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Prácticas de bioquímica II Introducción – técnicas espectrofotométricas La medida de la cantidad de luz absorbida por una puede utilizarse para detectar cuantificar esta molécula. De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, la absorbancia de un compuesto en solución es directamente proporcional a la concentración de dicho compuesto: A a bc A = absorbancia (también denominada a veces extinción o densidad óptica. a = coeficiente de absorción (especifico para cada sustancia a una determinada longitud de onda. b = distancia recorrida por la luz en el material absorbente (normalmente 1 cm). c = concentración de la sustancia absorbente. Tras la medida de la absorbancia del compuesto, la concentración puede determinarse a partir de la relación anterior si se conoce el coeficiente de absorción de dicho compuesto, asumiendo que la solución es pura. También puede obtenerse por extrapolación de la recta obtenida al representar la absorbancia frente a la concentración de distintas soluciones patrón del compuesto. La espectrofotometría permite también determinar la velocidad de reacciones en las que algunos de los compuestos reaccionantes absorben a longitudes de onda mesurables. La cinética de la reacción puede evaluarse siguiendo el cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo, debida a cambios en la concentración de un substrato o un producto. Este método tiene amplia aplicación en la determinación de actividades enzimáticas. Entre otras aplicaciones, también permite la detección de un compuesto en una disolución, gracias a que cada sustancia posee una “huella digital” propia: su espectro de absorción. Estudio de los cambios metabólicos debidos a ayuno y diabetes A. Objetivo de la práctica Se pretende estudiar los cambios metabólicos asociados a diferentes situaciones fisio-patológicas (alimentación, ayuno, diabetes). Se determinarán diferentes parámetros relacionados con las citadas situaciones, utilizando la rata como modelo: 1 a. análisis de metabolitos y actividades enzimáticos en orina y sangre. b. Determinación de contenido de glicógeno hepático. Los apartados siguientes (B, C y D y parcialmente el E) se han realizada en ausencia de los alumnos para evitar el sufrimiento de los animales. Como contrapartida se ofrece una práctica por ordenador en la que se puede observar todo el proceso. B. Preparación de los animales Previamente a la práctica se han tomado 6 ratas de aproximadamente 150-200 g y se han dividido en grupos de dos animales control alimentados, dos animales en ayunas de 48 horas y dos animales diabéticos. El estado diabético se ha inducido mediante una inyección intravenosa de una solución extemporánea de estreptozotocina (60 mg/kg peso) en 10 mM citrato sódico y 0.9 cloruro de sodio a pH 4.5. Los animales han sido sacrificados al cabo de 6-7 días tras el tratamiento, aunque el estado diabético era patente al cabo de 3-4 días. El desarrollo de la patología se ha verificado determinando la aparición de glucosuria y cetonuria. C. Sacrificio del animal Se ha introducido la rata en un recipiente limpio que contenga un fondo de serrín empapado con empapado con una sustancia anestésica (halotano) hasta que el animal ha quedado dormido. El sacrifico se ha realizado mediante la decapitación del animal. D. Toma de muestra Orina Antes del sacrificio, durante el manejo del animal, se produce de manera espontánea la micción. Sangre Los animales son anestesiados y sacrificados. La sangre se recoge en tubos de ensayo de 10 ml de plástico, se deja reposar en hielo durante 20 minutos y se centrifuga a 3,000 rpm durante 10 minutos a fin de obtener el suero. El suero puede ser utilizado de inmediato o bien distribuido en alícuotas y congelado a -20º para la posterior determinación. Tejido hepático Inmediatamente tras el sacrificio se procede a extraer el hígado del animal, sin dejar de observar su coloración característica. Se pesa el hígado entero anotando el valor en la libreta. Posteriormente se toma un fragmento de unos 2 gramos y se coloca en un tubo de 50 ml y se disgrega en 4 volúmenes de una solución al 10% de acido perclórico con la ayuda de un homogenizador de tejidos tipo polytron. El tubo se centrifuga a 6,000 rpm durante 5 minutos a 4º. Se depositan 500 μl de sobrenadante en un tubo Eppendorf y se congela -20º para su posterior determinación. 2 E. Determinación de los parámetros Determinación de parámetros en orina Se han seguido las indicaciones de la hoja informativa de la casa comercial. Determinación de glicógeno Se toman 100 μl del sobrenadante obtenido del extracto acido del tejido hepático y se depositan en una papel Whatman 31 ET. Seguidamente se toma el papel y se sumerge en un baño de etanol al 66%, enfriando a -20º, y se deja en agitación constante durante 10 minutos. De este modo el glicógeno queda atrapado en la trama celulosita mientras que otras moléculas, como los monosacáridos, se disuelven en el alcohol. Después de este primer lavado, se substituye el etanol utilizado por etanol al 66% a temperatura ambiente y se mantiene en agitación durante 20 minutos. Finalmente se realiza un último lavado de los papeles durante 30 minutos. Los papeles se depositan en una bandeja y se secan con la ayuda de un horno microondas (5 minutos en la posición de descongelar suele ser lo optimo). Una vez seco se introducen en un tubo Eppendorf y se añade 1 ml de solución amiloglucosidasa. Se dejan en constante agitación durante 2 horas a 37º. Posteriormente las muestras pueden ser congeladas o proceder directamente al siguiente paso. Después de la incubación enzimática se centrifuga a 5,000 rpm durante 3 minutos (preferiblemente a 4º) y se procede a determinar el contenido de glucosa del sobrenadante por el método de la glucosa oxidasa siguiendo las instrucciones suministradas por el fabricante. Solución amiloglucosidasa: solución de 14 U/ml de enzima en tampón acetato 0.4 M pH 4.8. La enzima se toma de una solución comercial 10 veces mas concentrada. Se preparan 4 tubos de ensayo: 1. Blanco. Contiene 20 μl de agua destilada. 2. Estándar. Contiene 20 μl de solución estándar de concentración 100 mg/dl de glucosa. 3. Solución X. Contiene 20 μl de solución estudiada. 4. Solución Y. Contiene 20 μl de solución estudiada. Se añaden 2 ml de solución de trabajo y se incuba durante 30 minutos. Se lee la absorbancia a 505 nm. Factor de conversión: glu mg dl 1000l solución 8000 mg glicógeno 5 dl 10 l 100l extracto 2 g tejido g tejido Solución Absorbancia Glucosa Glicógeno 3 Estándar 0.564 Control 0.807 143.08 mg/dl 5.72 mg/g tejido Ayuno 0.0 0 mg/dl 0 mg/g tejido Determinación de la glucosa glucosa β-D-glucosa O2 H 2O ácido glucónico H 2O2 oxidasa peroxidasa H 2O2 fenol ampinona quinona absorbe luz a 505 nm La glucosa oxidasa es altamente específica a β-D-glucosa – es una reacción altamente especifica. Sólo se observan los productos coloridos de la oxidación de la glucosa (no importa si hay otros monosacáridos en el suero). La enzima es tan especifica que no puede degradar la α-D-glucosa, por tanto hay que dejar un tiempo para que toda la D-glucosa se reacciones (por el paso de glucosa alfa a glucosa beta – paso de las dos formas debidas a la ciclación de la glucosa. Interferencias Si en el suero hay elevada concentración de sustancias reductoras, éstas pueden utilizar el peroxido de hidrogeno para oxidarse, por tanto la concentración de glucosa es subestimada, ya que el reductor ‘quita’ agua oxigenada del sistema – se produce menos quinona. Cuando se produce la hemólisis, se produce un aumento de la hemoglobina, lo que aumenta la absorbancia en el espectro rojo de la luz visible. Aparte, los eritrocitos, al romperse, liberan la glucosa almacenada en su interior, y por tanto sobreestima la concentración de glucosa. Método alternativo HK Glucosa6P glucosa glucosa6P NAD 6 fosfogluconato NADH deshidrogenasa NADH absorbe luz a 340 nm. Se utiliza NAD+ en vez de NADP+ ya que es más estable y también más barato. Es un sistema más específico y con menos interferencias, ya que las enzimas y los sustratos son más específicos. Este sistema es más caro, por tanto menos utilizado – sólo se usa en casos de interferencia sospechosa. Medida de la glucosa Se preparan cuatro tubos de ensayo: 1. Blanco. Contiene 20 μl de agua destilada. 2. Estándar. Contiene 20 μl de solución estándar de 100 mg/dl 3. Suero X. Contiene 20 μl del suero estudiado. 4. Suero Y. Contiene 20 μl del suero estudiado. 4 A los cuatro tubos se añaden 2 ml de solución de trabajo, y se deja a incubar durante 30 minutos. Se lee la absorbancia a 505 nm Solución Absorbancia Glucosa Estándar 0.272 Control 0.212 Ayuno 0.542 glucosa 0.218 100mg / dl 77.94mg / dl 0.272 glucosa 0.542 100mg / dl 199.26mg / dl 0.272 Determinación del colesterol en suero Por la acción de la colesterol esterasa los esteres de colesterol presentes en la muestra son hidrolizados a colesterol y ácidos grasos. El colesterol libre, en presencia de colesterol oxidasa y oxigeno, experimenta una oxidación enzimática liberando peróxido de hidrogeno, el cual en presencia de fenol, 4aminofonazona y peroxidasa da lugar a la formación de una quinona roja. La quinona formada es proporcional a la concentración de colesterol en la muestra. colesterol esteres de colesterol H 2O colesterol AG esterasa colesterol colesterol O2 H 2O colestenona H 2O2 oxidasa peroxidasa H 2O2 fenol 4 AP quinona H 2O Se preparan cuatro tubos de ensayo: 1. Blanco. Contiene 20 μl agua destilada. 2. Estándar. Contiene 20 μl solución de 200 mg/dl colesterol. 3. Suero X. Contiene μl del suero estudiado. 4. Suero Y. Contiene μl del suero estudiado. A los cuatro tubos de ensayo se añade 2 ml de solución trabajo, que contiene el tampón, las enzimas y los sustratos necesarios. Se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 505 nm. Solución Absorbancia Colesterol Estándar 0.175 0.163 Control 0.163 colesterol 200mg / dl 186.28mg / dl 0.175 0.134 Ayuno 0.134 colesterol 200mg / dl 153.14mg / dl 0.175 5 Determinación de la actividad fosfatasa alcalina en suero Las técnicas de determinación enzimática, y en particular las de interés clínico, son mayoritariamente espectrofotométricas. En estos casos se usan unos reactivos que actúan como sustratos del enzima y que al ser transformados ella ganan o pierden color, de tal modo que a más actividad más variación de color se produce. Esta variación de color es lo que nosotros podemos medir. La fosfatasa alcalina tiene una baja especificidad de sustrato, y por ello, es capaz de hidrolizar una amplia variedad de fosfoésteres orgánicos. El aceptor de fosfato liberado por la acción del enzima puede ser cualquier compuesto orgánico que contenga grupo hidroxilo, siendo habitualmente una molécula de agua: fosfatasa R Pi H 2O R OH H O Pi alcalina El término alcalina se refiere a que su pH óptimo es altamente básico. Esa enzima presenta múltiples isoformas, y está presente en muchos tejidos, aunque sus valores en sangre se alteran fundamentalmente en procesos que afectan el sistema hepato-biliar o el tejido óseo. Método de determinación El método de Bessey-Lowry emplea como sustrato dador de fosfatos el pnitrofenilfosfato. Este éster posee un color amarillo pálido, mientras que el producto de la reacción enzimática el p-nitrofenol, es de color amarillo intenso al pH alcalino de la reacción. Así puede determinarse la actividad enzimática a través de la velocidad de aparición de tonalidad amarilla intensa. fosfatasa p nitrofenilfosfato H 2O p nitrofenol Pi alcalina La concentración final del monorreactivo en el ensayo es el siguiente: Tampón glicocola pH 9.8 1M MgCl2 0.5 mM P-nitrofenolfosfato 10 mM Técnica determinativa Dejar atemperar el baño termostatizado acoplado a unos de los espectrofotómetros la longitud de onda de 405 nm. Pipetear en una cubeta de espectrofotómetro 1000 μl e monorreactivo y dejarlo atemperar a 37º durante cinco minutos. A continuación situar la cubeta en el espectrofotómetro y ajustar la absorbancia a 0. Añadir 20 μl de muestra. Inmediatamente después de mezclar, leer la absorbancia y simultáneamente poner en marcha el cronometro. Repetir las lecturas de absorbancia exactamente a los 1’, 2’, 3’ y 4’ después. Representar los valores de absorbancia frente tiempo. Hallar el valor de A/minuto. Calcular el valor de la actividad fosfatasa alcalina en las muestras sabiendo que el coeficiente de extinción molar es de 18.8 l/ mmol/cm. 6 Para la realización de esta práctica la mitad de los grupos realizarán las mediciones a 37º y la otra mitad a temperatura ambiente. ΔA 0 0.065 0.089 0.103 0.106 control absorbancia 0 0.292 1 0.357 2 0.381 3 0.395 4 0.398 actividad 0 214 293 339.9 349.8 ayuno 0 1 2 3 4 absorbancia 0.04 0.105 0.19 0.231 0.307 ΔA 0 0.061 0.146 0.187 0.263 actividad 0 201.3 481.8 617.9 867.9 Determinación de la actividad - fosfatasa alcalina 0.3 0.25 ΔA 0.2 control 0.15 ayuno 0.1 0.05 0 0 1 2 3 4 5 Tiempo Ayuno Control ΔA en función del tiempo: a 6.52 10 3 a 2.5 102 b 1.1 103 b 2.26 102 r 0.9 r 0.904 Actividad en función del tiempo a 215.16 a 82.5 b 3.3 b 74.58 r 0.99 r 0.908 Determinación de la KM de la fosfatasa alcalina En el apartado anterior hemos determinado la actividad de la fosfatasa alcalina en los sueros problema. En este caso la medida de actividad enzimática se refiere a la capacidad de catálisis en condiciones óptimas, es decir, cuando la enzima actúa a velocidad máxima. Este se consigue estandarizando las condiciones del medio (pH, temperatura, cofactores) y utilizando un exceso, o concentración saturante de sustratos. Cuando la concentración de sustrato no es saturante, la velocidad de la reacción depende de la concentración del sustrato según la ecuación de Michaelis-Menten, la función que relaciona los dos parámetros es: V VMax S K S M 7 Cuando la concentración de sustrato coincide con el valor de K M, la enzima trabaja a la mitad de la velocidad máxima. La K M es un parámetro enzimático que nos informa de la afinidad que tiene una determinada enzima para determinado sustrato, es decir, si una misma enzima presenta valores distintos de KM para diferentes sustratos, se observa que el que presenta un valor mayor de KM tiene menor afinidad por la enzima y viceversa. Para determinar gráficamente los valores de VMax y KM podemos realizar dos opciones: representar la concentración de sustrato frente la velocidad, representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten, o representar gráficamente la función inversa – la ecuación de Lineweaver-Burk, que resulta ser una recta. Método de determinación Al igual que en el apartado anterior partimos de una solución saturada del sustrato p-nitrofenolfosfato. La concentración de este reactivo que nos da el Kit comercial es de 10 mM. Para poder determinar la KM de la enzima deberemos disponer de distintas concentraciones de sustrato, para ello vamos a realizar un banco de diluciones con el fin de obtener las siguientes concentraciones: 10 mM 2.5 mM 1.25 mM 0.625 mM 0.3125 mM Una vez hechas las diluciones con buffer DEA (1mM, a pH de 9.8) procedimos a realizar el ensayo de la misma forma que en el apartado anterior con cada una de las diluciones y usando un suero control. Incubar a temperatura ambiente durante 4 minutos, seguidamente parar la reacción añadiendo 200 μl EDTA (0.5 M a pH = 8). Muchos enzimas requieren la presencia de cofactores tales como presencia de iones, por ejemplo magnesio. EDTA es un agente quelante de cationes divalentes, tal como lo es el magnesio. Una vez parada la reacción, leer la absorbancia a 405 nm, y representar la diferencia de absorción/minuto frente los valores de concentración y determinar el valor de KM. concentración 0.625 1.25 2.5 5 10 8 inversa abrosbancia 1.6 0.045998 0.8 0.067981 0.4 0.197628 0.2 0.108676 0.1 0.929368 1/A 21.74 14.71 5.06 9.2017 1.076 Determinación de Km 1/absorbancia 25 20 15 1/A 10 5 0 0 0.5 1 1.5 2 1/concentración Recta de regresión: y 6.1218 x 2.89 , r = 0.92 KM 6.1218 K M 6.1218 Vmax Vmax K M 6.1218 0.346 2.11 1 b 2.89 Vmax 0.349 Vmax Determinación de proteínas séricas Existen diversos métodos para determinar la concentración de proteínas totales en suero. El método más utilizado es el del Biuret. En este método, los compuestos que contienen más de 4 o 5 enlaces peptídicos forman complejos de color púrpura con sales de cobre en solución alcalina. El nombre de Biuret procede del hecho que una reacción análoga ocurre entre las sales de cobre y el compuesto inorgánico Biuret, el cual da el nombre a la reacción. Esta reacción permite la determinación de proteínas séricas, ya que la intensidad do color producida es proporcional al numero de enlaces peptídicos existentes y por lo tanto a las proteínas presentes en la mezcla de reacción. El reactivo de Biuret tiene la siguiente composición: CuSO4 6 mM NaOH 0.75 mM Etilenglicol 0.2 mM Emulgentes Se prepara una recta patrón utilizando soluciones de BSA de tres concentraciones distintas: 2.5 g/dl, 5 g /dl y 10 g/dl. Se preparan las primeras dos a partir de la solución de 10 g/dl. 9 Se preparan 6 tubos de ensayo: 1. Blanco. Contiene 20 μl de agua destilada. 2. 2.5 g/dl. Contiene 20 μl. 3. 5 g/dl. Contiene 20 μl. 4. 10 g/dl. Contiene 20 μl. 5. Suero X. Contiene 20 μl. 6. Suero Y. Contiene 20 μl. Se añade 1 ml de reactivo de Biuret. Incubar durante 20 minutos. Se lee la absorbancia a 545 nm. Solución 2.5 5 10 Control Diabetes Absorbancia 0.44 0.187 0.189 0.354 0.254 recta patrón absorbancia 0.2 0.15 0.1 Absorbancia 0.05 0 0 2 4 6 8 10 12 concentración BSA A b 0.354 1.72 102 16.789 g / dl a 2.006 106 A b 0.254 1.72 102 Diabetes 11.3559 g / dl a 2.006 106 Control Determinación de triglicéridos en el suero Los triglicéridos son hidrolizados enzimaticamente en glicerol y ácidos grasos. El glicerol formado se transforma en glicerol fosfato por la acción de la glicerol quinasa y ATP. La oxidación del glicerol fosfato en presencia de glicerol fosfato oxidasa libera peróxido de hidrogeno, que se detecta mediante un aceptor cromogénico de oxigeno, p-clorofenol/4-aminofenazona, en presencia de peroxidasa. La quinona roja formada es proporcional a la concentración de triglicéridos. 10 lipasa triglicéridos H 2O glicerol AG glicerol glicerol ATP glicerol 3 P ADP quinasa glicerol fosfato glicerol 3 P O2 dihidroxiacetona H 2O2 oxidasa peroxidas H 2O2 p clorofenol 4 AP quinona H 2O Se preparan 4 tubos de ensayo: 1. Blanco. Contiene 20 μl de agua destilada. 2. Estándar. Contiene 20 μl de solución estándar de 200 mg/dl 3. Suero X. Contiene 20 μl de suero estudiado 4. Suero Y. Contiene 20 μl de suero estudiado. Se añaden a los tubos 2 ml de solución trabajo y se lee la absorbancia después de 10 minutos de incubación. Solución Absorbancia Triglicéridos Estándar 0.163 0.069 Control 0.069 triglicéridos 200mg / dl 84.66mg / dl 0.163 0.170 Ayuno 0.170 triglicéridos 200mg / dl 208.58mg / dl 0.163 Resultados Proteínas séricas (7.2-8 mg/dl) Glicógeno Control 7.99 Control Ayuno 7.49 Ayuno 5.08 Diabético 9.69 Diabético 0 Colesterol (38-60 mg/dl) Control 148.36 22.4 Triglicéridos Control 67.2 Ayuno 115.79 Ayuno 169.365 Diabético 125.796 Diabético 113.84 Glucosa (83-102 mg/dl) Control 104.41 Ayuno 192.428 Diabético 266.98 K M 4.2mM (valor verdadero=1.5mM) 11 Gluconeogensis Liver glycogen constitutes a reserve of glucose for the body as a whole. The reserve is not large. In fact, the reserve is virtually exhausted in 24 hours. In such an animal the continuing requirement for glucose is satisfied by gluconeogenesis, which is the synthesis of glucose from non-carbohydrate precursors: lactate, propionate, glycerol, pyruvate, gluconeogenic amino acids. The contribution of gluconeogensis to meeting glucose requirements clearly depends on the amount of carbohydrates absorbed from the intestine, which in many species is not the same as the amount of carbohydrates ingested. Herbivores have a diet that is rich in cellulose, but microbial action in the intestine converts this carbohydrate to acetate, butyrate and propionate, of which only the last can yield glucose by gluconeogenesis. In general, only root and seed eaters, which include man, may have a diet in which a large amount of carbohydrates is both ingested and absorbed. Carnivores must derive a large part of their essential glucose from the gluconeogenic amino acids. The constitution of the diet affects not only the rate of gluconeogenesis but also the total capacity for gluconeogenesis. The amounts of certain key enzymes in the gluconeogenesis pathway vary inversely with the amount of carbohydrates in the diet. These enzymes include those which distinguish from the reversal of glucolysis and are namely: pyruvate carboxylase, glucose-6-pohsphatase, and fructose-1-6-biphosphatase and phospohenolpyruvate carboxykinase. 12 The secretion of insulin and cortisol depends directly or indirectly on the concentration of blood glucose. The concentration of these hormones in turn influences the synthesis of some of these enzymes, and hence the gluconeogenesis. In this practical the effect of the previous diet on the gluconeogenic capacity of an organ will be investigates. Only the liver and kidney are capable of gluconeogenesis and the greater size of the liver makes its contribution predominant. However, it is technically more convenient to investigate the gluconeogenic capacity in the kidney. The kidney has no store of glycogen whose breakdown might obscure the synthesis of glucose from noncarbohydrate precursors, or into which the newly synthesized glucose might be incorporated. Because the body’s metabolism can change rapidly, killing must be quick and avoid chemicals, which affect it. One method is to stun the rat and break its neck. The experiment is illustrative and to obtain reliable data in a practical of this nature would require a number of rats starved and fed rats. The technique will be the same for all experiments, but the treatment of the animals (rats) and the nature of the precursor will be varied. The experiment will study the effect on the rate of gluconeogensis in starvation and the nature of the gluconeogenic precursor. We will determine the rate of gluconeogenesis from five precursors by kidney slices from rats which have been on a normal digest or starved for 24 hours. The incubation media includes one of the five precursors: lactate, alanine, propionate, acetate or glycerol, in 10mM of Krebs bicarbonate medium. Nail 118.5mM NaHCO3 28.9mM KCl 4.7mM KH2PO4 1.2mM CACl2·6H2O 2.5mM MgSO4·7H2O 1.2mM Flasks containing 5 ml of precursor solution in Krebs bicarbonate medium, and control flasks containing only 5ml Krebs are preincubated in a shaking water bath at 37º while gassing with 95% oxygen and 5% CO2 gas mixture. The kidney from the starved rat is placed in a Perspex holder and sliced by drawing a razor blade through the holder. The slices are then washed, and bottled in the flasks containing substrates. The process is repeated for kidney slices from the fed rat. After the stoppers have been placed, the flasks are gassed with the gas mixture continuously during incubation. The importance of oxygen is to allow cellular respiration, oxidative phosphorylation and ATP synthesis; the importance of CO2 is to stabilize the equilibrium of the bicarbonate buffer and supply CO2 for carboxylase reactions (e.g. Pyruvate carboxylase). 13 The slices are incubated at 37º for 30 minutes with shaking. At the end of the incubation period, the slices are removed, blotted gently and weighed. Thin slices and efficient shaking are important features of this experiment because it’s important to provide efficient access of substrates to metabolizing tissue. Tissue weights: substrate propionate lactate alanine acetate control control fed (g) starved (g) 0.083 0.1 0.088 0.1 0.093 0.12 0.099 0.08 0.1 0.092 0.093 0.1 The concentration of glucose in the residual incubation medium must now be estimated. Calibration samples will also be required. Glucose oxydase reagent (Perid) and standard glucose solutions are used to determine a graph (0.05mM, 0.1mM, 0.15mM). The glucose reagent is preferable to chemical methods for general detection of reducing sugars since it is enzyme based, therefore specific for glucose, even if other reducing sugars are present. 5 ml glucose reagent is added to 1 ml from each incubation flask. 5 ml glucose reagent is added to 1 ml of each standard glucose solution and one reagent blank (1 ml water) total – 16 test tubes. The tubes are shaken to mix the contents and are placed in a water bath at 37º for 15 minutes. Mixing is important for assays to achieve homogeneous solutions. The glucose analysis is based on the following reactions: Hydrogen peroxide is formed when glucose is oxidized to gluconolactone and the hydrogen peroxide in turn oxidizes the chomagen ABTS (diammunium 2,2’-azino-bis(ethylbenzothiazoline-6-sulphonate)) in the presence of peroxydase to produce a green color. Next color absorbance will be measured (610 nm) and glucose content of the samples will be calculated. glucose concentration amount of glucose Absorbance in standard solution in 1 ml (610 nm) 0 0 0.04 0.05 0.05 0.16 0.1 0.1 0.28 0.15 0.15 0.41 14 Equation (regression) Calculate the rate of glucose formation as μmol/g tissue/hour for the incubated slices from the starved rats. You will need to: Use the standard plot Calculate the micromols of glucose in each of the 5 ml flasks Allow for incubation time (30 minutes) Allow for tissue weight. fed propionate lactate alanine acetate control control g absorbance μmol/g tissue/hour 0.083 0.09 2.55 0.088 0.117 3.65 0.093 0.153 5.03 0.099 0.124 3.53 0.1 0.078 1.63 0.093 0.076 1.66 starved g absorbance μmol/g tissue/hour propionate 0.1 0.17 5.36 lactate 0.1 0.27 9.43 alanine 0.12 0.4 12.26 acetate 0.08 0.25 10.77 control 0.092 0.087 2.22 control 0.1 0.092 2.25 15 The diagrams indicate a range of values obtained from 10 rats. How do your result compare with these? How would you extend this investigation? An interpretation of experimental results must be based upon a realistic estimation of the potential errors, for example: The kidney samples may dry out if cutting and selection is too slow. Technique in carrying out procedures The kidney slices will vary in thickness and composition. We have corrected for variations in weight, should we have corrected for surface area or variations in proportions of cortex? How could we do this? The rate of gluconeogenesis is controlled by a number of key enzymes which catalyze the ‘essentially irreversible’ reactions. It is at these stages that the catabolic pathway of glucolysis and the biosynthetic pathway of gluconeogensis differ. The activity of the enzymes controlling these reactions should be higher in the rats starved for 24 hours. Do your results agree with this? –yes, gluconeogenesis is more evident in the starved rats. propionate lactate alanine acetate control control fed 2.55 3.65 5.03 3.53 1.63 1.66 starved 5.36 9.43 12.26 10.77 2.22 2.25 The gluconeogensis is produced only from certain precursors – for example, acetate does not serve as precursor since it has similar gluconeogenic 16 rate as the control group, while other precursors have a much higher gluconeogenic rate. In ruminant animals it is more likely that the gluconeogenesis will be more efficient with propionate, while in carnivores gluconeogenesis will be more efficient gluconeogenic amino acids. 17
