Download Técnicas basadas en la resonancia de plasmones superficiales

UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTÍN
COMISIÓN NACIONAL DE ENERGÍA ATÓMICA
INSTITUTO DE TECNOLOGÍA
“Prof. Jorge A. Sabato”
Técnicas basadas en la resonancia de plasmones
superficiales.
Detección y estudio de reacciones de hibridización de ADN
en superficies.
Por Fernando D. Stefani
Director de Trabajo
Prof. Dr. Wolfgang Knoll
Tutora: Dra. Ana María Llois
Trabajo de seminario – Ingeniería en Materiales
República Argentina
2001
Contenido
Introducción General…………………………………………………………………………………
2
Capítulo 1: Plasmones superficiales
1.1 – Introducción.......................................................................................................................
1.2 – Plasmones.........................................................................................................................
1.3 – Plasmones Superficiales en una Interfase........................................................................
1.4 – Excitación de Plasmones Superficiales.............................................................................
1.5 – Plasmones Superficiales en Sistemas Multicapas............................................................
4
4
8
12
16
Capítulo 2: Técnicas basadas en la resonancia de plasmones superficiales
2.1– Introducción........................................................................................................................
2.2– Espectroscopia por resonancia de plasmones superficiales (SPR)...................................
2.3– Espectroscopia de fluorescencia por plasmones superficiales (SPFS).............................
2.4– Microscopía por resonancia de plasmones superficiales (SPM)........................................
2.5– Microscopía de fluorescencia por resonancia de plasmones superficiales (SPFM)..........
18
18
20
27
29
Capítulo 3: Hibridización de ADN
3.1 – Introducción.......................................................................................................................
3.3 – Ácido desoxiribonucleico...................................................................................................
3.3 – Hibridización y desnaturalización......................................................................................
3.4 – Detección y secuenciado de ADN.....................................................................................
30
30
33
35
Capítulo 4: Detección y estudio de reacciones superficiales de hibridización
4.1 – Introducción.......................................................................................................................
4.2 – Superficies sensoras........................................................................................................
4.3 – Modelo cinético.................................................................................................................
37
37
42
Capítulo 5: Esquemas de detección y resultados
5.1 – Introducción.......................................................................................................................
5.2 – Detección mediante SPR..................................................................................................
5.3 – Detección mediante SPFS................................................................................................
45
45
46
Capítulo 6: Resumen y conclusiones.....................................................................................
56
Apéndice I: Fundamentos Teóricos........................................................................................
59
Apéndice II: Movimiento de los electrones en un metal según la Teoría de Drude........... 74
Agradecimientos.......................................................................................................................
76
Referencias................................................................................................................................ 77
1
Introducción General
Hasta el día de hoy, miles de lesiones genéticas como mutaciones o deleciones han sido
identificadas como las responsables de enfermedades humanas, entre ellas varios tipos de
cáncer [18]. Por lo tanto, el análisis de secuencias genéticas tiene gran importancia para el
diagnóstico, monitoreo y terapia de este tipo de enfermedades. Por otro lado, movilizados por
el proyecto Genoma Humano (comenzado en 1990), un gran número de investigadores se
dedica actualmente a determinar los genomas de diferentes organismos. Por estas razones,
resulta necesario el desarrollo de métodos rápidos, eficientes y sensibles capaces de procesar
muestras de ADN de manera conveniente.
La mayoría de los esfuerzos se dirigen actualmente hacia el desarrollo de esquemas
superficiales de detección, ya que estos permiten la posterior fabricación de sensores y chips
multi-spot para detección y secuenciado automáticos. En general, estos esquemas se basan
en la detección de reacciones de hibridización entre un oligonucleótido inmovilizado en la
superficie, denominado catcher, y una cadena de ADN en solución denominada target.
Las técnicas basadas en la resonancia de plasmones superficiales proveen una alternativa
atractiva a este respecto. La espectroscopía por resonancia de plasmones (SPR) se ha
convertido en una herramienta ampliamente aceptada para la caracterización de interfases,
películas delgadas y
procesos cinéticos en superficies; en particular, reacciones de
hibridización. Varios instrumentos comerciales de SPR se encuentran disponibles en la
actualidad. Por otro lado, se ha desarrollado recientemente la espectroscopía de fluorescencia
por resonancia de plasmones (SPFS). Esta técnica también puede utilizarse para el estudio
de reacciones superficiales de hibridización, y a pesar de que impone la necesidad de contar
con targets fluorescentes, es interesante por su gran sensibilidad.
Este trabajo de seminario ha tenido como objetivo realizar un estudio comparativo de
arquitecturas superficiales y esquemas de detección aplicados al estudio de reacciones de
hibridización de ADN en superficies.
En el presente trabajo se explicarán los principios de funcionamiento de estas técnicas, se
presentarán algunas de las arquitecturas supramoleculares utilizadas para inmovilizar a los
catchers, se mostrarán algunos de los posibles esquemas de detección, se expondrán los
resultados más notables y se propondrán experimentos para el futuro. En el primer capítulo se
trata la física de los plasmones y en el segundo las técnicas basadas las técnicas de
detección de eventos basadas en la excitación de plasmones superficiales, se describen los
principios de operación, las potencialidades y limitaciones de cada una. El capítulo tres está
dedicado a describir las principales características de las moléculas de ADN, cuyo
conocimiento es necesario para comprender la posterior discusión. El cuarto capítulo trata el
tema de las superficies sensoras empleadas en cada técnica y el modelo cinético utilizado
2
para el estudio de las hibridizaciones. En el capítulo cinco se describen los experimentos
realizados, se exponen resultados conclusiones y se proponen experimentos para el futuro.
Finalmente en el capítulo sexto se resumen los conceptos más importantes.
Este trabajo fue realizado durante una pasantía de cinco meses en el Instituto Max Planck
para la Investigación de Polímeros (Max Planck Institut für Polymerforschung; Mainz,
Alemania). En dicho instituto se trabajó dentro del departamento de Ciencia de Materiales bajo
la dirección del Prof. Dr. Wolfgang Knoll.
3
CAPÍTULO 1:
PLASMONES SUPERFICIALES
1.1 – Introducción
El fenómeno de los plasmones superficiales se conoce desde hace unos 25 años. En la
actualidad, su teoría es bien conocida y pueden encontrarse un número de publicaciones que
discuten sus propiedades en detalle [1][2][3].
En este capítulo se explica qué son los plasmones, se analizan sus características y
métodos de excitación.
1.2 – Plasmones
Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de conducción de un metal.
Tal vez el modelo teórico más simple para estudiar a los metales es el propuesto por Drude.
La teoría de Drude considera a los electrones de conducción de un metal como a un gas
homogéneo de electrones inmerso en un potencial positivo uniforme impuesto por los iones
inmóviles de la red cristalina. Lo interesante es que este modelo tan simple permite predecir
de manera bastante aceptable la conductividad eléctrica y térmica de los metales, y además
predice la existencia de plasmones.
A continuación se muestra el tratamiento de la conductividad alterna según la teoría de
Drude, y se verá cómo la misma predice la existencia de los plasmones son predichos.
Para calcular cómo se induce una corriente en un metal debido a un campo eléctrico
variable, conviene escribir el campo de la siguiente manera:
(
E (t ) = Re E (ω )e −i ω t
)
(1)
La ecuación de movimiento para la cantidad de movimiento por electrón es:
dp p
= − eE
dt τ
*
(2)
Se busca una solución estacionaria de la forma:
(
p (t ) = Re p (ω )e −i ω t
)
(3)
Reemplazando las formas complejas de p y E en la ecuación (2), que debe cumplirse tanto
para la parte real como imaginaria, se encuentra:
*
Por razones de claridad no se deduce aquí la ecuación (2) pero puede encontrarse la deducción en el apéndice I.
Vale aclarar sin embargo que e es la carga del electrón y τ es el tiempo de relajación, es decir, el tiempo promedio
que un electrón puede viajar sin sufrir una colisión son un ion.
4
− i ω p (ω ) = −
p (ω )
− eE (ω )
τ
(4)
La densidad de corriente no es más que j = − n ep / m , donde n es la densidad volumétrica de
electrones y m es la masa del electrón, sale inmediatamente que:
(
j(t ) = Re j(ω )e −i ω t
j(ω ) =
n ep (ω )
m
(n e
=
2
)
)
/ m E (ω )
1/ τ − i ω
(5)
Este resultado es comúnmente escrito como:
j(ω ) = σ (ω ) E (ω )
(6)
donde σ(ω) es la conductividad de corriente alterna o la conductividad dependiente de la
frecuencia:
σ (ω ) =
σ0
1 − i ωτ
σ0 =
n e2 τ
m
(7)
La aplicación más importante de este resultado es el estudio de la propagación de
radiación electromagnética en un metal. Puede parecer que las suposiciones hechas por el
modelo de Drude hacen a este resultado inaplicable para dicho caso, debido a que:
1) En una onda electromagnética, el campo eléctrico E va acompañado por un campo
magnético H perpendicular de la misma magnitud, que no fue incluido en la ecuación
de movimiento (2)
2) En una onda electromagnética, los campos no sólo varían en el tiempo sino también
en el espacio, mientras que la ecuación de movimiento (2) fue deducida asumiendo
una fuerza espacialmente uniforme (ver apéndice I)
La primera complicación puede ser ignorada porque incluir el efecto del campo magnético
agrega un término adicional −
ep (ω )
mc
× H *, el cual es v/c veces más pequeño que el término
con En donde v es la velocidad promedio de los electrones. Incluso para una densidad de
corriente tan grande como 1A/mm2, v=j/ne es solamente 0.1cm/s. Entonces, el término
magnético es típicamente 10-10 del término eléctrico y puede ser ignorado siempre.
El segundo punto presenta cuestiones más serias. La ecuación de movimiento (2) se
deduce asumiendo que en cualquier instante, la misma fuerza actúa sobre cada electrón, lo
cual no es cierto si el campo varía con la posición. De todos modos, la densidad de corriente
*
A partir de la Ley de Lorentz:
1


F = e E + v × H 
c


5
en un punto r está totalmente determinada por lo que el campo ha hecho sobre cada electrón
en el punto r desde su última colisión. Esta colisión, en la gran mayoría de los casos, tiene
lugar no más allá de unos cuantos caminos libres medios desde el punto r. Entonces, si el
campo no varía apreciablemente en distancias del orden del camino libre medio electrónico,
j(r,t) puede calcularse correctamente, considerando que el campo en todo el espacio está dado
por su valor en el punto r, E(r,t).
En consecuencia, el siguiente resultado
j(r ,ω ) = σ (ω ) E (r ,ω )
(8)
es válido siempre y cuando la longitud de onda λ del campo sea grande en comparación con
el camino libre medio electrónico l. Para metales, esto es usualmente válido en el rango del
visible (λ del orden de 103nm)*. A continuación se asumirá que la longitud de onda es grande
en comparación con el camino libre medio.
Las ecuaciones de Maxwell en presencia de una densidad de corriente j se escriben†:
∇⋅D = 0
(9.a)
∇⋅B = 0
(9.b)
1 ∂B
=0
c ∂t
(9.c)
1 ∂D 4 π
=
j
c ∂t
c
(9.d)
∇×E +
∇×H −
Se busca una solución con una dependencia temporal e-iωt. En un metal se puede escribir j
en términos de E según (6), lo cual combinado con las ecuaciones de Maxwell da como
resultado:
∇ × (∇ × E ) = −∇ 2 E =
iω
i ω  4 πσ
iω 
∇×H =
E−
E

c
c  c
c 
(10)
o bien,
− ∇ 2E =
ω2  4 π i σ 
1 +
E
ω 
c2 
(11)
que tiene la forma usual de una ecuación de onda:
*
Cuándo esta condición no se satisface es necesario tartar el problema con las llamadas toerías no-locales
(nonlocal theories), de mayor complejidad.
†
Aquí se considera una onda electromagnética en la cual no hay densidad de carga inducida. Más adelante se
tomará el caso de oscilaciones en la densidad de carga; los plasmones.
6
− ∇ 2E =
ω2
ε (ω ) E
c2
con una constante dieléctrica compleja dada por:
ε (ω ) = 1 +
4πiσ
c
(12)
Para frecuencias suficientemente altas tales que ωτ >>1, la combinación de (12) y (7) da
como resultado en un primera aproximación:
ε (ω ) = 1 +
ω p2
ω2
(13)
donde ωp se conoce como la frecuencia de plasma y está dada por:
ω p2 =
4 πn e 2
m
(14)
Una consecuencia importante de (13) es que el gas de electrones puede sostener
oscilaciones de densidad de carga. Es decir una perturbación en la cual la densidad de carga
eléctrica tiene una dependencia temporal e-iωt. De la ecuación de continuidad:
∇⋅ j = −
∂ρ
⇒ ∇ ⋅ j(ω ) = i ωρ (ω )
∂t
(15)
y de la Ley de Gauss:
∇ ⋅ E (ω ) = 4 π ρ (ω )
(16)
Teniendo en cuenta la ecuación (8):
i ωρ (ω ) = 4 π σ (ω )ρ (ω )
(17)
4 π i σ (ω )
(18)
Esto tiene una solución y es:
1+
ω
=0
La ecuación (18) es precisamente la condición que se encontró anteriormente para la
propagación de radiación. En este caso muestra la condición que la frecuencia debe cumplir
para que una onda de densidad de carga se propague.
La naturaleza de estas oscilaciones de densidad de carga, conocidas como oscilaciones de
plasma o plasmones, puede entenderse en términos de un modelo muy simple. Imagínese
que todo el gas de electrones es desplazado una distancia d con respecto a los iones
positivos fijos. La carga superficial producida da lugar a un campo eléctrico de magnitud 4πρ*,
donde ρ* es la carga por unidad de área en cada extremo (ver figura 1.1).
7
_____
_ _ _ρ*=-nde
__
E=2πρ∗+2πρ∗=4πnde
d
+++++
ρ∗=+nde
+++++
Figura
1.1:
modelo
para
la
comprensión de las oscilaciones de
plasma o plasmones.
Entonces, el gas de (N) electrones como un todo obedecerá la ecuación de movimiento:
Nmd!! = − Ne 4 π ρ* = − Ne(4 πn ed ) = −4 πn e 2 Nd
(19)
que da como resultado una oscilación a la frecuencia de plasma.
1.3 – Plasmones Superficiales en una Interfase
A continuación se trata el caso particular plasmones superficiales en una interfase; se
analizan sus características y métodos de excitación con un haz luminoso. Considérese que
dicha interfase se ubica en el plano XY, y que separa dos espacios semi-infinitos de
materiales 1 y 2, cuyas propiedades ópticas están caracterizadas por sus constantes
dieléctricas complejas ε1(ω) y ε2(ω), respectivamente (ver figura 1.2) .
x
y
Figura 1.2: sistema de referencia
z
ε1(ω)
ε2(ω)
en una interfase entre dos medios
de constantes dieléctricas ε1 y ε2
En este tratamiento se ignorarán materiales magnéticos, es decir que se tomará µ=1 en
todos los desarrollos.
Los plasmones superficiales sólo pueden ser excitados en la mencionada interfase si el
campo eléctrico tiene una componente normal a la superficie tal que puede inducir una carga
superficial ρ*. Para que eso sea posible el desplazamiento eléctrico debe verificar:
z ⋅ (D 2 − D1 ) = 4 πρ*
(20)
Luz S-polarizada propagándose a lo largo de la dirección X, sólo tiene componentes de
campo eléctrico paralelas a la dirección y; es decir, una onda TE tiene un campo eléctrico
E=(0; Ey; 0), y por lo tanto son incapaces de excitar plasmones superficiales. Tales modos sólo
8
pueden ser excitados por luz P-polarizada, es decir ondas TM con campo eléctrico E=(Ex; 0;
Ez), o equivalentemente, H=(0; Hy; 0). Las ondas electromagnéticas superficiales tendrán la
forma:
medio 1
A1 = A10 e i (k 1x−ω t ) = A10 e i (k x1x + k z1z −ω t )
(21.a)
medio 2
A 2 = A 20 e i (k 2 x −ω t ) = A 20 e i (k x 2 x−k z 2 z −ω t )
(21.b)
Dónde A puede representar tanto al vector eléctrico E coma al vector magnético H; kx1 y kx2
son las componentes en x de los vectores de onda en los medios 1 y 2, kz1 y kz2 son los valores
absolutos de las componentes del vector de onda según la dirección z y ω es la frecuencia
angular. Por supuesto que ambos campos deben cumplir las ecuaciones de Maxwell (9). Las
condiciones de contorno electromagnéticas imponen que en la interfase:
E1x = E 2 x
(22)
H1y = H 2 y
(23)
y
De la ecuación (22) sale inmediatamente que kx1=kx2=kx. Además, aplicando la ecuación de
Maxwell (9.d), con j=0 ya que no hay flujo neto de cargas, a los campos E y H dados por (21),
se llega a que:
k1z H y =
ω
ε1 E x
c
(24)
kxH y = −
ω
ε1 E1z
c
(25)
ω
ε 2 Ex
c
(26)
ω
ε 2 E2 z
c
(27)
k2z H y = −
kxH y = −
Las ecuaciones (24) y (26) llegan a la única solución no trivial cuando:
k1z
ε
=− 1
k2z
ε2
(28)
Aplicando las ecuaciones de Maxwell (9.c) a los campos E y H se obtiene:
− k x E1z + k1z E x =
ω
Hy
c
(29)
− k x E2 z − k 2 z E x =
ω
Hy
c
(30)
9
La ecuación (26) muestra que los plasmones superficiales sólo pueden ser excitados en
una interfase entre dos medios con constantes dieléctricas de signo opuesto. Para un material
en contacto con un dieléctrico de constante dieléctrica positiva εd, esta condición puede ser
satisfecha para toda una variedad de excitaciones elementales, siempre y cuando sus
características como oscilador resulten, al menos en un rango espectral estrecho, en una
constante dieléctrica negativa. Dentro de ciertos límites, este puede ser el caso de fonones o
excitones. El acoplamiento de estas excitaciones a un campo electromagnético produce los
llamados phonon surface polariton, o exciton surface polariton, respectivamente.
En nuestro caso interesa el acoplamiento de un campo electromagnético con las
oscilaciones colectivas de plasma de los electrones de conducción de un metal en la interfase
entre un metal con constante dieléctrica εm= ε’m + i ε”m y un dieléctrico de constante dieléctrica
εd= ε’d + i ε”d. Estas excitaciones se denominan surface plasmon polaritons, o directamente
surface plasmons: plasmones superficiales.
A partir de ahora se utilizarán los subíndices m en lugar de 1 y d en lugar de 2; tan solo
para especificar un medio dieléctrico y otro metálico en lugar de medios genéricos 1 y 2.
Operando con las ecuaciones (26), (27) y (30) se obtiene:
2
ω
k x 2 + k dz 2 =   ε d
c
2
k x + k mz
2
(31.a)
2
ω
=   εm
c
(31.b)
o bien
2
k dz
ω
= εd   − kx2
c
k mz
ω
= εm   − kx2
c
(32.a)
2
(32.b)
que junto con la ecuación (28) permite obtener la relación de dispersión de los plasmones
superficiales en una interfase metal / dieléctrico:
kx =
ω
c
εm⋅ εd
εm + εd
(33)
En este punto es conveniente detenerse a destacar un par de detalles:
1-
Usualmente se trata a ω como real. Dado que εm es compleja, kx es también complejo,
es decir kx= k’x + ik”x. Como consecuencia de esto, los plasmones superficiales que se
propaguen por una interfase metal / dieléctrico exhibirán una longitud de propagación finita Lx,
10
dada por Lx=1/k”x. Este decaimiento tiene una gran importancia ya que determina la
resolución lateral de las técnicas basadas en la resonancia de plasmones superficiales.
2-
En el rango espectral de interés se tiene que:
εm⋅ εd
≥ εd
εm + εd
(34)
lo cual tiene dos importantes consecuencias. La primera se deduce de la ecuación (32.a). Al
insertar la ecuación (34) se obtiene una componente z del vector de onda en el dieléctrico
puramente imaginaria. De las ecuaciones de onda (21) puede verse que esto significa que los
plasmones superficiales constituyen una onda evanescente no-radiativa que se encuentra
unida a la interfase y que su amplitud, la cual es máxima en dicha superficie (z=0), decae
exponencialmente hacia el interior del dieléctrico [9](figura 1.3).
La longitud de penetración típica es del orden de unos cientos nanómetros; esta
especificidad superficial es lo que hace que este campo óptico sea tan interesante para la
caracterización de nanoestructuras superficiales.
Figura 1.3: campo eléctrico evanescente
asociado a los plasmones superficiales en
una interfase metal/dieléctrico [9] .
La segunda consecuencia de la ecuación (34) es que el vector de onda de un fotón libre
que se propaga en el dieléctrico kf,
kf =
ω
⋅ εd
c
(35)
es siempre menor que el vector de onda de un plasmón superficial ksp propagándose en una
interfase entre ese mismo medio y un metal (figura 1.4).
11
kf
ksp
Figura 1.4: componentes X de los vectores de
x
θi
z
onda de un fotón incidente desde un dieléctrico
Dieléctrico
y los plasmones superficiales que se propagan
Metal
Dieléctrico
entre ese mismo dieléctrico y un metal.
1.4 – Excitación de Plasmones Superficiales
Para el acoplamiento de los fotones con los plasmones superficiales sólo interesa la
componente x de los vectores de onda de los fotones. Esto significa que para una reflexión
simple de fotones en una interfase plana, variando el ángulo de incidencia, uno puede pasar
de tener kfx=kf.sinθi nulo para incidencia normal, al vector de onda completo kf para incidencia
rasante (figura 1.4). Sin embargo, la ecuación (34) dice que esto no es suficiente para excitar
los plasmones superficiales ya que el vector de onda de los fotones es siempre menor que el
de los plasmones. En la figura 1.5 se representa gráficamente esta situación. Se puede ver
que la curva de dispersión de los plasmones está siempre por debajo de la curva de
dispersión de los fotones propagándose en el dieléctrico. Esto indica que es imposible que
estos fotones se acoplen a los plasmones superficiales.
ω
ω=
c
kf
εd
ω=
c
kf
εp
Figura 1.5: relaciones de dispersión
ω=c kf
εm + εd
εm⋅ εd
ωi
para fotones incidentes desde un
dieléctrico d (recta violeta), un prisma
p de índice de refracción mayor
(recta azul punteada) y plasmones
superficiales en una interfase entre
un metal m y el dieléctrico d.
ksp
k
Una manera de solucionar este problema experimentalmente es mediante la configuración
de Kretschmann[5]*. Esta consiste en hacer incidir fotones a través de un prisma dieléctrico p,
*
Existen también otros métodos de acoplamiento, como por ejemplo el propuesto por Otto [4] y el acoplamiento
por gratings[1].
12
de índice de refracción mayor
( εp >
)
ε d . La curva de dispersión de estos fotones se
muestra también en la figura 1.5 con una línea punteada. El vector de onda de estos fotones
es, dentro de ciertos límites de frecuencia, mayor que el vector de onda de los plasmones
superficiales. En este caso, los fotones pueden excitar plasmones superficiales si inciden con
el ángulo adecuado (figura 1.6)
kf
θsp
x
z
Prisma
Metal
Dieléctrico
ksp
Figura 1.6: componentes X de los vectores de
onda de un fotón incidente desde un prisma y
los plasmones superficiales que se propagan
entre un metal y un dieléctrico de índice de
refracción menor al del prisma.
Experimentalmente, este acoplamiento resonante puede observarse midiendo la intensidad
reflejada, o mejor aún la reflectividad, en función del ángulo de incidencia. Se observará un
pronunciado mínimo en la reflectividad cuando el ángulo de incidencia es tal que se verifica la
condición de resonancia.
k spx =
ω εm⋅ εd
ω
=
ε p sin θ sp = k fx
c εm + εd
c
(36)
De la condición de resonancia (36) puede calcularse el ángulo de incidencia
correspondiente al acoplamiento de los fotones incidentes con los plasmones superficiales.
Dicho ángulo se denomina θsp (figura 1.6)
θ sp = arcsin
εm⋅ εd
(ε m + ε d ) ⋅ ε p
(37)
En la figura 1.7 se muestra una curva de reflexión interna total en un prisma de LaSFN9
(ε=3.403) y una curva de reflectividad medida para un film de 50 nm de Au evaporado sobre un
prisma de LaSFN9. Vale la pena comparar ambas curvas y destacar algunas de las
características más notables de la curva de resonancia de plasmones:
1)
Para ángulo de incidencia menores que el ángulo crítico de reflexión total θc,
puede verse que la reflectividad es mucho mayor. Esto se debe a que el film metálico
actúa parcialmente como espejo
13
A pesar de lo marcado en 1), el θc puede todavía distinguirse con claridad. Esto
2)
es de importante utilidad para la calibración de los equipos de medición como se verá
más adelante.
Para ángulos de incidencia mayores que θc la reflectividad es menor que en el
3)
caso de reflexión interna total debido a cierta absorción en el metal y se mantiene
prácticamente constante hasta que se aproxima el ángulo de acoplamiento con los
plasmones superficiales θsp, donde la reflectividad comienza a disminuir hasta valores
muy bajos.
1,0
1,0
0,8
Reflectividad
Reflectividad
0,8
0,6
0,4
0,2
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
45
θ
50
c
55
θ [°]
60
45
θ
50
c
55
θ [°]
θ
60
65
SP
Figura 1.7: curvas de reflectividad para un prisma de LaSFN9 (ε=3,4039) y para
un film de Au (ε =-12,3 + i 1,29) de 50nm evaporado sobre un prisma de LaSFN9.
Como se expuso anteriormente, los plasmones superficiales generan un campo óptico en la
interfase metal / dieléctrico que tiene su máxima intensidad en la interfase y decae
exponencialmente hacia el interior del dieléctrico. Esto sucede también en el caso de reflexión
interna total (ver apéndice I.4). Una diferencia muy importante en este caso es que debido al
proceso de resonancia establecido entre el campo electromagnético incidente y los
plasmones, la intensidad del campo evanescente en la superficie se ve notablemente
amplificada. Por ejemplo, en la figura 1.8, se muestran los casos de un film de Au y de un film
de Ag, ambos de 50 nm de espesor; el factor de amplificación es de aproximadamente 16 en
el caso del Au, y de 50 en el caso de la Ag. Las curvas mostradas en la figura 1.8 fueron
calculadas resolviendo las ecuaciones de Fresnel para los sistemas mencionados. Todas las
características ópticas de estos sistemas pueden ser descriptas mediante la resolución de
14
dichas ecuaciones, las cuales quedan determinadas por las constantes dieléctricas y los
espesores de las capas involucradas*.
De la comparación de las curvas expuestas en la figura 1.8 puede notarse directamente
que el mínimo es mucho más agudo en el caso de la Ag. Esto se debe a que la Ag es un
metal apreciablemente más transparente que el Au (ε”Ag < ε”Au)† Este es el comportamiento
típico de un proceso de resonancia, si los plasmones actuasen como resonadores perfectos,
el mínimo debería ser perfectamente agudo; es decir, en el caso ficticio de un metal sin
pérdidas (ε”=0), el ancho mitad del mínimo debería ser nulo.
1,0
1,0
50
50
0,8
0,8
10
0
45
50
55
60
2
0,6
30
2
ES / Ein
0,4
20
Reflectividad
2
ES / Ein
2
0,6
30
0,4
20
0,2
10
0,0
65
0
Reflectividad
40
40
0,2
45
θ [°]
50
55
0,0
60
θ [°]
Figura 1.8: reflectividad e intensidad del campo eléctrico relativa en la superficie (z=0),
para 50nm Au (derecha; εAu= -12+ i 1,29) y para 50nm de Ag (izquierda; εAg= -17+ i 0,5).
Otra particularidad es que los máximos de intensidad no coinciden con los mínimos de
reflectividad. La razón una vez más está en el carácter resonante de los plasmones
superficiales. Cuando se atraviesa la resonancia, el campo sufre un cambio de fase de 180°,
como en cualquier resonador. En el caso ficticio de un metal sin pérdidas, dicho cambio de
fase sucede puntualmente en el ángulo de resonancia θsp. En cambio, en un caso real (cómo
en un resonador amortiguado), el cambio de fase sucede más gradualmente, y será más
difuso cuánto mayores sean las pérdidas. Ahora, lo que se observa en la reflexión es la
superposición coherente de una onda parcial reflejada directamente por la interfase metal /
dieléctrico, y una fracción del modo superficial re-irradiada vía el prisma. Entonces, el mínimo
*
†
Y por supuesto toda la información concerniente al campo incidente.
εAg= -17+ i0,5; εAu= -12+ i1,29.
15
en reflectividad que se observa se debe a la interferencia destructiva entre dos ondas
parciales que difieren en fase por 180°. Esta interferencia se produce justo después del
ángulo de máxima intensidad de los plasmones superficiales. Una vez más, a mayores
pérdidas, más difuso será el cambio de fase, y mayor la diferencia entre las posiciones
angulares del máximo de intensidad y el mínimo de reflectividad.
1.5 – Plasmones Superficiales en Sistemas Multicapas
Como ya se expuso en más de una oportunidad, los plasmones superficiales tienen
asociado un campo electromagnético superficial evanescente que tiene su máxima intensidad
en la superficie y decae exponencialmente hacia el interior del dieléctrico. La longitud de
decaimiento depende de la longitud de onda del campo incidente y de las propiedades ópticas
del metal; para longitudes de onda usuales* y filmes de metales nobles, su valor es del orden
de los 200nm. Por este motivo, cualquier cambio en las propiedades ópticas del dieléctrico,
dentro de los 200nm aproximadamente, alterará las condiciones de excitación de los
plasmones superficiales. Esta característica es la que permite detectar por ejemplo la
adsorción de una nueva capa dieléctrica mediante el monitoreo del ángulo de resonancia.
Considérese ahora el mismo sistema que en la sección anterior, prisma / metal / dieléctrico,
pero insertando una nueva capa de dieléctrico sobre el metal. Supongamos que el nuevo
dieléctrico tiene una constante dieléctrica εa mayor que la del medio dieléctrico original (εa>εd).
En este caso, el índice de refracción efectivo con el que interactúan los plasmones
superficiales es mayor. Esto es equivalente a correr la curva de dispersión de los plasmones
superficiales hacia vectores de onda mayores. La figura 1.9 muestra este corrimiento; la curva
correspondiente a ωsp es la relación de dispersión de los plasmones en el sistema original, y la
curva ωsp´ en el sistema con la nueva capa dieléctrica.
En consecuencia, a una dada frecuencia, el vector de onda de los plasmones superficiales
será mayor y se necesitará un ángulo de incidencia mayor para excitar dichos modos. De
este simple razonamiento uno puede concluir que las condiciones de excitación de los
plasmones superficiales dependerán del índice de refracción efectivo del medio en contacto
con el metal, dentro de una distancia del orden de los 200nm a partir de la interfase.
Entonces, si una capa uniforme dieléctrica se adsorbiera sobre el metal, uno podría, dado el
espesor de dicha capa, calcular el índice de refracción o viceversa. Es importante recalcar que
estas magnitudes no pueden medirse independientemente con una técnica como esta. Es
más, si la capa dieléctrica no es uniforme, entrará en juego también la fracción de área
cubierta por el dieléctrico.
*
En el espectro visible e IR cercano. Típicamente: 630nm (Láser de HeNe)
16
ω
ωd(k)
Figura 1.9: relaciones de dispersión para fotones
ωp(k)
incidentes desde un dieléctrico d (recta violeta),
ωsp(k)
ωsp’(k)
un prisma p de índice de refracción mayor (recta
azul punteada), plasmones superficiales en una
interfase entre un metal m y el dieléctrico d
ωi
(verde; ωsp) y plasmones en una interfase igual a
la anterior pero con una capa extra (rojo; ωsp’)
ksp ksp’
k
La reflectividad de un sistema multicapa puede calcularse teóricamente con las constantes
dieléctricas y los espesores de cada capa como dato. Estos cálculos de reflectividad se llevan
a cabo considerando la distribución de los campos, la reflexión y transmisión en cada capa. El
formalismo matemático que extiende los resultados obtenidos en la sección 1.3 se denomina
método de la matriz de transferencia (Transfer Matrix Method) y es la base del programa de
computación Winspall utilizado para el análisis de las mediciones realizadas en este trabajo.
Una descripción detallada del método matemático puede encontrarse en [6].
17
CAPÍTULO 2: TÉCNICAS BASADAS EN LA RESONANCIA DE PLASMONES
SUPERFICIALES
2.1– Introducción
En este capítulo se presentarán tres técnicas basadas en la excitación de plasmones
superficiales que son de gran utilidad para caracterizar películas delgadas y estudiar procesos
cinéticos en superficies:
- Espectroscopía por resonancia de plasmones superficiales (SPR).
Surface plasmon resonance spectroscopy
- Espectroscopía de fluorescencia por plasmones superficiales (SPFS)
Surface plasmon field enhanced fluorescence spectroscopy
- Microscopía por resonancia de plasmones superficiales (SPM)
Surface plasmon microscopy
- Microscopía de fluorescencia por resonancia de plasmones superficiales (SPFM)
Surface plasmon fluorescence microscopy
Se expondrán las potencialidades y limitaciones de estas técnicas en general y se explicará
cómo se aplicaron estas técnicas en este trabajo en particular.
2.2– Espectroscopía por resonancia de plasmones superficiales (SPR)
Como se ha explicado en el capítulo 1, las condiciones de excitación de plasmones
superficiales dependen de las propiedades dieléctricas del medio en un rango de 200nm. Más
específicamente, si se considera un sistema multicapa, el ángulo de incidencia para la
excitación de plasmones superficiales depende del espesor óptico (índice de refracción y
espesor) de las capas involucradas. Recordando la ecuación (38) del capítulo 1:
∆ θ sp ∝ ∆n ⋅ ∆d
(1)
Entonces, conocidas las condiciones de excitación de plasmones superficiales, se puede
obtener el espesor (efectivo) dado el índice de refracción, o viceversa.
Lo antedicho es justamente la base de la espectroscopía por resonancia de plasmones
superficiales: detectar cambios superficiales en una interfase mediante el monitoreo de las
condiciones de excitación de los plasmones superficiales. Esto da origen a dos modos de
medición (figura 2.1):
1-
Barrido: consiste en la medición de la reflectividad en función del ángulo de
incidencia, lo que permite obtener la posición angular del mínimo de reflectividad θsp.
Midiendo el corrimiento de θsp producido por la adsorción de una capa dieléctrica, y
18
teniendo como dato el índice de refracción de la misma, puede calcularse el espesor o
viceversa. Para ello se ajustan las curvas experimentales a través del software
Winspall2.0 que se basa en el método de la matriz de transferencia; dicho software fue
desarrollado en nuestro grupo.
2-
Cinético: el objetivo es monitorear el crecimiento de una película o el avance de
un proceso de adsorción superficial. Consiste en posicionar el detector a un ángulo de
incidencia determinado y registrar el aumento de la reflectividad en función del tiempo.
Este aumento se debe a que a medida que la masa depositada sobre la superficie
aumenta, el acoplamiento de los plasmones superficiales se produce a ángulos de
incidencia mayores. El ángulo se elige preferentemente a la derecha del mínimo de
reflectividad porque en esa zona las pendientes de las curvas de reflectividad antes y
después (de la formación de la película o adsorción de las moléculas) son
prácticamente paralelas, y en consecuencia el aumento en la reflectividad es
directamente proporcional al corrimiento del mínimo (el cual es a su vez proporcional al
espesor o la masa adsorbidas sobre la superficie; ecuación (1)).
Reflectividad
Modo de Barrido
Modo Cinético
1,0
1,0
0,8
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
40
45
50
55
θ [°]
60
65
70
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo [min]
Figura 2.1: modos de operación de la espectroscopía por resonancia de plasmones (SPR)
La espectroscopía por excitación de plasmones (SPR) se ha convertido en una herramienta
analítica ampliamente aceptada para la caracterización de interfases y films delgados y para
el estudio de procesos cinéticos superficiales, como por ejemplo reacciones de inmovilización
19
en interfases. Una variedad de instrumentos comerciales basados en esta técnica están
actualmente disponibles* y son ampliamente utilizados. La mayor ventaja del SPR es que
permite trabajar con muestras no marcadas, ya que es la simple presencia de las moléculas
de analito en la interfase, o más precisamente el contraste óptico que estas moléculas
producen lo que se detecta. Por ejemplo, la formación de una capa monomolecular de
Streptavidina, una proteína tetramérica de masa molecular 60000 g/mol,
con un
empaquetamiento lateral máximo del 60%, produce un desplazamiento del ángulo de
resonancia de plasmones (θsp) de 0,5° que corresponde a una capa de d= 4nm (asumiendo un
n=1,45). El mínimo espesor detectable (determinado por el índice de refracción y la menor
división del goniómetro) es en este caso de 0,1-0,2 nm, lo cual brinda una relación señal/ruido
suficientemente alta como para realizar un análisis cinético detallado y obtener con precisión
constantes cinéticas y de afinidad. Además, las curvas medidas pueden ajustarse muy
satisfactoria
2.3– Espectroscopía de fluorescencia por plasmones superficiales (SPFS)
Si se quieren detectar capas muy diluidas lateralmente o analitos de bajo peso molecular,
la técnica SPR es ineficaz. En estos casos se generan capas efectivas muy finas que
producen un desplazamiento angular demasiado pequeño como para ser detectado. Estas
limitaciones de detección han inducido el uso de muestras marcadas (fluorescentes) para
incrementar la señal de los eventos en la interfase.
A continuación se explicarán los conceptos básicos referidos al uso del campo óptico
evanescente generado por los plasmones superficiales para la excitación de fluoróforos
cercanos a la interfase [8].
Como se explicó en el capítulo anterior, lo plasmones superficiales tienen asociado un
campo óptico evanescente que penetra en el dieléctrico y decae exponencialmente dentro de
él. Esta especificidad superficial hace que este campo electromagnético sea de gran interés
para el estudio de fenómenos superficiales, pero no es una característica única del campo
asociado a los plasmones superficiales; en condiciones de reflexión interna total (Apéndice
I.8), también se produce un campo electromagnético evanescente cuya amplitud es máxima
en la interfase y decae exponencialmente dentro del medio. En ambos casos la longitud de
decaimiento es del orden de la inversa del vector de onda incidente. La diferencia principal
entre estos dos campos es la amplificación de la intensidad en la interfase, es decir la relación
entre la intensidad incidente y la intensidad en la superficie, Es2/Ei2. Este factor de
amplificación es 4 para el caso de reflexión interna total, cuando se incide con el ángulo crítico
(ver apéndice I.8). Para el caso de resonancia de plasmones superficiales, la máxima
*
Biacore, Texas Instruments.
20
intensidad se encuentra cerca del mínimo de reflectividad (cómo se explicó en el capítulo 1) y
el factor de amplificación depende de las propiedades dieléctricas del metal: para Au es
aproximadamente 16, y para Ag 50 (Figura 2.2).
1,0
50
0,8
2
ES / Ein
2
0,6
30
0,4
20
Reflectividad
40
θ
H2O
0,2
10
0
0,0
45
θ
50
c
55
60
θ [°]
1,0
50
0,8
30
2
ES / Ein
2
0,6
0,4
20
Reflectividad
40
θ
Au
H2O
0,2
10
0
45
50
55
60
0,0
65
θ [°]
1,0
50
0,8
30
2
ES / Ein
2
0,6
0,4
20
Reflectividad
40
θ
Ag
H2O
0,2
10
0
45
50
55
0,0
60
θ [°]
Figura 2.2: cálculos de reflectividad e intensidad de campo en la interfase
(normalizada a la intensidad incidente) en función del ángulo de incidencia, para
un sistema multicapa: prima (ε =3,4039), (a) H2O, (b) 50nm Au/H2O y (c) 50nm
Ag/H2O. La longitud de onda del haz incidente es de 630nm.
21
Esta mayor intensidad de campo es muy favorable para SPFS ya que la intensidad de la
fluorescencia emitida por un cromóforo aumenta con la intensidad del campo excitante (y con
la probabilidad de decaimiento radiativo desde el nivel excitado al nivel base*). Por esta razón
cuando es posible se utilizan films de Ag, aunque en muchos casos se prefiere Au por su
estabilidad química†.
El próximo punto que merece atención es el comportamiento de un cromóforo emitiendo en
las cercanías de una superficie metálica. Dependiendo de la distancia del cromóforo al metal,
diferentes mecanismos de disipación se hacen predominantes (Figura 2.3).
Si el cromóforo se encuentra muy cerca de la superficie metálica, la energía almacenada
en el cromóforo durante la excitación se disipa en el metal en forma de calor. Este proceso noradiativo de relajación se llama quenching‡ y reduce notablemente el tiempo de decaimiento
(vida media del estado excitado) y la intensidad de la fluorescencia emitida.
Para distancias de separación intermedias, los cromóforos excitados pueden emitir
acoplándose con estados plasmónicos del metal. Se encontró que una distancia de
separación óptima para este mecanismo es de unos 20nm [12]. Naturalmente, parte de la
energía de excitación se disipa en la molécula fluorescente en forma de modos vibracionales.
Por lo tanto, los plasmones acoplados de esta manera están corridos hacia el rojo con
respecto al campo de excitación, y en consecuencia emiten en un cono a ángulos ligeramente
menores [13].
A distancias más grandes, la emisión radiativa de los cromóforos no se ve modificada por la
presencia del metal, a excepción de efecto despreciables de interferencia entre el campo
emitido y el reflejado por la superficie metálica que actúa como espejo.
Todo lo antedicho se puede resumir matemáticamente en la siguiente ecuación [11]:
4
Id   d0  
= 1 +   
I∞   d  


−1
(2)
En la cual I∞ es la intensidad de fluorescencia emitida por un cromóforo a una distancia
infinita de la superficie del metal, es decir en ausencia de cualquier metal. Id es la intensidad
emitida a una distancia d y d0 es el llamado radio de Förster, que da la distancia a la cual la
intensidad de fluorescencia es la mitad de la correspondiente a una separación infinita.
Valores típicos del radio de Förster son 7 u 8 nm.
*
Se asume que la longitud de onda de excitación está dentro del rango de absorción del cromóforo. Además, como
generalmente se trabajará con sistemas estratificados en una interfase sólido / líquido, se considera el
comportamiento de un arreglo plano de cromóforos.
†
Otra razón por la cual se puede preferir Au es para poder usar intensidades de láser que brinden una buena
relación señal / ruido sin saturar el fotomultiplicador.
‡
Se denomina quenching de fluorescencia a cualquier proceso que disminuya la intensidad y/o vida media de un
cromoforo. Estos procesos pueden ser por ejemplo, transferencia de energía (como el poceso mencionado arriba),
formación de complejos, reacciones del estado excitado o colisiones (dynamic quenching).
22
Plasmones
Superficiales
Disipación
Radiación
Prisma (εp)
Figura 2.3: mecanismos de disipación de
la energía almacenada en lo cromóforos
Metal (εm)
excitados [8].
Cromóforo
Agua (εd)
Por supuesto que si se trata de un cromóforo excitado por el campo evanescente de
plasmones superficiales, no se observará fluorescencia si el cromóforo se encuentra más allá
de la distancia de decaimiento del campo de los plasmones, la cual está en el rango de los
200nm. Entonces, cuando se trata de detectar fluorescencia proveniente de un cromóforo
excitado por el campo óptico de plasmones superficiales, la distancia óptima del cromóforo a
la superficie estará determinada por el compromiso que imponen los mecanismos de
relajación y la intensidad del campo excitante. En la figura 2.4 se esquematiza la situación. La
línea llena representa la intensidad del campo óptico de los plasmones superficiales (para un
film de 50nm de Au) normalizada con la intensidad del campo incidente y la línea punteada
representa la intensidad de fluorescencia dada por la ecuación (2) con un radio de Förster de
10nm.
Prisma
Metal Agua
16
14
E 2s
E i2
12
10
1
8
6
4
2
0
-100
0
100
200
300
400
Intensidad de Fluorescencia
18
Figura
2.4:
perfiles
de
la
intensidad del campo eléctrico
Id
I∞
producido por los plasmones
superficiales y de la emisión de
un fluoróforo en las cercanías
de un metal.
0
Posición [nm]
23
Como se puede ver en la figura 2.4, todo el proceso de quenching se lleva a cabo en una
distancia de entre 10 y 15 nm, mientras que el decaimiento del campo evanescente de los
plasmones superficiales se produce en distancias de los cientos de nm. Esto significa que
cromóforos ubicados a una distancia de un radio de Förster, sufrirán una pérdida de
intensidad de fluorescencia de un factor 2, pero todavía se encuentra dentro de la zona de
campo excitante altamente amplificado por modos resonantes de los plasmones superficiales.
Eso significa que si se diseña adecuadamente la arquitectura superficial para la detección de
analitos fluorescentes, puede ganarse mucho en sensibilidad al usar el campo óptico de
plasmones superficiales para “iluminar” a los cromóforos.
La técnica de SPFS puede aplicarse, al igual que la SPR, en modo de barrido y en modo
cinético. No es necesario aclarar nada especial sobre el modo de barrido; se registran
simultáneamente la reflectividad y la fluorescencia en función del ángulo de incidencia. Con
respecto al modo cinético, se realiza de igual modo que en SPR. Se fija el ángulo de
incidencia a izquierdas del mínimo de reflectividad, y se registra la intensidad de fluorescencia
en función del tiempo. A medida que más analito fluorescente se acerca a la superficie, la
intensidad de fluorescencia aumentará. Este aumento será proporcional siempre y cuando el
analito que se deposita sobre la superficie no produzca un corrimiento del ángulo de
resonancia de los plasmones. En cambio, si los analitos fluorescentes que se acercan a la
superficie producen un corrimiento notable del ángulo de resonancia de los plasmones
superficiales, la excitación de los cromóforos decaerá a medida que más y más analito se
acerque a la superficie. Este efecto hace que el incremento de la intensidad de fluorescencia
ya no sea proporcional a la cantidad de analito depositada sobre la superficie, lo cual complica
el análisis de los datos cinéticos. Se puede ver de cálculos y se verifica experimentalmente
que la no-linealidad se hace importante a partir de desplazamientos del ángulo de resonancia
de plasmones mayores a 0,4°, por debajo de ese límite este efecto puede despreciarse [7][8].
En la figura 2.5 se muestran dos mediciones de barrido sucesivas, antes y después de la
adsorción de un analito fluorescente sobre un film de Au de 50nm. Las curvas de reflectividad
antes y después de la adsorción son idénticas. Sin embargo las curvas de fluorescencia son
muy diferentes. Antes de la adsorción se midió solamente un fondo del orden de unas 4000
cps. Después de la adsorción se midió un espectro de fluorescencia correspondiente a la
emisión de los fluoróforos que penetraron en el campo de los plasmones superficiales. Puede
observarse que, como es lógico, la forma de la curva de emisión de fluorescencia en función
de ángulo de incidencia es análoga a la del campo electromagnético de los plasmones.
24
Figura 2.5: mediciones de SPFS
antes
0,8
Reflectividad
6
0,4
5,0x10
0,2
y
rojo)
y
después (verde y violeta) de la
0,6
1,0x10
(anaranjado
6
5
Fluorescencia [cps]
1,5x10
adsorción de un analito marcado
con Cy5 sobre un film de Au.
Las curvas de reflectividad son
idénticas antes y después. En
cambio la fluorescencia aumenta
dramáticamente
cuando
los
analitos fluorescentes se adsorben
0,0
0,0
45
50
55
θ [°]
60
65
en la superficie y son excitados por
el
campo
eléctrico
de
los
plasmones superficiales.
Set-up experimental
En la figura 2.6 se muestra el set-up experimental utilizado en este trabajo para realizar
mediciones mediante SPR y SPFS. Cómo se puede ver el sistema es sencillo. Básicamente
es un set-up de SPR [14] modificado con unidades para la detección de fluorescencia.
Consiste en un goniómetro θ -2θ (Huber) que puede moverse de a pasos de 0,001°, donde se
montan las muestras para variar el ángulo de incidencia del haz láser. Para medir la
reflectividad se usa un fotodiodo y un amplificador lock-in, de manera tal que se computa la
intensidad solamente en la longitud de onda del láser incidente. Este dispositivo cuenta con
dos lásers, lo cual permite trabajar con dos longitudes de onda. Sin embargo para los
experimentos realizados en este trabajo sólo se utilizó una: 630nm (HeNe; Uniphase 5mW).
Para medir fluorescencia se utilizó un fotomultiplicador (PM1; Hamamatsu) y un contador
(HP). Se trabaja con una computadora personal que controla los motores paso a paso de
goniómetro, los obturadores y el sistema de protección del fotomultiplicador, y registra la
posición del goniómetro y las señales del amplificador y el contador. Cabe aclarar que cuando
se trabaja en SPR todo el circuito del fotomultiplicador no se utiliza; ésta parte del set- up se
utiliza para trabajar en SPFS.
25
Fotodiodo
Lente
θ
Obturador
Láser HeNe
Divisor
de haz
Chopper
θ
Prisma y
celda de flujol
Lente
Polarizador
Goniómetro
Láser Nd YAG
Espejo
Filtro
Fotomultiplicador
Polarizador
Control de
obturadores
Amplificador
de entrada
fija (lock-in)
Protección de
Fotomultiplicador
Contador
Figura 2.6: Set-up experimental empleado para las mediciones de SPR y SPFS.
El formato de las muestras empleadas para los experimentos de este trabajo es el
siguiente. Para excitar a los plasmones superficiales se utilizó como acople óptico un prisma
de ángulo recto en la configuración de Kretschmann; el material del prisma es un vidrió de alto
índice de refracción (Schott, LaSFN9; ε = 3,4039). El film metálico* se evaporó sobre
pequeños sustratos de LaSFN9, que se acoplaron al prisma por medio de un aceite de índice
de refracción similar.† Sobre el film metálico se posiciona el cuerpo principal de la celda de
flujo (figura 2.7b) que está construido con un vidrio de baja fluorescencia (Schott, Herasil).
Este se sella contra el metal y contra el plato de fondo (Herasil) a través de O-rings (figura
2.7a).
*
†
En general se utiliza Au por su estabilidad química frente a los solventes comúnmente usados.
Este procedimiento se realiza por dos razones:
1- es más fácil evaporar sobre los pequeños vidrios planos que sobre el prisma.
2- la superficie de la cara del prisma se daña con los usos sucesivos. De esta manera, sólo es necesario
reemplazar los sustratos que son notablemente más baratos.
26
θ
Prisma
Líquido acoplante
Sustrato de Vidrio
Film metálico
O-rings
Celda de flujo
(a)
Plato de fondo
Entrada
Salida
(b)
Figura 2.7: celda de flujo.
2.4– Microscopía por resonancia de plasmones superficiales (SPM)
Para entender el funcionamiento de esta técnica considérese una muestra compuesta por
un film metálico sobre el cual se han preparado escalones de una capa dieléctrica de distintos
espesores. Supóngase que un haz de luz p-polarizada se expande y se hace incidir sobre
esta muestra de modo que ilumine las diferentes zonas simultáneamente. En ese caso las
distintas áreas con diferentes espesores tienen diferentes reflectividades y si se detecta el haz
reflejado con una cámara, se obtendrá una imagen con contrastes correspondientes a los
diferentes espesores [14][15][16].
En la figura 2.8 se ilustra el principio de funcionamiento de SPM. Se exponen cuatro curvas
de reflectividad para 4 espesores de una capa de sílice sobre un film de Au y se muestra
cómo se generan los contrastes para dos ángulos de incidencia [17].
27
1 2 3 4
a
0,9
Reflectividad
1 2 3 4
b
Figura 2.8: principio de funcionamiento de la
microscopia por resonancia de plasmones. Para
1
0,6
un dado ángulo de incidencia, los distintos
2
espesores producirán una reflectividad diferente
3
0,3
produciendo un contraste [17].
4
0
24
26
28
30
θ [°]
También en SPM puede trabajarse en modo de barrido y en modo cinético. Para extraer
información cuantitativa de las imágenes obtenidas se necesita trabajar con una cámara CCD
que capture las imágenes en forma digital, para poder posteriormente analizar los contrastes
con un software adecuado. De este análisis se pueden reconstruir las curvas de reflectividad
en función del ángulo de incidencia y las curvas de reflectividad en función del tiempo para
distintos puntos del sustrato. Esto significa que puede trabajarse con arreglos multi-spot, lo
cual constituye la principal ventaja de la SPM. De esta manera pueden preparase un número
de spots sobre un mismo sustrato con diferentes arquitecturas superficiales, exponerlos a la
misma solución y monitorear la evolución de los procesos con la garantía de que las
condiciones experimentales son idénticas en todos los puntos (concentración, temperatura,
etc.)*. En resumen, en una medición de SPM se obtiene información equivalente a varias
mediciones de SPR. La mayor desventaja de esta técnica es que la preparación de las
muestras y el alineamiento del equipo son notablemente más complicados que en las técnicas
anteriores.
A diferencia de otras microscopías en las cuales la resolución está limitada por la longitud
de onda, la SPM puede alcanzar resoluciones en espesor que van desde algunos ángstroms
hasta cientos de nanómetros.
La resolución lateral, es decir el tamaño de las mínimas estructuras visualizables, está
determinada por la longitud de decaimiento de los plasmones superficiales, la cual depende
de la parte imaginaria de la constante dieléctrica del metal utilizado. A mayor ε”, es decir
mayores pérdidas, la longitud de decaimiento es menor y consecuentemente la resolución
lateral es mayor. Por este motivo se prefiere usar Au para SPM, además de que el Au es
químicamente más estable que cualquier otro metal.
*
Asumiendo que se expande el haz homogéneamente sobre toda el área de interés.
28
2.5– Microscopía de Fluorescencia por resonancia de plasmones superficiales (SPFM)
Análogamente, si se trabaja con material fluorescente, pueden capturarse imágenes de la
fluorescencia emitida. Un análisis de esas imágenes permite obtener las curvas fluorescencia
emitida por distintos puntos del sustrato. La microscopía de fluorescencia por resonancia de
plasmones tiene las mismas ventajas y desventajas que la SPM, y las mismas ventajas y
limitaciones que la SPFS.
Set-up experimental
En la figura 2.9 se muestra el set-up experimental utilizado para SPM y SPFS. Presenta
unas pocas modificaciones con respecto a un set-up de SPR o SPFS:
-
Se expande el haz incidente a través de un filtro espacial (objetivo + pinhole)
-
Mediante una lente convergente se obtiene un haz paralelo.
-
En lugar de un fotodiodo (en el caso de SPR) o un fotomultiplicador (en el caso de
SPFS) se utiliza una cámara CCD con su objetivo, la cual produce una imagen que se
visualiza en un monitor.
Se utiliza una computadora personal para controlar y registrar la posición del goniómetro y
para capturar las imágenes. Posteriormente se pueden analizar las imágenes adquiridas y
cuantificar los contrastes en diferentes zonas de modo de obtener las curvas de reflectividad
individuales.
Cámara
CCD
Lente
Objetivo
Monitor
PC
Prisma
Láser
Polarizadores
Lente
θ
Film metálico
Recubrimiento
Objetivo
Filtro
espacial
Filtro
Cámara
CCD
Figura 2.9: set-up experimental empleado para mediciones de SPM y SPFM
29
CAPÍTULO 3:
HIBRIDIZACIÓN DE ADN
3.1 – Introducción
Para comprender la posterior discusión acerca de los esquemas de detección de
reacciones de hibridización, se necesita conocer las principales propiedades físicas y
químicas de las moléculas de ADN. Con ese sentido, se tratan en el presente capítulo las
características elementales de la estructura y la conformación del ADN, como así también las
propiedades fundamentales que derivan de ellas.
3.2 – Ácido Desoxiribonucleico (ADN)
El ácido desoxiribonucleico, ADN, es una biomolécula de importancia trascendental para
las células vivas. Su función consiste en almacenar la información genética y transmitirla de
generación en generación. Esta información se manifiesta cuando, en las condiciones
adecuadas, es transcripta al ácido ribonucleico, ARN, para que éste último se encargue de
transformarla en una secuencia de aminoácidos. Entonces, el ADN contiene en su secuencia
toda la información necesaria para la síntesis de las proteínas necesarias para los seres
vivientes.
El ADN es un biopolímero compuesto por una secuencia de nucleótidos [19][20]. Estos
monómeros están compuestos por tres partes (figura 3.1):
-
una base nitrogenada
-
un grupo trifosfato
-
un azúcar
En el caso del ADN, el azúcar es la desoxiribosa y se encuentra en forma de anillo
furanósido. La desoxiribosa está unida a una base nitrogenada a través de una unión βglicosídica en el Carbono 1’ y tiene un grupo trifosfato unido en el Carbonos 5’. Las bases
pueden ser una purina: Adenina (A) o Guanina (G), o una pirimidina: Timina (T) o Citosina (C).
Para dar la cadena de ADN, los nucleótidos se unen a través de una unión fosfodiéster,
liberando un anión difosfato y un protón. Esta unión se forma a través de la reacción de un
grupo trifosfato de un nucleótido (ubicado en el Carbono 5’ de la desoxiribosa) con el oxhidrilo
de otro (ubicado en el C 3’).
Estas uniones forman el esqueleto de las cadenas de ADN constituido por el azúcar y el
fosfato. Dicha cadena no es simétrica y pueden entonces distinguirse los extremos, uno se
denomina 3’ y el otro 5’. Así, un nuevo nucleótido siempre se adiciona en el extremo 3’ (figura
3.2).
30
Guanina
Citosina
Adenina
Timina
Figura 3.1: los cuatro nucleótidos que componen el ADN. Un nucleótido está compuesto
por un grupo trifosfato (encerrado en rosa), un azúcar (ribosa en el caso de ADN; azul) y
una base nitrogenada. En el ADN se encuentran presentes cuatro nucleótidos diferentes
sólo distinguibles por sus bases: Guanina, Adenina, Citosina, Timina.
Dos cadenas de ADN pueden unirse para formar una doble cadena (llamadas también
dúplex). Esto se produce a través de uniones puente de Hidrógeno entre las bases. Los pares
unidos no son cualesquiera sino que son Adenosina (A)-Timina (T) y Citosina (C)-Guanina (G)
(Figura 3.3)[21]. Y esto da origen a la regla de Chargaff: en una doble cadena de ADN, la
cantidad de Purinas (A y G) es igual a la cantidad de Pirimidinas (T y G)*.
Para que una doble cadena se forme, es necesario que las secuencias de ambas cadenas
sean lo suficientemente complementarias; esto quiere decir que las uniones puente de H
formadas sean suficientes para estabilizar la nueva estructura.
Por supuesto el dúplex más estable se produce cuando ambas cadenas son perfectamente
complementarias. Sin embargo, dentro de ciertos límites, pueden formarse también dobles
cadenas que no son perfectamente complementarias, y naturalmente estas últimas serán
menos estables que las primeras.
*
Y a una regla nemotécnica para recordar los pares formado: Aníbal Troilo (AT) y Carlos Gardel (CG).
31
5´
3´
Figura 3.2: estructura de la cadena de ADN. Obsérvese como se forman las
uniones fosfo-diéster entre los nucleótidos que dan origen a la cadena de ADN.
La conformación de las dobles cadenas fue dilucidada por Watson y Crick en 1953 [21] y
tiene la forma de una doble hélice (figura 3.3). Esto se debe, además de a las uniones puente
de H entre bases, a que los pares de bases son planos y tienden a apilarse unos sobre otros,
tomando una conformación similar a la de una escalera caracol con los pares de bases en el
lugar de los escalones.
Se conocen diferentes formas de hélices de ADN, pero bajo condiciones fisiológicas la
forma más común es la forma B. Esta forma es una hélice derecha de 2 nm de diámetro que
completa un giro cada 10 pares de bases en una longitud de 3,4 nm (la distancia entre bases
es de 0,34 nm; figura 3.3).
32
Esqueleto
de azúcar
Y fosfato
Timina
Adenina
Citosina
Guanina
Uniones
puente de H
Figura 3.3: dúplex de ADN. A la izquierda se muestra la estructura de doble
hélice que adopta el dúplex. A la derecha, un detalle de las uniones puente de
H entre las bases complementarias (AT y CG).
3.3 – Hibridización y desnaturalización
La reacción mediante la cual dos cadenas de ADN se unen para dar una doble cadena se
denomina reacción de hibridización. La reacción inversa, es decir la separación de una doble
cadena en dos cadenas individuales, se llama desnaturalización. En general, estas dos
reacciones constituyen un equilibrio dinámico entre los estados de cadenas individuales en
forma de ovillos estadísticos y las cadenas dobles en forma de hélice. La estabilidad de las
dobles cadenas depende de varios factores, uno de ellos es la temperatura. Al proceso de
desnaturalización por aumento de la temperatura se lo denomina melting*. Un parámetro que
permite cuantificar
la estabilidad de las cadenas dobles es la temperatura de
desnaturalización (Tm, melting temperature), que es la temperatura a la cual el 50% de las
cadenas dobles se separan. El proceso de melting o desnaturalización por temperatura de
ADN puede monitorearse por espectroscopía UV mediante la absorción a 260nm. Las bases
*
La traducción de melting al castellano es fusión. En inglés utilizan este término debido a las similitudes de este
proceso de denaturalización con el cambio de fase de sólido a líquido. Ambos procesos acontecen a una
temperatura dada si la muestra es pura. Si la muestra es impura (en el caso de ADN, la muestra es impura cuando
contiene más de una secuencia o cadenas de diferente longitud) el proceso sucede dentro de un rango de
temperaturas.
33
del ADN absorben a esa longitud de onda pero al formar la doble cadena, por efectos del
apilamiento, esta absorción se ve disminuida. Midiendo la absorción a 260nm en función de la
temperatura se obtiene la curva de melting, a partir de la cual puede obtenerse la temperatura
de melting.
A una temperatura dada, la estabilidad de la doble cadena de ADN depende de:
•
Contenido de C+G: los pares de bases CG contienen tres uniones puente de H,
mientras que las AT sólo tienen dos. Entonces a mayor contenido CG, más estable es
el dúplex y mayor la Tm.
•
Longitud de la cadena: a mayor longitud de cadena, mayor es la Tm. Además la
pendiente de la curva de melting es mayor, debido a una cooperación mejorada por el
apilamiento.
•
Fuerza iónica: cuando la fuerza iónica del solvente es alta, se evita la repulsión entre
los grupos fosfatos cargados negativamente. Esto estabiliza la doble cadena, subiendo
la Tm.
•
pH: Las cadenas de ADN son polielectrolitos, con grupos básicos (las bases) y grupos
ácidos (los fosfatos). La uniones puente de H se establecen entre las bases y,
lógicamente, son estables dentro de ciertos límites de pH.
•
Complementariedad:
la
presencia
de
no-complementariedades
(mismatches)
desestabiliza la doble cadena, no sólo por la ausencia de uniones de H, sino también
porque el apilamiento se ve distorsionado. El efecto desestabilizante disminuye a
medida que aumenta la longitud de cadena.
El último punto es muy importante porque permite, mediante la optimización de las otras
condiciones, la detección de mutaciones simples o deleciones entre dos cadenas. Lo antes
mencionado es la base de los métodos de detección que se explicarán en capítulos
posteriores.
Hairpin-loops
Si la secuencia es la adecuada, una cadena simple de ADN puede formar un lazo (loop) a
través de uniones puente de hidrógeno entre bases complementarias dentro de la misma
secuencia. Para que el anillo o loop sea estable debe tener al menos cuatro bases. Entonces,
siempre que se tenga una cadena simple de ADN que tenga dos fragmentos de su secuencia
auto-complementarios, separados por al menos cuatro bases, puede cerrarse sobre sí misma
para formar un hairpin-loop.
34
3.4 – Detección y secuenciado de ADN
En los métodos de secuenciado convencionales, se trata a las muestras de ADN con
agentes que producen una mezcla de fragmentos de cadena de diferentes longitudes y
marcados radioactivamente. Los fragmentos son separados por electroforesis en gel y
finalmente, del análisis de las bandas obtenidas en el gel puede deducirse la secuencia
[22][23]. Los métodos actuales de este tipo pueden secuenciar cadenas de hasta 1000 pares
de bases (pb, pares de bases) en algunas horas, lo cual es todavía lento para los
requerimientos actuales. Además, estas técnicas son caras (varios dólares por pb) y requieren
la utilización de materiales radioactivos y tóxicos. Por estas razones, en los últimos años, una
variedad de métodos alternativos han sido (y siguen siendo) desarrollados.
Como se dijo anteriormente, la mayoría de los esfuerzos se dirigen hoy en día hacia el
desarrollo de esquemas de detección de ADN en superficies, porque esto permite la posterior
fabricación de sensores y chips multispot para la detección automática. La mayoría de estos
métodos consiste en la detección de las reacciones de hibridización entre un oligonucleótido
inmovilizado en una superficie (catcher) y una cadena de ADN en solución (target). Como se
ha explicado en la sección anterior, la estabilidad y consecuentemente la constante de
afinidad de las reacciones de hibridización dependerá de la complementariedad de las
cadenas. El objetivo de estos métodos es distinguir entre secuencias de oligonucleótidos
perfectamente complementarias, y secuencias con un mismatch (MM1).
Una vez desarrollados estos métodos, diseñando adecuadamente los catchers, pueden
utilizarse para secuenciar cadenas completas de ADN mediante el método de secuenciado
por hibridización (SBH) [24][25]. Además, en muchos casos (usualmente en aplicaciones
farmacéuticas y biomédicas) no es necesario secuenciar una cadena completa de ADN sino
que interesa detectar una mutación en un gen determinado. Entonces se pueden preparar
sensores con la secuencia del gen defectuoso o examinar la existencia de diferentes
mutaciones simples, y así obtener el resultado deseado rápidamente.
Actualmente, una variedad de técnicas pueden ser utilizadas para la detección de
reacciones de hibridización en superficies. Entre estas técnicas pueden destacarse la
espectroscopía por
resonancia de plasmones [29]-[37], espectroscopía por ondas
evanescentes en fibras ópticas [38][37], microbalanza de cuarzo [27][28]. Otras técnicas
involucran la utilización de muestras marcadas; entre ellas espectroscopía de fluorescencia
por fibras ópticas [41], electroquímica luminiscente [40] y espectroscopía de fluorescencia por
resonancia de plasmones [39]. La decisión se inclinará por un métodos u otro contrastando la
alta sensibilidad que brindan las muestras fluorescentes con las ventajas de trabajar
directamente con muestras no marcadas.
35
De estas técnicas, en este trabajo se emplearon la espectroscopía por resonancia de
plasmones (SPR) y la espectroscopía de fluorescencia por resonancia de plasmones
superficiales (SPFS).
36
CAPÍTULO 4:
DETECCIÓN Y ESTUDIO DE REACCIONES SUPERFICIALES DE
HIBRIDIZACIÓN
4.1 – Introducción
Para detectar reacciones de hibridización sobre superficies y estudiar su cinética utilizando
las técnicas de SPR y SPFS, se hacen necesarios dos elementos: una superficie sensora y un
modelo cinético. En este capítulo se presentan las superficies sensoras y el modelo cinético
empleados en los experimentos realizados en este trabajo. Es importante notar que utilizando
a modo de ejemplo las arquitecturas de estas superficies sensoras, se explican todos los
conceptos necesarios de tener en cuenta para el diseño de nuevas superficies sensoras.
4.2 – Superficies sensoras
Las superficies sensoras deben tener las características apropiadas para que la detección
sea específica y efectiva. Dichas características se consiguen a través de diferentes
arquitecturas superficiales.
En este caso, se denominan arquitecturas superficiales a las estructuras supramoleculares
que se construyen en las superficies sensoras para inmovilizar a los oligonucleótidos que
actuarán como catchers para la detección de una secuencia de ADN.
Dichas estructuras supramoleculares deben adecuarse a las necesidades de las técnicas
de detección. En el caso particular de las técnicas basadas en la resonancia de plasmones,
hay dos variables de importancia vital para una óptima sensibilidad en la detección; estas son
la densidad superficial de catchers y la distancia con respecto a la superficie a la que se
ubican los mismos. Para ilustrar esto, a continuación se enseñan las dos arquitecturas
superficiales que fueron empleadas para los experimentos que se exponen en el capítulo
siguiente; una para la detección mediante espectroscopía por resonancia de plasmones
superficiales (SPR) y otra para la detección mediante espectroscopía de fluorescencia por
resonancia de plasmones superficiales (SPFS).
4.2.1 Film metálico
Para empezar, toda técnica basada en la resonancia de plasmones superficiales necesita
de la presencia de un film metálico, preferentemente de Au o Ag. La elección de estos metales
se debe a varios factores.
Primero, la Plata y el Oro tienen propiedades ópticas adecuadas. Esto quiere decir que,
para un espesor razonable, la curva de reflectividad vs. ángulo de incidencia tiene las
características apropiadas; o sea que el mínimo de SPR es suficientemente agudo y se
37
encuentra a un ángulo de incidencia que puede ser cómodamente detectado. El espesor
óptimo es de alrededor de 50nm, tanto para al Au como para la Ag. En la figura 4.1 se
Reflectividad
muestran curvas de reflectividad teóricas para distintos espesores de Au (ε= -12,3 + i 1,29).
1,0
1,0
0,8
0,8
Film de Au
(ε= -12,3 + i 1,29)
50nm
60nm
70nm
80nm
90nm
100nm
150nm
0,6
0,6
Film de Au
(ε= -12,3 + i 1,29)
0nm
10nm
20nm
30nm
40nm
50nm
0,4
0,2
0,4
0,2
0,0
0,0
30
40
50
60
70
80
θ [°]
30
40
50
60
70
80
θ [°]
Figura 4.1: reflectividad en función del ángulo de incidencia para un sistema
compuesto por un prisma (ε =3,4039), un film de Au (ε = -12,3 + i 1,29) de diferentes
espesores y agua (ε = 1,778).
Las curvas de reflectividad Au y Ag se han comparado en capítulos anteriores. Se ha visto
que la curva correspondiente a la Ag presenta un mínimo más agudo, lo cual es, en principio,
favorable para mediciones cinéticas o microscópicas porque para un mismo corrimiento del
mínimo, el cambio en la reflectividad es mayor. También se destacó la gran amplificación del
campo superficial que se obtiene con films de Ag. Sin embargo, el uso de Au brinda mayor
resolución lateral para la microscopía, ya que presenta una longitud de decaimiento menor
(εAu>εAg). Además, con films de Au se obtiene una mayor sensibilidad; es decir, el corrimiento
de θsp producido por una misma capa dieléctrica adsorbida, es mayor si se usa un film de Au.
Por ejemplo, si se adsorbe una capa dieléctrica (ε= 2,25) de 5nm sobre un film de Au de
50nm, el mínimo de resonancia de plasmones se corre 1°; si se pretende obtener el mismo
corrimiento usando un film de Ag (también de 50nm), la capa debe tener en cambio un
espesor de 7nm.
Otra característica importante es que ambos metales reaccionan fácilmente con los grupos
tiol para dar uniones estables, razón por la cual son sustratos muy adecuados para la
preparación de las monocapas auto-ensambladas necesarias para la preparación de las
38
superficies sensoras. Las monocapas auto-ensambladas (SAM*) son arreglos moleculares que
se producen espontáneamente cuando se sumerge un sustrato en una solución de un
surfactante activo [47]. En comparación con las películas de Langmuir-Blodgett las SAM son
más estables y fáciles de preparar [49]. Las SAM más conocidas y estudiadas son las
formadas por alcano-tioles sobre Au, ya que los planos (111) del Au y los grupos tiol (S-H)
tienen una gran afinidad. Cuando se pone en contacto una superficie de Au con una solución
de algún alcano-tiol, éstos se adsorben rápidamente y reaccionan a través de los átomos de S
tratando de ocupar todos los sitios disponibles en la superficie. Esto deja a las cadenas
hidrocarbonadas apuntando hacia la solución, las cuales, atraídas por fuerzas de Van der
Waals, se acomodarán de forma compacta para formar la monocapa. Usando tioles con
diferentes grupos funcionales en el extremo opuesto, pueden funcionalizarse superficies con
distintas características; es más, las características de la superficie pueden cambiarse
después de formada la SAM, mediante una reacción química posterior.
Por último, el Au es mucho más estable frente a los solventes y soluciones utilizados más
frecuentemente. Este factor es muchas veces el más importante al momento de decidir qué
metal utilizar. Si se necesitan las características de la Ag pero con la estabilidad del Au, es
posible utilizar un film mixto; por ejemplo de 40nm de Au y 5nm de Ag.
En este trabajo, los films se prepararon por evaporación térmica en vacío (5.10-6 mbar) de
Au o Ag (Balzers, 99,99%), a una velocidad aproximada de 0,1 nm/s, en una evaporadora
Balzers BAE250 o Edwards FL400. Los films se evaporaron sobre sustratos de vidrio LaSFN9
previamente limpiados en ultrasonido en sucesivas etapas con detergente diluido (Hellmanex
2%), agua y etanol (puro).
4.2.2 Arquitecturas superficiales para SPR
Para la detección de reacciones de hibridización mediante SPR, es conveniente que las
reacciones ocurran cerca de la superficie metálica, ya que el campo óptico evanescente de los
plasmones superficiales tiene mayor intensidad en esta zona y en consecuencia la
sensibilidad es mayor. Por este motivo, se inmovilizan los oligonucleótidos catcher
directamente sobre el film de Au mediante un proceso de auto-ensamblado. Para controlar la
densidad superficial de catchers, se auto-ensambla una monocapa mixta, formada por los
oligonucleótidos tiolados y otro tiol más pequeño que actúa como espaciador (figura 4.2). El
tiol espaciador debe tener en el otro extremo un grupo funcional que brinde la menor
adsorción no específica de ADN posible.
En este trabajo se utilizó 1-mercapto-6-hexanol (MCH) como espaciador, es decir un tiolalcohol de 6 carbonos. Se eligió un tiol con un oxhidrilo terminal porque se conoce que la
adsorción de ADN es despreciable.
*
Siglas de los términos en inglés: Self Assembled Monolayers
39
Los oligonucleótidos catcher empleados tienen un grupo tiol adosado a su extremo 5’, a
continuación tienen una serie de bases que actúan como espaciador, y finalmente la
secuencia específica.
La densidad óptima de catchers queda determinada por un compromiso entre dos factores:
1) A mayor densidad de catchers, mayor es el cambio en la densidad óptica al
producirse la hibridización.
2) A mayor densidad de catchers, la hibridización se ve dificultada por efectos
estéricos; es decir, a las cadenas target les es más difícil encontrar una posición
adecuada para acoplarse con el catcher.
Vidrio
Au
Espaciador
Catcher
Target
Figura 4.2: arquitectura superficial utilizada en las superficies sensoras
para la detección de reacciones de hibridización mediante SPR.
En los experimentos realizados en este trabajo, la monocapa se obtuvo poniendo en
contacto la superficie metálica con una solución mixta compuesta por el catcher y el
espaciador*.
Diferentes relaciones entre catcher y espaciador dan como resultado distintas densidades
superficiales de catcher. Vale aclarar que la relación entre los tioles en solución no se traslada
directamente a la superficie, sino que la proporción de catchers en la superficie es
notablemente menor. Esto se debe a que en la mayoría de los casos la velocidad de reacción
del espaciador es mucho mayor que la del oligonucleótido. La relación óptima para la
detección de oligonucleótidos de 30pb (15 de espaciador y 15 de secuencia específica) fue
determinada en 90% catcher, 10% MCH [35].
*
Otros autores realizan las monocapas autoensambladas (self assembled monolayers) en etapas. Esto es, primero
se realiza una monocapa del espaciador, y luego se pone en contacto a la superficie con la solución del catcher
para incluir los oligonucleótidos por susutición de moléculas de espaciador. La densidad de catcher en ese caso se
controla variando los tiempos de exposición de la última etapa.
40
4.2.3– Arquitecturas superficiales para SPFS
Para la detección mediante SPFS, el valor óptimo de la densidad superficial de catchers
está determinado por el compromiso explicado en la sección anterior (vale el mismo
razonamiento hecho para el caso de SPR). De todos modos, la densidad de catchers no es
la variable crítica ya que la SPFS tiene una gran sensibilidad, sino que la variable más
importante de optimizar es, en este caso, la distancia a la cual los cromóforos se ubican de la
superficie metálica. Como se explicó en el capítulo 2, la distancia óptima es del orden de un
radio de Förster, es decir unos 8 nm para la mayoría de los cromóforos moleculares dipolares.
(1)
(2)
Vidrio
Au
Biotina
Streptavidina
Catcher
Target con
cromóforo
Figura 4.3: arquitectura superficial empleada en las superficies sensoras
para la detección de reacciones de hibridización mediante SPFS.
Por lo tanto, en este caso no conviene usar catchers auto-ensamblados porque los
cromóforos quedan muy cerca de la superficie. Lo más favorable es construir una estructura
molecular que ubique a los catchers más lejos de la superficie metálica, a una distancia mayor
que un radio de Förster. Un tipo de arquitectura superficial que cumple con estos requisitos se
muestra en la figura 4.3 y fue la empleada en los mediciones realizadas en este trabajo.
41
Primero se expuso el film metálico a una solución compuesta por un tiol biotinizado (1) y un
tiol más corto (2)* para obtener una monocapa auto-ensamblada mixta que (nuevamente el tiol
corto actúa como espaciador). La relación entre ambos está optimizada para que las biotinas
terminales conformen una matriz adecuada para la subsiguiente formación de una monocapa
de streptavidina †. Esta monocapa expone a la solución otros sitios de interacción específicos
para biotina, los cuales son ocupados por los oligonucleótidos biotinizados que actúan como
catchers. La relación óptima de tioles fue determinada en un 10% de tioles biotinizados y 90%
de tioles con OH terminales [7][45][46].
Con esta arquitectura, los cromóforos quedan a una distancia de separación de la
superficie metálica de aproximadamente 15 nm‡.
4.3 – Modelo cinético
Por último en este capítulo de trata el modelo cinético utilizado para el análisis de las
reacciones de hibridización. Este es importante debido a que a partir de experimentos
cinéticos pueden obtenerse las constantes cinéticas y, a parir de ellas, la constante de
afinidad que permite diferenciar entre secuencias perfectamente complementarias y
secuencias con diferencias (mismatches).
El modelo cinético de Langmuir [47][48] fue creado para la adsorción sobre superficies de
las moléculas de un gas y asume:
1)
la adsorción sólo procede hasta la formación de una monocapa
2)
la superficie está siempre en contacto con una presión constante de gas
3)
todos los sitios de posible adsorción son equivalentes y la superficie es uniforme
4)
la adsorción de una molécula es independiente de la ocupación de los sitios vecinos
Se puede ver que, bajo ciertas condiciones, las suposiciones 1 a 4 tienen sus análogas
para el caso de reacciones de hibridización en superficies. La condición 1 tiene su análoga en
el hecho de que sólo pueden formarse cadenas dobles de ADN, lo que quiere decir que sólo
una molécula de target puede ligarse a un catcher. La condición 2 es equivalente a requerir
concentración constante de target sobre la superficie, lo cual es válido para concentraciones
los suficientemente altas (mayores a 10-7 M) como para que los procesos de transporte sean
*
Ambos compuestos fueron sintetizados especialmente para este fin por Boeringer Manheim GmbH.
La streptavidina es una proteína tetramérica (60000 g/mol aprox.) que fue aislada de la bacteria Streptamyces
avidinii y es conocida por su capacidad de unir específicamente hasta 4 moléculas de d-biotina (vitamina H) con
una extraordinariamente alta afinidad y con una constante de disociación excepcionalmente baja (koff = 10-15 M-1)
[42][43]. Tiene una forma aproximadamente tetragonal; sus dimensiones pueden determinarse por dispersión de
RX y son 4,2nm x 4,2nm x 5,6nm [44].
†
‡
El valor de 15nm fue estimado para un catcher con 15 bases de espaciador y 15 bases de secuencia de detección.
El espesor de la monocapa de tioles es aprox. 1,6nm; el de la monocapa de streptavidina es de 4nm; y la longitud
del catcher es aprox. 10nm.
42
despreciables. La condición 3 es imposible de cumplir estrictamente, pero sí se verifica
estadísticamente. Por último, si la fuerza iónica de la solución no es muy baja* y la densidad
de catchers no es muy alta, puede asumirse que se cumple la condición 4.
Entonces se pueden escribir las ecuaciones del modelo de Langmuir adaptadas para las
reacciones de hibridización en superficies:
Hibridización
(adsorción)
Desnaturalización
(desorción)
dφ
= k on ⋅ C ⋅ (1 − φ )
dt
(1.a)
dφ
= k off ⋅ φ
dt
(1.b)
Donde ϕ es la fracción de catchers hibridizados, C es la concentración del target en solución,
kon y koff son las constantes cinéticas de hibridización y desnaturalización respectivamente.
La velocidad global de la reacción es entonces:
dφ
= k on ⋅ C ⋅ (1 − φ) − k off ⋅ φ
dt
(2)
Esta ecuación diferencial puede resolverse sin dificultad. Con condición inicial nula, la
solución es:
φ (t ) =
[
k on ⋅ C
−(k ⋅C + koff )⋅(t −t0 )
⋅ 1 − e on
k on ⋅ C + k off
]
(3)
En algunos casos se necesita modelar la cinética de un proceso que comienza con una
fracción inicial de catchers hibridizados. Para eso se puede resolver la ecuación (3) con
condición inicial ϕ(0)= ϕ0:
φ (t ) =

k on ⋅ C
k on ⋅ C
+ φ 0 −
k on ⋅ C + k off 
k on ⋅ C + k off
 −(kon ⋅C + koff )⋅(t −t0 )
⋅e

(4)
En la figura 3.5 (a) se muestra una simulación de ϕ(t) para el proceso de adsorción y
desorción (C=0), de acuerdo con la ecuación (5).
Para encontrar la fracción de catchers hibridizados en el equilibrio (figura 5.3(b)), se toma
el límite para tiempos infinitos en la ecuación (4), o se igualan las velocidades de hibridización
y desnaturalización (1) y (2), y se obtiene:
φ Eq =
k on ⋅ C
K ⋅C
=
k on ⋅ C + k off
K ⋅C +1
(5)
Donde K=kon / koff, es la constante de afinidad o de equilibrio.
*
Cuanto menor es la fuerza iónica de la solución, las repulsiones entre cadenas de oligonucleótidos se hacen más
importantes. Esto se debe a que las cargas negativas de los fosfatos del esqueleto de las cadenas se ven más
expuestas.
43
La ecuación (4) es la solución general y puede utilizarse para modelar los procesos de
hibridización (adsorción), ya sean con condición inicial nula o no, y con el valor de
concentración adecuado pueden también modelarse los procesos de desnaturalización
(desorción).
1,0
Simulación Langmuir
4
-1 -1
kon= 10 M s
0,8
koff= 10 M
-3
1,0
-1
-6
0,8
C = 10 M
0,6
Simulaciones Langmuir de Equilibrio
ϕ
ϕ
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
7
K= 10
6
K= 3*10
6
K= 10
0,0
0,0
0
500
1000
1500
2000
0
Tiempo [s]
2x10
-6
4x10
-6
6x10
-6
8x10
-6
1x10
-5
Concentración [M]
Figura 4.5: A la izquierda, curvas simuladas con el modelo cinético de Langmuir para una
4
-1 -
-3
-1
7
-1
concentración 1µM, constante de asociación kon = 10 M s y constante de disociación koff = 10 M .
La parte correspondiente a la desorción se simuló con concentración nula (C=0).
6
6
A la derecha, isotermas de Langmuir simuladas con constantes de afinidad K = 10 , 3.10 y 10 M .
44
CAPÍTULO 5:
ESQUEMAS DE DETECCIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
5.1 – Introducción
Dado que el objetivo final de esta línea de investigación es la detección de secuencias de
ADN a través del estudio de reacciones de hibridización en superficies sensoras, el primer
paso para optimizar las condiciones de detección de cadenas dobles de ADN es la detección
y estudio de reacciones de hibridización de cadenas simples de oligonucleótidos.
En este capítulo se presentan algunos de los esquemas de detección que se emplearon
para el estudio de reacciones superficiales de hibridización. Se describen los experimentos
realizados con cada técnica, se discuten los resultados y se proponen experimentos que
complementarían el trabajo aquí presentado.
En todos los casos, a no ser que se aclare lo contrario, se trabajó con un set-up y una celda
de flujo tal como se muestran en el capítulo 2, y los resultados expuestos son el promedio de
por lo menos dos mediciones. Los filmes metálicos se evaporaron según se explica en el
capítulo 4 y las arquitecturas superficiales fueron producidas in situ dentro de la celda de flujo
y monitoreadas por SPR. La temperatura de trabajo fue de 21°C + 2°C.
5.2 – Detección mediante SPR
La detección de reacciones de hibridización de oligonucleótidos mediante SPR ha sido
estudiada en profundidad previamente [29]-[37].
En este caso se pretendió sin éxito detectar reacciones de hibridización de cadenas largas
de ADN (4000 pb aproximadamente) mediante SPR, utilizando arquitecturas superficiales
similares a las expuestas en el capítulo 4*. Esta serie de experimentos fue motivada por la
necesidad de detectar muestras sin marcar y se pensó que la gran masa de las moléculas de
la muestra sería suficiente para producir un cambio perceptible en las condiciones de
resonancia de los plasmones cuando se hibridizaran sobre la superficie. Las muestras se
obtuvieron por clonación, por lo cual estaban en forma de cadenas dobles. Naturalmente, el
dúplex formado por el target y su cadena complementaria (4000 pb) es mucho más estable
que el formado localmente entre la cadena target y el catcher (15 pb). Por esta razón, se
necesita desnaturalizar las muestras previamente a la inyección en la celda de flujo para la
hibridización en la superficie. En estos experimentos se desnaturalizaron las muestras
térmicamente pero, por razones de tiempo, no pudo optimizarse el procedimiento ni verificarse
que el mismo sea realmente efectivo (es decir que una fracción apreciable de la muestra
*
Dado el gran tamaño de los targets, se emplearon también menores densidades superficiales de catchers para
evitar impedimentos estéricos en las reacciones de hibridización.
45
llegan a la celda de flujo en forma de cadenas simples). El último punto puede ser la causa
principal del fracaso de los experimentos.
Otra posible manera de sobrepasar este obstáculo es mediante el uso de catchers de PNA
(Peptide Nucleic Acid). El PNA es un análogo sintético del ADN que tiene la particularidad de
que puede formar un dúplex con ADN en condiciones de baja fuerza iónica. Esta
característica permite diseñar experimentos en los cuales se desnaturaliza la muestra en
condiciones de muy baja fuerza iónica, en donde el dúplex ADN-ADN es inestable, y luego se
inyecta en la celda de flujo para exponer las cadenas simples de ADN a la superficie con
catchers de PNA, para formar el dúplex ADN-PNA, que sí es estable en esas condiciones.
Una vez más, por razones de falta de tiempo, estos experimentos no pudieron realizarse.
5.3 – Detección mediante SPFS
La detección y estudio de reacciones de hibridización de oligonucleótidos, utilizando targets
marcados ha sido desarrollada anteriormente [7][39] y se han realizado numerosos
experimentos de detección y estudio de reacciones de hibridización [50]. Sin embargo más
investigación es necesaria en esta dirección para optimizar la detección de ADN.
Por otro lado, en este trabajo se desarrolló un novedoso esquema de detección que emplea
catchers marcados. Este sistema aprovecha los cambios conformacionales que sufren las
cadenas de ADN de los catchers al hibridizar. Con este método se pueden detectar muestras
sin marcar con una sensibilidad notablemente mayor que la obtenible con SPR.
A continuación se explican los dos esquemas de detección, se exponen resultados típicos
de ambos y se comparan para resaltar las ventajas y limitaciones de cada uno.
5.3.1 – Target marcado
Este es el esquema tradicional de SPFS. Se utiliza un film de Au de 47nm, evaporado
sobre unos sustrato de vidrio LaSFN9, sobre el cual se prepara una nanoestructura como la
que se expone en la sección 4.2.3. Las monocapas de tioles y de Streptavidina y los catchers
se ensamblaron in situ dentro de la celda de flujo y su crecimiento fue monitoreado mediante
mediciones cinéticas de SPR. Los resultados de nuestras mediciones se muestran en la
figura 5.1.
Todas las soluciones fueron preparadas en buffer PBS (10mM buffer de fosfato, 2,7mM
KCl, 150 mM NaCl, pH=7,4). Los tioles fueron ensamblados a partir de una solución 500µM con
una relación biotinizado:espaciador de 1:9, la Streptavidina se unió a la superficie
funcionalizada a partir de una solución 0,5µM y los oligonucleótidos catcher a partir de una
solución 5µM.
46
Después de la formación de cada monocapa se realizó una medición de barrido de SPR
(figura 5.2), lo cual permite posteriormente, mediante el ajuste teórico de las curvas, obtener
los valores de espesor efectivo.
SA
0,42
3
Reflectividad
2
0,38
0,36
Tioles
1
0,34
Catchers
0,32
Espesor óptico efectivo
(ε = 2,25) [nm]
Figura 5.1: mediciones cinéticas de SPR
0,40
para el monitoreo de la formación de las
nanoestructuras
20
30
40
50
60
70
la
detección de los eventos de hibridización
mediante SPFS. Se muestra el aumento
en la reflectividad que produjo cada capa
y el espesor óptico efectivo, asumiendo
dieléctrica ε = 2,25.
0
10
para
para todas las capas una constante
0,30
0
empleadas
80
90
Tiempo [min]
0,08
0,8
Reflectividad
Reflectividad
0,07
0,6
0,4
0,06
0,05
0,2
0,04
0,0
45
50
55
60
65
56,0
θ [°]
56,5
57,0
57,5
58,0
58,5
θ [°]
Figura 5.2: mediciones de barrido de SPR para cada etapa de la formación de la
superficie sensora empleada en SPFS. Las curvas corresponden a: film de Au
(anaranjado),
tioles
biotinizados
y
espaciador
(violeta),
streptavidina
(rojo)
y
oligonucleótidos catcher (verde). A la derecha se detalla la zona de los mínimos y se
puede observar el corrimiento sucesivo del mismo después de la formación de cada capa.
47
Cabe recordar que los valores de espesor se calculan asumiendo una constante dieléctrica.
En nuestro caso el valor es ε=2,25, ya que este es el valor de constante dieléctrica
aproximado de la mayoría de las monocapas formadas por moléculas orgánicas. Además, los
espesores calculados no son los verdaderos sino que son espesores efectivos, debido a que
mediante SPR sólo puede detectarse una densidad óptica que incluye, además del índice de
refracción, a la densidad superficial. Esto significa que si el recubrimiento superficial no es
completo, el espesor calculado será menor.
Una vez preparada la superficie sensora, se inyecta en la celda de flujo la solución de
oligonucleótidos target, y se registra la hibridización a través de una medición cinética de
SPFS. Ajustando la curva obtenida con el modelo de Langmuir se obtienen las constantes
cinéticas y de equilibrio.
En general pueden realizarse dos experimentos distintos: cinéticos o de equilibrio. El
primero consiste simplemente en inyectar la solución de targets de concentración conocida,
esperar al equilibrio y finalmente bombear buffer a través de la celda de flujo (rinsing*),
registrando todo el proceso mediante una medición cinética de SPFS. De esta manera se
obtienen dos curvas, una a continuación de la otra, de las cuales pueden obtenerse los
valores de kon y koff a través del modelo de Langmuir. Finalmente, a partir de las constantes
cinéticas puede calcularse la constante de afinidad.
Se han realizado previamente experimentos con esta metodología para targets de 15 pb
[7]. Los materiales utilizados se muestran en el cuadro 5.1 y los resultados en la figura 5.3.
Cómo puede verse, los comportamientos de las cadenas perfectamente complementarias
(MM0), las cadenas con un mismatch (MM1) y con dos (MM2), son notablemente diferentes y
pueden distinguirse fácilmente por simple observación y a través de las constantes de afinidad
(K= kon/koff).
Catcher
Bio-5´ TTT TTT TTT TTT TTT TGT ACA TCA CAA CTA 3´
Target MM 0
Target MM 1
Target MM 2
3´ ACA TGT AGT GTT GAT 5´-Cy5
3´ ACA TGC AGT GTT GAT 5´-Cy5
3´ ACA TGC ACT GTT GAT 5´-Cy5
Cuadro 5.1: materiales utilizados en los experimentos cuyos resultados se exponen en
la figura 5.3. Los mismatches están destacados en color en las secuencias de los
targets. El catcher y los targets están modificados en sus extremos 5’ con una molécula
de Biotina y una molécula del fluoróforo Cy5, respectivamente.
*
El término castellano de rinsing sería para este caso enjuagar. En este texto se utilizará el termino inglés siempre
con el significado explicado arriba.
48
Figura 5.3: mediciones de
1,2x10
-5
koff= 2*10 s
1,0x10
K= 2,2*10 M
8,0x10
koff= 4,6*10 s
5
7
K= 1,8*10 M
MM 0
MM 1
MM 2
Simulación
Langmuir
5
4,0x10
5
2,0x10
MM2.
-1
Las curvas experimentales
-1
fueron
MM2:
2
-1 -1
kon= 3,5*10 M s
-4
koff= 5,2*10 s
5
K= 6,7*10 M
2000
4000
ajustadas
con
el
modelo de Langmuir.
-1
Las constantes cinéticas y
-1
de afinidad obtenidas en
0,0
0
la
15 pb con MM0, MM1 y
-4
6,0x10
estudiar
hibridización en sistemas de
-1
MM1:
3
-1 -1
kon= 8,1*10 M s
5
para
cinética de reacciones de
-1
9
6
Fluorescencia [cps]
SPFS
Constantes cinéticas
MM0:
4
-1 -1
kon= 4,2*10 M s
6
6000
cada caso se exponen en la
Tiempo [s]
tabla de la derecha.[7]
La otra metodología experimental consiste en realizar inyecciones sucesivas de soluciones
de target de concentración cada vez mayor, esperando en cada caso al equilibrio. De esta
manera se obtienen valores de equilibrio para cada concentración que pueden ajustarse con
el modelo de Langmuir para obtener la constante de afinidad K. Este método es mucho más
laborioso pero los valores de K obtenidos son más confiables ya que se obtienen en todo un
rango de concentraciones.
Se han realizado experimentos con este método con los materiales expuestos en el cuadro
5.1 [7]. En la figura 5.4 se muestra el resultado de una medición de equilibrio para el target de
MM1; puede verse como el valor de K obtenido concuerda con el valor obtenido de la
medición cinética.
1,5*106
6
1,2*10
1µM
8,0*10
Fluorescencia [cps]
Fluorescencia [cps]
0,25µM
5
0,1µM
4,0*10
5
0,01µM
0,0
1,0*106
MM1
K=1,6*10-7 M-1
5
5,0*10
0,0
0
100
200
Tiempo [min]
300
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Concentración [µM]
Figura 5.4: a la izquierda, medición de SPFS para obtener los valores de fluorescencia de equilibrio
para distintas concentraciones de target. A la derecha la isoterma de Langmuir obtenida; en la figura
se muestra el valor de la constante de afinidad empleado para el ajuste de los puntos experimentales.
49
Cómo se explicó en el capítulo anterior, para que la fluorescencia sea proporcional a la
cantidad de targets hibridizados, es necesario que la masa de los targets, al acercarse a la
superficie, no modifique de manera importante las condiciones de excitación de plasmones
superficiales. En estos experimentos este requerimiento se satisface, gracias a la baja
densidad superficial de catchers empleada; esto puede verse en la figura 5.5, donde se
muestran las curvas de reflectividad, prácticamente idénticas, antes y después de la
hibridización de los targets.
0,05
Reflectividad
Reflectividad
0,8
0,6
0,4
0,04
0,03
0,2
0,02
0,0
45
50
55
60
65
θ [°]
56,8
57,0
57,2
57,4
57,6
57,8
58,0
θ [°]
Figura 5.5: barridos de SPR antes (verde) y después (rojo) de la hibridización. El corrimiento del
mínimo es despreciable, lo que habilita a que se considere una relación lineal entre la señal de
fluorescencia y el número de targets hibridizados.
Una manera más productiva de realizar estos experimentos consiste en combinar las
mediciones cinéticas con las de equilibrio; es decir, medir cuidadosamente las cinéticas de
hibridización para cada concentración, para luego ajustarlas con el modelo de Langmuir y
obtener los valores de kon y koff *. Así, con un solo experimento se puede obtener un valor de la
constante de afinidad K a partir de las constantes cinéticas y otro a partir de los valores de
equilibrio. Naturalmente, si ambos valores coinciden, el experimento es auto-consistente y el
nivel de confianza de las mediciones es mayor.
*
Esto quiere decir que deben registrarse en su totalidad con una densidad de puntos aceptables. En la figura 5.4, se
puede ver que la medición para 0,01µM no es completa sino que comenzó cuando el proceso de hibridización ya
había se estaba desarrollando. Cuando se realizó ese experimento, el interés no era registrar la cinética sino
encontrar el valor de euilibrio.
50
Catcher
Bio-5´ TTT TTT TTT TTT TTT TGT ATC TCA GTT CTA 3´
Target MM 1
5´ACA TAG AGT AAA GAT 3´- Cy5
Cuadro 5.2: materiales utilizados en los experimentos cuyos resultados se exponen en
la figura 5.6. El mismatch está destacado en color en la secuencia del target. El catcher y
el target están modificados en su extremo 5’, con una molécula de biotina y del fluoróforo
Cy5, respectivamente.
Constantes cinéticas
C = 0,05 µM
4
-1 -1
kon = 1*10 M s
-4 -1
koff = 2*10 s
6
2,0x10
1µM
0,5µM
Fluorescencia [cps]
6
1,6x10
C = 0,1 µM
3
-1 -1
kon = 9,4*10 M s
-4 -1
koff = 1,8*10 s
0,25 µM
0,1 µM
Rinsing
6
1,2x10
C = 0,25 µM
4
-1 -1
kon = 1*10
M s
-1
koff = 2*10-4 s
5
8,0x10
C = 0,5µM
4
-1 -1
kon = 1*10 M s
-4 -1
koff = 2*10 s
0,05 µM
5
4,0x10
C = 1µM
4
-1 -1
kon = 1*10 M s
-4 -1
koff = 2*10 s
0,0
0
6000
12000
18000
24000
30000
36000
42000
Rinsing
3
-1 -1
kon = 9,4*10 M s
-4 -1
koff = 1,8*10 s
Fluorescencia [cps]
Tiempo [s]
1,8x10
6
1,5x10
6
1,2x10
6
9,0x10
5
6,0x10
5
3,0x10
5
7
K= 5,1*10 M
-1
0,0
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Concentración [µM]
Figura 5.6: medición de SPFS combinada. Se monitorea la cinética de hibridización
hasta el equilibrio para diferentes concentraciones de target. Del ajuste cinético pueden
obtenerse las constantes cinéticas y de los valores de equilibrio la constante de afinidad.
Esto permite medir la constante de afinidad por dos métodos en un mismo experimento;
los valores obtenidos se muestran junto a los gráficos. La curva de 0,05µM no puede
ajustarse con el modelo de Langmuir debido a procesos de transporte que toman
importancia a tan bajas concentraciones.
51
La figura 5.6 muestra una de nuestras medicines realizada para un sistema con 1 mismatch
(MM1); los materales empleados se muestran en el cuadro 5.2. En el gráfico superior se
muestra la medición cinética para varias concentraciones y las simulaciones según el modelo
de Langmuir. Se puede ver que todas las etapas, a excepción de la correspondiente a
0,05µM, se ajustan aceptablemente con prácticamente los mismos valores de kon y koff . La
curva experimental para 0,05µM no puede ajustarse con el modelo de Langmuir y las mismas
constantes cinéticas; la hibridización sucede más lentamente que lo predicho por el modelo.
Esto puede deberse a procesos de transporte que se hacen importantes que a tan bajas
concentraciones.
5.3.2 – Catcher marcado
Otro esquema de detección se basa en la dependencia con la distancia de la emisión
fluorescente y utiliza un catcher modificado con un fluoróforo en su extremo libre [17]. En la
figura 5.7 se muestran la arquitecturas superficiales utilizadas en estos casos.
Au
Au
Vidrio
Vidrio
Figura 5.7: dos arquitecturas superficiales con catcher marcado empleadas para la
detección de reacciones de hibridización mediante SPFS. Al producirse la hibridización, el
fluoróforo se aleja de la superficie, ubicándose a una distancia mayor a un radio de Förster y
la emisión de fluorescencia aumenta. A la izquierda se muestra la superficie sensora con un
catcher sin hairpin-loop; y a la derecha con hairpin-loop. Se comprobó que la presencia del
hairpin-loop favorece la diferenciación entre sistemas con diferente número de mismatches.
Como se explicó en el capítulo 4, para obtener una emisión de fluorescencia óptima, los
fluoróforos deben ubicarse a una distancia mayor que un radio de Förster. Una manera de
comprobar esto experimentalmente es preparar una nanoestructura como la de la figura 5.7 y
ponerla en contacto con soluciones de diferente fuerza iónica en condiciones de excitación de
los fluoróforos.
52
Para el caso de catcher sin hairpin-loop, cuanto mayor es la fuerza iónica, mayor es el
apantallamiento de las cargas negativas de los fosfatos del esqueleto de los catchers, y en
consecuencia la molécula se puede retorcer para dar una conformación estadística.
Contrariamente, si la fuerza iónica es menor, las cargas negativas quedan más expuestas, la
repulsión entre los grupos fosfato es mayor y las cadenas son más rígidas. Esto hace que a
mayores fuerzas iónicas los fluoróforos queden en promedio más cerca de la superficie y la
emisión de fluorescencia sea menor. En la figura 5.8 se muestran resultados de mediciones
barrido de SPFS para un catcher con la secuencia mostrada en el cuadro 5.2 (pero modificado
con Cy5 en su extremo 3’), que muestran este efecto.
Si se usa un catcher con hairpin-loop el efecto observado es el mismo pero en este caso se
debe también a que las uniones puente de hidrógeno son inestables en condiciones de baja
fuerza iónica y el loop se abre. Los resultados obtenidos para mediciones de SPFS son
similares a los mostrados en la figura 5.8; por supuesto los valores exactos dependen del
hairpin-loop formado.
Hairpin-free Catcher
6
Fluorescence [cps]
2,0x10
0,005 M NaCl
0,025 M NaCl
0,05 M NaCl
0,1 M NaCl
0,25 M NaCl
0,5 M NaCl
1
M NaCl
6
1,5x10
6
1,0x10
Figura 5.8: mediciones de
SPFS
para
fluorescente
un
catcher
inmovilizado
en contacto con soluciones
de diferentes fuerza iónica.
A menor fuerza iónica, el
5
5,0x10
fluoróforo se ubica más
lejos de la superficie y la
0,0
emisión es mayor.
45
50
55
60
65
θ [°]
Análogamente, una cadena simple es una estructura mucho más flexible que una doble
hélice; entonces, a medida que los eventos de hibridización se producen, la fluorescencia
aumenta de manera proporcional, debido a la mayor cantidad de fluoróforos ubicados a una
distancia mayor que un radio de Förster. Este método es el más novedoso y tal vez más
interesante porque aprovecha los efectos conformocionales del ADN para detectar los eventos
de hibridización de muestras sin marcar.
53
Una aspecto de importancia en este caso es la foto-degradación (photo-bleaching) de los
fluoróforos que produce una disminución de la señal de fluorescencia. En los experimentos
realizados, se utilizó un obturador automático para bloquear el haz incidente en forma
periódica y así disminuir el foto-bleaching. Además se disminuyó la intensidad del láser. Las
dos operaciones están sujetas a una situación de equilibrio: el uso del obturador está limitado
por la insuficiencia de datos y la intensidad del láser por la disminución de la relación
señal/ruido. No obstante, si se aplican adecuadamente, ambas medidas son efectivas y como
puede verse en la figura 5.9, se puede obtener una señal estable de fluorescencia por tiempos
aceptables.
En los experimentos de target fluorescente, el foto-degradación de los fluoróforos no es
importante debido a que los targets con fluoróforos degradados pueden ser remplazados por
otros desde la solución. En cambio, en este caso, los fluoróforos están inmovilizados y no hay
Fluorescencia [cps]
posibilidad de sustitución [17].
3,0x10
6
2,5x10
6
Figura 5.9: emisión de fluorescencia de
un catcher fluorescente inmovilizado. Si
se
2,0x10
constantemente
el
foto-
bleaching es importante para tiempo
Sin obturador
Con obturador
6
ilumina
cortos. En cambio, si se utiliza un
obturador, la señal de fluorescencia se
mantiene
1,5x10
estable
para
tiempos
razonables. [17]
6
10
20
30
40
Tiempo [min]
En la figura 5.10 se muestran los resultados de nuestras mediciones cinéticas realizadas en
sistemas con MM0 y con MM1, empleando catchers marcados. En el cuadro 5.2 se muestra la
secuencia del catcher utilizado; este catcher no tiene la posibilidad de formar hairpin-loop (por
esa razón las tablas adjuntadas a los gráficos se.titulan hairpin-free). Una vez más, los puntos
son las mediciones experimentales y las líneas llenas son simulaciones según el modelo de
Langmuir. Los sistemas con MM0 y MM1 pueden distinguirse a simple vista y a través de las
constantes cinéticas y de afinidad, sin embargo la diferencia no es tan grande como en el
caso de target fluorescente. Una manera de mejorar la sensibilidad de este método consiste
en utilizar una catcher con de secuencia tal que se forme un hairpin-loop cuando este se
encuentra desnaturalizado. De esta manera, más cromóforos estarán cerca de la superficie
antes de la hibridización, con lo cual la capacidad de detección del método mejora.
54
6
2,4x10
MM1 Catcher marcado
Hairpin-free 15-mer
6
Fluorescencia [cps]
2,2x10
Hibridización:
4
-1 -1
kon= 1,2*10 M s
6
2,0x10
-4
-1
koff= 1,0*10 s
8
6
-1
K= 1,2*10 M
C= 1 µM
1,8x10
6
1,6x10
Rinsing:
4
-1 -1
kon= 1,2*10 M s
6
1,4x10
-4
-1
koff= 1,0*10 s
8
6
1,2x10
0
2000
4000
6000
8000
10000
-1
K= 1,2*10 M
C= 7*10-3 µM
Tiempo [s]
6
Fluorescencia [cps]
1,8x10
MM0 Catcher marcado
Hairpin-free 15-mer
6
1,6x10
Hibridización:
4
-1 -1
kon= 7,5*10 M s
6
-4
1,4x10
-1
koff= 1,8*10 s
8
-1
K= 4,2*10 M
C= 1E-6 M
6
1,2x10
Rinsing:
4
-1 -1
kon= 7,5*10 M s
6
1,0x10
-4
-1
koff= 1,7*10 s
8
5
8,0x10
0
2000
4000
6000
8000
-1
K= 4,4*10 M
C= 3E-9 M
Tiempo [s]
Figura 5.10: mediciones cinéticas de SPFS con catcher marcado sin hairpin-loop para sistemas con
MM0 y MM1. Los datos experimentales se ajustaron satisfactoriamente con el modelo de Langmuir.
Las constantes cinéticas y de afinidad se exhiben en las tablas adjuntadas a los gráficos.
También se realizaron experimentos con un catcher fluorescente cuya secuencia permite la
formación de un hairpin-loop de 4 pb. Los materiales empleados se muestran en la cuadro 5.3
y las bases que forman el lazo se destacan en color.
Catcher
Bio-5´ TTT TTT TTT TTT TTT TGT ACA TCA CAA CTA 3´-Cy5
Target MM0
Target MM1
3´ ACA TGT AGT GTT GAT 5´
3´ ACA TGC AGT GTT GAT 5´
Cuadro 5.3: materiales empleados para el estudio de reacciones de hibridización con catcher
fluorescente con un hairpin-loop de 4 pb (las bases que forman el hairpin-loop están destacadas en
color anaranjado).
55
En la figura 5.11 se muestran los resultados obtenidos en nuestras mediciones con los
materiales del cuadro 5.3. En este caso la diferencia en la cinética y las constantes de afinidad
entre los dúplex con MM0 y MM1 es mucho más notable. Si bien la sensibilidad sigue siendo
menor que la obtenida para el caso de targets marcados, la mejora introducida por el hairpinloop del catcher es importante. Por razones de tiempo, no pudieron hacerse más
experimentos en esta dirección pero sería importante realizarlos ya que esta técnica permite
trabajar con muestras sin marcar, lo cual es una ventaja de gran importancia. Es importante
resaltar para el diseño de futuros experimentos que aunque en este caso el hairpin-loop se
formó con bases de la secuencia específica a detectar, esto no es necesario. La secuencia del
espaciador puede diseñarse de modo tal de formar un hairpin-loop con las bases de la
secuencia a detectar. Incluso pueden formarse hairpin-loops mas efectivos: puede optimizarse
la cantidad de pb, y la posición para ubicar al cromóforo más cerca de la superficie.
5
Fluorescencia [cps]
1,1x10
MM1 Catcher marcado
4pb-hairpin 15-mer
Hibridización:
3
kon= 9,3*10
5
1,0x10
koff= 2,0*10
-4
7
K= 4,6*10
4
9,0x10
Rinsing:
3
kon= 9,3*10
koff= 2,0*10
4
8,0x10
-4
7
K= 4,6*10
0
2000
4000
6000
Tiempo [s]
Fluorescencia [cps]
MM0 Catcher marcado
4pb-hairpin 15-mer
5
1,2x10
Hibridización:
4
-1 -1
kon= 8,4*10 M s
koff= 1,5*10
-4
8
K= 5,6*10 M
5
1,0x10
Rinsing:
4
-1 -1
kon= 8,4*10 M s
-4
koff= 1,4*10 s
8
K= 6,0*10 M
4
8,0x10
0
2000
4000
-1
-1
6000
Tiempo [s]
Figura 5.11: mediciones cinéticas de SPFS con catcher fluorescente para sistemas
con MM0 y MM1. En este caso el catcher puede formar un hairpin-loop de 4 pb. Los
datos experimentales se ajustaron satisfactoriamente con el modelo de Langmuir. Las
constantes cinéticas y de afinidad se exhiben en las tablas adjuntadas a los gráficos.
56
CAPÍTULO 6:
RESUMEN Y CONCLUSIONES
En este capítulo se resumen los conceptos más importantes de este trabajo.
En primer lugar se estudiaron las técnicas basadas en la resonancia de plasmones
superficiales. Se explicaron las características de las mismas con fundamentos teóricos y se
analizaron ventajas y limitaciones de cada una.
Como se expuso en las secciones de teoría, los plasmones superficiales son modos
electromagnéticos que se propagan en interfases. Esto hace que todas las técnicas basadas
en la resonancia de plasmones superficiales tengan la particularidad de ser específicas para
interfases. Su campo de acción es de unos 200nm desde la interfase.
La espectroscopía por resonancia de plasmones (SPR) ya se ha establecido como
herramienta de caracterización de películas delgadas y estudio de procesos de adsorción
sobre superficies. Tiene la gran ventaja de no requerir muestras fluorescentes ya que la señal
es producida por la sola presencia de los analitos en las cercanías de la superficie y una
notable sensibilidad: el mínimo espesor detectable está entre 0,1 y 0,2nm. Esta técnica tiene
dos limitaciones importantes:
1-
No pueden obtenerse espesor e índice de refracción de los analitos en forma
independiente. Sólo se detecta un espesor óptico.
2-
Baja sensibilidad cuando se quiere caracterizar película de baja densidad lateral o la
adsorción de analitos de bajo peso molecular.
La espectroscopía de fluorescencia por resonancia de plasmones (SPFS) es una técnica
diferente. Consiste en excitar fluoróforos en las cercanías de una interfase con el campo
electromagnético superficial de los plasmones. Con esta técnica pueden estudiarse capas
superficiales muy diluidas lateralmente o la adsorción de analitos de peso molecular muy bajo
(en este caso la masa no juega ningún papel). Debido a mecanismos de disipación de la
fluorescencia, sólo pueden detectarse fluoróforos que se encuentren a más de un radio de
Förster de la superficie; para los fluoróforos dipolares más usados esto significa unos 8nm.
Finalmente, las microscopias por plasmones superficiales. Tanto la SPR como la SPFS
pueden aplicarse en modo microscópico. Esto requiere un set-up más complejo y una
preparación de las muestras mucho más laboriosa. Sin embargo estas técnicas tienen la gran
ventaja poder trabajar con arreglos multi-spot, lo cual permite obtener una gran cantidad de
información con un solo experimento bajo condiciones experimentales homogéneas.
En segundo lugar se aplicaron algunas de estas técnicas a la detección de reacciones
superficiales de hibridización. Cada técnica requiere de una superficie sensora que se adapte
a sus características. Estas superficies sensoras se preparan mediante la construcción de
nano-estructuras que permitan inmovilizar un oligonucleótido para que actúe como catcher.
57
Se realizaron experimentos con SPR sin obtener resultados satisfactorios. Sin embargo, se
diseñaron experimentos que podrían conducir a buenos resultados.
También se utilizó la técnica de SPFS en dos esquemas de detección: el tradicional de
target fluorescente y un novedoso esquema de detección que emplea catchers marcados.
Este último fue desarrollado parcialmente en este trabajo y aprovecha los efectos
conformacionales del ADN y los mecanismos de disipación de los fluoróforos excitados para
detectar los eventos de hibridización. En esta dirección se propusieron experimentos que
permitirían optimizar esta nueva metodología.
58
APÉNDICE I:
FUNDAMENTOS TEÓRICOS.
I.1 – Introducción
Gran parte de este trabajo se basa en la utilización de técnicas que involucran la
excitación plasmones superficiales, y la interacción del campo eléctrico evanescente
asociado, con películas delgadas dieléctricas. Por esta razón se necesita conocer la teoría de
estos modos electromagnéticos para comprender la posterior discusión.
En este capítulo se dan los fundamentos teóricos de la teoría del electromagnetismo que
son necesarios para comprender el comportamiento y los modos de excitación de los
plasmones superficiales.
I.2 – Teoría electromagnética
La descripción fundamental del electromagnetismo está representada por los vectores
campo eléctrico E y campo magnético H Para describir el efecto de los campos
electromagnéticos en la materia es necesario introducir un segundo conjunto de vectores: la
densidad de corriente j, el desplazamiento eléctrico D y la inducción magnética B. Las
derivadas espaciales y temporales de estos vectores están relacionadas por las ecuaciones
de Maxwell, las cuales son válidas en todo punto para el cual las propiedades físicas de su
entorno son continuas.
Ecuaciones de Maxwell:
∇ ⋅ D = 4π ρ
(1)
∇⋅B = 0
(2)
∇×E +
∇×H −
1 ∂B
=0
c ∂t
1 ∂D 4 π
=
j
c ∂t
c
(3)
(4)
En este caso se han escrito las ecuaciones de Maxwell en el sistema de unidades
Gaussiano (CGS). La constante c relaciona las unidades eléctricas con las unidades
magnéticas y es la velocidad de la luz en el vacío; ρ es la densidad volumétrica de carga.
59
Para determinar en forma única los vectores de campo bajo condiciones dadas de carga y
corrientes eléctricas, las ecuaciones de Maxwell deben complementarse con ecuaciones que
describan
el
comportamiento
de
las
sustancias
en
presencia
de
los
campos
electromagnéticos. Éstas ecuaciones son las llamadas ecuaciones constitutivas o ecuaciones
materiales.
En general estas ecuaciones son complicadas pero si los cuerpos se encuentran en
reposo (o se mueven lentamente) y si los materiales son isótropos, las ecuaciones materiales
o constitutivas toman la siguiente forma:
Ecuaciones Materiales o Constitutivas:
j = σ ⋅E
(5)
D = ε ⋅E
(6)
B = µ ⋅H
(7)
Donde σ es la conductividad eléctrica, ε la constante dieléctrica y µ la permeabilidad
magnética. Las ecuaciones de Maxwell relacionan los vectores de campo por medio de un
sistema de ecuaciones diferenciales. Operando matemáticamente se pueden conseguir
ecuaciones diferenciales que satisfacen los vectores eléctrico y magnético por separado.
Para aquella parte del espacio que no contiene cargas ni corrientes y constituye un medio
homogéneo; es decir ρ=0, j=0, ε y µ independientes de la posición. Sustituyendo la ecuación
material (7) en la ecuación de Maxwell (3) y calculando el rotor en ambos miembros se
obtiene:
 µ ∂H 
∇ × (∇ × E ) + ∇ × 
=0
 c ∂t 
(8)
Reemplazando la ecuación material (6) en la ecuación de Maxwell (4) y derivando con
respecto al tiempo:
2
 ∂H  ε ∂ E ε !!
∇×
= E
=
2
c
 ∂t  c ∂t
(9)
Sustituyendo la ecuación (9) en la (8) se obtiene:
∇ × (∇ × E ) +
εµ !!
E=0
c2
(10)
Ahora, haciendo uso de la identidad ∇ × (∇ × v ) = ∇∇ ⋅ v − ∇ 2 v y teniendo en cuenta que,
dado que no hay cargas, ∇ ⋅ E = 0 , se obtiene de la ecuación (10) una típica ecuación de
onda. Y de forma similar se obtiene la propia para el campo magnético H:
60
∇ 2E −
εµ !!
E=0
c2
(11.a)
∇2H −
εµ !!
H=0
c2
(11.b)
Estas ecuaciones sugieren la existencia de ondas electromagnéticas con una velocidad de
propagación dada por:
v=
c
εµ
(12)
Cabe aclarar que este concepto de velocidad de una onda electromagnética sólo tiene
significado preciso cuando se trata de ondas relativamente simples, como por ejemplo ondas
planas. Se puede ver claramente que (12) no representa la velocidad de propagación de
cualquier solución de (11) si se tiene en cuenta que las ondas estacionarias son también
solución de estas ecuaciones.
Para las sustancias más comúnmente utilizadas, la constante dieléctrica es mayor que la
unidad y la permeabilidad magnética es prácticamente igual a la unidad. Entonces, de
acuerdo con (12), la velocidad v es casi siempre menor que la velocidad de la luz en el vacío
c.
I.3 – Condiciones de contorno
Las ecuaciones de Maxwell fueron planteadas para regiones del espacio en las cuales las
propiedades del medio (caracterizadas por ε y µ) son continuas. Sin embargo, muchas veces
es necesario tratar con situaciones físicas en las cuales las propiedades del medio cambian
abruptamente a través de una o más superficies. Es de esperar que también los vectores E,
H, D y B cambien abruptamente a través de dichas superficies, mientras que ρ y j den lugar a
las correspondientes cantidades superficiales.
A continuación se derivan relaciones que describen la transición a través de una interfase.
Para empezar es conveniente pensar a dicha superficie de discontinuidad, no como una
superficie sino como una capa delgada dentro de la cual los valores de ε y µ varían
continuamente desde los valores ε1, µ1 a un lado de la capa, hasta los valores ε2, µ2 del otro
lado. Dentro de esta capa considérese un cilindro pequeño cuyo eje principal es normal a la
interfase y cuyas bases tienen área δA; tal cual se muestra en la figura I.1.
61
n2
ε2 ; µ2
δA
Figura I.1: interfase considerada
como volumen de transición para
δh
las propiedades ópticas.
ε1 ; µ1
n1
El vector de inducción magnética B y sus derivadas pueden entonces asumirse continuos
a través de la capa de transición. En este caso podemos aplicar el teorema de Gauss a la
integral de la divergencia de B en el volumen del cilindro:
∫ divB dV = ∫ B ⋅ n dS = 0
(13)
La segunda integral se realiza sobre la superficie del cilindro, y n es la normal saliente.
Debido a que se considera que las áreas son pequeñas puede suponerse que B es constante.
Entonces, la integral de superficie (13) puede reemplazarse por:
B1 ⋅ n1 δ A + B 2 ⋅ n 2 δ A + contibución de las paredes = 0
(14)
En el límite para el espesor δh tendiendo a cero, la contribución de las paredes es
despreciable, y en consecuencia:
n ⋅ (B 2 − B1 ) = 0
(15)*
La ecuación (15) impone la primer condición de borde: la componente normal de la
inducción magnética es continua a través de una superficie de discontinuidad.
El desplazamiento eléctrico se trata de manera similar pero se tiene que considerar un
término adicional si hay cargas presentes.
∫ divD dV = ∫ D ⋅ n dS = 4 π ∫ ρ dV
(16)
Al tomar el límite para el espesor de la capa C tendiendo a cero, debemos pasar de la
densidad volumétrica de carga ρ a la densidad superficial de carga ρ* definida por:
lim ∫ ρ dV = ∫ ρ* dA
(17)
n ⋅ (D 2 − D1 ) = 4 πρ*
(18)
δh→0
Entonces:
*
Para escribir (14) se tuvo en cuenta que n1=-n2
62
La ecuación (18) impone una segunda condición de borde: en presencia de una superficie
cargada con densidad superficial de carga ρ*, la componente normal del desplazamiento
eléctrico cambia abruptamente a través de la superficie en un valor igual a 4πρ*. A
continuación se examina el comportamiento de las componentes tangenciales. Considérese
ahora un área rectangular perpendicular a la capa C como se muestra en la figura I.2.
Sea b el vector unitario perpendicular al rectángulo. Entonces, aplicando el teorema de
Stokes a la ecuación de Maxwell (3):
1
∫ ∇ × E ⋅ b dS = ∫ E ⋅ dr = − c ∫ B! ⋅ b dS
P2
ε2 ; µ2
ε1 ; µ1
P1
t2
n
Q2
t
t1
Q1
(19)
Figura I.2: corte transversal de la
interfase consierada como un
b
espacio de transición para las
propiedades ópticas.
La primera y tercera integral se realizan sobre el área del rectángulo y la segunda a lo
largo del borde del rectángulo. Si la longitud P1Q1 o P2Q2 (δs) es suficientemente pequeña,
puede aceptarse que el campo eléctrico toma valores constantes E1 y E2 a lo largo de los
! también se
respectivos lados del rectángulo. De modo similar puede considerarse que B
mantiene constante en dichos segmentos. Bajo estas condiciones, (19) puede escribirse
como:
1
E1 ⋅ t1 δ s + E 2 ⋅ t 2 δ s + contribución de los extremos = − B! ⋅ b δs δh
c
(20)
Tomando el límite para δh tendiendo a cero, asumiendo que E no tiene ninguna
! es finito, las contribuciones de los extremos P1P2 y Q1Q2
singularidad aguda y que B
desaparecen:
t ⋅ (E 2 − E1 ) = b ⋅ [n × (E 2 − E1 )] = 0
(21)
La orientación del rectángulo es totalmente arbitraria, como así también la del vector
unitario b. En consecuencia:
n × (E 2 − E1 ) = 0
(22)
63
La ecuación (22) impone una tercera condición de contorno: la componente tangencial del
vector eléctrico es continua a través de la interfase.
Se puede hacer un análisis similar para el campo magnético. La única diferencia es que
aparece un término adicional cuando existen corrientes eléctricas. En lugar de (20) se obtiene:
1!
4π
H1 ⋅ t1 δ s + H 2 ⋅ t 2 δ s + contribución de los extremos = D
⋅ b δsδh +
j * ⋅b δ s
c
c
(23)
El vector j* representa una densidad superficial de corriente definida de manera análoga a
la densidad superficial de carga (17). Tomando límite cuando δh tiende a cero:
n × (H 2 − H1 ) =
4π
j*
c
(24)
Finalmente la ecuación (24) impone una cuarta condición de borde: en presencia de una
densidad superficial de corriente j*, el vector campo magnético sufre un cambio abrupto al
atravesar una interfase; el valor de dicha discontinuidad es de
4π
j * ×n .
c
I.4 – Ondas electromagnéticas
En un medio homogéneo, en regiones libres de cargas y corrientes, los vectores eléctrico
y magnético deben cumplir con las ecuaciones de onda (11). La solución más simple es la de
un campo electromagnético correspondiente a una onda plana. A continuación se estudiará
dicho caso.
Sea r(x; y; z) el vector posición de un punto P en el espacio y s(sX; sy; sz) un vector unitario
en la dirección de propagación de la onda. Cualquier solución de las ecuaciones de onda del
tipo:
E = E (r⋅s−vt )
(25.a)
H = H (r⋅s−vt )
(25.b)
se dice que representa una onda plana porque para cada instante t, E o H son constantes en
el plano determinado por r ⋅ s = constante .
Denotando con un punto la derivación con respecto al tiempo t, y con una prima la
derivación con respecto a la variable u = r ⋅ s − vt , se puede escribir:
! = −vE′
E
(∇ × E)x
=
∂Ez ∂Ey
−
= E ′z s y − E ′y s z = (s × E′)x
∂y
∂z
(26)
(27)
64
Por supuesto pueden obtenerse ecuaciones análogas para el vector campo magnético H,
y para las componentes y y z de los rotores correspondientes. Remplazando estas ecuaciones
en las ecuaciones de Maxwell (3) y (4):
s × E′ +
µv
H′ = 0
c
(28.a)
s × H′ +
εv
E′ = 0
c
(28.b)
Integrando las ecuaciones (28) con constantes de integración nulas (despreciando cualquier
campo constante en el espacio), y considerando como antes
v
1
se obtiene:
=
c
εµ
E=−
µ
s×H
ε
(29.a)
H=−
ε
s×E
µ
(29.b)
Si se realiza el producto escalar por s en las ecuaciones (29) da como resultado:
E⋅s = H ⋅s = 0
(30)
La relación (30) expresa la transversalidad de los vectores eléctrico y magnético; es decir
que los vectores de campo yacen en planos perpendiculares a la dirección de propagación. Es
más, de las ecuaciones (29) y (30) puede deducirse que E, H y s forman una terna derecha de
vectores ortogonales, y que al mismo tiempo los módulos de los vectores de campo cumplen
con la relación:
µH= εE
(31)
Un caso particular de mucho interés es el de las ondas planas harmónicas en el tiempo; es
decir cuando cada componente cartesiana de E y H tiene la forma:
{
a cos(τ + δ ) = Re ae −i (τ +δ )
}
 r ⋅s 
τ = ω t −
 = ωt − k ⋅ r
v 

(32)
(33)
65
I.5 – Polarización
En las secciones anteriores se mostró cómo la teoría electromagnética de Maxwell predice
la existencia de las ondas electromagnéticas, y pudo observarse que en dichas ondas los
vectores eléctrico, magnético y la dirección de propagación constituyen una terna derecha.
Esto quiere decir que si tomamos al eje Z paralelo a la dirección de propagación s, sólo las
componentes X e Y de los vectores E y H serán no nulas.
También es de interés conocer la curva descripta por la punta del vector E, a lo largo del
tiempo en un punto dado del espacio. Esta curva es lo que se llama estado de polarización.
No se desarrollarán las ecuaciones aquí porque lo más importante en este caso es el
concepto geométrico*. En general, el vector E describirá una elipse en el plano XY y se dice
que la luz está polarizada elípticamente. Lógicamente que esta elipse puede degenerarse en
círculo o en una línea recta, en estos casos se dice que la polarización es circular o lineal
respectivamente.
Considérese una onda plana que incide sobre una superficie. El plano de incidencia es
aquel definido por la dirección de propagación de la onda y la normal a la superficie. Si la
onda está linealmente polarizada, existen dos casos extremos que son interesantes de
destacar.
a) El vector E es perpendicular al plano de incidencia, en cuyo caso la onda se denomina
Transverse Electric (TE)
b) El vector H es perpendicular al plano de incidencia, en cuyo caso la onda se denomina
Transverse Magnetic (TM)
Es importante notar que una onda polarizada en forma arbitraria puede descomponerse en
dos ondas, una onda TE y una TM.
Las ondas TE con también llamadas S-polarizadas; mientras que las TM también son
denominadas como P-polarizadas.
*
Para el caso de una onda plana, puede deducirse el estado de polarización planteando las componente x e y de la
onda según las ecuaciones (32) y (33) con amplitudes independientes para cada componente. Utilizando la
identidad cos(τ+δ) = cosτ cosδ- sinτ sinδ, puede uno deshacerse de la parte variable que contiene τ, y obtener la
curva así definida. En general, esa curva será una elipse rotada pero y como casos particulares pueden obtenerse
tanto un círculo como un segmento de recta.
66
I.6 – Reflexión y refracción
Cuando una onda electromagnética plana incide sobre la interfase de dos medios
homogéneos de diferentes propiedades ópticas, ésta se separa en dos: una onda transmitida
que penetra en el segundo medio, y otra onda que se refleja propagándose de nuevo en el
primer medio. La existencia de las ondas reflejada y transmitida puede probarse mediante las
condiciones de contorno impuestas por la interfase, ya que puede verse fácilmente que dichas
condiciones no pueden satisfacerse sino se postula la existencia de ambas ondas.
Una onda plana que se propaga en la dirección especificada por el vector unitario si *queda
completamente definida cuando se conoce el comportamiento de un punto particular en el
espacio. Por ejemplo si F(t) representa el comportamiento temporal de uno de los campos en
un punto dado, el comportamiento temporal de otro punto cuya posición relativa al primer
punto es r, está dada por F(t - r.s/v). En la interfase entre dos medios, la variación temporal de
los campos secundarios debe ser la misma que aquella del campo primario. Entonces, si los
vectores unitarios que denotan las direcciones de propagación de las ondas reflejada y
transmitida son sr y st, al igualar los argumentos de las ondas en un punto r de la interfase:
t−
r ⋅ si
r ⋅ sr
r ⋅ st
=t−
=t−
v1
v1
v2
(34)
donde v1 y v2 son las velocidades de propagación en los medios.
Para ser más explícitos, consideremos a partir de ahora una onda plana que se propaga
en el plano xz, con la interfase en el plano z=0, entonces r = (x;y;0 ) y las igualdades (34)
quedan:
x s ix + y s iy
v1
=
x s rx + y s ry
v1
=
x s tx + y s ty
v2
(35)
Y como las igualdades (35) deben cumplirse para cualquier punto de la interfase, es decir
cualquier valor de x e y:
s ix s rx s tx
=
=
v1 v1 v 2
s iy
v1
=
s ry
v1
=
s ty
v2
(36.a)
(36.b)
El plano definido por si y la normal a la interfase se llama plano de incidencia; en nuestro
caso el plano xz. Las relaciones (36) muestran que las tres ondas, la incidente, la reflejada y la
*
A partir de ahora se utilizaran los superíndices i, r y t para denotar las magnitudes correspondientes a las ondas
incidente, reflejada y transmitida respectivamente.
67
transmitida yacen en el plano de incidencia. Denominando θi, θr y θt, a los ángulos que forman
los vectores si, sr y st con el semieje z+ se pueden escribir las siguientes relaciones:
s ix = sinθ i
s iy = 0
s iz = cosθ i
s rx = sinθ r
s ry = 0
s rz = cosθ r
s tx = sinθ t
s ty = 0
s tz = cosθ t
(37)
Si se sustituye el conjunto de igualdades para las componentes x de (37) en (36):
sin θ i sinθ r sinθ t
=
=
v1
v1
v2
(38)
Entonces, sin θ i = sin θ r , y debido a que la onda reflejada se propaga en el mismo
semiplano que la onda incidente, cosθ i = cosθ r ; lo cual quiere decir que:
θ r = 2π − θ i = − θ i
(39)
Esta ecuación junto con la afirmación de que la onda reflejada yace en el plano de
incidencia constituye la Ley de Reflexión.
También de las relaciones (38) puede verse que:
sinθ i v1
=
sinθ t v 2
(40)
Recordando la ecuación (12) y definiendo al índice de refracción de un medio n como al
cociente entre la velocidad de propagación en vacío y la velocidad de propagación en dicho
medio:
nk =
ε o µo
vk
=
c
ε k µk
sinθ i n1
ε 2µ2
=
=
= n12
ε 1 µ1
sinθ t n 2
(41)
(42)
La relación (42) junto con la afirmación de que la onda transmitida yace en el plano de
incidencia constituye la Ley de Refracción. Se llama índice de refracción relativo al cociente
entre los índices de refracción de ambos medios, n12 = n1 / n2 .En la figura 3 se muestran las
direcciones de las ondas incidentes, reflejada y transmitida (o refractada).
68
Z
Er//
Ei⊥
Er⊥
Ei//
θi
θr
Figura I.3: direcciones y sentidos
de las ondas y campos eléctricos
1 (n1)
incidente, reflejado y transmitido en
X
una interfase sobre el plano XY.
θt
2 (n2>n1)
Et⊥
Et//
I.7 – Formulación de Fresnel
En la sección anterior se presentaron las leyes de reflexión y refracción. Las mencionadas
leyes indican las direcciones de las ondas electromagnéticas reflejadas y transmitidas, en
función de la dirección de la onda incidente y de las propiedades ópticas de los medios
involucrados. Sin embargo, hasta ahora no se ha tratado el tema de las amplitudes (y por
ende de las intensidades) de los campos reflejados y transmitidos o refractados. Los cálculos
de Fresnel que se muestran a continuación permiten calcular dichas amplitudes.
Una vez más se asumirá que los dos medios son homogéneos e isótropos, y además que
ambos tienen conductividad nula y consecuentemente son perfectamente transparentes (ε=ε´;
ε´´=0)*. Entonces, su permeabilidad magnética será para los fines prácticos igual a la unidad
(µ1= µ2= 1).
Sea Ei la amplitud del campo eléctrico incidente. Ei es en un número complejo con su fase
igual a la parte constante del argumento de la función de onda δ (ver ecuación (32)); la parte
variable es:
 r ⋅ si
τ i = ω t −

v1



 = ω t − x sin θ i + z cos θ i


v1





(43)
Descompondremos los vectores en dos componentes; una paralela al plano de incidencia,
denotada con el subíndice // y otra perpendicular, denotada con el subíndice ⊥. En la figura 1
*
La constante dieléctrica es en general un número complejo ε= ε´+ iε´´. La parte imaginaria ε´´ es la parte
relacionada con las pérdidas por absorción. Cuando un material es perfectamente transparente, es decir no hay
absorción de luz, ε´´=0. Estos cálculos de Fresnel se realizarán para materiales transparentes para facilitar la
comprensión. De todos modos, más adelante se tratará el problema de la excitación de plasmones superficiales,
para eso es necesaria la presencia de un film metálico, que por supuesto no es transparente. En ese caso se verá
claramente el rol fundamental de la parte imaginaria de la constante dieléctrica.
69
pueden verse los sentidos positivos para dichas componentes. Las componentes cartesianas
del campo eléctrico incidente son entonces:
E ix = − E i // cosθ i e −i τi
(44.a)
E iy = E i ⊥ e −i τi
(44.b)
E iz = E i // sinθ i e −i τi
(44.c)
Las componentes del campo magnético pueden calcularse fácilmente mediante la
ecuación (41) con µ =1:
H = ε s×E
H ix = − E i ⊥ cosθ i ε 1 e −i τi
H iy = − E i //
ε 1 e −i τi
H iz = E i ⊥ sinθ i ε 1 e −i τi
(45)
(46.a)
(46.b)
(46.c)
Teniendo en cuenta las leyes de la reflexión y de la refracción deducidas en la sección
anterior, siguiendo un procedimiento análogo al recién presentado, pueden plantearse las
componentes de los campos eléctricos y magnéticos reflejados y transmitidos.
Las condiciones de contorno demandan la continuidad de las componentes tangenciales
de los campos:
E ix + E rx = E tx
E iy + E ry = E ty
(47.a)
H ix + H rx = H tx
H iy + H ry = H ty
(47.b)
Las condiciones (15) y (18) para las componentes normales de B y D se satisfacen
automáticamente. Sustituyendo (47) en las componentes de los campos incidente, reflejado y
refractado, y teniendo en cuenta que cos θ r = − cos θ i se obtienen las cuatro siguientes
relaciones:
70
cos θ i (E i // − E r // ) = cos θ t E t //
(48.a)
E i⊥ + E r ⊥ = E t ⊥
(48.b)
ε 1 cosθ i (E i ⊥ − E r ⊥ ) = ε 2 cosθ t E t ⊥
(48.c)
ε 1 (E i // + E r // ) = ε 2 E t //
(48.d)
Se puede notar que el conjunto de ecuaciones (48) está compuesto por dos grupos de dos
ecuaciones cada uno. Un grupo sólo contiene las componentes paralelas al plano de
incidencia, mientras que el otro grupo contiene sólo las componentes perpendiculares al plano
de incidencia. Entonces, estas dos clases de ondas son independientes.
Haciendo uso de la relación n = ε (recordar que estamos considerando µ=0), se puede
resolver el sistema (48) para las componentes reflejada y transmitida n términos de la onda
incidente:
E t // =
2n1 cosθ i
E i //
n2 cosθ i + n1 cosθ t
(49.a)
Et⊥ =
2n1 cosθ i
E i⊥
n1 cosθ i + n2 cosθ t
(49.b)
E r // =
n2 cosθ i − n1 cosθ t
E i //
n2 cosθ i + n1 cosθ t
(49.c)
E r⊥ =
n1 cosθ i − n 2 cosθ t
E i⊥
n1 cosθ i + n2 cosθ t
(49.d)
Las ecuaciones (49) son las llamadas fórmulas de Fresnel. Con ellas se pueden calcular
luego la reflectividad y la transmitividad. Por supuesto que estos cálculos sencillos
presentados aquí pueden extenderse a sistemas multicapas, e incluso sistemas que incluyan
filmes de materiales conductores (es decir, no perfectamente transparentes; ε=ε´+iε´´)
I.8 – Reflexión Interna Total
Hasta aquí se ha excluido el caso para el cual la ley de refracción da como resultado un
valor imaginario para el ángulo de refracción θ t. Esto sucede cuando la luz se propaga desde
un medio ópticamente denso hacia otro menos denso; es decir:
71
n12 =
ε 2µ2
n2
=
<1
ε 1 µ1
n1
y su ángulo de incidencia es mayor que el ángulo crítico θc dado por: sin θ c = n12 .
Cuando θi = θc, sinθt = 1, entonces θt = 90° y la luz reflejada emerge en una dirección
tangente a la interfase. Si θi supera a θc, toda la luz incidente se refleja dentro del primer
medio y se dice que se produce una reflexión interna total.
Teniendo en cuenta que θt es un número complejo (sinθt >1) se puede escribir:
sin θ t =
sin θ i
n12
cosθ t = ± i
sin 2 θ i
n12 2
(50.a)
−1
(50.b)
Reemplazando estas relaciones en las fórmulas de Fresnel se puede ver que para cada
componente la intensidad de la luz totalmente reflejada es igual a la intensidad de la luz
incidente:
E r // = E i //
E r ⊥ = E i⊥
(51)
Sin embargo, el campo electromagnético en el segundo medio no desaparece, lo único
que sucede es que no hay un flujo neto de energía a través de la interfase. Recordemos la
parte variable del factor de fase escrito esta vez para la onda transmitida o refractada
(ecuación (43) escrita para la onda transmitida):
 r ⋅ st
τ t = ω t −

v2



 = ω t − x sinθ t + z cosθ t


v2





(52)
Reemplazando las ecuaciones (51) en el factor de fase, la ecuación de onda resulta:
e −i τt =
 x sinθi
−i  t −
nv2
e 
 ω z sin 2θi
 "
−1
n2
 e v2
(53)
La ecuación (53) muestra un aspecto muy importante del fenómeno de reflexión interna
total, esto es que existe un campo electromagnético sobre el plano de incidencia que va más
allá de la interfase. Dicho campo decae exponencialmente en amplitud a medida que penetra
en el segundo medio*†. La longitud para la cual la amplitud decrece en 1/e es:
*
Obviamente solo el signo negativo delante de la raíz cuadrada se corresponde con la situación física. El signo
positivo indicaría que la amplitud de la onda crecería infinitamente en forma exponencial a medida que penetra en
el segundo medio.
†
La interacción de este campo electromagnético evanescente con el medio da origen a un número de técnicas de
estudio conocidas como Attenuated Total Internal Reflection (ATR)[10]
72

v 2  sin 2 θ i

l=
−
1

ω  n12 2

−
1
2

λ 2  sin 2 θ i

=
−
1

2 π  n12 2

−
1
2
(54)
En la figura 4 se muestra la reflectividad calculada, como así también la intensidad del
campo evanescente en la interfase, en función del ángulo de incidencia. Para z=0, las ondas
incidente y reflejada están totalmente en fase, lo cual da como resultado una interferencia
constructiva y produce una amplificación del campo óptico en la interfase en un factor de 4
aproximadamente.
6
1,0
5
4
3
2
ES / Ein
2
0,6
0,4
2
0,2
1
0
Reflectividad
0,8
θ
H2O
0,0
45
θc
50
55
60
θ [°]
Figura 1.4: curvas calculadas de reflectividad e intensidad normalizada de campo
eléctrico para reflexión interna total de un haz p-polarizado de λ =630nm, en un
prisma de ε = 3.4 en contacto con H2O (ε = 1,778).
73
APÉNDICE II:
MOVIMIENTO DE LOS ELECTRONES EN UN METAL SEGÚN
LA TEORÍA DE DRUDE
II.1 – Introducción
El descubrimiento del electrón por J.J. Thomson en 1897 produjo un impacto inmediato en las
teorías de la estructura de la materia y sugirió un mecanismo obvio para la conductividad de
los metales. Tres años después del descubrimiento de Thomson, Drude construyó su teoría
de la conducción eléctrica y térmica aplicando la exitosa teoría cinética de los gases a los
metales, considerándolos como un gas de electrones.
La teoría de Drude [51] supone a los electrones inmersos en un potencial uniforme positivo
impuesto por los iones inmóviles en la red cristalina. Se considera que sólo durante las
colisiones (con los iones o, en mucho menor medida, con otro electrón) actúan fuerzas sobre
los electrones y la duración de las colisiones es despreciable.
II.2 – Ecuación de movimiento de los electrones
Se trata a continuación el movimiento de los electrones debido a una fuerza (eléctrica o
magnética) uniforme dentro del marco del modelo de Drude.
Un electrón tomado al azar en el instante t, sufrirá una colisión en el instante t+dt con una
probabilidad dt/τ, (τ es el tiempo de relajación) y, contrariamente, pasará un tiempo dt sin sufrir
ninguna colisión con probabilidad 1-dt/τ. Si no experimenta ninguna colisión evolucionará bajo
la acción de la fuerza uniforme que actúa sobre él (debida al campo eléctrico y/o magnético
espacialmente uniforme) y adquirirá una cantidad de movimiento extra f(t)dt + O(dt)2. Sea p(t)
la cantidad de movimiento por electrón en el instante t, la contribución a la cantidad de
movimiento por electrón de todos los electrones que no colisionan entre t y t+dt es el producto
entre la fracción (1-dt/τ) y la cantidad e movimiento promedio [p(t) + f(t)dt + O(dt)2] de dichos
electrones.
Entonces, si se desprecia la contribución a p(t+dt) de los electrones que sí sufren una colisión
entre t y t+dt, se obtiene:
(
 dt 
p (t + dt ) = 1 −  p (t ) + f (t ) dt + O ( dt ) 2
τ

)
 dt 
p (t + dt ) = p (t ) −  p (t ) + f (t ) dt + O ( dt ) 2
 τ
(1a)
(1b)
La corrección de la ecuación 1 debida a los electrones que sufren una colisión es de segundo
orden en dt. Para ver esto nótese primero que esos electrones constituyen una fracción dt/τ
74
del total. Además, como la velocidad
(y la cantidad de movimiento) toma una dirección
aleatoria después de cada colisión, cada uno de estos electrones contribuirá al promedio de la
cantidad de movimiento p(t+dt) sólo lo que haya adquirido a través de la acción de la fuerza f
desde la última colisión. Esa cantidad de movimiento debe adquirirla en un tiempo no mayor a
dt, y es entonces del orden de f(t)dt. Así, la corrección es del orden de (dt/τ)f(t)dt y no afecta a
los términos lineales en dt. Entonces, se puede escribir:
 dt 
p (t + dt ) − p (t ) = − p (t ) + f (t ) dt + O ( dt ) 2
 τ
(2)
Donde la contribución de todos los electrones ha sido tenida en cuenta. Dividiendo por dt y
tomando el límite cuando dt tiende a cero, se obtiene:
dp (t )
dt
=−
p (t )
τ
+ f (t )
(3)
Esta es la ecuación de movimiento de los electrones impulsados por una fuerza uniforme
según el modelo de Drude. Lo que esta ecuación establece es que el hecho de que los
electrones colisionen con los iones introduce un término de amortiguamiento en la ecuación
de movimiento.
75
AGRADECIMIENTOS
Quiero dedicar este espacio para agradecer a la gente que me ayudó a concretar este trabajo
de seminario.
En primer lugar quiero agradecer al Prof. Dr. Wolfgang Knoll por haberme dado brindado el
apoyo académico y económico (gracias a la beca de la Max Plank Gesselschaft que me
otorgó) que hicieron posible este trabajo. Y lo más importante, gracias por haberme hecho
sentir tan cómodo a gusto trabajando bajo su dirección durante m estadía.
Al Dr. Thomas Neumann por haber dedicado tanto tiempo a enseñarme y a divertirme. Joder!
A Ana Peré Vignau por todo.
A mi familia.
A Danfeng Yao por su apoyo para llevar a cabo los experimentos.
A la Dr. Lisa “Albareda” Henke por su gran ayuda dentro y fuera de instituto.
A la Dra. Ana María Llois por su guía y su supervisión y sobre todo por su apoyo
incondicional, que fueron fundamentales para la concreción de este trabajo.
A Andreas Scheller por su paciencia con los problemas que nos trae el bueno de Bill.
A Gleb Yakubov por las divertidas y valiosas conversaciones. Ya te voy a mandar el mate!
A todos los Knollies
A mis compañeros del IT.
Al personal del MPIP y del IT.
76
REFERENCIAS
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(1988).
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