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CALLEGARI ET AL., NUEVAS PROTEÍNAS RESPONSABLES DE LA QUIEBRA PROTEICA, PAG. 1
DESCUBRIMIENTO DE NUEVAS PROTEÍNAS RESPONSABLES DE LA QUIEBRA
PROTEICA “NATURAL” EN LOS VINOS BLANCOS Y ROSADOS
CALEGARI Giovanni1, MANTEAU Sébastien2, POINSAUT Philippe2, SCOTTI Barbara1
1
ENARTIS, Via S. Cassiano 99, 28069 San Martino Trecate (NO) Italia
Martin Vialatte Oenologie, 79 av Thévenet BP 1031 Magenta 51319 Epernay cedex, France
Autore (Email: [email protected])
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INTRODUCCIÓN
Las proteínas contenidas en el vino pueden tener orígenes diversas: la uva, de la que proviene la
mayor parte (Dambrouck et al., 2003), las levaduras, las bacterias y los tratamientos enológicos,
como en el caso de un sobreencolado.
A pesar de que las proteínas son compuestos minoritarios en el vino, la estabilidad proteica de los
vinos blancos y rosados es un problema real y muy difundido. Las proteínas, en efecto, pueden
ser responsables de la aparición de enturbiamientos y de precipitados en botella que representan
una pérdida económica importante para el productor. Para prevenir el problema los enólogos
tratan todos los vinos, de forma casi sistemática, con bentonita.
Fig 1
Fig 2
Fig. 1: quiebra espontánea en botella: al cabo de algunos meses a temperatura ambiente, un vino rico en
proteínas (botella de la izquierda) presenta una quiebra proteica espontánea. En cambio, el vino que no
contiene proteínas (botella de la derecha) queda límpido.
Fig. 2: observación al microscopio óptico (1000 aumentos) de una quiebra proteica espontánea. El
enturbiamiento proteico se presenta muy a denudo en forma de agregado amorfo y translúcido.
La bentonita es una arcilla capaz de adsorber las proteínas pero desafortunadamente elimina del
vino también muchas sustancias aromáticas y colorantes (Ribéreau-Gayon et al., 1998).
La literatura científica (Ribéreau-Gayon et al., 1998) y la experiencia de bodega indican que la
quiebra proteica está influida por numerosos factores: favorables (polifenoles, Fe2+, Cu2+, calor
etc.) e inhibidores (manoproteínas, coloides, etc.). Además de las proteínas, los principales
factores necesarios para la quiebra proteica son los polifenoles. En presencia de un tapón de
corcho que cede taninos, por ejemplo, un vino blanco o rosado rico en proteínas casi siempre
sufre una quiebra proteica.
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Algunos trabajos realizados hace algunos años, mostraron que las proteínas de defensa del
racimo - quitinasas y taumatina-similares – están implicadas en el fenómeno de enturbiamiento
causado por la exposición al calor (Waters et al., 1996).
Utilizando técnicas de análisis como la electroforesis SDS-PAGE y el Western blot (Manteau et
al., 2003), se quiso indagar cuáles eran las proteínas implicadas en la precipitación proteica que
se produce espontáneamente (sin calentamiento) en botella.
Fig. 3: Quiebra proteica provocada por un tapón de corcho que cede taninos a un vino rico en proteínas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Electroforésis SDS-PAGE y coloración específica de las proteínas
Antes de ser depositado sobre el gel electroforético de poliacrilamida (PAGE), el extracto proteico
es mezclado con el tampón de Laemmli. Este último contiene un tensoactivo aniónico negativo, el
dodecil sulfato de sodio (SDS), que permite cargar negativamente todas las proteínas. El gel de
electroforesis SDS-PAGE forma una red que actúa como un tamiz molecular. Bajo la acción de un
campo eléctrico, las proteínas cargadas negativamente son arrastradas hacia el polo positivo. Una
proteína con una masa molecular muy precisa formará una banda bien definida durante la fase de
revelación mediante coloración o Western blot.
Fig. 4: esquema de la electroforesis SDS-PAGE
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RISULTADOS Y DISCUSIÓN
La electroforesis SDS-PAGE es la técnica más
utilizada por los laboratorios de investigación para
evidenciar las proteínas. El gel forma una especie de
tamiz molecular y la proteína, en función de su
tamaño, migra más o menos lentamente bajo la
acción de un campo eléctrico. Luego una proteína de
masa molecular muy precisa forma una banda bien
definida.
Para la revelación de las bandas proteicas se
utilizaron dos técnicas: coloración con nitrato de
plata y Western blot. La coloración de la
electroforesis SDS-PAGE con nitrato de plata
evidencia no sólo las proteínas sino también los
polifenoles. Estos últimos en realidad son una
mezcla de compuestos de diferentes masas y
tamaños que forman una banda continua (smear) a
lo largo del trayecto de migración de las proteínas. El
uso de la técnica de Western blot y la utilización de
anticuerpos específicos, permiten evidenciar de
forma específica invertasa, quitinasa y taumatinasimilares.
En este estudio, se analizaron más de 70 vinos de
orígenes diferentes. Después de la electroforesis
SDS-PAGE se pudieron observar hasta 12 proteínas
diferentes tanto en los vinos blancos como en los
rosados (datos no publicados). Ninguno de los vinos
analizados evidenció la presencia de bacterias o
levaduras en el precipitado proteico. Estas muestras
pueden ser consideradas por tanto representativas
de la quiebra proteica espontánea en botella.
Fig. 5: perfil SDS-PAGE de proteínas implicadas en la
quiebra proteica
Perfil proteico después de la electroforesis SDS-PAGE de
un vino base Champenois y de algunos precipitados
proteicos obtenidos en diversos vinos.
A: electroforesis SDS-PAGE y coloración con nitrato de
plata; B: Western blot con anticuerpos específicos de la
invertasa de la uva; C: Western blot con anticuerpos
específicos de la quitinasa de la uva; D: Western blot con
anticuerpos específicos de taumatina-similares de la uva.
Después de la centrifugación del vino, el precipitado viene
recuperado, lavado con una solución hidroalcohólica a pH
3 y solubilizado en tampón de Laemmli. El “volumen
equivalente de vino” está indicado en lo alto de la figura.
Están confrontadas también la quiebra proteica
espontánea de un vino base Champenois (Champagne
Base Wine b) con las inducidas por un calentamiento a
40°C (Champagne Base Wine b + 40°C) y a 80°C
(Champagne Base Wine b + 80°C).
La penúltima columna de la derecha corresponde al perfil
de un precipitado proteico obtenido después del contacto
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entre una solución de lisozima y un tapón de corcho. Mientras que la última columna de la derecha es el
perfil del vino base Champenois (Champagne Base Wine c).
Como se puede ver en la foto de la electroforesis, para obtener una coloración parecida con
nitrato de plata, se utilizaron precipitados correspondientes a diversos volúmenes de vino. Esto
significa que los diferentes vinos que presentaron quiebra no contenían la misma cantidad de
precipitado.
El uso del calor para inducir la quiebra desnaturaliza y modifica considerablemente el perfil de las
proteínas presentes en el precipitado. Después del calentamiento a 80°C, en efecto, las bandas
proteicas no están tan bien delimitadas y la invertasa y la quitinasa forman bandas continuas o
smear.
La observación de los perfiles proteicos muestra también que en la quiebra proteica natural están
implicadas varias proteínas.
Contrariamente a lo indicado en la bibliografía científica (Waters et al., 1996), las proteínas de
defensa del grano de uva, quitinasa y taumatina-similares, no están implicadas de forma
sistemática en la quiebra proteica en botella. A lo largo de este trabajo hemos podido mostrar que
proteínas como la lisozima (vino no clarificado) y unas diez proteínas más pueden estar
implicadas en el fenómeno de la quiebra proteica en botella (más de 10 bandas de diferente masa
molecular son observables con la electroforesis SDS-PAGE tratada con nitrato de plata). Es
importante señalar también que en todas las quiebras proteicas examinadas en este estudio, el
Western blot reveló siempre la presencia de invertasa, normalmente considerada una
manoproteína “estabilizante”.
Son necesarias investigaciones sucesivas para definir el rol de todas las proteínas identificadas, y
en particular de manoproteínas como la invertasa, en la quiebra proteica de los vinos blancos y
rosados.
Bibliografía
- Dambrouck, T., Marchal, R., Marchal-Delahaut, L., Parmentier, M., Maujean, A. & Jeandet, P. (2003).
Immunodetection of proteins from grapes and yeast in a white wine. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 51(9), 2727-2732.
- Manteau, S., Lambert, B., Jeandet, P. & Legendre, L. (2003). Changes in chitinase and thaumatin-like PRproteins of grape berries during the Champagne winemaking process. American Journal of Enology and
Viticulture, 54(4), 267-272.
- Ribéreau-Gayon, P., Glories, Y., Maujean, A. & Dubourdieu, D. (1998). Les traitements de clarification et
de stabilisation - Le collage des vins. In « Traité d'œnologie. 2. Chimie du vin, stabilisation et traitement »,
Vol. 2, Dunod. Paris, pp. 343-381.
- Waters, E. J., Shirley, N. J. & Williams, P. J. (1996). Nuisance proteins of wine are grape pathogenesisrelated proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(1), 3-5.
Agradecimientos
Agradecemos al laboratorio de Enología y Química Aplicada y al laboratorio de Defensa de estrés y
Reproducción de las Plantas de la Universidad de Reims por habernos ofrecido los anticuerpos utilizados en
este estudio.
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