Download Clase 16 Espectroscopias

Técnicas Espectroscópicas
•La espectroscopia estudia la interacción entre la radiación y la materia.
• Un espectro es una representación gráfica de la distribución de
intensidades de la radiación electromagnética emitida o absorbida por
la materia, en función de la longitud de onda de dicha radiación.
Que es la Luz?
 Es una radiación electromagnética
 Consta de un campo eléctrico y un campo
magnético los cuales oscilan en fase de manera
perpendicular uno al otro y perpendicular a la
dirección de propagación
 Se la clasifica de acuerdo a la frequencia de su
onda
 Exibe propiedades tanto de onda como de
partícula
2
¿Cómo interactúa la luz con la materia?
• La radiación EM transporta energía y momento los cuales pueden ser
transferidos a la materia con la que interactúa
• La energía que posee una molécula en un momento dado es la suma de varias
contribuciones:
E = Eelectrónica + Evibracional + E rotacional + Etranslacional
Eelectrónica = energy transitions of electrons (UV-vis)
Evibracional = atomical vibrations about the mean center of chemical bonds (IR)
E rotacional = tumbling motion of molecule (microwave)
Etranslacional = displacement of molecules due to normal thermal motions of matter
E=ch/λ
E=hν
Espectroscopía UV-VIS
ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO
GENERALIDADES:
basada en la medición de
transiciones vibracionales entre el
estado basal y el primer estado
vibracional
∆E = E2- E1 = hυ
la unidad utilizada comúnmente es el número de onda (cm-1), la cual es
proporcional a la frecuencia.
la región del espectro de infrarrojo comúnmente utilizada es la comprendida
entre 1000-4000 cm-1
son activas aquellas vibraciones que ocurren con cambio en el momento
dipolar de la molécula
Interaction of IR radiation with
matter
Assymmetric stretching
Twisting
Scissoring
11
Symmetric stretching
Wagging
Rotation
-CH2
v
i
b
r
a
t
i
o
n
s
las vibraciones características
de átomos unidos covalentemente
son: “stretching” y “bending”
la frecuencia de vibración varía de
manera inversamente proporcional a
la raíz cuadrada de la masa reducida
de los átomos que vibran por una
constante de fuerza
donde 1/µ = 1/MA + 1/MB
el número de modos normales
puede calcularse como
3N-6
ESPECTROSCOPÍA DE IR APLICADA AL ESTUDIO DE PROTEÍNAS
*
el espectro de IR de proteínas
presenta un número de bandas
características denominadas Amida
que son debidas a la vibración de los
átomos involucrados en el enlace
peptídico
*
la más utilizada para el estudio de la
estructura de proteínas es la Amida I
(C=O stretching)
0.30
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
0.25
t(0)
t(3 hs)
Amida I (')
Absorbance
0.20
0.15
Amida II
(y cadenas laterales)
0.10
0.05
Amida II'
0.00
1700
1650
1600
1550
Wavenumber (cm-1)
1500
1450
El problema del solvente
condiciones fisiológicas: solución acuosa
agua tiene una fuerte banda de absorción en el infrarrojo que coincide
con la banda Amida I
en H2O: films muy finos, para no saturar el detector (problemas para
sustraer el buffer)
en D2O: la banda del solvente se corre a menor frecuencia. La Amida I´ se
corre pocos cm-1, y la Amida II´lo hace unos 100 cm-1, superponiéndose con el
DOH
Otros inconvenientes:
vapor atmosférico
contraiones u otros contaminantes que absorban en el infrarrojo, distorsionando
los espectros (trifluoroacético)
Asignación de bandas (cm-1)
Conformación
hélice alfa
cadena beta
antiparalela
en solución
de H2O
1653
1632
en solución de
D2O
1650
1632
1690
1630
1675
1632
1645
1656
1648
1643
cadena beta
paralela
desordenadas
de acuerdo a los distintos
arreglos de puente hidrógeno
(distintas estructuras secundarias)
aparecerán bandas en distintas
posiciones dentro de la Amida I
BSA
α-lactalbumina
Absorbance
Absorbance
Absorbancia
B-FABP
1700
1690 1680 1670 1660 1650 1640 1630 1620 1610 1600
ν (cm-1)
1700
1690
1680
1670
1660
1650
ν (cm-1)
1640
1630
1620
1610
1600
1690
1680
1670
1660
1650
ν (cm )
-1
1640
1630
1620
1610
1600
* el área de las distintas bandas corresponde de manera bastante directa al
porcentaje de las distintas estructuras secundarias presentes en la proteína
* las distintas bandas componentes de la Amida I aparecen superpuestas, es
necesario aumentar la resolución para poder resolverlas como bandas separadas:
Autodeconvolución:
el espectro observado sería la convolución de dos funciones, la del espectro real
(E(υ)) por un factor (G(υ)) debido a distorsión, filtro, función forma de línea)
M(υ) = G(υ) * E(υ)
* el proceso de deconvolución aumenta la resolución, me muestra como separadas
dos bandas que antes aparecían juntas
* ventajas: no modifica el área original de las bandas
* desventajas: amplifica el ruido, problemas con el vapor atmosférico
Deconvolución del espectro de FABP: aplicando un
factor k=2, bandas que originalmente son de 20 cm-1
aparecen con un ancho de 10 cm-1
Derivación:
Desventajas:
* rápida degradación de la relación
señal/ruido a medida que aumenta el
orden de derivación
* No mantiene el área de las bandas
componentes.
Espectros Diferencia:
* Utilizado principalmente para
remover el solvente
* Muy útil para estudiar cambios
sutiles en la estructura de la proteína
Análisis cuantitativo del espectro de proteínas:
Autodeconvolución, derivación y espectros diferencia
número y posición de las bandas que componen el espectro de la proteína
Espectro artificial: variando la proporción de los distintos componentes hasta
lograr el mejor ajuste al espectro original
Cambios conformacionales (estructura secundaria y terciaria)
por efecto de:
- fuerza iónica del medio
- interacción con membrana
- interacción con ligando
- distintas condiciones desnaturalizantes (pH, urea, temperatura, etc)
Efecto de la fuerza iónica del
medio sobre el espectro de LBABP (pérdida de ligando)
Efecto del pH sobre el
espectro de α-lactalbumina
0.16
0.20
B-FABP (alta fuerza iónica)
B-FABP (baja fuerza iónica)
α-lactalbumina pH 7
α-lactalbumina pH 2
0.14
0.12
Absorbance
Absorbance
0.15
0.10
0.05
0.10
0.08
0.06
0.04
0.00
0.02
-0.05
1700
0.00
1680
1660
1640
-1
ν (cm )
1620
1600
1800
1750
1700
1650
-1
ν (cm )
1600
1550
1500
Efecto de la interacción con membranas sobre la velocidad
de intercambio de protones amida
(pérdida de la estructura terciaria)
Los protones amida del enlace peptídico pueden intercambiarse con protones
del solvente (deuterones en D2O).
Si estos protones están formando puentes hidrógeno, sólo intercambiarán en
la fracción de tiempo en que estos estén disociados.
La péridda de estructura terciaria aumenta la velocidad con la que estos se
intercambian.
Intercambio isotópico: frecuencia de vibración depende de la masa de los
átomos que vibran
0.30
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
0.25
t(0)
t(3 hs)
Amida I (')
Absorbance
0.20
0.15
Amida II
(y cadenas laterales)
0.10
0.05
Amida II'
0.00
1700
1650
1600
1550
Wavenumber (cm-1)
1500
1450
Amida I: se corre unos pocos cm-1.
Amida II: se corre unos 100 cm-1. Está muy
afectada por la banda de DOH (1400-1500 cm-1).
Se superpone con cadenas laterales de aspártico
y glutámico.
Cambios en la cinética de deuteración
debida a distintos factores (interacción con
membranas, interacción con ligandos,
condiciones desnaturalizantes) implican
cambios en la estructura terciaria de la
proteína.
0.30
Espectro de absorción al infrarrojo de B-FABP
t(0)
t(3 hs)
Amida I (')
0.20
Absorbance
Métodos para determinar la velocidad de deuteración
• miden corrimiento de la amida I.
• miden la relación banda Amida I/AmidaII.
0.25
0.15
Amida II
(y cadenas laterales)
0.10
0.05
Amida II'
0.00
1700
1650
1600
1550
Wavenumber (cm-1)
0.025
0.015
5 min
15 min
30 min
60 min
90 min
180 min
300 min
360 min
0.010
0.005
Cambios en la Amida I
por Deuteración
0.000
1700 1690 1680 1670 1660 1650 1640 1630 1620 1610 1600
ν (cm-1)
5
B-FABP
B-FABP + POPG
-1
4
diferencia a 1620 cm
Absorbance
0.020
3
2
1
0
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900 100011001200130014001500
Tiempo (min)
1700 1690 1680 1670 1660 1650 1640 1630 1620 1610 1600
ν (cm-1)
1500
1450
ESPECTROSCOPÍA DE IR APLICADA
AL ESTUDIO DE LÍPIDOS
* Un espectro de lípidos puede separarse:
- bandas debidas a los grupos polares
o 1700-1750 cm-1: C=O stretching (es la más intensa)
o 1170 cm-1: C-O stretching (se puede acoplar con C-C stretching)
o 1250 y 1085 cm-1: P=O stretching
o 900-800 cm-1: P-O stretching
o además, dependiendo si el lípido es una colina, una etanolamina, etc, aparecerán
distintas bandas.
- bandas debidas a las cadenas hidrocarbonadas:
o 2920 y 2850 cm-1: CH2 stretching (banda muy sensible a la relación trans-gauche)
o 2956 y 2870 cm-1: CH3 stretching (sensible a esta relación)
o 3010 cm-1 =C- stretch: (insaturados)
o 1530-1350 cm-1: bending metilos y metilenos: el número y la posicion de las bandas
depende de la conformación
o 1380-1190 cm-1: brinda información del largo de la cadena hidrocarbonada. En
fosfolípidos se superpone con la banda del grupo fosfato (1220 cm-1)
El espectro del H2O se superpone con algunas bandas del lípido, pero todas las
regiones se hacen accesibles comparando los espectros en H2O con los espectros en
D2O. El D2O no afecta las posiciones de las bandas del lípido (no hay deuteración)
La utilización de lípidos completa o parcialmente deuterados permite el estudio de
mezclas de lípidos (las bandas aparecerán a distintas posiciones debido a diferencias
en la masa reducida)
Estudios de transiciones de fases: los cambios observados en la figura 2 son
debidos a un aumento de conformaciones gauche
Fig 1
Fig 2
How can light be manipulated?
 By using polarisers the light can be reduced to propogate in
planes and controlled states
Light source
Polariser
Target
23
 Polarisers commonly used in sun glasses
p-polarised
s-polarised
24
Reflection
Fresnel equations:
reflexion coefficient
 Tells us the amount of reflected and refracted light
S-polarised:
r = E0 r / E0i
r⊥ =
E0 r / E0i =
[ ni cos(θ i ) − nt cos(θ t )] / [ ni cos(θ i ) + nt cos(θ t )]
S-polarised: electric field of the light perpendicular to the plane of the diagram
P-polarised:
r|| =
E0 r / E0i =
[ ni cos(θt ) − nt cos(θi )] / [ ni cos(θt ) + nt cos(θi )]
P-polarised: electric field of incident light is polarised in the plane of the diagram
Reflectance
R = r2
25
• Reflectividad calculada por las ecuaciones de Fresnel
Interfase Aire-vidrio
Interfase Aire-agua
1.0
θB = 53.57o
Reflectivity
0.8
0.6
0.4
Rs
0.2
0.0
0
Rp
20
40
60
80
Angle of incident light / degree
El efecto ”imagen”
Positive point charge near a surface:
pulls the free electrons toward the surface
The electric field is perpendicular to the
surface at all points, and ends right at
the excess charges at the surface.
Note that can not be any electric field within
the interior of a conductor!
27
Net result is a small buildup of negative
charge at the surface of the metal
Outside of the surface, the electric field
produced by this redistribution of charges is
identical to what would be produced by
a single negative charge equal in magnitude
and located a distance “R” beneath the surface
of the metal. This fictitious charge is called
the “image” charge.
El efecto ”imagen”
Dipole parallel to the surface plane
µ0
Real dipole
Image dipole
µimage
Right at the interface, the electric field parallel to the surface is zero everywhere! 
The image dipole cancels the “real” dipole
28
El efecto ”imagen”
Dipole perpendicular to the surface plane
µ0
Dipolo Real
µeffective=2µ0
µimagen
Dipolo
imágen
Image dipole is oriented in the same direction as the original dipole  Total
effective dipole moment is twice what would otherwise be expected – the
presence of the metal enhances the molecular dipole
29
Regla de Seleccion superficial
Sólo los modos vibracionales que poseen un dipolo de transicion
perpendicular a la superficie puede ser observado sobre superficies
metálicas
• Esto no se aplica a moleculas adsorbidas a materiales aislantes o
semiconductores
• Solo se aplica a moleculas adsorbidas directamente a la interfase
30
Reflectividad del haz de luz IR (2900cm-1) en la interfase sólido-aire
φ = 80o
interfase Air-oro
1.5
p (xy)
0
20
40
0.6
p60
<E(z=0)>2/<E0>2
0.0035
0.0030
0.0025
0.0020
0.0015
0.0010
0.0005
0.0000
<E(xy)>2/<E0>2
<E(z=0)>2/<E0>2
2.0
80
Angle / degree
1.0
0.5
0.0
20
40
60
p(z)-
0.5
0.3
0.2
p(xy)-
0.1
s0
80
p-
0.4
0.0
S0
φ = 60o
Si-air interface
0.7
20
40
60
80
Angle of incident light / degree
Angle of incident light / degree
Material
φmax / degree
<E(z=0)>2/<E0>2
Au
80.4
1.83
Pt
73.0
1.56
Ge
59.4
0.69
Si
60.2
0.61
ZnSe
58.5
0.48
Reflectividad del haz de luz en la interfase agua-aire
Air-water interface
<E(z=0)>2/<E0>2
0,5
p-
0,4
p(z)0,3
0,2
s-
p(xy)-
0,1
0,0
0
20
40
60
80
Angle of incident light / degree
PM-IRRAS
(Espectroscopia de absorción-reflexión infrarroja con modulación de la polarización)
Modulación de la intensidad a la
frecuencia ωi introducido por el
interferómetro:
I + = C+ [( R p + Rs ) + J 0 (Φ 0 )( R p − Rs )]I 0 (ωi )
Modulación de la polarización a ωm
inducido por el modulador fotoelástico.
I − = C− [ J 2 (Φ 0 )( R p − Rs )]I 0 (ωi ) cos(2ωmt )
S =C
J 2 (Φ 0 )( R p − Rs )
( R p + Rs ) + J 0 (Φ 0 )( R p − Rs )
∆S =
S( d ) − S(0)
S(0)
0.012
νsCO
1743
νasPO-2
1253
νb(NH3+)
1540
δCH2
1460
0.008
0.004
νsPO-2
1084
Monocapas de PE-PEGs:
análisis por PM-IRRAS
0.000
-0.004
0.04
5mN/m
15mN/m
35mN/m
dpPE
νasPO-2
350
PE-PEG
s(COC)
ν
1273
0.02
(CC) −
ν
νas(COC)
as(COC) + rs(CH2)
ν
∆S/SO
0.00
-0.02
0.015
as(COC)
ν
5mN/m
15mN/m
35mN/m
PE-PEG1000
0.010
νasPO-2
1280
νasC-O-C
1126
1273
0.005
0.000
-0.005
5mN/m
15mN/m
30mN/m
1273
-0.010
0.016
0.012
PE-PEG
5000
νasPO-2
1265
νsC-O-C
1095
0.008
0.004
0.000
-0.004
5mN/m
15mN/m
32 mN/m
1800
1280
1600
1400
1200
Número de Onda (cm-1)
1000
1100
1000
Resonancia Magnética Nuclear
De Mayor a ……
LES HOUCHES, France,
1000 MHz, 23.5 T
Pacific
Pacific
Northwest
Northwest
National
National
Laboratory,
Laboratory, Yokohama Research Institute
Washington
Washington
800
800
MHz,
MHz,
18,8
18,8
T T
900 MHz, 18,8 T
…… a menor!
Átomos plausibles de ser estudiados por RMN
Núcleos con
momentos
cuadrupolar
I
Nucleídos
0
12C
16O
½
1H
13C
1
2H
14N
11B
23Na
17O
27Al
3/
2
5/
3
2
10B
15N
19F
35Cl
37Cl
29Si
31P
ω0 = frecuencia de Larmor
µ = vector de magnetización nuclear
I= Momento angular
Números cuánticos de Spin I
Números de
Estados Posibles
2I + 1
Cuantización Espacial
I = ½ , 2 estados Posibles
I = 2, 5 Estados Posibles
I = (I (I + 1) (h/2π))1/2
Todo núcleo atómico posee
un
momento
angular
intrínseco I y un momento
magnético asociado μ La
imagen clásica de un
núcleo es de una esfera
cargada rotando sobre un
eje. Ambos momentos son
magnitudes vectoriales
Magnetización Nuclear
z
H
µz
Momento
Magnético
µ
µ = γ .
I
Razón
Momento
Mgtogrica Angular
Element
o
γ (107T-1s-1)
ν (MHz)
9,4 T
Abun. (%)
1H
26,75
400
99,985
2H
4,11
61,4
0,015
13C
6,73
100,6
1,108
14N
1,93
28,9
99,63
15N
-2,71
40,5
0,37
17O
-3,63
54,3
0,037
19F
25,18
376,5
100
29Si
-5,32
79,6
4,7
31P
10,84
162,1
100
E=-µ .H
E = - µz . Hz
Efecto del campo Magnético
Ec. de Larmor (ω = γH)
z
H0
µ
x
y
z
µ
H0
x
y
Materiales y Métodos
Vesicle
Formation
Egg PC film
D2O
Egg PC
MLVs
Tip
Sonication
pNP
SUVs
H
H
H
H
H
H
b
a
O 2N
O 2N
O
-
H
H
H
H
b
a
O 2N
O
O
-
H
H
H
a
O
H
H
H
H
a
H
H
a
H
H
H
a
H
H
b
a
H
H
H
H
H
a
H
H
H
H
H
b
a
H
O
O 2N
H
H
H
H
b
a
O 2N
O
O 2N
O
H
H
H
H
H
b
a
O
H
H
H
a
O
-
H
H
b
a
-
H
H
H
H
H
H
H
H
b
a
O 2N
H
H
H
H
b
a
O 2N
H
H
H
H
b
H
H
a
H
H
b
a
O
O 2N
H
O
a
H
H
H
a
O
-
O
O
b
a
H
H
H
H
b
a
O
-
-
-
-
H
H
O 2N
O
H
-
H
b
O
-
H
H
b
a
-
-
H
H
H
H
b
a
O 2N
H
H
H
H
O 2N
H
O
-
O 2N
H
O
O 2N
O 2N
a
b
a
-
O 2N
H
O 2N
H
-
-
-
b
H
H
b
O
a
H
H
-
H
H
-
O
-
H
b
a
H
O
O 2N
O 2N
b
H
O 2N
H
b
O 2N
H
O
H
H
-
-
b
O 2N
H
H
O
H
O
b
O 2N
H
b
-
O 2N
b
O 2N
-
O 2N
H
b
O 2N
O
-
O 2N
O
O
-
-
H
O 2N
O
-
b
a
H
H
H
b
a
H
H
H
O
b
a
H
H
H
H
b
a
-
H
H
H
H
b
a
O
O 2N
O
-
H
H
H
a
O
O
H
-
-
H
H
H
a
O
H
H
H
b
a
O 2N
H
H
H
H
b
a
O 2N
O 2N
O
O
-
O
-
H
H
H
H
b
a
Rotating Frame
Overhauser Effect
Spectroscopy
(ROESY)
Varian Inova
500 mHz
O
H
-
H
H
b
a
O 2N
H
H
H
H
b
a
O 2N
O
O
-
H
H
H
H
b
a
H
H
H
H
b
a
O 2N
H
H
H
H
b
a
O 2N
O
O
-
O
-
H
b
-
O 2N
Longitudinal
relaxation time (T1)
H
H
O 2N
H
-
a
-
H
H
H
b
H
b
O 2N
H
b
O 2N
O 2N
1D 1H-NMR
(Chemical Shift)
H
O 2N
H
O 2N
a
-
-
H
H
H
H
b
a
O 2N
O
-
Assigment
PNPH
(pH 4.4)
PNP(pH 10.2)
Ha
(CH)2≈C-O-
7.253
7.21
Hb
(CH)2≈C-NO2
6.065
5.68
a
b
PNP-
PNPH
PPM
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
ASIGNACIÓN PARA LOS PICOS DE 1H DE PNPAssigne_
ment
Chemical
group
PNPH
(pH 4.4)
PNP(pH 10.2)
a
(CH)2≈C-O-
7.253
7.21
b
(CH)2≈C-NO2
6.065
5.68
1H
1H
a
b
PNP-
PNPH
PPM
8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
TABLA 1: Asignación de picos de resonancia a los
hidrógenos de la EPC en el espectro 1H-RMN del PNP
Asignación de
Picos
Desplazamiento
Químico (ppm)
A
CH3
0
B
(CH2)n
0,40
C
β-CH2
0,70
D
CH2C=C
1,14
E
Α-CH2
1,48
F
=C-CH2-C=
1,88
G
N+(CH3)3
2,35
H
CH2N+
2,79
I
O3POCH2C
3,13
J
O3POCH2CHO
3,40
K
CH2OCO
3,53
L
CH=CH, CHOCO
4,41
Fig. A
SEPARACIÓN ESPECTRAL ENTRE EL EPC Y PNP
a
1H-NMR
b
spectra (500 MHz) of EPC 65 mM (SUVs) and PNP:EPC (1:1.6
mol % in the membrane) and PNP, pH10.2, 37ºC
Medidas de tiempos de relajación
longitudinales (T1s)
MO
Tiempo
EFECTO DEL PNPH EN EL DQ Y EN LOS VALORES
DE T1 EN LOS 1HEPC
T1 (seg)
*
0.16
*
T1 EPC+pNPH
0.8
0.12
*
*
0.6
*
*
*
0.08
0.4
0.04
0.2
0.00
G
H
I
J
K
E
C
B
D
L
F
 C.S. (p.p.m.)
 C.S.
T1 EPC
1.0
A
Hidrogen peack assignemtent
The C.S. showed a preferential location at the glycerol level. The T1 only
showed a significant change for a CH2 (C) located near the carbonyl groups.
EFFECT PNP- ON CS AND T1 VALUES OF 1HEPC
1.4
C. S.
T1 EPC
0.16
T1 EPC+pNP-
1.0
0.12
0.8
0.08
0.6
0.04
 C.S. (p.p.m.)
T1 (seg)
1.2
0.4
0.00
G
H
I
J
K
E
C
B
D
L
F
A
Hidrogen peack assignemtent
C.S. didn’t show significant information. But the T1 of protons in the outer
polar head-group region became more restricted/immovilized.
Espectroscopia de Fluorescencia
Esquema de un Espectrofluorómetro
• Anisotropía de fluorescencia. Aplicación al estudio de
dinámica de membranas
• Transferencia de energía inducida por resonancia. Medida de
distancias moleculares
•
Microscopía de fluorescencia.
•
Inmunofluorescencia
Efecto de la polaridad del solvente
Exposición al solvente de Trp en una proteína
FLUORESCENCIA EN MODELOS DE MEMBRANA
Efecto de la temperatura y el contenido de colesterol
Espectroscopia de
Resonancia Paramagnética Electrónica
EPR
Microondas (GHz) ⇒ Energía = transiciones rotacionales moleculares
Sustancias Paramagnéticas con espines electrónicos desapareados:
Radicales Libres
Sólidos cristalinos
Iones de metales de transición y tierras raras
Sistemas en estado triplete
Resonancia: moléculas o iones paramagnéticos = e- desapareados
e- + H (campo magnético) = momento magnético, con las componentes orientadas en
la dirección del campo.
El espin electrónico asume sus dos estados permitidos ⇒ (±1/2)
La energía entre los 2 estados permitidos = Energía de Zeeman
E= ±1/2 g β H
La separación entre los niveles de Zeeman aumenta linealmente con H.
∆E= g β H
Entonces, la transición entre niveles puede ser inducida por un H de ν adecuada
∆E= h ν = g β H
Resumiendo: Los electrones desapareados poseen un momento magnético de espín
que se orienta en presencia de un campo magnético.
Si la energía es la adecuada para la resonancia, podrá haber absorción y transición
entre los subniveles.
Fuente de
microondas
Cavidad
Imán
Marcador de Espín: molécula que posee un grupo paramagnético, cuyo
comportamiento frente al H se ve afectado por el ambiente en donde se encuentra.
El más usado es el Nitróxido
Posee un espín nuclear del nitrógeno (I) = 1
Se produce una interacción entre el espín electrónico y el espín nuclear ⇒ la
absorción se desdobla según 2I+1=3 y el espectro muestra 3 lineas, esto es el
desdoblamiento hiperfino. Estas 3 líneas corresponden a las 3 posibles orientaciones
del momento magnético nuclear del nitrógeno
m = +1, 0, -1
MEDIDAS ESPECTRALES
Parámetro Empírico de
Orden y Movilidad
Parámetro de Orden
A||
-
A⊥
S=
h+1 /h0
Azz - ( Axx + Ayy ) / 2
Ejemplo: Efecto de Mentol en Membranas Sinaptosomales
12-SASL
O
5-SASL
2 mol%
POPC
5 mM
0.6
S
Colesterol
25 mol%
0.5
0
Filme
MLVs marcados
10
15
20
25
30
Mentol mM
30
% ∆h+1/ho
+ Buffer Acetato
5 mM, pH 5
5
20
10
0
Mentol
0
5
10
15
Mentol mM
20
25
30
Espectro de EPR de 16-SASL en
una dispersión acuosa de citocromo
oxidasa (0.24 mg fosfolípido / mg
proteína) a 24°C. (Adaptado de
Jost et al., 1973a)
Ejemplo: Interacción β-ciclodextrinas con marcadores de espín.
Polaridad del entorno del marcador de espín.
Interacción β-ciclodextrina (40mM) - spin label (0.15 mM)
15.4
2e+10
5-SASL
12-SASL
15.2
15.0
Intensidad
1e+10
a0
14.8
14.6
14.4
0
-1e+10
β
−CD

Buffer
14.2
a
14.0
eff
0
= (1 / 3)( A|| + 2 A⊥ )
3.25e+7
3.30e+7
13.8
0
10
20
30
Temperatura (ºC)
40
50
H (Gauss)
3.35e+7