoras GABAérgicas se
producía a través de un mecanismo de acción pre o postsináptico se usaron varias
aproximaciones experimentales basadas en el análisis cuántico de la liberación de
neurotransmisor. Dado que tanto en células microcultivadas como en rodajas de hipocampo,
kainato produjo un aumento en el número de fallos en la transmisión sináptica, se cuantificó la
proporción de éstos representándose frente al grado de inhibición de las eIPSCs observado,
independientemente de la concentración usada de kainato. Para este análisis se seleccionaron
12 de las 54 células estudiadas en las rodajas, células en las que los fallos en la transmisión
sináptica se pudieron identificar inequívocamente. Como muestra la figura 6B, el número de
fallos se correlacionó bien con el grado de inhibición de las eIPSCs inducido por kainato. Ello
sugiere que un cambio en la fiabilidad sináptica podría ser la causa de la reducción de las
eIPSCs.
Para comprobar si realmente un origen presináptico podía explicar estos cambios, se
calculó el coeficiente de variación (CV) de las respuestas sinápticas tanto en condiciones
control como en presencia de kainato, calculándose la razón entre ambos valores. Este valor,
fue >1 en 48 de las 54 células analizadas (1.82 ± 0.1), lo cual según está establecido, señala un
cambio en los parámetros de liberación como la explicación más probable para la reducción de
las eIPSCs. Esta conclusión fue también evidente cuando se representó la variación de la
amplitud media de las eIPSCs (M) frente al cambio en el estadístico 1/CV2 (el inverso del
cuadrado del coeficiente de variación), que denota la varianza de las eIPSCs (Fig. 6C). Se ha
establecido que un cambio en M no acompañado de un cambio correspondiente en la varianza
denota que sólo el contenido cuántico (q) sufre modificación durante un tratamiento dado,
indicando por tanto, un mecanismo postsináptico (Figura 6C, línea punteada) como causa de la
modificación de la transmisión. Por el contrario, un cambio en la amplitud de las respuestas
29
Resultados
acompañado por un cambio en el coeficiente de variación (i.e. en el estadísitico 1/CV2), sugiere
una variación en los parámetros de liberación (n ó p), lo que indica fuertemente un origen
presináptico como fuente de la variación (línea discontínua en la figura 6C; ver revisión de
Thompson y Deuchars, 1995). Como se puede observar en la figura 6C, la reducción en la
amplitud de las eIPSCs producida por kainato se vió acompañada de un cambio paralelo en
1/CV2, lo que indica un mecanismo de acción presináptico para kainato.
Kainato 0.3 µM
Control
A
C
1.5
r=0.93
85
r=0.7 Postsináptico
2
1.0
1/CV
Inhibición de eIPSCs (%)
B
65
0.5
45
Presináptico
25
0
25
50
75
100
Aumento de Fallos (%)
0.0
0.5
1.0
1.5
M
Figura 6. Kainato activó un mecanismo presináptico para inhibir la
transmisión GABAérgica. A) Kainato produce una reducción de la amplitud de las
eIPSCs y un aumento en el número de fallos.
B) El aumento en el número de fallos se correlacionó con el grado de disminución
de las eIPSCs, independientemente de la concentración de kainato usada. Sólo se
computaron las neuronas en las que los fallos pudieron determinarse de forma
segura (n=12). Las líneas discontinuas corresponden al intervalo de confianza de la
regresión del 95 %.
C) Las amplitudes medias y su coeficiente de variación (CV) se midieron durante la
aplicación de kainato y se normalizaron con sus respectivos valores control en cada
célula. La variación proporcional de la amplitud (M) vs. la variacion proporcional en
1/CV2 en 49 neuronas se representó independientemente de la concentración usada
de kainato. Nótese, que los datos experimentales siguen la relación predicha para
una acción presináptica (línea discontinua) más que para una acción postsináptica
(línea punteada). Por claridad, la recta de regresión (r=0.7, p<0.01) no se muestra,
pero fue indistinguible de la diagonal.
Está bien establecido que la frecuencia de las corrientes postsinápticas miniatura
(mIPSCs) puede ser, en determinadas condiciones, un buen indicador de los cambios
producidos en la probabilidad de liberación por efecto de alguna sustancia. Para determinar con
30
Resultados
una tercera aproximación si las reducciones de las eIPSCs inducidas por kainato poseen origen
presináptico, se estudiaron las corrientes miniatura (mIPSCs) antes, durante y después de la
adición de kainato 3-10 µM a la rodaja. Para ello, se incluyó tetrodotoxina a una concentración
de 0.5-1 µM para evitar la generación de potenciales de acción. De las 38 células estudiadas, en
29 de ellas se observó un descenso en la frecuencia de las mIPSCs (39.0 ± 3.8 %); en 3 células
el kainato no tuvo efecto notable y en las 6 restantes se produjo un aumento en la frecuencia
(17.3 ± 4.0 %). En conjunto la disminución media fue del 28.4 ± 4.8 % (n=38 células de 24
rodajas). Por el contrario, la amplitud de los mIPSCs no sufrió variación significativa. La figura
7 muestra un ejemplo representativo en una neurona piramidal de CA1. Estos datos también
son congruentes con un modo de acción presináptico para kainato.
Kainato 3 µM
Recuperación
50
pA
4s
C
1.0
0.8
Control
0.6
Kainato
3 µM
0.4
0.2
0.0
0
40
80
Amplitud (pA)
120
Probabilidad Acumulativa
B
Control
Probabilidad Acumulativa
A
1.0
0.8
Control
0.6
Kainato
3 µM
0.4
0.2
0.0
0
2
4
6
8 10
Intervalo (s)
Figura 7. Efecto de kainato sobre las corrientes inhibidoras GABAérgicas postsinápticas
miniatura (mIPSCs). Las respuestas miniatura se registraron en presencia de TTX 0.5-1 µM. A)
Registros de las mIPSCs antes, durante y después de la aplicación de kainato. B) Distribución
cumulativa de amplitud de las mIPSCs antes y durante la aplicación de kainato. Como se puede
observar, no hay ningún cambio en la amplitud de las respuestas durante la aplicación de kainato. C)
Distribución cumulativa de intervalos entre miniaturas antes y durante la aplicación de kainato 3 µM.
Se puede observar que el intervalo de tiempo que pasa entre la ocurrencia de dos miniaturas aumenta
cuando se aplica kainato a las rodajas.
1.3. El efecto de kainato no se debe a la activación de los receptores metabotrópicos de
glutamato.
Con el fin de descartar que un aumento en la concentración extracelular de glutamato
inducido por la adición de kainato a la rodaja, y la subsecuente activación de los receptores de
glutamato metabotrópicos, fuera el origen de las acciones observadas, se ensayó el efecto de
kainato en presencia de inhibidores de los receptores de glutamato metabotrópicos. Esta
31
Resultados
posibilidad se descartó dado que en presencia de MPPG y MCPG (1.5 mM cada uno de ellos),
los efectos de kainato permanecieron inalterados.
1.4. CNQX antagoniza el efecto de kainato de forma dosis-dependiente.
Aunque CNQX está considerado como el antagonista prototípico de los receptores de
AMPA, también bloquea a los receptores de kainato. Dado que en nuestras condiciones
experimentales los receptores de AMPA se encuentran bloqueados con GYKI 53655, a todos
los efectos se puede usar CNQX como antagonista de los receptores de kainato. Como se puede
observar en la figura 8A, cuando se aplicó kainato 10 µM en presencia de CNQX, éste fue
menos efectivo en reducir la amplitud de las eIPSCs, efecto que fue dosis-dependiente. Estos
resultados sugirieron que la reducción de la amplitud de las eIPSCs por kainato se debió,
Inhibición de las eIPSCs (%)
100
80
60
*
40
*
20
0
KA
10 µM
**
Reducción de frec. mIPSCs (%)
por kainato 3 µM
efectivamente, a la activación de receptores de glutamato de tipo kainato.
+
CNQX
25 µM 50 µM 100 µM
60
45
30
15
0
Control
Cóctel
Figura 8. Propiedades farmacológicas de la acción de kainato sobre las IPSCs.
A) La acción inhibidora de kainato fue antagonizada de forma dosis-dependiente por
CNQX. (* p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, test t de Student). Las barras representan la media ±
EEM de 6 (control), 3 (CNQX 25 y 100 µM) ó 2 (CNQX 50 µM) experimentos. B)
Kainato fue igualmente efectivo en reducir la frecuencia de las mIPSCs aún en
presencia de un cóctel de antagonistas de otros receptores. Este consistió en: MCPG
(1.5 mM); MPPG (1.5 mM), Naloxona (100 µM), Atropina (50 µM), 2-OH-Saclofén
(100 µM), DPCPX (0.1 µM), D-AP5 (50 µM) y GYKI 53655 (100 µM).
1.5. Kainato no actúa sobre otro tipo de receptores descritos que regulan la liberación de
neurotransmisor.
Para descartar la posibilidad de que un mensajero indeterminado, liberado tras la
depolarización neuronal y/o glial fuera la causa del efecto descrito, al activar algún receptor
32
Resultados
presináptico, kainato se aplicó en presencia de un cóctel de antagonistas compuesto por: MCPG
y MPPG (1.5 mM cada uno), naloxona (100 µM), atropina (50 µM), hidroxisaclofén (50-150
µM) y DPCPX (0.1 µM). Sin embargo, el efecto de kainato sobre las mIPSCs estuvo presente
aún en presencia de este cóctel (Fig. 8B), con lo que se pueden descartar los receptores
metabotrópicos de glutamato, de opiáceos, muscarínicos, de GABAB y A1 de adenosina como
mediadores de estos efectos. La somatostatina, aplicada al baño, no tuvo efecto alguno sobre
las eIPSCs, con lo cual también se puede descartar que tras la adición de kainato a la rodaja
ésta sea liberada y deprima las corrientes inhibidoras GABAérgicas.
1.6. El agonista endógeno de los receptores de kainato, glutamato, ejerce el mismo efecto
que kainato sobre las eIPSCs.
Para verificar si el agonista endógeno de los receptores de kainato, glutamato, era capaz
de actuar sobre los receptores de kainato para regular la liberación de GABA, este agonista se
aplicó a las rodajas en presencia de una mezcla de bloqueantes compuesto por MCPG y MPPG
(1.5 mM cada uno), GYKI 53655 (100 µM) y D-AP5 (200 µM) para prevenir la activación de
cualquier tipo de receptor de glutamato excepto la de los de kainato.
Al igual que el kainato, el glutamato redujo la amplitud de las corrientes inhibidoras
presentando una curva dosis-respuesta en forma de campana (Figura 9). Los datos
experimentales se ajustaron bien a la curva dosis-respuesta para glutamato calculada en
condiciones de estado estacionario a partir de los parámetros de activación e inactivación
obtenidos en neuronas en cultivo.
Al igual que ocurrió cuando se aplicó kainato, el coeficiente de variación (medido como
1/CV2) fluctuó de manera paralela a la variación de la media (M) entre las condiciones test y
control. Ello sugirió de nuevo una localización presináptica para los receptores que median
este efecto. Igualmente en presencia de glutamato, la frecuencia de las mIPSCs disminuyó
ligera pero significativamente (14.0 ± 4.0 %, n=5, Glutamato 30 µM), sin que se produjera
cambio alguno en la amplitud de las mismos. El efecto de glutamato sobre las eIPSCs (42.2 ±
6.1% de reducción, glutamato 10 µM) fue antagonizado por CNQX (100 µM; Fig. 10B) ya que
en presencia de este antagonista, glutamato produjo una depresión de la amplitud de las eIPSCs
de un 5.9 ± 12.3 % (n=4).
33
Resultados
A
Control
Glutamato
3 µM
B
Recuper.
80
Inhibición eIPSCs (%)
200
pA
100 µM
200
pA
1 mM
EC50 =300 µM
IC1/2= 2.5 µM
60
40
20
0
0.1
100
pA
100 ms
1
10 100 1000
Glutamato (µM)
A
eIPSCs
Glu
Control
50
pA
100 ms
+ Cóctel
B
Glu
Control
20
pA
100 ms
Reduccion IPSCs (%)
Figura 9. Efecto de glutamato sobre las eIPSCs. La aplicación de glutamato en las
condiciones de estado estacionario del receptor, reduce la transmisión inhibidora en
neuronas de CA1 de acuerdo con la ventana predicha según las propiedades de
activación e inactivación de los receptores de kainato. A) Corrientes sinápticas
inhibidoras (evocadas al estimular en el stratum oriens del hipocampo) registradas en
rodajas en neuronas piramidales de CA1 antes, durante y después de la aplicación de
glutamato. B) Curva dosis-respuesta. Los puntos rellenos corresponden a los valores
promedio ± EEM, mientras que los círculos no rellenos corresponden a valores
individuales. La línea continua representa la curva dosis-respuesta teórica para las
condiciones de equilibrio del receptor, calculada con los parámetros que se indican.
60
40
20
*
0
Glu
+
CNQX
10 µM Cóctel 100 µM
Figura 10. Propiedades farmacológicas del efecto de glutamato sobre las eIPSCs.
A), B) La acción depresiva de glutamato (10 µM) sobre las eIPSCs se mantuvo en
presencia de un cóctel de antagonistas de otros receptores (ver figura 8) y fue
antagonizada por CNQX.
34
Resultados
Finalmente, el efecto de glutamato sobre la amplitud de las eIPSCs persistió en
presencia del cóctel anteriormente descrito (Fig. 10) (MCPG, MPPG, naloxona, atropina, 2-ohsaclofén, DPCPX, APV y GYKI 53655).
1.7. Kainato deprime la transmisión GABAérgica en la región CA1 del hipocampo in vivo.
De los resultados anteriores, obtenidos in vitro, es evidente que los receptores de
kainato regulan la liberación de GABA. Estudios realizados en colaboración con el laboratorio
del Dr. Herreras, del Departamento de Investigación del Hospital “Ramón y Cajal”, indicaron
que este resultado también era el observado en experimentos in vivo. En este sentido, se
hicieron experimentos en el hipocampo de ratas anestesiadas, en las que se implantaron cánulas
de diálisis.
Se registraron potenciales de campo extracelulares en la capa piramidal de CA1,
evocados por estímulos eléctricos en las colaterales de Schaffer (Figura 11A). En estos
registros, la onda negativa representa los potenciales de acción sincrónicos de una gran
población de neuronas (espiga poblacional). Se ha demostrado que la amplitud de la espiga
poblacional es proporcional al número de células que dispara al mismo tiempo. La estimulación
por pares de pulsos sirve para medir la efectividad de la inhibición GABAérgica mediante la
comparación de la respuesta al segundo pulso (test) con la respuesta al primero (condicionada).
Estos 2 pulsos fueron separados 40 ms, y las respuestas de campo se promediaron cada 5
ensayos. En este intervalo, predomina la activación inhibidora mediada por receptores de tipo
GABAA. Este experimento se repitió en 5 animales con resultados similares (Fig. 11). La
efectividad de la inhibición fue drásticamente reducida cuando se introdujo kainato 3 µM en la
cánula de diálisis. Se eligió una concentración baja de kainato para evitar la activación de los
receptores de AMPA (se estima que la concentración que se alcanza extracelularmente es
aproximadamente 1/10 de la concentración perfundida, Herreras et al., 1994). Incluso a esta
baja concentración de kainato, una espiga poblacional, ausente en los controles, apareció
claramente en respuesta al pulso test, aumentando con el tiempo de perfusión. Este fenómeno
fue reversible tras retirar el kainato del líquido de perfusión (Figuras 11A y 11B). Por el
contrario, no se observó efecto alguno sobre la amplitud de la espiga inducida por la respuesta
condicionada, lo cual fue indicativo de que a estas concentraciones, kainato no produjo una
depolarización significativa. Además, en dos animales se hicieron registros sobre la capa
sináptica (stratum radiatum), no observándose un efecto significativo sobre los potenciales
postsinápticos de campo excitadores (EPSPs). De acuerdo con su acción sobre la inhibición
sináptica, durante la exposición a kainato, en el electroencefalograma hipocámpico apareció un
35
Resultados
patrón de actividad similar al de los estados epilépticos (Fig. 11C), siendo evidentes la
presencia de espigas epilépticas en la actividad electroencefalográfica (Fig. 11D inferior). Es
conocido que este tipo de actividad aparece en vivo y/o en rodajas después de exponer el tejido
A
B
40 ms
Ringer
Kainato
3 µM
t=1'
t=3'
t=8'
t=18'
Espiga Poblacional (mV)
a sustancias convulsantes que bloquean la inhibición mediada por GABA.
12
Cond.
8
4
Test
0
C
Kainato 3 µM
0
25
50
75
100
125
Tiempo de perfusión (min)
t=60'
2
mV
5
mV
1s
2
mV
20 ms
Figura 11. Efecto de bajas concentraciones de kainato sobre la inhibición
GABAérgica en experimentos llevados a cabo in vivo en el hipocampo. A) Para testar la
inhibición recurrente, se registraron potenciales de campo en la capa piramidal de CA1
evocados por pares de pulsos en la ruta de las colaterales de Schaffer. Los estímulos fueron
separados 40 ms. Nótese la ausencia de espiga poblacional (la señal negativa puntiaguda)
en respuesta al segundo estímulo (test) en condiciones control. Esta espiga poblacional se
desarrolla progresivamente tras la inclusión de kainato en el lugar de perfusión. A tiempos
de exposición prolongados aparecieron dobles espigas en el potencial de campo (inferior),
lo cual es una indicación de actividad epiléptica.
B) Evolución de la amplitud de las espigas poblacionales evocadas por el primer
(condicionada, Cond.) y el segundo (Test) estímulo. La respuesta test fue aumentada de
forma reversible mientras que la primera espiga se mantuvo constante a lo largo del
experimento.
C) Kainato indujo actividad epiléptica en el hipocampo, caracterizada por la presencia de
espigas interictales. El recuadro representa un registro expandido de 1 segundo.
36
Resultados
2. La modulación de la liberación de GABA por los receptores de kainato
involucra una función metabotrópica.
2.1. La activación de una proteína G sensible a toxina pertúsica y de proteína kinasa C
son necesarias para que se produzca la disminución de liberación de GABA mediada por
la activación de receptores de kainato.
Una vez determinado que la activación de los receptores de kainato produce una
depresión de la transmisión inhibidora GABAérgica y que estos receptores deben estar
localizados en los terminales presinápticos de los contactos inhibidores, se intentó determinar el
mecanismo mediante el cual se produce este efecto de disminuir la liberación del GABA.
Para determinar si los efectos de kainato sobre la liberación de GABA involucraban
la activación de una proteína G, se analizó, en primer lugar, la capacidad de este agonista para
deprimir las eIPSCs mediadas por GABA en rodajas que previamente habían sido incubadas
con toxina pertúsica (PTx) (5 µg/ml, 3-4 horas a 37 ºC). Al igual que en anteriores
experimentos, la activación de los receptores de AMPA por kainato se evitó añadiendo GYKI
53655 (100 µM) en todos las experimentos y la activación de los receptores de NMDA se evitó
incluyendo D-AP5 (50 µM). En las rodajas tratadas con PTx, las eIPSCs presentaron cinéticas
de activación y de deactivación similares a las observadas en las rodajas sin tratar. En estas
rodajas, kainato fue incapaz de alterar la amplitud de las respuestas inhibidoras (Figura 12).
Kainato (3 µM) produjo una reducción de la amplitud de las eIPSCs del 9.4 ± 5.3 % (n=6
neuronas de 5 rodajas diferentes) en rodajas que previamente fueron tratadas con PTx. Por el
contrario, el tratamiento similar con toxina colérica (20 µg/ml) tuvo un efecto mínimo en la
acción de kainato sobre la amplitud de las eIPSCs (50.6 ± 3.8 % de reducción, n=5 rodajas).
Estos resultados indican que una proteína G sensible a toxina pertúsica es necesaria para que
tengan lugar los efectos depresores de kainato sobre las eIPSCs en el hipocampo.
Las proteínas G pueden interaccionar de forma directa con dominios estructurales de
canales de calcio voltaje-dependientes (De Waard et al., 1997; Zamponi et al., 1997), siendo
éste uno de los mecanismos por el que actúan algunos receptores acoplados a proteínas G (e.g.
Dolphin et al., 1986; Boland y Bean, 1993). Para determinar si un mensajero soluble estaba
implicado o no en el efecto de kainato, se determinaron los efectos de kainato sobre las eIPSCs
tras incubar las rodajas con estaurosporina, un inhibidor de proteínas kinasas de amplio
37
Resultados
espectro. A una concentración de 500 nM, estaurosporina abolió completamente la acción de
kainato sobre las eIPSCs (2.0 ± 13.9 %, 3 µM de kainato; Figura 13), indicando que la
activación de una proteína kinasa, más que una modulación directa de los canales de calcio por
una proteína G, era responsable de la acción observada sobre la transmisión GABAérgica.
A
Kainato 3 µM
Control
Lavado
100
pA
C
Reducción de las eIPSCs(%)
Amplitud de las eIPSCs
B
Control
PTx 5 µg/ml
1.5
1.0
0.5
Control
0.0
0
50
Kainato 3 µM
100
150
Lavado
50 ms
60
40
20
**
0
Control
200
Tiempo (s)
PTx
ChTx
5 µg/ml 20 µg/ml
Figura 12. La modulación de la liberación de GABA mediada por receptores de
kainato involucra una proteína G sensible a toxina pertúsica. A) Inhibición de las
IPSCs por kainato. Las respuestas fueron registradas de neuronas de CA1 cuyo
potencial de membrana fue mantenido a -60 mV y fueron evocadas por estimulación
del stratum oriens. Los registros son el promedio de 5 respuestas consecutivas. B)
Curso temporal de la amplitud de las eIPSCs antes, durante y depués de aplicar
kainato en rodajas sin tratar (círculos negros) y en rodajas tratadas con toxina
pertúsica (círculos abiertos). Los valores son la media+EEM de 5 respuestas
consecutivas. C) Promedio del efecto de kainato 3 µM sobre la amplitud de las
eIPSCs en rodajas normales (control) y en rodajas tratadas con toxinas pertúsica (PTx)
o colérica (ChTx). Las barras representan la media+EEM de resultados obtenidos de
20, 6 (5 rodajas) y 5 (5 rodajas) neuronas, respectivamente.
Para determinar qué kinasa estaba involucrada en esta acción, se realizaron experimentos
farmacológicos con inhibidores específicos. La inhibición de la proteína kinasa dependiente de
cAMP (PKA) por H-89, un inhibidor específico, al cual la membrana plasmática es permeable,
aplicado a 500 nM (≅ 10 veces su IC50) no modificó el efecto de kainato sobre las eIPSCs (63.1
± 8.3 %, n=5 neuronas de 3 rodajas; Figura 13). Por el contrario, la calfostina C, un inhibidor
38
Resultados
altamente específico de proteína kinasa C (PKC), previno de forma dosis-dependiente la acción
de kainato (Fig. 13B), demostrando que la activación de la PKC está involucrada en la
depresión de la liberación de GABA inducida por kainato. De acuerdo con este resultado, la
activación de PKC con ésteres de forbol (PDBu, 0.5 µM) ocluyó totalmente la acción
inhibidora de kainato 3 µM (Figura 14). La incubación de las rodajas con Sp-cAMPS (50 µM),
un análogo permeante de cAMP, activador de PKA, no afectó a la reducción de la amplitud de
las eIPSCs inducida por kainato (Figura 14B), siendo ésta reducida en un 13 % (de un 63.2 % a
un 50.4 ± 11.1 % en presencia de Sp-cAMPS, n=5 células de 4 rodajas). Igualmente, el bloqueo
de fosfolipasa C (PLC) también atenuó en gran medida el efecto de kainato sobre la liberación
de GABA (Fig. 14B). Incubando las rodajas con U-73122 (10 µM), inhibidor de la PLC, se
redujo de forma significativa la atenuación de las eIPSCs inducida por kainato (21.2 ± 8.6 % de
inhibición, n=7 células de 4 rodajas; cf. 63.2 % en el control), un efecto que fue específico ya
que el análogo inactivo, U-73343, no ejerció acción alguna sobre la inhibición inducida por
kainato (52.0 ± 8.5 % de inhibición, n=4 células de 4 rodajas; Figura 14B).
B
Amplitud de las eIPSCs
2.0
Control
Estaurosp. 500 nM
1.5
1.0
0.5
C
0.0
0
Kainato 3 µM
100
200
Lavado
300
400
Reducción de las eIPSCs (%)
A
Tiempo (s)
60
40
**
20
0
**
**
.
C
C
sp
9
u ro M H -8 M lfo s. M lf os.
a
t
n
µ a
µ
M
a
s
µ
0
E 50
0 .5 C 0 .5 C 1
Figura 13. La modulación de las amplitudes de las eIPSCs por kainato involucra la activación
de una proteína kinasa C. A) Experimento representativo en el cual la acción de kainato sobre la
amplitud de las eIPSCs se evaluó en ausencia (círculos negros) y en presencia de estaurosporina
(círculos abiertos). Los valores son la media+EEM de 5 respuestas consecutivas. B) Efecto de
inhibidores específicos a los cuales la membrana es permeable, de proteínas kinasas sobre la acción
de kainato. La inhibición de las PKC por estaurosporina y por calfostina C previno el efecto de
kainato (3 µM). La inhibición de la PKA por H-89 no tuvo ningún efecto. Las barras representan la
media+EEM de 4, 5, 4 y 6 neuronas respectivamente. La barra horizontal rayada representa el
intervalo de confianza para el decremento en amplitud de las eIPSCs inducido por kainato (3 µM) en
rodajas sin tratar. **p<0.01, test t de Student.
39
Resultados
B
Amplitud de las eIPSCs
1.5
Reducción de las eIPSCs (%)
A
Control
PDBu 0.5 µM
1.0
0.5
0.0
Control Kainato 3 µM Lavado
50
150
250
350
60
40
*
20
0
450
Time (s)
**
S
u
3
2
34
DB
MP
12
73 µ M -73 µ M -cA M P 5 µ M
U
U 0
0.
Sp 0 µ
1
10
5
Figura 14. La estimulación de la PKC ocluyó la acción de kainato. A) Experimento
representativo mostrando que kainato no afecta la amplitud de las eIPSCs en presencia del
éster de forbol PDBu. Los valores son la media+EEM de 5 respuestas consecutivas. B) La
inhibición de fosfolipasa C, por U73122, previno el decremento en amplitud inducido por
kainato. El análogo inactivo, U73343, no tuvo efecto. La activación de PKC (con PDBu),
pero no la de PKA (con Sp-cAMPS) ocluyó la acción depresiva de kainato. Las barras son
la media+EEM de datos obtenidos de 7, 4, 5, y 4 rodajas, respectivamente. La barra
horizontal rayada representa el intervalo de confianza para el decremento de la amplitud de
las eIPSCs inducido por kainato (3 µM) en rodajas sin tratar. *p<0.05; **p<0.01, test t de
Student.
Estos resultados indicaron que los receptores de kainato activan una proteína G
acoplada a fosfolipasa C (PLC). La activación de PLC induciría la producción de diacilglicerol,
el cual es sabido que es un potente activador de PKC.
2.2. Kainato activa una población particular de PKC.
La activación de la PKC produce un aumento de la liberación de neurotransmisor en
sinapsis tanto excitadoras (e.g. Malenka et al., 1986) como inhibidoras (e.g., Copogna et al.,
1995). Sin embargo, nuestros resultados, muestran que kainato reduce la probabilidad de
liberación de GABA a través de un fenómeno mediado por PKC. La explicación más sencilla
consistente con estos resultados, es que existen dos poblaciones separadas de PKC y que la
activación de cada una produce efectos diferentes. Para determinar si éste era o no el caso, se
diseñaron experimentos de oclusión con el éster de forbol PDBu. Tras perfundir la rodaja con
PDBu (0.5µM), kainato fue totalmente inefectivo en decrecer la amplitud de las eIPSCs (Figura
14A); esto es, el éster de forbol ocluyó completamente la acción de kainato. Con el fin de evitar
la modificación de los receptores de GABA por los ésteres de forbol (e.g. Vaello et al., 1994),
40
Resultados
se midió la frecuencia de miniaturas (mIPSCs), registrados en presencia de TTX (0.5 µM) (Fig.
15 ). PDBu triplicó la frecuencia de mIPSCs (311.9 ± 68.4 % , n=6 células). Kainato produjo
un aumento adicional de la frecuencia de mIPSCs (66.0 ± 21.2 %). El efecto de PDBu fue
prevenido con la inclusión de 1 µM de calfostina C (19.0 ± 19.0 de aumento, n=4), lo que
demuestra que la acción general de la estimulación de PKC ocluye totalmente la acción de
kainato. Cuando el experimento se realizó a la inversa, incluyendo PDBu una vez que kainato
hubo realizado su efecto, la inhibición fue totalmente revertida, aumentando la frecuencia de
minis hasta 166.7 ± 39.6 % del valor control (n=5). Por tanto, kainato fue incapaz de ocluir la
acción del éster de forbol. Estos resultados indicaban, que los receptores de kainato tienen
acceso a una población limitada y específica de PKC, cuya activación no compromete a la
población total.
A
Control
Kainato 3 µM
Kainato 3 µM + PDBu 0.5 µM
C
75
75
mIPSCs (#/30 s)
mIPSCs (#/30 s)
B
20
1 s pA
50
25
Kainato
PDBu 0.5 µM
0
0
2
4
6
50
25
PDBu
Kainato 3 µM
0
8 10 12 14
0
Tiempo (min)
2
4
6
8 10 12 14
Tiempo (min)
Figura 15. PDBu ocluyó la acción inhibidora de kainato pero kainato no ocluyó la acción
estimuladora de PDBu. A) Registros de las corrientes inhibidoras miniatura (mIPSCs),
registradas en presencia de TTX (0.5 µM) antes (superior), durante la aplicación de kainato
(intermedio) y durante la aplicación de kainato más PDBu (inferior). B) Un experimento
representativo mostrando el efecto de PDBu y de la subsecuente inclusión de kainato (3 µM)
sobre la frecuencia de mIPSC. C) En una neurona diferente, cuando el efecto de kainato sobre
las mIPSC alcanzó un estado de equilibrio se añadió PDBu. Las líneas punteadas indican en
cada caso el valor medio de la frecuencia de mIPSC en esta célula en particular. Más que
decrecer la frecuencia de minis, kainato la aumenta en presencia del éster de forbol. Resultados
similares se observaron en 5 (B) y 6 (C) neuronas.
41
Resultados
2.3. La acción de kainato es independiente de la actividad del receptor como canal iónico.
Para determinar si la acción metabotrópica de kainato era dependiente o independiente de
la actividad del receptor de kainato como canal, se examinó si el efecto inhibidor de kainato
cambiaba cuando se modificaba la concentración extracelular de sodio. Es conocido que la
mayor parte de la carga a través del canal es acarreada por este ion en la mayoría de los
receptores ionotrópicos de glutamato. El sodio fue sustituido por concentraciones
equimoleculares de N-metil-D-glucamina. La reducción de hasta el 60% del sodio extracelular
no impidió la generación de potenciales de acción, y por tanto, se pudo estudiar la actividad
sináptica evocada. En estas circunstancias, kainato fue igualmente efectivo en reducir la
amplitud de las eIPSCs (Fig. 16C). Menores concentraciones de sodio (<60 mM) no
permitieron la generación de potenciales de acción. A concentraciones de Na+ menores (37.5
mM; 25% de lo normal, en presencia de TTX), kainato fue igualmente efectivo en reducir la
frecuencia de mIPSCs (Figura 16A). Este experimento se repitió eliminando completamente el
sodio de la solución extracelular con un resultado idéntico (Fig. 16B).
Estos datos indican que la inhibición de la liberación de GABA por kainato es
esencialmente independiente de la función como canal del receptor.
A Na extracelular = 37.5 mM B 60 IPSCs miniaturas C 80
Kainato 3 µM
30
pA
Lavado
2s
40
20
0
Na+
Na+
Na+
150 mM 37.5 mM 0 mM
Reducción de amplitud (%)
Control
Reducción frecuencia (%)
+
IPSCs evocadas
60
40
20
0
Na+
150 mM
Na+
60 mM
Figura 16. La regulación de la liberación de GABA por kainato es independiente de la
actividad del receptor como canal iónico. A) Registros mostrando el efecto de kainato
sobre la frecuencia de mIPSCs en condiciones de bajo Na+ extracelular (25% del total). La
reducción del sodio extracelular no afectó al grado de reducción en la frecuencia de mIPSC
inducido por kainato (B) ni al grado de reducción de las respuestas evocadas (eIPSC) (C).
Las barras son la media+EEM de los valores obtenidos de 12, 5 y 4 neuronas,
respectivamente (B) y 20 y 3, respectivamente (C).
42
Resultados
2.4. AMPA no activa una cascada similar.
El antagonista competitivo de los receptores de tipo AMPA/kainato, CNQX,
previene de forma dosis-dependiente la acción inhibidora de kainato sobre las eIPSCs (ver
Figura 8A). En los experimentos descritos, la activación de los receptores de AMPA se previno
añadiendo 100 µM de GYKI 53655 a la solución de perfusión. Sin embargo, como GYKI es un
antagonista no competitivo de los receptores de AMPA (Paternain et al., 1995), no impide la
unión del agonista al receptor. Tras la demostración de que la subunidad del receptor de AMPA
GluR1 podía producir la activación de una proteína G de forma independiente a su actividad
como canal (Wang et al., 1997), todavía podría ser posible que GYKI 53655 impidiera la
apertura del canal tras la unión del agonista pero no la subsecuente activación de la proteína G.
Para descartar la posibilidad de que kainato estuviese produciendo su actividad moduladora por
su acción como agonista de los receptores de AMPA, se determinó si la unión del agonista
prototípico de los receptores de AMPA, era capaz de producir acciones similares sobre la
amplitud de las eIPSCs. Para ello, se incluyó GYKI 53655 (100 µM) y ciclotiazida (50 µM)
(una sustancia que elimina la desensibilización de los receptores de AMPA). En estas
circunstancias, 50 µM de AMPA fue completamente inefectivo en reducir la amplitud de las
eIPSCs (101.2 ± 4.7 % del valor control, n=4), pudiéndose descartar que los receptores de
AMPA estén involucrados en la depresión de la transmisión GABAérgica mediada por kainato.
2.5. La activación de los receptores metabotrópicos de glutamato de tipo I no ocluye la
acción de kainato.
Es sabido que los receptores metabotrópicos de glutamato de tipo I están acoplados a una
proteína G, la cual es capaz de activar PLC y producir IP3 y diacilglicerol (ver Conn y Pin,
1997). Con el fin de comprobar si la activación de esta ruta en los terminales inhibidores podía
ocluir la acción de kainato, se estudiaron los efectos de kainato en presencia de DHPG, un
agonista específico de los receptores metabotrópicos del grupo I (Schoepp et al., 1994). DHPG
(100 µM) produjo un aumento de la actividad espontánea así como un cambio en la corriente
de fijación. Transcurridos 5 minutos, la actividad espontánea cesó y la corriente de fijación
volvió a sus valores originales, aunque la amplitud de la respuesta inhibidora evocada
permaceció aumentada un 29.6 ± 13.3 %, n=4. En esta situación, la adición de kainato (3µM)
produjo un decremento de las eIPSCs de igual magnitud que la de los experimentos control
(Fig.17), produciéndose una reducción del 67.5 ± 4.7 % (n=4; cf. 63.2 % en el control).
43
Resultados
Estos resultados demuestran que o bien no existen receptores mGluRs de tipo I en los
terminales inhibidores GABAérgicos del hipocampo estudiados o que esta ruta de señalización
no converge con la activada por los receptores de kainato.
Inhibición eIPSCs (%)
por KA 3 µM
80
Figura 17. La activación de los
receptores metabotrópicos de tipo I no
ocluye la acción de kainato. En
presencia de DHPG 100 µM (un agonista
de los receptores metabotrópicos de
glutamato de tipo I) kainato fue capaz de
producir una depresión de las eIPSCs de
igual cuantía que en condiciones control.
Las barras representan la media ± EEM de
26 neuronas en el caso control y de 5
neuronas en presencia de DHPG.
60
40
20
0
Control
+ DHPG
100 µM
2.6. La activación de los receptores de kainato modula la señal de calcio.
Es conocido que la activación de la PKC facilita la liberación de neurotransmisor
porque, entre otras acciones, potencia las corrientes de Ca2+ al fosforilar los canales
responsables de esta corriente. Para que la activación de la PKC produzca una reducción de la
liberación de neurotransmisor, como la encontrada en el presente trabajo para los receptores de
kainato, sería necesario que la PKC interaccionara con un canal de potasio, facilitando su
actividad, o con un canal de calcio, inhibiéndolo. Para comprobar la existencia de alguna
relación entre los receptores de kainato y las corrientes de potasio o de calcio, se redujeron en
primer lugar las corrientes de potasio añadiendo tetraetilamonio (TEA, 2.5 mM) a la rodaja. El
bloqueo de los canales de potasio aumentó la liberación de neurotransmisor, observándose un
aumento de la amplitud de las eIPSCs así como un enlentecimiento en la desactivación de las
respuestas (Figura 18A). Sin embargo, el bloqueo de los canales de potasio no ocluyó el efecto
de kainato 3 µM (54.1 ± 4.6 % de inhibición con 2.5 mM de TEA, n=8 neuronas de 6 rodajas;
Fig 18). Un experimento similar se llevó a cabo en presencia de bajo (0.5 mM) y alto (10 mM)
calcio. El aumento de la concentración extracelular de calcio produjo un incremento de la
amplitud de las eIPSCs, indicando que, al igual que cuando se bloquearon los canales de K+, la
cantidad de calcio que ingresaba en el terminal estaba aumentada. Sin embargo, en este caso la
forma de la respuesta no se alteró (Fig. 19A). En presencia de Ca2+ 10 mM, kainato redujo la
amplitud de las eIPSCs sólo un 21.0 ± 4.3 % (n=4), mientras que a calcio 0.5 mM, kainato fue
44
Resultados
más efectivo en deprimir la transmisión GABAérgica (70.6 ± 12.3 %, n=4) que en las
condiciones control (i.e 1.8 mM calcio).
A
Control
TEA 2.5 mM
Normalizadas
C
T
100
pA
1.5
Control
TEA
1.0
0.5
0.0
100 ms
C
C
50
Kainato
150
Lavado
250
350
Reducción de eIPSCs (%)
Amplitud de las eIPSCs
B
60
40
20
0
Control
450
Tiempo (s)
TEA
2.5 mM
Figura 18. Efecto del bloqueo de los canales de K + sobre la acción
inhibidora de kainato. A) Tetraetilamonio (TEA) aumentó la amplitud de las
eIPSC y prolongó su curso temporal de decaimiento. Los registros son la
media de 5 respuestas consecutivas, las cuáles están normalizadas en el panel
de la derecha. B) Un experimento representativo mostrando que el bloqueo
de los canales de K+ no tiene efecto sobre la acción inhibidora de kainato. C)
Promedio de todos los experimentos. Las barras representan la media ± EEM
de 5 (control) y 8 (TEA) neuronas.
Estos experimentos indican que la estimulación de la PKC tras la activación de los
receptores de kainato resulta en la fosforilación de elementos que están involucrados en la
liberación de neurotransmisor inducida por calcio.
45
Resultados
A
Ca2+
2 mM
Ca2+
10 mM
Normalizadas
2
10
150
pA
C
2+
1.5
Reducción de eIPSCs(%)
Amplitud de las eIPSCs
B
Ca 0.5 mM
2+
Ca 10 mM
1.0
0.5
0.0
50 ms
C
50
Kainato
150
250
Lavado
350
450
Tiempo (s)
80
60
40
**
20
0
Control Ca2+ Ca2+
0.5 mM 10 mM
Figura 19. Un aumento de la concentración extracelular de Ca2+ atenuó la
reducción de las eIPSC inducida por kainato. A) Con el Ca2+ extracelular elevado se
aumentó la amplitud de las eIPSCs con un efecto mínimo sobre su curso temporal.
Ambos registros se representan en el panel derecho normalizados y sobreimpuestos. B)
Experimento representativo mostrando la falta de efecto de kainato (3 µM) a altas pero
no a bajas concentraciones de Ca2+. C) Comparación de las reducciones de amplitud de
las eIPSCs obtenidas a concentraciones normales (1.8 mM), bajas (0.5 mM) y altas (10
mM) de Ca2+ extracelular. Las barras son la media ± EEM de 20, 4 y 4 neuronas
respectivamente. **p<0.01, test t de Student.
3. Las interneuronas de hipocampo presentan dos poblaciones de receptores
de kainato con mecanismos de señalización diferentes.
3.1. El aumento de actividad espontánea y el descenso de amplitud de las respuestas
evocadas son efectos producidos por la activación de receptores de kainato diferentes.
En nuestras condiciones experimentales, la aplicación de kainato fue generalmente
acompañada por un aumento en la frecuencia de respuestas espontáneas (sIPSCs), debido al
hecho de que kainato produjo la depolarización de las interneuronas (Fig. 20).
46
Resultados
A
Kainato 3 µM
Control
Interneurona del S.O.
-65 mV
B
Recuperación
2s
30
mV
Célula Piramidal
1s
40
pA
Figura 20. Kainato depolariza las interneuronas y aumenta la frecuencia de las sIPSCs en
las neuronas piramidales. A) Efecto depolarizante de kainato 3 µM en presencia de GYKI
53655 100 µM y D-APV 50 µM sobre las interneuronas del stratum oriens. B) Simultáneamente,
se observa un aumento en la frecuencia de las IPSCs espontáneas en la neuronas piramidales de
CA1. Estos efectos revierten tras el lavado de kainato.
Para clarificar si la depresión de la transmisión inhibidora GABAérgica evocada y
el aumento de actividad espontánea observado son fenómenos relacionados de forma directa o
no, se buscaron agonistas de los receptores de kainato que permitieran discriminar entre ambos
efectos.
Para ello, se determinó el efecto de diferentes agonistas de los receptores de kainato
sobre la excitabilidad de las interneuronas del stratum oriens así como sobre las eIPSCs
registradas en neuronas piramidales de CA1, en condiciones de bloqueo de los receptores de
NMDA y AMPA. En algunos experimentos, se usó el nuevo compuesto SYM 2206, que a 100
µM muestra especifidad como antagonista de los receptores de AMPA sobre los receptores de
kainato. En los experimentos con glutamato, se evitó la activación de los receptores
metabotrópicos de glutamato incluyendo MPPG y MCPG (1-1.5 mM cada uno). En estas
condiciones, kainato (3 µM) deprimió la amplitud de las eIPSCs (63.2 ± 2.4 %; n=26). La
acción de kainato fue mimetizada por ATPA, un derivado de AMPA descrito como agonista
específico de los receptores de kainato formados por subunidades GluR5 (Clarke et al.1997). A
10 µM, ATPA causó una reducción de la amplitud de las eIPSCs del 58.5 ± 6.2 % (n=8). La
actividad de ATPA fue parcialmente antagonizada por CNQX. Por el contrario, S-AMPA fue
47
Resultados
inefectivo en reducir la amplitud de las eIPSCs a concentraciones suficientes para activar los
receptores de AMPA (i.e. 50 µM; -0.1 ± 6.4 %, n=9), siendo altamente efectivo a
concentraciones suficientemente altas para activar los receptores de kainato (92.5 ± 3.5 % de
reducción a 500 µM; n=4).
Todos los agonistas anteriormente descritos también aumentaron la frecuencia de
sIPSCs en las células piramidales. Sin embargo, el agonista endógeno de estos receptores,
glutamato, cuando se aplicó a bajas concentraciones (3-10 µM) fue capaz de inhibir la eIPSCs
de forma significativa (42.2 ± 6.1 %, n=11 p<0.01, Fig. 21), una acción que, también fue
prevenida por CNQX (5.9 ± 12.3 %, n=4). Sin embargo, a pesar de este efecto, glutamato no
aumentó la frecuencia de sIPSCs (100.0 ± 7.0 %, n=4), indicando que, a esta concentración,
glutamato no produjo la depolarización de las interneuronas. Glutamato fue activo incluso a
más bajas concentraciones (3 µM, 20.0 ± 4.2 % de depresión; n=4; p<0.01), sin alterar la
frecuencia de eventos espontáneos en la célula sometida a registro (93 ± 5 %; n=7) (Fig. 21a).
En estas mismas neuronas, se comprobó que kainato (0.3 µM) causó el incremento de la
frecuencia de sIPSCs (447 ± 103 %; n=6), deprimiendo la amplitud de las eIPSCs un 32.1 ± 4.6
% (n=3).
Por el contrario, se observó que ATPA a 1 µM, era capaz de depolarizar las
interneuronas del stratum oriens (11.8 ± 2.1 mV; n=4) y aumentar de forma notable su
frecuencia de disparo y subsecuentemente, la frecuencia de sIPSCs en las células piramidales
(1179 ± 261 %; n=7; p<0.001). Sin embargo, a esta concentración, ATPA, redujo la amplitud
de las eIPSCs sólo un 16.1 ± 3.2 %; n=11; p<0.001). A concentraciones más bajas (0.3 µM),
ATPA todavía fue efectivo en aumentar la frecuencia de sIPSCs (303 ± 65.6 %, n=5; p<0.001)
siendo inhábil sobre el eIPSCs (4.0 ± 7.8 % de aumento de la amplitud, n=9) (Fig. 21C). La
acción de AMPA fue similar a la de ATPA en cuanto a que a bajas concentraciones (i.e. 50
µM) aumentó de forma drástica la frecuencia de sIPSCs (973 ± 178 %; n=5), mientras que no
tuvo ningún efecto sobre las eIPSCs (Fig. 22A,C).
48
Resultados
Figura 21. A) A 3 µM el agonista endógeno de los receptores de kainato,
glutamato, no aumentó la frecuencia de actividad espontánea inhibidora
(sIPSCs) en neuronas piramidales, mientras que sí disminuyó la amplitud
de las respuestas evocadas (eIPSCs), inducidas por estimulación del
stratum oriens (los registros de la derecha son el promedio de 12
respuestas). A 10 µM, glutamato tuvo un efecto mayor sobre las respuestas
evocadas sin alterar la frecuencia de sIPSCs (B). C) El agonista de los
receptores de kainato de tipo GluR5, ATPA, aumentó de forma notable la
frecuencia de sIPSCs (izquierda) sin afectar a la amplitud de las eIPSC
(derecha).
Estos resultados indican que la sensibilidad para el agonista de los receptores que depolarizan
las interneuronas (i.e. aumento de la frecuencia de sIPSCs) y la de los receptores que controlan
la liberación de GABA (i.e. amplitud de las eIPSCs) es diferente. Ello se ilustra también por la
falta de correlación entre el aumento de sIPSCs y el grado de disminución de la amplitud de las
eIPSCs inducida por diferentes agonistas de los receptores de kainato (Fig. 22B). Por tanto, se
puede concluir que los receptores que median cada efecto tienen una naturaleza diferente.
Para mejor sustanciar que el efecto de la activación de los receptores de kainato sobre la
amplitud de las eIPSCs y sobre la depolarización de la membrana está mediada por receptores
diferentes, se estudió el efecto de kainato tras incubar las rodajas con toxina pertúsica (5 µg/ml,
3-5 h a 37 ºC), estaurosporina (0.5 µM) y bisindolilmaleimida (inhibidor de la PKC) (BIS, 0.1
µM).
49
*
100
75
50
25
0
60
40
20
*
3
*
10 0.3
*
1
0
Redución de elPSCs (%)
*
Reducción de eIPSCs (%)
*
1200
800
400
50 µM
80
60
40
20
0
100
600 1100 1600
Frecuencia de sIPSC (%)
Glutamato ATPA AMPA
1300
* *
900
*
*
500
200
100
100
AMPA 50 µM
2
4
0
6
8
Tiempo de Registro (min)
10
Amplitud de las eIPSC (%)
C
B
Frecuencia de sIPSC (%)
Frecuencia de sIPSC (%)
A
Resultados
Figura 22. A) Efecto de diferentes concentraciones de glutamato, ATPA y AMPA sobre la
frecuencia de sIPSCs (barras sombreadas) y sobre la amplitud de las eIPSCs (barras
negras). * p<0.001, test t de student. B) La frecuencia de sIPSCs durante la aplicación de
agonistas de receptores de kainato (normalizada con respecto del control) se representa
frente al grado de reducción de las eIPSCs obtenido frente a cada concentración de
agonista, (glutamato, ATPA, AMPA y kainato). Nótese la falta de correlación entre estos
dos parámetros (r2<0.01). C) Curso temporal de la acción de AMPA (en presencia de
GYKI 53655 100µM) sobre la frecuencia de sIPSC y sobre la amplitud de las eIPSCs.
Cada punto representa el valor medio (±EEM; n=6) de periodos consecutivos de 30
segundos. (* p<0.001, ANOVA y test t de student).
En todos los casos la acción de kainato sobre la modulación de las eIPSCs fue
severamente impedida (Fig. 23 y 24A). Sin embargo, tanto kainato como ATPA fueron todavía
capaces de depolarizar las interneuronas, no encontrándose diferencias ni en el grado de
depolarización ni en el grado de aumento de la actividad espontánea en las rodajas tratadas y no
tratadas. Todas las interneuronas del stratum oriens registradas (n=12) fueron sensibles a
ATPA (1-10 µM). En promedio, 3 µM de kainato depolarizó las interneuronas un poco menos
que 1 µM de ATPA (8.6 ± 1.8 mV, n=7 y 12 ± 1.8 mV, n=5, respectivamente). La frecuencia
de disparo inducida por 3 µM de kainato fue de 3.9 ± 0.4 Hz, un valor que no fue alterado en
rodajas tratadas con PTx (3.5 ± 0.5, n=5) o con estaurosporina (4.2 ± 1.0 Hz, n=3) (Fig. 25B).
Estos resultados, indican que, a diferencia del control de la liberación de GABA, la
depolarización de las interneuronas mediada por la activación de los receptores de kainato no
50
Resultados
requiere un acoplamiento a una cascada de segundos mensajeros.
A
B
Interneurona del stratum oriens
Kainato
Tratada con PTx
Control
KA 2 min
KA 6 min
KA 10 min
Lavado
20
mV
-65 mV
100
pA
100 ms
10 s
Figura 23. El efecto depolarizante de kainato pero no su acción sobre las
IPSCs persiste en rodajas tratadas con PTx. A) Efecto depolarizante de 3 µM
de kainato sobre una interneurona del stratum oriens, en una rodaja tratada con
toxina pertúsica. B) Kainato no reduce las IPSCs registradas en neuronas
piramidales de CA1 de una rodaja tratada con toxina pertúsica. (5 µl/ml) durante
3-5 horas a 37 ºC antes de ser registrada.
Frecuencia de sIPScs (%)
Frecuencia de disparo (Hz)
80
(26)
60
1000
PTx
0
**
(7)
(12)
(6)
No Tratada
BIS
750
500
250
0
**
(6)
BIS
**
(11)
20
**
(4)
Calfos.C
40
Estaurosp.
C
B
No tratada
Depresión de las eIPSCs
inducida por kainato 3 µM (%)
A
6
5
4
(3)
(4)
(5)
3
2
1
0
No Tratada PTx Estaurosp.
Figura 24. A) El decremento de la
amplitud de las eIPSCs inducido por
kainato (No tratada, n=26) se abolió en
rodajas tratadas con toxina pertúsica
(PTx, 5 µl/ml), o con cada uno de los
siguientes
inhibidores
de
PKC,
aplicados a concentraciones 10 veces su
IC50: estaurosporina (Estaurosp., 0.5
µM), Calfostina C (Calfos. C, 0.5 µM),
o bisindolilmaleimida (BIS, 0.1 µM). B)
El tratamiento con PTx o con
estaurosporina no tiene efecto sobre el
aumento en la frecuencia de disparo de
las interneuronas del stratum oriens inducido por 3 µM de kainato. C) La
inhibición de la PKC no fue capaz de modificar el aumento de actividad
espontánea (sIPSC) inducido por kainato. Los valores son la media ± EEM
del número de neuronas indicado en paréntesis. ** p<0.001, test t de
Student.
51
Resultados
Finalmente, se pretendió determinar si la falta de efecto de kainato sobre las eIPSCs por
inhibición de la PKC se podía revertir lavando el inhibidor. Para ello, se intentó registrar la
misma neurona durante largos períodos de tiempo. En la neurona de CA1 mostrada en la figura
25A registrada de una rodaja tratada con estaurosporina, kainato produce un aumento en la
amplitud de las eIPSCs, más que una disminución. Sin embargo, tras 60 minutos de lavado de
la estaurosporina, la aplicación de kainato fue efectiva en reducir la amplitud de las eIPSCs
registradas en la misma neurona (Fig. 25B). También se llevó a cabo el experimento inverso.
Tras demostrar la efectividad de kainato para disminuir la amplitud de las eIPSCs en una célula
de una rodaja control, ésta se incubó con estaurosporina. Como se puede ver en la figura 25D,
la incubación durante 30 minutos con estaurosporina disminuye notablemente la acción de
kainato para deprimir la amplitud de las eIPSCs. Estos mismos resultados fueron replicados en
4 rodajas diferentes.
A Estaurosporina 0.5 µM
Control KA 3 µM
200
pA
50 ms
C Ringer
Control KA 3 µM
B Lavado de la estaurosporina (60’)
Control KA 3 µM
Promedio (n=10)
C
KA
100
pA
50 ms
200
pA
50 ms
KA
KA
C
100
pA
50 ms
D Estaurosporina 0.5 µM (30’)
Control KA 3 µM
Promedio (n=10)
C
60
pA
50 ms
Promedio (n=10)
Promedio (n=10)
C
40
pA
50 ms
60
pA
50 ms
KA
40
pA
50 ms
Figura 25. A) El efecto inhibidor de kainato sobre la amplitud de las eIPSCs registradas en
neuronas de CA1 desapareció en rodajas que previamente habían sido tratadas con
estaurosporina. A la izquierda se muestran respuestas individuales superpuestas y a la derecha
su promedio. Esta neurona se pudo mantener estable durante el periodo en el que la
estaurosporina se lavó (60 min). En esta situación, la aplicación de kainato indujo una reducción
significativa de la amplitud de las eIPSCs (B). C) En una rodaja control, kainato aumentó la
actividad espontánea, reduciendo la amplitud de las corrientes inhibidoras evocadas. D)
Después de incubar esta misma rodaja con estaurosporina durante 30 minutos, el efecto de
kainato sobre la amplitud de las eIPSCs registradas en la misma célula se eliminó. Nótese, que
el aumento en la actividad espontánea (sIPSCs) persistió, y que la depolarización postsináptica,
inducida por kainato, fue similar en cada caso. Estos resultados se obtuvieron en cuatro
ocasiones.
52
Resultados
4. La modulación de la liberación de GABA mediada por la activación de
receptores de kainato presinápticos es un fenómeno común a diferentes
zonas del cerebro.
Para determinar si en otras áreas del cerebro la activación de los receptores de kainato
produce igualmente la modulación de la liberación de GABA, se llevaron a cabo experimentos
sobre la transmisión inhibidora en otras zonas del cerebro.
4.1. Hipocampo.
Se registraron las IPSCs evocadas en las neuronas piramidales de CA3 tras la estimulación
de las interneuronas del stratum oriens o del stratum lucidum en presencia de GYKI 53655 y de
D-AP5. La aplicación de kainato 3 µM a las rodajas de hipocampo en las que se registraron las
eIPSCs en CA3 produjo un 60.2 ± 6.0 % de disminución de la amplitud media de estas
respuestas (n=5) (Fig. 26), un efecto similar al observado en CA1. Igualmente, la aplicación de
kainato produjo una corriente entrante postsináptica de 69.4 ± 2.1 pA. También se observó un
aumento significativo en la actividad espontánea, que aumentó hasta el 1249 ± 360 % (n=5).
A
Control
Kainato 3 µM
100
pA
C
80
100
ms
1.5
60
1/CV2
Inhibición de eIPSCs (%)
B
Recuperación
40
20
0
1.0
0.5
0.0
0.0
Kainato
3 µM
0.5
1.0
1.5
M
Figura 26. En la región CA3 de hipocampo kainato también
reduce la liberación de GABA. A) Registros en los que se observa
la acción depresora de kainato sobre las eIPSCs. Este efecto revierte
tras el lavado de kainato. B) Cuantificación del efecto de kainato 3
µM sobre las eIPSCs registradas, en esta zona de hipocampo (n=5
células de 5 rodajas diferentes). C) El estadístico 1/CV2 varía de
forma paralela a la amplitud media de las corrientes, lo que indica
un mecanismo de acción presináptico.
53
Resultados
El estudio del coeficiente de variación de estas respuestas indicó un mecanismo de acción
presináptico como la acción más probable de kainato. Como se puede observar en la figura
26B, el punto medio se sitúa sobre la diagonal, lo que indica que la variación en la amplitud se
corresponde con un cambio proporcional en los parámetros de liberación.
4.2. Cerebelo.
En primer lugar se estudió el efecto de kainato sobre la transmisión sináptica inhibidora
a nivel de las células de Purkinje del cerebelo. Para ello, el electrodo de estimulación se colocó
en la capa molecular, cerca de la capa de las células de Purkinje, registrándose las corrientes
inhibidoras en las neuronas de Purkinje en condiciones de bloqueo de los receptores de AMPA
y de NMDA. La aplicación de kainato 3 µM produjo un descenso de la amplitud media de las
eIPSCs de un 44.2 ± 9.3 % (n=15) (Fig. 27). También se observó la generación de una corriente
entrante de 14.0 ± 5.4 pA, lo que sugiere la presencia de receptores de kainato funcionales en
las células de Purkinje. Sin embargo, estos experimentos no revelaron cambio significativo en
la actividad espontánea (sIPSCs) tras la aplicación de kainato (96.4 ± 5.3 %, n=8)
El estudio del coeficiente de variación (Fig. 27B) indicó un mecanismo presináptico de
acción, ya que que, como en el caso anterior, el punto medio se situó sobre la diagonal.
En segundo lugar, se estudió el efecto de kainato sobre la liberación de GABA que tiene
lugar en las sinapsis establecidas por las células de Purkinje sobre las neuronas de los núcleos
profundos del cerebelo. En estas rodajas el electrodo de estimulación se colocó sobre las fibras
que forman los axones de las células de Purkinje, registrándose las respuestas evocadas en las
neuronas que forman dichos núcleos (DCN). Al aplicar kainato (3 µM) a estas rodajas en
condiciones de bloqueo de los receptores de AMPA y NMDA, se observó un descenso de la
amplitud media de las eIPSCs de un 44.0 ± 4.6 % (n=7) (Fig.28). En estas células, la aplicación
de kainato produjo un cambio de la corriente de fijación de 34.3 ± 4.4 pA. Igualmente se valoró
si la aplicación de kainato tuvo efecto sobre la actividad espontánea, observándose que en
presencia de kainato se produjo un aumento de 4 veces en esta actividad (397.2 ± 95.1 %, n=5).
Una vez más se determinó el coeficiente de variación, comprobándose que el punto
medio caía sobre la diagonal de la gráfica, lo cual, sugiere un mecanismo de acción
presináptico.
54
Resultados
A
Control
Kainato 3 µM
Recuperación
50
pA
C
60
1.5
40
1.0
1/CV2
Inhibición de eIPSCs (%)
B
100
ms
20
0.5
0.0
0
0.0
Kainato
3 µM
0.5
1.0
1.5
M
Figura 27. Efecto de la activación de los receptores de kainato sobre
las eIPSCs registradas de células de Purkinje de cerebelo. (A y B)
Kainato (3 µM) produjo una reducción de la amplitud media de las
eIPSCs. C) El estudio del cambio de 1/CV2 con respecto del cambio de
la amplitud media de las corrientes sugiere un mecanismo de acción
presináptico.
A
Control
Kainato 3 µM
Recuperación
50
pA
50
ms
C
60
1.5
40
1.0
1/CV2
Inhibición de eIPSCs (%)
B
20
0
0.5
0.0
0.0
Kainato
3 µM
0.5
1.0
1.5
M
Figura 28. Efecto de la activación de los receptores de kainato sobre
las eIPSCs registradas de neuronas de los núcleos profundos de
cerebelo. (A y B) Kainato (3 µM) produce una reducción de la amplitud
media de las eIPSCs que varió de forma paralela al cambio del
estadístico 1/CV2 (C).
55
Resultados
4.3. Neocorteza.
Se registraron células piramidales de la capa V de la neocorteza en rodajas preparadas
de corteza suprahipocampal. Para generar IPSCs, el electrodo de estimulación se colocó en el
entorno de la célula registrada. La aplicación de kainato (3 µM) produjo un ligero descenso de
la amplitud media de las corrientes inhibidoras (18.2 ± 9.3 %, n=4) (Fig. 29). También se
observó en estas células que kainato inducía una corriente entrante de 72.3 ± 17.1 pA y un
incremento en el número de eventos espontáneos (al 814.8 ± 273.5 %, n=4). Como en casos
anteriores, el estudio del coeficiente de variación indicó un mecanismo de acción presináptico
como explicación más probable para estos resultados.
A
Control
Kainato 3 µM
Recuperación
50
pA
100
ms
C
1.5
40
30
1/CV2
Inhibición de eIPSCs (%)
B
20
10
0
1.0
0.5
0.0
0.0
Kainato
3 µM
0.5
1.0
1.5
M
Figura 29. Efecto de la activación de los receptores de kainato
sobre las eIPSCs registradas en neuronas piramidales de la capa
V de corteza tras estimular las interneuronas adyacentes. A)
Kainato (3 µM) produjo una reducción de la amplitud de las eIPSCs
que fue paralela al cambio del estadístico 1/CV2 (C). B)
Cuantificación del efecto de kainato 3 µM. La barra representa la
media ± EEM de 4 neuronas de 4 rodajas diferentes.
En la figura 30 se presenta de forma comparativa el efecto de kainato 3 µM sobre
las eIPSCs en las diferentes áreas estudiadas. Nótese que al igual que en CA1 del hipocampo,
no parece existir correlación alguna entre la disminución de las corrientes evocadas y el efecto
producido sobre la actividad espontánea (Fig. 30C).
56
Resultados
Estos resultados indican que los receptores de glutamato de tipo kainato están
presentes en la parte presináptica de los contactos inhibidores en diferentes áreas del cerebro y
que, al menos en estas zonas, estos receptores tienen una función similar, que es modular a la
baja la liberación del neurotransmisor GABA.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Aumento de sIPSCs (%)
Reducción de eIPSCs (%)
B
Reducción de eIPSCs (%)
A
60
40
20
0
CA1CA3 DCN P
1000
500
0
CA1CA3 DCN P
C
C
0
1500
400 800 12001600
Frecuencia de sIPSCs (%)
C
Figura 30. Comparación del
efecto de kainato 3 µM sobre
las eIPSCs en diferentes áreas
del cerebro. A) Kainato
deprime las eIPSCs en las
regiones CA1 y CA3 de
hipocampo, en las células de los
núcleos profundos (DCN) y de
Purkinje (P) del cerebelo y en
las neuronas piramidales de
corteza (C) B) Efecto sobre la
frecuencia
de
respuestas
espontáneas (sIPSCs).
C) Representación gráfica de la correlación entre la depresión de las
corrientes evocadas y el cambio producido sobre la actividad
espontánea. Como se puede observar, no existió correlación entre
ambos fenómenos.
57
Discusión
DISCUSIÓN.
Los resultados expuestos demuestran que kainato regula la transmisión GABAérgica
en el área CA1 del hipocampo reduciéndola. Esta acción es compatible con la bien conocida
naturaleza convulsante y excitotóxica del ácido kaínico (Coyle, 1983). En el presente trabajo,
se diseñaron experimentos en diferentes modelos experimentales, microcultivos, rodajas de
cerebro e in vivo, obteniéndose en todos los casos resultados compatibles. Ello demuestra que
este efecto es una acción general y no un resultado inherente a una preparación experimental
en particular.
Hace más de 15 años, cuando kainato empezó a usarse como agente excitotóxico,
algunos autores describieron acciones de este compuesto sobre la inhibición GABAérgica.
Sloviter y Damiano (1981) fueron los primeros en sugerir que kainato decrecía la inhibición
en el hipocampo, un resultado que desde entonces ha sido encontrado por diferentes autores
(Westbrook y Lothman, 1983; Fisher y Alger, 1984; Kehl y McLennan, 1985; Gaiarsa et al.,
1994). Sin embargo, la falta de conocimiento sobre los receptores de kainato y de sus
propiedades evitó alcanzar conclusiones válidas en esos momentos.
Considerando que los receptores de AMPA, los otros receptores susceptibles de ser
activados por kainato, fueron sistemática y completamente bloqueados por GYKI 53655 y que
el bloqueo de los receptores metabotrópicos de glutamato no previno el efecto observado, se
puede concluir que la acción de kainato sobre la inhibición GABAérgica es mediada por la
activación de receptores de kainato. La falta de antagonistas específicos de los receptores de
kainato impidió la demostración de una implicación directa de estos receptores en la
inhibición de las eIPSCs. Sin embargo, en presencia de GYKI 53655, el antagonista de los
receptores de AMPA y kainato, CNQX pudo ser usado como antagonista de los receptores de
kainato. Como se ha descrito, este antagonista inespecífico fue capaz de inhibir la acción de
kainato de forma dosis-dependiente.
La posibilidad de que kainato produjera en las rodajas la liberación de algún tipo de
sustancia que, al activar sus propios receptores, fuera capaz de producir el efecto observado,
fue descartada dado que en presencia de un cóctel de antagonistas para bloquear los
receptores posibles, kainato siguió produciendo la depresión de las corrientes inhibidoras. El
58
Discusión
hecho de que glutamato, el agonista endógeno de estos receptores, tuviera un efecto similar
sobre la transmisión inhibidora, permite concluir que la activación de estos receptores por el
agonista endógeno produce la desinhibición de las poblaciones neuronales. Por tanto,
considerando el perfil farmacológico y las propiedades de la acción de kainato sobre la
función sináptica GABAérgica descritos en esta memoria, podemos concluir que la depresión
de la inhibición es mediada por activación de receptores de glutamato de tipo kainato
presentes en la parte presináptica de los contactos inhibidores y que éste es uno de los papeles
principales que los receptores de kainato desempeñan en la fisiología cerebral.
1. La acción de kainato es presináptica.
Efectivamente, kainato redujo notablemente la amplitud de las eIPSCs tanto en
microcultivos como en rodajas de hipocampo. Todas las evidencias obtenidas con diferentes
aproximaciones sugirien un sitio de acción presináptico para kainato. En primer lugar, se
compararó la proporción de fallos en la liberación de neurotransmisor antes y durante la
aplicación de kainato. Para este análisis sólo se consideraron aquellas células en las que los
fallos pudieron ser determinados sin ambigüedad. El aumento en el número de éstos estuvo
correlacionado con la magnitud del decremento en la amplitud de las eIPSCs. Ello sugiere un
cambio en la probabilidad de liberación de neurotransmisor durante la aplicación de kainato.
En neuronas microcultivadas, una situación en la cual la generación de la espiga presináptica
pudo ser controlada, se observó igualmente un aumento en el número de fallos. En segundo
lugar, kainato redujo la frecuencia de mIPSCs sin producir cambio alguno en la amplitud de
las mismas, un resultado igualmente compatible con un decremento en la probabilidad de
liberación. El análisis del coeficiente de variación de las respuestas evocadas (i.e. el
estadístico CV2), se modificó proporcionalmente a la variación de la amplitud media de las
respuestas, resultado igualmente demostrativo de un modo de acción presináptico para
kainato.
Algunos autores han tratado de determinar la distribución subcelular de los receptores
de kainato, a pesar de la carencia de buenos anticuerpos. Sin embargo, ninguno de ellos ha
podido concluir de forma inequívoca su localización. Aunque la señal inmunocitoquímica se
ha encontrado preferentemente en la densidad postsináptica de sinapsis asimétricas, en
algunos casos se ha observado marcaje en axones no mielinizados y en terminales
presinápticos (Huntley et al., 1993; Petralia et al., 1994). Ello de acuerdo con nuestros
59
Discusión
resultados, sugiere la existencia de receptores de kainato presinápticos. No obstante, la
identificación de las subunidades de los receptores de kainato presentes en los botones
sinápticos GABAérgicos requerirá estudios definitivos de microscopía electrónica del tipo de
los llevados a cabo para otros receptores de glutamato (e.g. Luján et al., 1996; Shigemoto et
al., 1996; Rubio y Wenthold, 1997).
2. La curva dosis-respuesta para el efecto de kainato y de glutamato presenta forma de
campana.
En el presente trabajo, la acción de kainato sobre las eIPSCs se evaluó en condiciones
de equilibrio. Experimentos realizados en nuestro laboratorio indican la existencia de una
ventana de activación por el agonista de este receptor (Paternain et al., 1998). Esta ventana
surge de las propiedades de activación e inhibición de estos receptores en condiciones de
estado estacionario. En las rodajas de hipocampo, la curva dosis-respuesta de la inhibición de
las eIPSCs calculada tanto para kainato como para glutamato presentó forma de campana,
existiendo un rango de concentraciones efectivas. Este hecho se debe a que dosis más altas o
más bajas impiden que se mantenga una actividad del receptor en estado estacionario, debido
a que las más bajas son incapaces de activar el receptor y las más altas lo desensibilizan
rápidamente. Ello resulta en una curva dosis-respuesta teórica en forma de campana para las
condiciones de funcionamiento del receptor en estado estacionario. La ventana de corriente
teórica mostrada en la figura 5B como una línea continua se calculó como la fracción de
canales no inactivados que pueden ser activados por cada concentración de kainato, teniendo
en cuenta las curvas de activación y de inactivación para los receptores de kainato nativos
determinadas previamente en neuronas de hipocampo en cultivo. Como se puede observar, los
valores experimentales de la acción de kainato sobre las eIPSCs en rodajas de hipocampo
ajustan razonablemente bien con los datos obtenidos en neuronas cultivadas. En este sentido,
esta curva presentó un máximo a concentraciones de kainato en torno a 10 µM y de
aproximadamente 100 µM para glutamato.
3. La depresión de las corrientes inhibidoras mediada por activación de receptores de
kainato requiere la activación de una cascada metabotrópica.
Con la aproximación farmacológica llevada a cabo, los resultados descritos muestran
de forma clara que la depresión de la liberación de GABA inducida por la activación de los
receptores de kainato en la zona CA1 de hipocampo resulta de la iniciación de una cascada de
segundos mensajeros producida por la activación de una proteína G sensible a toxina
60
Discusión
pertúsica. La ruta involucra la activación de fosfolipasa C y de PKC, constituyendo una
acción metabotrópica de los receptores de kainato que es independiente de su actividad como
canal iónico. Recientemente se ha mostrado en neuronas corticales, que los receptores de
AMPA pueden regular los niveles de AMPc mediante la activación de una proteína Gi,
aunque no existe ninguna evidencia acerca del papel fisiológico que esta interacción pudiera
desempeñar. Sin embargo, estos resultados indican igualmente que, además de formar canales
iónicos, los receptores ionotrópicos de glutamato pueden exhibir acción metabotrópica. En el
caso de los receptores de kainato, semejante actividad afecta profundamente a la actividad
neuronal ya que resulta en la modulación de la inhibición mediada por GABA.
En sinaptosomas de hipocampo también se ha encontrado acoplamiento de los
receptores de kainato a proteína G (Cunha et al., 1999). Si el receptor de kainato se acopla
directamente a la proteína G o lo hace a través de una proteína adaptadora es difícil de
predecir. Sin embargo, se ha observado que la afinidad por kainato de estos receptores en el
pez dorado (carpín dorado), presenta cierta sensibilidad a PTx así como a la ADP ribosilación
de una proteína de 40 KDa, que podría coincidir con los receptores de kainato de este pez
(Ziegra et al, 1992). Aunque estos datos son consistentes con una interacción directa de los
receptores de kainato con una proteína G sensible a toxina pertúsica, la topología de las
subunidades de los receptores de kainato es, en principio, difícil de reconciliar con la
estructura de los receptores de la familia de los metabotrópicos, que presentan sitios
específicos de interacción con las proteínas G (ver Pin y Duvoisin, 1995). Por ello, es posible
que una proteína adaptadora pueda estar implicada en transmitir la señal desde el receptor de
kainato hasta la proteína G tras la unión de glutamato.
4. ¿Son las proteínas exocitóticas los efectores de una población específica de PKC?
Es sabido que la activación de la PKC (p.e. con ésteres de forbol) aumenta la
liberación de neurotransmisor en sinapsis inhibidoras (Capogna et al., 1995), un resultado que
fue replicado en nuestras condiciones experimentales. Sin embargo, la activación de los
receptores de glutamato de tipo kainato conduce a la activación de un reservorio de PKC que
produce un descenso en la probabilidad de liberación de GABA. Este resultado indica la
existencia de, al menos, dos poblaciones o reservorios de PKC en los terminales
GABAérgicos. La estimulación de uno de ellos produciría un aumento de la liberación de
transmisor mientras que el otro la inhibiría. En este sentido, la oclusión de la acción de
61
Discusión
kainato por PDBu puede ser explicada por la activación de todos los reservorios de PKC por
parte del éster de forbol, impidiendo cualquier tipo de activación por parte de kainato. Por el
contrario, la activación por parte de kainato de una población inhibidora de PKC,
cuantitativamente pequeña, no es capaz de impedir la acción de los ésteres de forbol. Por
tanto, se puede hipotetizar que la ruta de señalización activada por los receptores de kainato
involucra una población particular de PKC (ver Nishizuca, 1988). Es interesante hacer notar
que en presencia de PDBu, más que disminuir la frecuencia de miniaturas (mIPSCs), kainato
la aumentó y que esta acción fue adicional al efecto de PDBu. Este resultado podría ser
esperado si se produjera una suave depolarización del terminal presináptico por un receptor
acoplado a un canal catiónico (Lena y Changeux, 1997; ver también McGehee y Role, 1996;
Glitsh y Marty, 1999), como sería el caso de los receptores de kainato.
Otro e importante aspecto de los datos presentados es que la inhibición de la liberación
de GABA inducida por kainato puede ser reducida aumentando la fuerza electromotriz de
Ca2+. Esto prodría significar que la población de PKC susceptible de ser activada por los
receptores de kainato interfiere con un paso en el mecanismo de liberación en el cual el Ca2+
debe de estar involucrado. En principio, la reducción en la liberación de neurotransmisor
puede provenir de alguno de estos fenómenos: (1) la cantidad de calcio que entra en el
terminal disminuye como consecuencia de la inhibición de los canales de calcio. (2)
disminuye la sensibilidad a calcio de la maquinaria de liberación. En ambos casos, el
resultado es una disminución en la liberación y en ambos casos un aumento en el gradiente
químico para el calcio podría restaurar las condiciones iniciales. Sin embargo, es bien
conocido que la activación de PKC produce un aumento de las corrientes a través de los
canales de calcio y, por tanto, un aumento en la cantidad de neurotransmisor liberado (Swartz,
1993; Swartz et al., 1993). Aunque la activación de PKC ha sido también implicada en una
inhibición de los canales de calcio inducida por la liberación de neurotransmisor (e.g.;
Diversé-Pierluissi y Dunlap, 1993), la mayoría de la inactivación de canales de calcio
inducida por la liberación de neurotransmisor involucra mecanismos mediados por proteínas
G delimitados a la membrana plasmática, sin la participación de proteínas kinasa (revisado
por Hille, 1992). Para minimizar un eventual déficit de calcio, se bloquearon los canales de
potasio para prolongar la duración de los potenciales de acción y, por tanto, la duración de la
entrada de calcio en los terminales. El aumento en la entrada de calcio al bloquear los canales
de potasio, no fue suficiente para impedir la acción de kainato, aunque si se aumentó la
liberación de neurotransmisor (Fig. 15). Sin embargo, aumentando el gradiente químico para
62
Discusión
el calcio se aumentó la concentración de calcio que entró en el terminal sin cambiar la cinética
de la entrada. Este proceder fue bastante efectivo en prevenir la acción inhibidora de kainato.
Este resultado indica que la modulación de la liberación de GABA por kainato es consistente
con un cambio mediado por PKC en la sensibilidad a calcio de las proteínas involucradas en
la exocitosis, más que una acción directa de la PKC sobre canales de calcio presinápticos (e.g.
Retting et al., 1997).
En resumen, estos resultados proporcionan la evidencia que sustenta una actividad
metabotrópica de un receptor típicamente ionotrópico con claras consecuencias fisiológicas.
Los receptores de kainato parecen controlar la actividad de una población particular de PKC
que influye notablemente la liberación de GABA en el hipocampo. Este hecho añade más
diversidad a la función de los receptores de glutamato y abre nuevas vistas sobre el modo de
operación de los receptores de glutamato de tipo ionotrópico (Fig. 31).
GLUTAMATO
NMDA
EXTRACELULAR
Zn
GLU
AMPA
KAINATO
mGluR I, II, III
GLY
PA
Mg
G
INTRACELULAR
NR2A
NR2B
SUBUNIDADES NR1+
NR2C
NR2D
GluR5-7
KA1, KA2
GluR1-4
AdC
PLC
mGluR1-8
IONOTROPICOS
METABOTROPICOS
Figura 31. Clasificación de los receptores de glutamato de acuerdo a su composición
subunitaria, sus propiedades farmacológicas y a sus mecanismos de señalización. Los
receptores de kainato y los de AMPA, además de funcionar como canales también presentan
función metabotrópica.
5. En las interneuronas de hipocampo coexisten las dos poblaciones de receptores de
kainato con sistemas de señalización diferentes.
Tanto el agonista endógeno, glutamato, como ATPA, un agonista de receptores
GluR5, y AMPA, un activador de algunos tipos de receptores de kainato, son capaces de
disociar el aumento de actividad espontánea (sIPSCs) observada por la acción depolarizante
63
Discusión
de los receptores de kainato de sus efectos sobre la liberación de GABA. Además, el efecto
sobre la liberación de GABA pero no la acción depolarizante de kainato fue sensible al
bloqueo de proteínas G o de PKC en las interneuronas de hipocampo. Estos resultados
indican, de forma inequívoca, la existencia de dos poblaciones de receptores de kainato en las
interneuronas del hipocampo que presentan desigual sensibilidad a agonista y que usan
diferentes sistemas de señalización (Fig. 32).
Estos resultados están en clara contradicción con uno de los argumentos usados por
algunos autores en contra de la existencia de receptores presinápticos de kainato,
fundamentados en la observación de que la estimulación repetitiva (i.e. 6 Hz) de las rutas
inhibidoras disminuye la amplitud de las eIPSCs. Aunque no se muestra, hemos evaluado esta
posibilidad en nuestras condiciones experimentales, no encontrándo una reducción de las
eIPSCs tan marcada como la descrita (Frerking et al., 1998). Por el contrario, en nuestros
experimentos, la estimulación repetitiva, provocó una reducción media de las respuestas
similar a la recientemente observada en experimentos con activación sostenida de las sinapsis
inhibidoras corticales (Galarreta et al., 1998). En definitiva, en nuestras condiciones
experimentales, esta depresión dependiente de frecuencia de las eIPSCs es claramente
insuficiente para explicar la reducción de las eIPSCs observada tras la adición de kainato al
baño. De hecho, nuestros resultados demuestran que bajas concentraciones de glutamato
deprimen las eIPSCs GABAérgicas en ausencia de disparos presinápticos repetitivos.
Además, si el aumento de actividad espontánea fuera responsable de la depresión de las
eIPSCs, algún tipo de correlación tendría que existir entre el aumento de actividad de las
interneuronas y el descenso de la amplitud de las eIPSCs, independientemente del agonista
usado. Sin embargo, de acuerdo con nuestras observaciones éste no fue el caso (Fig. 22) ni en
el hipocampo ni en las otras estructuras examinadas (Fig. 30).
La diferente sensibilidad a los diferentes agonistas de los tipos de receptores
responsables de un fenómeno u otro, indica que estos receptores difieren en su composición
molecular. Aunque las interneuronas del hipocampo expresan predominantemente la
subunidad GluR5 de los receptores de kainato, recientemente también se ha encontrado que
una importante población de interneuronas expresa la subunidad GluR6 y que estas dos
subunidades (GluR5 y GluR6) pueden ensamblarse formando receptores heteroméricos con
propiedades farmacológicas propias (Paternain et al., 2000). En consecuencia, la diversidad
de receptores de kainato es mayor de lo que se preveía y hasta el momento no se puede
64
Discusión
establecer ninguna conclusión sobre el tipo de subunidades que componen los receptores que
median cada efecto.
Curiosamente, la sensibilidad a glutamato de los receptores de kainato responsables de
la regulación de la liberación de GABA, fue mayor que la de los que producen la
depolarización somatodendrítica. Esto es lo que se esperaría para un receptor situado en un
sitio que no es capaz de sensar el glutamato sináptico. La concentración real de glutamato que
sensan los receptores de kainato in vivo es desconocida y probablemente limitada por la
actividad de los transportadores de glutamato. Estimaciones recientes indican que ésta puede
llegar a ser de 160-190 µM en el espacio extrasináptico. Este rango de concentraciones
pueden ser suficientes para la activación de receptores de glutamato situados a distancia de los
lugares de liberación, dado su aparentemente alta sensibilidad a glutamato. Por tanto, los dos
requerimientos para que la modulación de la liberación de GABA ocurra en respuesta a la
liberación sináptica de glutamato, una concentración suficiente fuera de la sinapsis y alta
sensibilidad del receptor, parecen cumplirse. De hecho, un estudio reciente (Min et al., 1999),
ha demostrado que la liberación sináptica de glutamato de las colaterales de Schaffer es
suficiente para reducir la amplitud de las eIPSCs mediante un mecanismo cuya farmacología
es compatible con la de los receptores de kainato.
6. La modulación de la liberación de GABA mediada por la activación de receptores de
kainato presinápticos es un fenómeno común a diferentes áreas del cerebro.
La disminución de la liberación de GABA producida por la activación de receptores
de kainato situados en terminales presinápticos parece ser un fenómeno general, puesto que,
se ha podido poner de manifiesto en las zonas CA1 y CA3 del hipocampo, en los núcleos
profundos del cerebelo, en las sinapsis inhibidoras que se establecen sobre las células de
Purkinje, así como en la capa V de corteza cerebral. Los datos experimentales también
muestran que se produce una depolarización de las células registradas y un aumento variable
de la actividad espontánea, no existiendo tampoco correlación entre el aumento de actividad
espontánea observado y la depresión de las corrientes evocadas. Aunque no se ha estudiado
sistemáticamente, existe la posibilidad de que en todos los casos los receptores de kainato
situados en los terminales estén asociados a proteínas G y que tengan función metabotrópica
al igual que ocurría en la zona CA1 del hipocampo. Sea como fuere, estos resultados indican
que en diferentes áreas del cerebro existen receptores de glutamato de tipo kainato cuya
activación produce una depresión de la transmisión sináptica inhibidora GABAérgica.
65
Discusión
Receptores de Kainato
somatodendríticos
(Depolarización)
A
Receptores de kainato
presinápticos
(Inhibición de la liberación de neurotransmisor)
ATPA>KA>Glu>AMPA
KA>Glu>ATPA>>AMPA
Figura 32. En las interneuronas del hipocampo coexisten dos poblaciones de
receptores de kainato con sistemas de señalización diferentes y con diferente
sensibilidad a agonistas.
7. Relevancia fisiológica del bloqueo de la liberación de GABA mediada por receptores
de kainato.
Es conocido que el glutamato puede regular no sólo su propia liberación sino también
la liberación de GABA activando receptores de glutamato metabotrópicos localizados
específicamente en terminales excitadores y GABAérgicos. El significado funcional exacto de
este hecho aún no ha sido bien establecido. Nuestros resultados identifican otro receptor de
glutamato capaz de ejercer esta misma actividad moduladora.
Cabe imaginar que si las sinapsis inhibidoras y excitadoras están parcialmente
integradas, el glutamato sináptico puede desbordarse (Kullmann et al., 1996) y alcanzar
concentraciones lo suficientemente altas para activar receptores de kainato en los terminales
GABAérgicos presinápticos. Teniendo en cuenta el dramático efecto que algunas
concentraciones de glutamato tienen sobre la liberación de GABA en condiciones de estado
estacionario (cuando sólo una pequeña cantidad de receptores están activos), el efecto de
glutamato en el pico de activación puede tener como consecuencia la completa supresión de la
función GABAérgica. Sin embargo, para este tipo de interacción computacional se requiere
un cronometraje exacto de la ocurrencia tanto de la liberación de glutamato como de la
invasión de la terminal inhibidora por el potencial de acción. La coincidencia temporal de
señales excitadoras e inhibidoras en el hipocampo es común y, de existir este mecanismo,
podría ser detectada en la dendrita de la célula postsináptica como una gran y duradera
depolarización que no se daría si no existiera este tipo de interacción. Por tanto, éste podría
ser un mecanismo de asegurar y/o reforzar la comunicación excitadora entre células. Para que
esta posibilidad sea posible, es necesario además que los terminales excitadores e inhibidores
66
Discusión
estén lo suficientemente cerca en el Sistema Nervioso Central. Se asume de forma general,
que las sinapsis inhibidoras se disponen en los troncos dendríticos y en los somas. Por el
contrario, las espinas dendríticas se han considerado siempre como blancos de los axones
excitadores, formando sinapsis asimétricas. Sin embargo, estudios inmunocitoquímicos
combinados con microscopía electrónica, han mostrado de forma convincente que las espinas
dendríticas reciben igualmente axones GABAérgicos (Ribak, 1978; Hendry et al., 1983;
Houser et al., 1984; revisado por DeFelipe y Fariñas, 1992). Consecuentemente la posibilidad
de que los terminales GABAérgicos sensen la cantidad de glutamato sináptico liberado existe
realmente.
La hipótesis anterior no excluye la posibilidad de que el tono inhibidor esté bajo el
control del glutamato extracelular. Los receptores de kainato presentan una ventana de
concentraciones de agonista activas. Para el agonista endógeno, esta ventana presenta un
máximo a 100 µM (menos de 10 veces la concentración alcanzada en la hendidura sináptica).
Además, una concentración de aproximadamente 100 µM es la calculada como valor
alcanzado en el fluido extracelular en condiciones isquémicas (Benveniste et al., 1984). La
predicción es que a esta concentración de glutamato, la función GABAérgica puede estar
seriamente
comprometida,
resultando
probablemente
excitotoxicidad. En efecto, en experimentos recientes,
en
actividad
epiléptica
y
ratones a los que les falta el
transportador de glutamato astrocítico, en los cuáles permanece elevada la concentración
extracelular de glutamato en el fluido extracelular durante largos períodos, presentan ataques
epilépticos espontáneos (Tanaka et al., 1997).
En resumen, nuestros resultados demuestran que los receptores de kainato modifican
la “fiabilidad” de las sinapsis GABAérgicas pudiendo modificar la “fuerza” de las conexiones
inhibidoras. Este efecto se alcanza, no obstante, dentro de un preciso rango en la
concentración extracelular de agonista. Concentraciones más altas o más bajas no son lo
suficientemente eficientes en alterar la fiabilidad. De este modo, la excitabilidad del circuito
estaría bajo el fino control de la concentración extracelular de glutamato a través de la
activación transitoria o tónica de los receptores de kainato. Este hecho implica la existencia de
reglas computacionales para la función de los receptores de kainato en la integración
neuronal.
67
Conclusiones
CONCLUSIONES.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se han alcanzado las siguientes
conclusiones:
1. La potente actividad epileptógena del ácido kaínico, conocida desde hace más de 15
años, se debe, al menos en parte, al efecto depresor de la inhibición GABAérgica
que conlleva la activación de los receptores de kainato presinápticos.
2. Los receptores de kainato presentan dos tipos de señalización celular
independientes, uno asociado a su actividad como canal iónico; el otro asociado a la
activación de una proteína G que dispara una cascada de segundos mensajeros,
constituyendo ésta la primera evidencia fisiológica de una función metabotrópica
para los receptores de glutamato de tipo kainato.
3. Los dos tipos de receptores de kainato coexisten en las interneuronas del
hipocampo. Una población se localiza en el compartimento somatodendrítico y su
activación provoca la depolarización de la membrana; la otra se localiza en la parte
presináptica de las sinapsis inhibidoras y su activación produce la disminución de la
liberación de GABA a través de un mecanismo que involucra la activación de la
proteína kinasa C.
68
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