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EFECTO SOLVENTE
EFECTO SOLVENTE
Los espectros de emisión de
algunos
fluoróforos son muy sensibles al ambiente
circundante, incluyendo al solvente
A partir de los espectros de emisión de
estos fluoróforos unidos a proteínas y
membranas se puede inferir la naturaleza del
sitio de unión
EFECTO SOLVENTE
La emisión de un fluoróforo en solución ocurre
a λ más largas que la λ de absorción
CORRIMIENTO DE STOKES
Disipación de energía vibracional
Redistribución electrónica en las moléculas EG
de solvente que rodean al fluoróforo en estado
excitado
Interacciones específicas entre fluoróforo y
solvente (enlace de hidrógeno, complejos de
transferencia de carga, etc)
EE
EFECTO SOLVENTE
Efecto general
Se produce por la
influencia colectiva del
juego entero de moléculas
de solvente sobre el
fluoróforo. Está
relacionado con el índice
de refracción (n) y
constante dieléctrica (ε) del
solvente
Efecto específico
Interacción
específica entre
pocas moléculas
de solvente y el
fluoróforo
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Diagrama parcial de energía
relajación vibracional (10-12 – 10-15 s)
S1
relajación por solvente (10-11 s)
solvente poco polar
hν
νΑ (10-15 s)
S1
solvente más polar relajado
hν
νF
hν
ν’F (10-8 – 10-9 s)
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Los efectos generales del solvente producen
corrimientos al rojo a medida que aumenta la
polaridad del solvente, pero los espectros son
semejantes
F
ÁCIDO 2-ANILINO-6- NAFTALEN SULFÓNICO
en:
● acetonitrilo
● etilenglicol
● agua
λ
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Ecuación de Lippert (1960): predice los desplazamientos
de Stokes de un fluoróforo en medios de distinta polaridad
Se debe verificar:
1) ausencia de efectos específicos
2) que la relajación por solvente sea más rápida que la emisión
fluorescente
momento dipolar del fluoróforo en
estado fundamental y excitado
constante dieléctrica
2 (µ* - µ)2
νa − νf =
hc a3
no de onda de
luz absorbida y
fluorescente
ε–1
2ε + 1
radio de la cavidad
donde está el
fluoróforo
n2 - 1
2n2 + 1
+ cte
pérdida por
relajación
vibracional
índice de refracción
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
ε–1
2ε + 1
n2 - 1
2n2 + 1
∆f
polarizabilidad
polarizabilidad electrónica o de alta frecuencia: se
relaciona con la redistribución electrónica del
solvente al interaccionar con el momento dipolar del
fluoróforo en estado excitado (µ*)
polarizabilidad molecular o de baja frecuencia:
se relaciona con la reorientación entre sí de las
moléculas de solvente
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Interpretación de la ecuación de Lippert
Se considera al fluoróforo como un dipolo en un medio
continuo de constante dieléctrica homogénea
Un dipolo puntual produce un
campo eléctrico inducido (R) en el
solvente de igual dirección y de
sentido contrario al dipolo
Este campo eléctrico es distinto en
estado fundamental y excitado, y
se distingue si debe a factores
electrónicos o a la reorientación
del solvente.
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
CAMPOS ELÉCTRICOS
El campo eléctrico es distinto en estado fundamental (R) y
excitado (R*), y se distingue si debe a factores electrónicos
(Re y Re*) o a la reorientación del solvente (Rr y Rr*) .
R = (2 µ/a3) f
R* = (2 µ∗/a3) f
Re = (2 µ/a3) f(n)
Rr = (2 µ/a3) ∆f
R*e = (2 µ∗/a3) f(n)
R*r = (2 µ∗/a3) ∆f
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Estos campos son fáciles de describir con la siguiente figura:
E
Redistribución de electrones del fluoróforo, pero no
de sus núcleos (Franck Condon)
R*e
Rr
µ*
µ*
R*e
R*r
µ
Re
R*r
hν
ν
Re
Rr
µ
El solvente se perturba al cambiar el momento dipolar del
analito: primero modificando la posición de sus electrones
y después la posición de sus moléculas
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/solventeffects/index.html
Las energías implicadas en cada posición del diagrama se
calculan de la siguiente manera:
Recordar que:
E = µR
∆E = hcν
R*e Rr
absorción
Re Rr
Energía en estado vapor
(no considera
el solvente) Componente de orientación
Componente electrónico
∆Eabs Eabs = Ev – µRr – µRe
E*abs = E*v – µ∗Rr – µ∗R*e
µ*
µ
∆Eabs ∆Eem =
µ* R*e R*r
emisión
µ
Re R*r
hc (νa- νf) =
∆Eem E*em = E*v – µ*R*r – µ*R*e = hc (νa(v)- νf(v)) – (µ*-µ)Rr + (µ*-µ)R*r
Eem = Ev – µR*r – µRe
k
νa-νf = k/hc + (µ*-µ) (R*r-Rr)/hc
k´
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
νa-νf = k/hc + (µ*-µ) (R*r-Rr)/hc
k´
Expresando los campos de reorientación Rr en función de la
polarizabilidad
Recordar que Rr = (2 µ/a3) ∆f
νa-νb = k´+ (µ*-µ)/hc (2µ*∆f/a3 – 2µ∆f/a3) = 2 (µ*-µ)2∆f/hca3
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Desplazamiento esperado por efecto general del solvente
2-anilinonaftaleno (2-AN) en hexano y en cloroformo irradiado a 350 nm
µ*-µ = 20 D
a=4A
Solvente
hexano
ε
n
∆f
1.88
1.37
0.00044
cloroformo 4.81
1.45
0.147
νa-ν
νf
28 cm-1
λem (calcul.)
350.3 nm
9275 cm-1 518.2 nm
Sin embargo, la emisión del 2-AN en hexano se detecta a 370 nm
Relajación vibracional
APLICACIÓN DE LA ECUACIÓN DE LIPPERT
Indicadores de polaridad de sitios de unión
Se determina la polaridad de un sitio de unión comparando la
fluorescencia de una sonda unida a dicho sitio con la
fluorescencia de la sonda en solventes de polaridad conocida.
(νa-νf)
2/hca3 (µ*-µ)2
Se prepara una curva de
calibración
∆f
A mayor (µ*-µ) de un fluoróforo, mayor pendiente, mayor
sensibilidad a cambios de polaridad.
Ej: los sulfonatos de N-arilaminonaftaleno son indicadores de
polaridad de sitios biológicos
EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE
Gráficos de Lippert para dos derivados naftilamínicos en
mezclas etanol-agua
La constante dieléctrica y el índice de refracción del sistema depende
de la constante dieléctrica y del índice de refracción de cada solvente
y de su respectivo % en la mezcla (promedio ponderado)
Desplazamientos de Stokes en distintos solventes
(νa-νf)
NH2
solventes apróticos
solventes próticos
2-anilinonaftaleno
∆f
(νa-νf)
-O
OR
C
+
9-metil antroato
∆f
EFECTOS ESPECÍFICOS DEL SOLVENTE
Interacción química entre fluoróforo y unas pocas moléculas
vecinas de solvente durante el tiempo de vida del estado
excitado
2-anilinonaftaleno en ciclohexano, y en ciclohexano con
cantidades crecientes de etanol
F
0 % etanol
0.2 % etanol
0.4 % etanol
1.7 % etanol
100 % etanol
Efecto
general
λ
Otro ejemplo:
O
C
HO CH3
CH3
2-acetilantraceno
Fluorescencia de 2-acetilantraceno en hexano-dioxano
Al aumentar el % de dioxano (hasta 100 %) el máximo de emisión
se corre paulatinamente
efecto general
Fluorescencia de 2-acetilantraceno en hexano-metanol
1-2 % de metanol (% pequeño para modificar ε y N) producen un
corrimiento brusco del máximo de emisión
efecto específico
Se produce enlace de hidrógeno entre metanol y grupo
carbonilo del fluoróforo durante el tiempo de vida del estado
excitado (el espectro de absorción no se modifica)
Espectros de 2-acetilantraceno en mezclas hexano-metanol
Metanol
0.34 M
0.2 M
0.12 M
0.075 M
0.05 M
0.03 M
0M
DOS: Trans-4dimetilamino4’-(1-oxobutil)estilbeno
Espectros de emisión de DOS en ciclohexano (CH), tolueno (T), acetato
de etilo (EA) y butanol (B). La línea punteada muestra el espectro de
emisión del DOS en vesículas de DPPC (dipalmitoil fosfatidil colina)
Otro ejemplo de efecto solvente
DNS: 4-dimetilamino-4’nitroestilbeno
hexano
ciclohexano tolueno acetato de etilo butanol
EJERCICIOS
1) Calcular el desplazamiento de Stokes de 2-aminonaftaleno (2-AN) en
hexano y en cloroformo cuando se irradia a 350 nm. El valor (µ*-µ) para
2-AN es 20 D y el a = 4 Å
Recordar
1debye (D) = 3.34x10-30 c x m
Constante de Plank (h) = 6.63x10-34 J x s
Velocidad de la luz (c) = 3 x 108 m x s-1
Factor de la ley de Coulomb (k) = 9x109 J x m/c2
2) Usar los siguientes datos de corrimientos de Stokes de PRODAN en
distintos solventes para calcular el cambio de su momento dipolar al pasar
al estado excitado. Analizar si existen efectos específicos de solvente.
Buscar en tabla los valores de índices de refracción y constantes
dieléctricas. Considerar: a = 4.2 Å
O
C
CH2
H3C
N
CH3
PRODAN
6-propionil-2-(dimetilamino)naftaleno
H3C
Solvente
ciclohexano
trietilamina
clorobenceno
cloroformo
acetona
1,3-propilen glicol
metanol
agua
Máx. absorción (nm)
342
343
354
357
350
370
362
364
Máx. emisión (nm)
401
406
430
440
452
510
505
531