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PAPEL CRUCIAL DE RECEPTORES CANNABINOIDES CB2 EN LA REGULACIÓN DE RESPUESTAS INMUNES CENTRALES DURANTE EL DOLOR NEUROPÁTICO REVISIÓN MCCR Desde que se descubrió en la modernidad el uso médico de los cannabinoides, el uso de estos para tratamientos ha aumentado. En este estudio se examinó el dolor neuropático, ya que es una lesión en el nervio muy difícil de tratar, inclusive con analgésicos potentes. Sin embargo, sabiendo el poder del CBD, aquí hemos utilizado diferentes tipos de ratones modificados genéticamente para aclarar el papel que tienen los receptores CB2 en la regulación de las respuestas inmunes centrales que conducen al dolor neuropático. Durante los estudios, los ratones CB2 y los ratones tipo salvaje, fueron expuestos a la lesión del nervio ciático, ambos desarrollaron una hiperalgesia y alodinia similar. Lo curioso es que los ratones CB2 desarrollaron un reflejo de dolor colateral, asociado a un aumento de la microglia y la expresión astrocítica en el cuerno espinal contralateral. Las mejoradas manifestaciones de dolor neuropático se replicaron en ratones de tipo salvaje, con células de la medula ósea de ratones CB2, demostrando así que la implicación de los receptores CB2 se expresa en células hematopoyéticas en el desarrollo del dolor neuropático en la medula espinal. Estos resultados demuestras el papel clave que tiene el receptor CB2 en la modulación de la activación de la glía en respuesta a la lesión del nervio, llegando a la conclusión de los agonistas cannabinoides CB2 podrían representar un nuevo grupo de agentes farmacológicos para el tratamiento del dolor neuropático. RESUMEN ABSTRACTO El dolor neuropático es una manifestación clínica de la lesión del nervio difícil de tratar incluso con compuestos analgésicos potentes. Aquí, hemos utilizado diferentes líneas de ratones modificados 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org genéticamente para aclarar el papel desempeñado por los receptores cannabinoides CB2 en la regulación de las respuestas inmunes centrales que conducen al desarrollo del dolor neuropático. Los ratones CB2 y los compañeros de camada de tipo salvaje fueron expuestos a la lesión del nervio ciático, y ambos genotipos desarrollaron una hiperalgesia y alodinia similar en la pata ipsilateral. Lo más sorprendente es que los ratones CB2 también desarrollaron un reflejo de dolor contralateral, asociado a un aumento de la microglia y la expresión astrocítica en el cuerno espinal contralateral. De acuerdo a esto, la hiperalgesia, alodinia, y microglial y la activación astrocítica inducida por la lesión del nervio ciático se atenuaron en los receptores de ratones transgénicos sobre expresando CB2. Estos resultados demuestran el papel del receptor CB2 cannabinoide, crucial en la modulación de la activación de la glía en respuesta a la lesión del nervio. Las mejoradas manifestaciones de dolor neuropático se replicaron en ratones de tipo salvaje irradiadas reconstituidos con células de la médula ósea de los ratones CB2, demostrando de este modo la implicación de los receptores CB2 se expresan en células hematopoyéticas en el desarrollo del dolor neuropático en la médula espinal. INTRODUCCIÓN El interés en el uso médico de los cannabinoides ligados ha aumentado considerablemente en los últimos años. Dos receptores de cannabinoides, CB1 y CB2, se han estudiado ampliamente para aclarar su participación en varias situaciones fisiopatológicas en la que los cannabinoides ligados podrían ser agentes terapéuticos potenciales, incluyendo el tratamiento del dolor. En efecto, los derivados del cannabis se han utilizado durante siglos como compuestos analgésico, y agonistas de cannabinoides se han reportado para ser eficaz en varios modelos animales de dolor agudo y crónico (Pertwee, 2001). Sin embargo, los efectos psicoactivos de estos agonistas podrían representar una seria limitación para su uso clínico. Los receptores CB1, ubicados principalmente en el sistema nervioso central (Tsou et al., 1998) Curiosamente, la activación de los receptores CB1 expresados en los nociceptores periféricos, pero no en el SNC atenúa el dolor neuropático en roedores (agar-Wal et al., 2007). La identificación de los receptores CB2 en las células gliales (Zhangetal., 2003;. Beltramoetal, 2006) ha abierto nuevas aproximaciones terapéuticas para estos receptores ligados. CB2 ha sido también propuesto para estar presentes en las neuronas (Van Sickle et al, 2005.). En la médula espinal, la expresión del receptor CB2 se indujo durante el dolor neuropático producido por lesión del nervio periférico en paralelo con la expresión simultánea de microglia activada (Zhang et al., 2003). La microglia parece estar implicado en el desarrollo del dolor neuropático a través de la liberación de varias citocinas, que son conocidos para producir sensibilización de las neuronas en la espina dorsal (De Leoand Yezierski, 2001;. Clarketal, 2007). Los CB2 agonistas inducen efectos analgésicos en modelos de dolor neuropático (Ibrahimetal., 2003). 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org MATERIALES Y MÉTODOS ANIMALES EN CONDICIONES EXPERIMENTALES. Los animales fueron alojados en grupos de tres a cinco y tuvieron acceso a agua y a los alimentos. Las condiciones de vivienda se mantuvieron a 21° C y una humedad relativa del 55 al 10% en un ciclo de luz / oscuridad controlado (luz encendida 08 a.m.-8:00 PM). Se llevaron a cabo todos los procedimientos y la cría de animales de experimentación de acuerdo con las normas éticas estándar (Comunidad Europea orientaciones sobre el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 86/609/CEE) y aprobado por el comité de ética local (Ético de Animales Experimentales Comité ‘ Instituto Municipal de Asistencia Sanitaria / Universidad Pompeu Fabra, Bezirksregierung Ko ¨ ln). Todos los experimentos se realizaron bajo condiciones ciegas. Con ratones de 3 meses de edad y un peso de 23-29 g, fueron utilizados. CONSTRUCTOS DE PLÁSMIDO Y GENERACIÓN DE RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBRE EXPRESAN CB2 La lectura abierta de los receptores CB2 murinos se aislaron mediante la amplificación de PCR de ARNm del cerebro de los ratones, usando cebadores que crean un sitio de enzima de restricción XhoI adyacente a la translación inicial y final de los sitios. El vector de expresión MoPrP.Xho (Watkins et al., 2003) se utilizó para la producción de ratones transgénicos. Este vector contiene el promotor murino de PrP, exón 1, intrón 1, el exón 2, y 3 secuencias no trasladadas. El receptor CB2 ORF se clonó en el exón 2 de MoPrP.Xho (Watkins et al., 2003). El transgén de PrP-CB2 se escindió del vector de plásmido con la endonucleasa de restricción NotI que conduce a fragmentos de ADN de 12 kb. Fundadores transgénicos se cruzaron con los ratones CD-1 durante siete generaciones. La presencia del transgen fue determinada por PCR usando cebadores específicos de nuevo exón 2 de la PrP (5-CCAGC-CTCCACCACCATGTGGC) y del receptor CB2 (5-AGCCACCGTTG-GAGCCGTTG). ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL ARNM DE CB2 POR PCR EN TIEMPO REAL. Los ratones fueron asesinados por dislocación cervical. Secciones del cerebro y cervical y torácica de la médula espinal se retiraron rápidamente, se colocaron en un lugar fresco/congelado y almacenado inmediatamente a -80 ° C hasta su uso. Las secciones del cerebro se redujeron a 500 um en diferentes niveles que contienen las regiones de interés: tálamo y materia gris periacueductal (PAG). Estas secciones se obtuvieron de acuerdo con Paxinos y Franklin (2001), montadas en portaobjetos, y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Secciones fueron disecadas siguiendo el método descrito por Palkovits (1983). Después de la digestión con DNasa, se realizó la transcripción inversa siguiendo las instrucciones del fabricante de Epicentro Technologies Corporation. PCR cuantitativa se realizó en tres repeticiones utilizando un Rotorgene 3000 Tiempo real termociclador (Corbett Research) y SYBR Green (Invitrogen) como un ADN específico fluorescente de doble cadena (Gutiérrez-Ada’netal., 2004). Los cebadores para la cuantificación transgénica fueron los mismos 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org como se describieron anteriormente. Los cebadores para la cuantificación de la expresión de CB2 endógena fueron 5′-TCTGGAAAGCC-CACCGGCATGTAG y 5′-CAAGGCACAGCATGGAACAGAAGG. El método comparativo CT se utiliza para la cuantificación de los niveles de expresión (Gutiérrez-Ada’n et al., 2004). Un ADNc de GADPH se utilizó como control de la formalización para asegurar los niveles de GADPH constantes en todas las muestras independiente-mente de las condiciones experimentales. GENERACIÓN DE LA MÉDULA ÓSEA DE RATONES QUIMÉRICOS. Las células de médula ósea (BM) se cosecharon por lavado de tibias y fémures de 6 – a 8-semanas de edad CB2 + / + o CB2-/ – ratones donantes masculinos con PBS. Los animales recibieron por vía intraperitoneal 150 mg / kg de amoxicilina y 15 mg / kg clavulánico en un volumen de 0,1 ml/10 g durante 10 d a partir del día de la transferencia. Después de 8 semanas de injerto, la eficiencia de la reconstitución se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de linfocitos de sangre periférica (PBL). A todos los ratones se les extrajo sangre de la vena de la cola y los PBL se analizaron mediante citometría de flujo (FACS Canto de flujo de Cy-Tometer; BD Biosciences; software de análisis de FlowJo; árbol estrella) con anticuerpos monoclonales contra CD45.1 y CD45.2 (BD Biosciences) para determinar el grado de quimerismo. Sólo los ratones BM-quiméricos que mostraron> 93% de eficiencia de la reconstitución con células de donante fueron elegidos para los experimentos. CB2 + / + ratones reconstituidos con CB2 + / + BM se denominan como quimera-WT, y CB2 + / + y a los animales reconstruidos con CB2-/ – BM se conocen como quimera-CB2. PREPARACIÓN DE LA MICROGLIA. Los cerebros y las médulas espinales fueron retirados de los ratones perfundidos, y una sola célula de suspensiones fue generado y filtrada a través de un filtro de células de 100 um. Gradientes de Percoll de 30/37/70% se llevaron a cabo para el fraccionamiento de las células a 1000 x g durante 30 min, y las células mononucleares de cerebro se recogieron de la interfaz. EXPERIMENTOS CONDUCTUALES. Los estímulos mecánicos (modelo de estimulación von Frey) se utilizaron como medidas del resultado de dolor neuropático. En la prueba plantar, la pata media con latencias de abstinencia para las patas traseras laterales y contralaterales se determinaron a partir de la media de tres ensayos separados, tomada en intervalos de 5 min para prevenir la sensibilización Térmica y alteraciones del comportamiento usando un aparato disponible comercialmente (Ugo Basile Biológica Aparato de Investigación) (Har-greavesetal., 1988). En una primera secuencia experimental, CB2-/ – fueron utilizados (16 machos más 16 hembras) y CB2 + / + (16 machos más 15 hembras). En el segundo estudio, se utilizaron ratones transgénicos que sobre expresan los receptores CB2 (12 machos más 12 hembras) y CB2 + / + (12 hombres, 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org además de 12 hembras). Por último, CB2-/ – fueron evaluados (10 machos), CB2 + / + (10 machos), quimera-CB2 (12 machos), y la quimera-WT (10 hembras) ratones. Los ratones se habituaron primero durante 1 hora para cada prueba experimental diferente una vez al día durante 4 d. Después del periodo de habituación, se establecieron las respuestas de línea de base durante 2 días consecutivos para cada paradigma en la siguiente secuencia: modelo de von Frey, prueba plantar (30 minutos más tarde), y las pruebas en frío (15 minutos más tarde). Todas las pruebas de comportamiento se realizaron en el mismo grupo de animales. Un día después de las mediciones iniciales de la lesión del nervio ciático fue inducida. La ligadura parcial del nervio ciático a nivel de la mitad del muslo justo próximo a la trifurcación se formó con una ligadura del muslo utilizando un hilo de seda 9-0 para inducir el dolor neuropático, como se ha descrito previamente (Malmberg y Basbaum, 1998). Los ratones CB2 -/- y CB2 +/+ se ensayaron en cada paradigma en los días 3, 6, 8, 10, y 15 después de la intervención quirúrgica utilizando la misma secuencia que para las respuestas de línea de base. Los datos se compararon cada día experimental utilizando un ANOVA de dos vías (cirugía y el genotipo como entre-grupo de factores) seguido por ANOVA de una vía correspondiente cuando sea apropiado. INMUNOHISTOQUÍMICA Al final del experimento de comportamiento, de tres a cinco ratones por grupo fueron profundamente anestesiados con ketamina / xilazina (50/10 mg / kg) y después intracardialmente perfusos con fosfato heparinizada-phatebuffer (PB), seguido de 4% de paraformaldehído lumbar. La región de la médula espinal se ha retirado, se fijaron posteriormente en paraformaldehído a lo 4% durante 2 h, y crio preservados en solución de sacarosa al 15% a 4 º C. Se seleccionó la sección de L2 a L6-S1 de la médula espinal y luego embebido en OCT, seleccionado en 25 um secciones sobre acryostat, y montado seis secciones por ratones y dos ratones por diapositiva en diapositivas heladas recubiertas. Los portaobjetos se incubaron en anticuerpos policlonales Iba1 (1:200; Wako Chemicals) para la tinción de la microglia o anticuerpo policlonal GFAP (1:1000; Dako) para la tinción de astrocitos a 4 ° C durante la noche. Los ensayos inmunohistoquímicos fueron seguidos por incubación en el anticuerpo de conejo anti-CY3 secundario (1:500; Jackson Immunoresearch) para Iba1 o GFAP durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con PB 0,1 M, los portaobjetos se montaron con Mowiol. TINCIÓN CB2. Las médulas espinales se eliminaron y se congelaron en hielo seco y sin perfusión anterior. Ellos se seccionaron en un criostato a 20 um de espesor y se montaron en portaobjetos de vidrio. Los tejidos se fijaron durante 30 min en formaldehído al 4% disuelto en PBS 0,1 M, pH 7,3. A continuación, los portaobjetos se incubaron durante 15 min en 0,3% de H2O2, durante 60 min en 0,5% Triton X-100 y durante 2 h en 3% de BSA. Los portaobjetos se lavaron en PBS por lo menos dos veces durante 5 min entre cada fase de incubación. Las secciones se marcaron a 4 º C durante 20 h 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org utilizando un anticuerpo policlonal de conejo CB2 primario (1:1000; Abcam), para la tinción de la microglia con Iba1 anticuerpo primario policlonal (1:200; Wako Chemicals), para la tinción con anticuerpo policlonal de astrocitos GFAP primaria anticuerpos (1:1000; Dako), y para la tinción de las neuronas con fluoresceína conjugada Neu-N (1:500; Millipore Bioscience Investigación Reactivos) anticuerpo primario. La doble tinción para los receptores CB2 y para la microglia o astrocitos utilizando un anticuerpo secundario de la misma anfitrión fue formado por utilizando el método de To’th y Mezey (2007). Brevemente, después de que los receptores CB2, el proceso fue seguido mediante el uso de un sistema de amplificación de señal de tiramida. Los portaobjetos se incubaron durante 30 min en estreptavidina-HRP (1:200) dissolvedin TNB (Tris 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, reactivo de bloqueo 0,5%). Las secciones se lavaron tres veces durante 5 min y se incubaron en fluoróforo de tiramida (1:100 en reactivo de amplificación) por 6-9min. Los portaobjetos se lavaron en PBS (tres veces durante 5 min), y se fijaron de nuevo durante 15 minutos en 4% de paraformaldehído. Después de lavar en PBS (3 veces en 10min), el ensayo fue seguido por la cocción de los portaobjetos en el horno de microondas en 10 mM en citrato, pH 6, durante 5 min, después del enfriamiento (6090min), que se lavaron de nuevo. A continuación, los portaobjetos se incubaron en 0,5% de Triton X100 y en PBS que contenía 1% de albúmina de suero bovino y 10% de suero de cabra durante 60 min. Las secciones se marcaron a 4 º C durante 20 h utilizando policlonal de conejo anti-GFAP anticuerpo primario (1:1000; Dako) o de conejo policlonal Iba1 anticuerpo primario (1:200; Wako Chemicals). El ensayo fue seguido por una incubación en conjugado con Cy3 de burro anti-conejo (1:250; Jackson Immunoresearch) anticuerpo secundario. Los ensayos fueron seguidos por incubación con burro conjugado con FITC anti-conejo (1:250; Jackson Immunoresearch) anti-cuerpo secundario para la microglia o astrocitos para a temperatura ambiente durante 2 h. Las secciones se lavaron en agua y se montaron en Vectashield medio de montaje (VectorLaboratories, H-1200). RESULTADOS LAS MANIFESTACIONES DE DOLOR NEUROPÁTICO SE HAN MEJORADO EN LOS CB2-‐/ – RATONES La hiperalgesia a un estímulo nocivo térmico (ensayo plantar), y la alodinia al frío (prueba de fríoplaca) y los estímulos mecánicos (modelo de estimulación de von Frey) se utilizaron primero como medidas de resultado del comportamiento del dolor neuropático. Respuestas basales de ratones CB2-/ – y CB2 + / + fueron similares en los tres modelos nociceptivos, y el simulacro de operación no produjo ninguna modificación de estos umbrales nociceptivos en ambos genotipos. La lesión del nervio ciático mejoró de manera similar a la hiperalgesia térmica y alodinia inducida mecánica y térmica en la pata ipsilateral en ambos CB2-/ – CB2+ / +. Lo más sorprendente, sin embargo, el mismo grado de hiperalgesia térmica y alodinia mecánica también desarrollado en la pata contralateral de los ratones CB2-/ – , revelando una imagen de espejo del dolor. Esta imagen de espejo no se observó en CB2 + / +. Un resultado similar se obtuvo en ambos sexos de CB2-/ – y CB2 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org + / + en las tres medidas de comportamiento nociceptivo. (Ibrahim et al, 2006) De acuerdo con los informes anteriores, se observó una tendencia a mejorar la respuesta nociceptiva basada en la prueba plantar en CB2-/ -, aunque un efecto significativo (p <0,05) sólo se reveló en el análisis de datos desde ambos géneros juntos. LAS CÉLULAS MICROGLIALES SE INVOLUCRAN EN LAS MEJORADAS MANIFESTACIONES DE DOLOR NEUROPÁTICO EN CB2-‐/ – RATONES Hemos evaluado respuestas gliales en el asta dorsal de la médula espinal lumbar después de la lesión del nervio ciático o simulacro de operación en CB2-/ – y CB2 + / + para determinar su posible participación en el aumento de la sensibilidad al dolor neuropático de los animales CB2-/ -. La lesión del nervio ciático induce una potenciación similar de células micro gliales totales en el cuerno dorsal y ventral ipsilateral de la médula espinal en CB2-/ – y CB2+ / +. Curiosamente, se observó una reacción microglial similar en los cuernos ipsilateral y contralateral en CB2-/ -, pero no en CB2 + / +. Del mismo modo, CB2-/ una activación de micro gliales en los cuernos ipsilaterales se observaron y CB2 + / +, y una estimulación en los cuernos contralaterales sólo en CB2 + / +. De acuerdo con estos hallazgos, un aumento significativo de la tinción para Iba1, un marcador específico de células micro gliales, se observó en el lado ipsilateral después de la lesión del nervio en CB2 + / + y en el lado ipsilateral y contralateral en CB2-/-. Este aumento se debió a un aumento en el número de células de la microglia, que muestran cambios morfológicos específicos. Por lo tanto, no se observaron descansos típicos con un cuerpo de células pequeñas y ramificaciones delgadas y grandes en ratones con operación simulada. Después de la lesión del nervio, estos microglia descansando estaban presentes sólo en el lado contralateral de CB2 + / +. En contraste, el lado ipsilateral de CB2 + / + y tanto el lado ipsilateral y contralateral de CB2-/ – ratones contenía microglia con un fenotipo activado. Estas células tienen cuerpos celulares más grandes, así como ramificaciones más gruesas y más cortas. El mismo resultado también se encontró en las respuestas astrocíticas, con una activación similar en los cuernos ipsilaterales en CB2-/ – y CB2 + / + ratones, y una reacción selectiva en los cuernos contralateral sólo en CB2-/ -. Por lo tanto, notablemente, el perfil de activación de las células gliales igualó exactamente el patrón de hipersensibilidad nociceptivo. Debido a la activación glial y respuestas funcionales son inhibidas por la estimulación del receptor CB2 (Ehrhart et al, 2005; Romero-Sandoval y Eisenach, 2007), estos resultados sugieren que la supresión de los receptores CB2 tuvieron un efecto de desinhibición en la respuesta glial después de lesión del nervio ciático, lo que conduce a la respuesta al dolor exacerbado en estos animales, que se revelaron sobre todo en el lado contralateral. EL DOLOR NEUROPÁTICO ES ATENUADO EN RATONES TRANSGÉNICOS QUE SOBRE EXPRESAN LOS RECEPTORES DE CANNABINOIDES CB2 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org Estos ratones transgénicos se generaron mediante el uso de un promotor de PrP murina que se expresa específicamente en las neuronas y células gliales. Se obtuvieron cinco líneas transgénicas diferentes. Tres líneas transgénicas fueron seleccionados por la evaluación de los receptores CB2 transgénicos en diferentes regiones del cerebro. Una de estas líneas con alta expresión del receptor CB2 transgénico en la médula espinal fue seleccionado para los presentes experimentos. La diferente expresión observada en la médula espinal, tálamo y la materia gris periacueductal era atribuible al promotor PrP murino utilizado en la construcción del transgen. Para los tipos de células que expresan receptores CB2, se realizó un análisis de inmunofluorescencia de secciones de la médula espinal de ratones transgénicos que sobre expresan los receptores CB2. Se encontró que los receptores CB2 localizados con el marcador de microglia Iba1 y con el marcador neuronal Neu-N, pero no con el marcador GFAP de astrocitos. De acuerdo con el experimento anterior, las respuestas iniciales de ratones transgénicos que sobre expresan los receptores CB2 y CB2 + / + fueron similares en los tres modelos nociceptivos y los del simulacro de operación no produjeron ninguna modificación en los umbrales nociceptivos. La hiperalgesia térmica y mecánica inducida por la lesión del nervio ciático en la pata ipsilateral en CB2 + / + fueron fuertemente atenuadas en los ratones transgénicos que sobre expresan los receptores CB2. El nervio ciático lesionado robustamente mejoró la respuesta de la microglia en el cuerno ipsilateral de los CB2 + / +, indicados por un aumento significativo de la tinción de Iba1. La tinción Iba1 mejorada fue atributada de un mayor número de microglias, con un fenotipo activado. Esta respuesta fue significativamente atenuada en ratones transgénicos que sobreexpresan los receptores CB2. La tinción microglial no se modificó significativamente en el cuerno contralateral en estos grupos de ratones. La tinción de astrocíticos también fue significativamente mayor en el cuerno ipsilateral de la médula espinal en CB2 + / +, pero no en animales transgénicos más de los receptores expressingCB2 ni en el lado contralateral en cualquier grupo experimental. LESIÓN DEL NERVIO CIÁTICO EN CB2 + / + CB2-‐/ – DE LA MÉDULA ÓSEA DE RATONES QUIMÉRICOS PRODUCE EL DESARROLLO SIMILAR DE DOLOR NEUROPÁTICO COMO EN LOS RATONES CB2-‐/ -‐ Finalmente hemos evaluado in vivo la participación del sistema inmune en las respuestas observadas en los ratones CB2-/ -. Las células BM de los ratones CB2-/ – donantes que expresan los antígenos de superficie CD45.2 fueron inyectados por vía intravenosa en los receptores congénicos irradiados letalmente con CD45.1. Después de 8 semanas de injerto, la reconstitución eficaz del receptor de los ratones quiméricos se verificó por análisis de linfocitos de sangre periférica. 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org La lesión del nervio ciático en ratones BM-quimérico produjo una alodinia mecánica similar y la hiperalgesia térmica en la pata ipsilateral como se observó en CB2 + / + y CB2-/ – los animales. La activación de las células microgliales inducidas por la lesión del nervio ciático se evaluó mediante el uso de inmunofluorescencia de Iba1. Una mejora similar se observó en el cuerno ipsilateral y contralateral de la médula espinal en ratones quiméricos. DISCUSIÓN Los presentes resultados revelan un papel crucial de los receptores de cannabinoides CB2 en el control del desarrollo del dolor neuropático a través de un mecanismo inmunológico ligado a la activación glial. La hiperalgesia y alodinia inducida por la lesión del nervio ciático se mejoraron en los ratones CB2 – / -. Estas manifestaciones conductuales de dolor neuropático se ajustaban a los cambios inducidos en la microglia y la activación de astrocitos. Se observó una manifestación reducida de dolor neuropático después de la lesión del nervio en ratones transgénicos que sobreexpresan receptores CB2 bajo el control de un promotor de PrP en el cerebro y la médula espinal. La expresión de los receptores CB2 transgénicos fueron encontradas en las células microgliales y las neuronas, pero ausente en los astrocitos, de acuerdo con la literatura (Van Sickle et al, 2005;.. Romero-Sandoval et al, 2008). La disminución de la hiperalgesia, alodinia, y la activación glial espinal en estos ratones transgénicos podrían estar relacionados con la fuerte sobreexpresión de los receptores CB2 en el nivel de la médula espinal. Sin embargo, estos ratones también mostraron un aumento de la expresión de los receptores CB2 en estructuras supra espinales implicadas en la transmisión del dolor, tales como el tálamo y la materia gris periacueductal, que también podría participar en las manifestaciones disminución de dolor neuropático. El fenotipo opuesto revelado en los ratones transgénicos que sobreexpresan los receptores CB2 y CB2 – / – subraya la relevancia de estos receptores en la mediación de las manifestaciones de dolor neuropático. Estas respuestas iniciales similares se obtuvieron en las diferentes líneas de ratones modificados genéticamente que carecen o que sobreexpresan los receptores CB2, lo que indica la ausencia de cambios nociceptivas en condiciones fisiológicas en estos animales. Estos resultados sugieren que la activación de los receptores CB2 podrían atenuar las manifestaciones de dolor neuropático en dosis más bajas que las requeridas para inducir antinocicepción. Las manifestaciones alteradas de dolor neuropático observados en los ratones CB2-/- y los ratones transgénicos que sobreexpresan receptores CB2 sugieren que los endocannabinoides juegan un papel importante en el control del dolor en estas condiciones patológicas. En apoyo de esta hipótesis, una mejora en los niveles de los dos principales endocannabinoides, anandamida y 2araquidonoil-glicerol, se reveló después de la lesión del nervio ciático en la médula espinal y varias áreas del cerebro implicadas en el dolor, tales como la materia gris periacueductal y la médula rostral ventral (Petrosino et al., 2007). 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org Los niveles de endocannabinoides también se han mejorado después de la lesión del nervio ciático en la raíz dorsal (Mitrirattanakul et al., 2006) y la sección del nervio ciático próxima a la lesión (Agarwal et al., 2007). Estos aumentos de los niveles de endocannabinoides están probablemente relacionados con una mayor biosíntesis o un catabolismo disminuido y el transporte, porque los endocannabinoides se producen en la demanda de almacenamiento sin ninguna sustancia (Di Marzo, 1998). Por lo tanto, los endocannabinoides podrían producir una activación tónica de los receptores CB2 después de la lesión del nervio ciático que limitarían la progresión y las manifestaciones de dolor neuropático. De acuerdo a esto, la hiperalgesia mecánica y térmica producida después de la lesión del nervio ciático se atenúa por la administración del Naraquidonoil-serotonina, un inhibidor de la hidrolasa de amida del ácido graso, la enzima responsable de la degradación de la anandamida, que apoyan aún más el papel de los endocannabinoides en el control del dolor neuropático. En la médula espinal, la expresión del receptor CB2 se asocia con la aparición de las células microgliales activadas después de dolor crónico producido por lesión del nervio periférico. Su activación se requiere para la inducción y el desarrollo de estados de dolor crónico. La activación de la microglia está involucrada en el desarrollo del dolor neuropático a través de la liberación de varias citosinas que se sabe que producen sensibilización neuronal en la médula espinal (DeLeo y Yezierski, 2001; Clark et al, 2007) e iniciar el proceso de neuroinflamatoria que lleva al desarrollo de dolor neuropático (Watkins et al., 2001). Los moduladores químicos que activan las células microgliales están bajo el control de los mediadores inmunes, así como neuromoduladores liberados por las neuronas cercanas, tales como las prostaglandinas (Tanga et al., 2006). IFN-_ (interferón-_) es otro mediador implicado en la activación de la microglia que puede inducir una regulación positiva de la expresión de ARNm de CB2 (Carlisle et al., 2002). El proceso de neuroinflamación completa que conduce a la progresión del dolor neuropático requiere la coactivación de ambos microglia y astrocitos (Colburn Et al., 1999). Curiosamente, la estimulación del receptor CB2 se ha informado para atenuar la activación microglial. Los receptores de CB2 se encuentran en las células microgliales que jugarían un papel crucial en la limitación de la difusión de este proceso neuroinflamatorio. Por lo tanto, la actividad de los receptores CB2 en células microgliales reduciría su activación durante el desarrollo del dolor neuropático. Una alteración de la respuesta inmune central después de la lesión del nervio podría ser responsable de las mejoradas manifestaciones del dolor neuropático en los ratones CB2-/-. Esta hipótesis se demostró mediante la replicación de las manifestaciones conductuales e histológicas mejoradas del dolor neuropático observadas en los ratones CB2 -/- en los ratones CB2+/+ irradiados trasplantados con células de médula ósea de CB2-/-. Estos ratones CB2- /- BM quiméricos mostraron mejoradas manifestaciones de dolor neuropático según lo revelado por la 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org alodinia, hiperalgesia, y los astrocitos y la activación de las células microgliales en el lado contralateral de la médula espinal después de la lesión del nervio ciático. Mediante la generación de ratones con médula ósea quiméricas, se presentan pruebas de que los monocitos recién contratados procedentes de la médula ósea de ratones CB2-deficientes participan en la reconstitución de la médula espinal después de microglia lesiones nerviosas periféricas. Recientemente, se ha demostrado que las células derivadas de médula ósea que son reclutados a la médula espinal están implicadas en el desarrollo del dolor neuropático. En particular, la expresión de CCR2 en cualquiera de microglia residentes o los macrófagos derivados de médula ósea puede ser suficiente para el desarrollo de alodinia mecánica en un modelo de dolor neuropático murino. Después de la lesión del nervio, gradientes formados por quimio quinas ligadas a 2 (CCL2) y CCL3 orquestan el reclutamiento y la activación de la microglia residente y derivados de los monocitos a través de señalización a través de sus respectivos receptores CCR2, CCR1, CCR5. La actividad del receptor de cannabinoides CB2 puede influir críticamente en la inducción de la expresión de CCR2 por los monocitos y por lo tanto inhibir su quimio taxis (Steffens et al., 2005). Por lo tanto, nuestros hallazgos demuestran un papel crucial de la respuesta inmune mediada por la microglia en el desarrollo de una mayor sensibilidad al dolor neuropático en los animales CB2-/-. Los ratones modificados genéticamente, ya sea mediante el aumento o la eliminación de genes específicos pueden estar limitados por el hecho de que este cambio genético puede estar afectando no sólo el gen, pero también otros componentes biológicos, tal vez participando en los efectos evaluados en estos modelos genéticos. Nuestros resultados revelan un papel crucial de los receptores CB2 en la modulación de la respuesta inmune del sistema nervioso durante el dolor neuropático. En contraste, la disrupción genética de los receptores CB1 no tuvieron consecuencias importantes en el desarrollo del dolor neuropático (Castan ~ e ‘et al., 2006) a pesar de la alta expresión de estos receptores en el SNC (Tsou et al., 1998). Solamente los receptores CB1 expresados en los nociceptores periféricos, pero no en el SNC parecen estar implicadas en las manifestaciones de dolor neuropático (Agarwal et al., 2007). La participación selectiva de los receptores CB2 y la baja expresión en las neuronas (Van Sickle et al., 2005) enfatizan aún más la relevancia de estos receptores en los mecanismos adaptativos centrales que conducen al dolor neuropático. Por lo tanto, los agonistas cannabinoides CB2 podrían representar un nuevo grupo de agentes farmacológicos para el tratamiento del dolor neuropático ya que carece de efectos secundarios psicoactivos. INFORMACIÓN MCCRID: ARKMCCR-00131 PUBMED ID: 19005077 PMCID: PMC3844839 Nombre Original: Crucial Role of CB2 Cannabinoid Receptor in the Regulation of Central Immune Responses during Neuropathic Pain 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org