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Datos Generales
Nombre del Actividad antibacteriana de extractos etanólicos de tres especies de plantas del
género Annona en Staphylococcus aureus
Proyecto
Semillero
SEINCOBIO - SEMILLERO DE INVESTIGACIÓN EN CONSERVACIÓN
BIOLÓGICA
Área del
Proyecto
Ciencias Biológicas y del Mar
Subárea del
Biología General
Proyecto
Tipo de
Proyecto
Proyecto de Investigación
Subtipo de
Proyecto
Investigación en Curso
Grado
Pregrado
Programa
Académico
Biología
Email
[email protected]
Teléfono
3138929581
Nodo
Bogotá
Integrantes :
[1013654362-CAROLINA ANDREA QUIROZ MONTOYA]
Instituciones a las que pertenece :
[860015542-UNIVERSIDAD DE LA SALLE]
Datos Específicos del Proyecto
Introducción
A lo largo del tiempo el ser humano ha estado rodeado y expuesto a una gran cantidad de
bacterias que afectan y deterioran su vida. Esto debido a los cambios ecológicos, mal uso y
tratamiento de basuras en las ciudades, adaptaciones microbianas referente a resistencia a
antibióticos, entre otros (1). Aun así, los procesos tecnológicos y la medicina han logrado
nuevos avances en el desarrollo de antibióticos y vacunas para dar solución a algunas
enfermedades peligrosas o mortales, las cuales han permitido reducir o impedir la aparición de
miles de infecciones bacterianas (2). Cierta parte de las enfermedades infecciosas a las que se
encuentra expuesto el ser humano son causadas por bacterias patógenas como Staphylococcus
aureus, la que en la mayoría de los casos es contraída, por el consumo de alimentos mal
elaborados, manipulados y cocidos en diferentes establecimientos comerciales no industriales
(3).
Planteamiento del Problema
Planteamiento del problema: Staphylococcus aureus es una bacteria comúnmente llamada como
estafilococo dorado por su pigmentación amarilla, es una bacteria con forma de coco, Gram
positivo, anaerobio e inmóvil (1). Por otro lado, también es considerada como una de las
responsables de las intoxicaciones alimentarias, cuando es contraída por el consumo de
alimentos mal elaborados en establecimientos comerciales no industriales (1). A la vez esta
bacteria, es la causante de diversas afecciones que comprende desde infecciones cutáneas hasta
enfermedades sistemáticas mortales (2). Desde hace algunos años, S. aureus se ha convertido en
una amenaza mundial al presentar resistencia a antibióticos de primera generación como
ampicilina y penicilina, además de demostrar resistencia a meticilina y vancomicina (3,4). Esto
es debido principalmente a que dichas cepas han surgido de hospitales debido a factores como
el amplio uso de antibióticos, tratamientos incorrectos en cuanto a dosis mal utilizadas por los
pacientes, tiempo de intervención y abandono del medicamento sin la terminación del
tratamiento (3,5). Justificación: En Colombia se están realizando grandes esfuerzos para el
desarrollo y la búsqueda de nuevos mecanismos biotecnológicos que permitan complementar y
fomentar la medicina alternativa a partir de las propiedades fitoquímicas de las plantas (6).
Desde hace varias décadas, el uso de plantas ha sido el punto de atención para los
investigadores, debido a que gran parte de sus constituyentes podrían funcionar como
alternativa para dar una posible solución a algunos factores que afectan nuestro bienestar (7).
Las plantas poseen un gran reservorio de metabolitos como parte del mecanismo de defensa
frente a microorganismos, insectos, etc (3). Entre estos compuestos se han identificado fenoles,
flavonas, flavonoides, entre otros; las cuales han demostrado tener propiedades antioxidantes,
anticancerígena, antifúngicas y antibacterianas (8-11). Lo anterior permite que estos
constituyentes puedan ser utilizados para inhibir el crecimiento de bacterias y que dado que el
uso de extractos vegetales es poco utilizados en la medicina convencional colombiana, puede
que las bacterias patógenas aún no hayan desarrollado mecanismos de resistencia contra estos
(3,12-13). Actualmente el uso de mezclas de agentes antimicrobiales ofrece un medio poderoso
para combatir la propagación de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos.
Generalmente, algunas bacterias patógenas como el caso de S. aureus han desarrollado
resistencia a un tipo de agente y que la probabilidad que de una bacteria sea resistente a una
combinación de agentes es baja (14-15). El efecto que se puede presentar en las mezclas se
divide en 3: sinérgica, aditivo y antagónica (14-15).
Objetivo General
Evaluar la actividad antibacteriana de tres extractos etanólicos del género Annona (Annona
muricata, Annona squamosa y Annona cherimola) de manera independiente y en mezclas frente
a Staphylococcus aureus.
Objetivo Específicos
? Evaluar el efecto de los extractos etanólicos de hojas de Annona muricata, Annona squamosa
y Annona cherimola en la inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus. ? Determinar sí
existe un efecto de las mezclas de los extractos etanólicos de Annona muricata, Annona
squamosa y Annona cherimola en el crecimiento de Staphylococcus aureus.
Referente Teórico
El género Annona ha sido investigado con respecto al efecto de los extractos a partir de 1982,
desde entonces se han intensificado sus estudios debido al potencial de sus compuestos y a la
variedad de actividades biológicas que estas poseen (16), entre las actividades más conocidas y
reportadas corresponden a efectos insecticidas, larvicida, antitumorales, antibacteriales y
antimalariales (16). Por otro lado, es uno de los géneros más conocidos de la familia
Annonaceae, cuenta con más de 360 especies descritas (17). Actualmente, son muy pocas las
especies del género Annona que se cultivan mundialmente; en Colombia, los cultivos más
reconocidos para uso doméstico y/o comercial corresponden a Annona muricata, Annona
squamosa y Annona cherimola (Guanábana, Anón y Chirimoya, respectivamente) (17). En
relación con las especies a trabajar en el desarrollo de la propuesta, se han encontrado estudios
donde se evalúa la actividad antibacteriana de A. muricata de frutos sanos y maduros, corteza,
semillas y hojas con extractos de fermentación anaerobia, así como metanolico, acuoso e
hidroalcoholico, los cuales han presentado actividad frente a Escherichia coli, Streptococcus
mutans, Pseudomonas aeroginosa, Streptococcus spp y en S. aureus (25-28). Por otro lado, con
relación a A. cherimola, se realizó un estudio de actividad antibacteriana de hojas, flores y
frutos con extracto de aceites esenciales obtenidos por arrastre de vapor, frente a E. coli, S.
aureus, Enterococcus faecalis, Shigella sonei y Proteous mirabilis, además de reportarse la
actividad antifúngica frente a Candida albicans (29). Finalmente, con relación a A. squamosa se
encontró un estudio referente a actividad antibacteriana con hojas y semillas con extractos de la
mezcla de etanol-metanol y hexano-cloroformo respectivamente frente a Neisseria gonorrhoeae
(30); generalmente está especie de planta es utilizada para usos antiinflamatorios e insecticida
frente a mosquitos como Culex quinquefasciaturs y Aedes aegypti (31-32). Por otro lado, con
respecto a la evaluación del efecto de las mezclas no se encontraron estudios realizados con
dicho fin, ni para actividad antibacteriana ni con las especies a trabajar en las bases de datos de
ScienceDirect, Scielo y Web Science.
Metodología
? Selección de la Materia Prima Se colectaron 500g de hojas de A. muricata, A. squamosa y A.
cherimola. Todas las plantas fueron identificadas directamente en el sitio de recolecta teniendo
en cuenta el Herbario Nacional Colombiano (18). ? Preparación del material vegetal El material
vegetal inicialmente fue enjuagado en agua destilada, luego llevado a una etapa de sumergido en
Hipoclorito de Sodio para su posterior inmersión en agua destilada con el objetivo de eliminar
el cloro residual, el resultante del procedimiento anterior fue secado al aire libre sobre papel
periódico concluyendo con el triturado del material por separado en un molino (19). ?
Preparación de los extractos etanólicos Se colocaron 200g del material vegetal en polvo en
1000ml de etanol al 96% por 48h. Inicialmente los extractos fueron filtrados en dos etapas, por
gasa y por papel filtro Whatman#1, posteriormente estos se concentraron mediante destilación a
presión reducida por medio de un Rotaevaporador, obteniendo de tal forma el extracto crudo
(20). Finalmente, el extracto crudo se colocó en un horno a 50°C por 72h para así obtener el
extracto crudo seco. ? Preparación de las diluciones A partir del extracto crudo seco se
realizaron las concentraciones al 1,25%, 0,62%, 0,31%, 0,15% y 0,07%. El solvente utilizado
fue Dimetil Sulfoxido (DMSO). Estas concentraciones fueron guardadas en tubos eppendorf
estériles y conservadas en refrigeración hasta el momento de su utilización para las pruebas
posteriores de actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus. ? Preparación y
estandarización del inoculo La bacteria S. aureus fue donada por parte de la Universidad de la
Salle. Inicialmente la bacteria fue inoculada 24 horas por 37°C en Caldo Nutritivo (21,19).
Posteriormente se centrifugo y se suspendió en solución salina estéril hasta alcanzar la densidad
bacteriana equivalente a la turbidez de 0,5 del Patrón de McFarland por medio del uso del
espectrofotómetro (21,19). ? Pruebas microbiológicas y controles de crecimiento Test de
sensibilidad con antibióticos Luego de realizar la estandarización del inoculo, se efectuó una
siembra masiva sobre agar nutritivo en cajas de Petri, se colocaron los sensidiscos de
Ampicilina, Eritromicina, Amoxicilina/Acido clavulanico, Gentamicina y Cefalexina, para
luego iniciar la incubación a 37°C por 24 horas, para observar la presencia de halos de
inhibición (22). El procedimiento anterior se realizó por duplicado con el fin de seleccionar el
control positivo para Staphylococcus aureus. Test de sensibilidad con Ampicilina En una
microplaca de 24 pozos se prepararon concentraciones de 10µg/ml, 50µg/ml y 80µg/ml de una
solución madre del antibiótico seleccionado en el test de sensibilidad (Ampicilina), a
continuación se completaron los volúmenes finales a 1000 ml con agar nutritivo. Posteriormente
se agregaron 3 µl del inoculo estandarizado incluyendo al control negativo. Finalmente se
procedió con la incubación a 37°C por 24 horas, con el fin de observar la interacción que
presenta el antibiótico con la bacteria S. aureus. Este procedimiento se realizó por triplicado.
Test de sensibilidad con Dimetil Sulfoxido (DMSO) En una microplaca de 24 pozos se
prepararon concentraciones 2%, 5% y 10% de Dimetil Sulfoxido (DMSO), luego se
completaron los volúmenes finales a 1000 ml con agar nutritivo. Posteriormente se agregaron 3
µl del inoculo estandarizado incluyendo al control negativo. Finalmente se procedió a la
incubación a 37°C por 24 horas, para de esta forma observar la interacción que presenta el
Dimetil Sulfoxido (DMSO) con la bacteria S. aureus. Este procedimiento se realizó por
triplicado. ? Ensayo prueba High Throughput SPOTi Actividad independiente Se realizó una
solución madre al 50% de cada extracto crudo, pesando 0,75g del extracto que luego fueron
disueltos en 1,5ml de DMSO, a partir de dicha solución madre, se prepararon las diluciones
25%, 12,5%, 6,2%, 3% y 1,5%. Luego se agregaron 50µl de cada dilución en una microplaca de
24 pozos (cada pozo de completo su volumen a 1000µl con agar nutritivo) para así obtener las
concentraciones finales de 1,25%, 0,62%, 0,31%, 0,15% y 0,07%. De la misma forma se
prepararon los controles de esterilidad de los extractos con la concentración más alta y controles
de crecimiento con DMSO y Agar Nutritivo. Posteriormente se agregó 3 µl del inoculo
estandarizado incluyendo a los controles de crecimiento a excepción de los controles de
esterilidad. Finalmente se procedió a la incubación a 37°C por 24 horas, para observar la
interacción que presenta los extractos etanólicos con el crecimiento de la bacteria S. aureus.
Este procedimiento se realizó por triplicado. Por otro lado, se realizó el mismo procedimiento
anteriormente mencionado con la solución madre al 50% para así obtener una concentración
final al 2,5%. Actividad combinada A partir de la solución madre y las diluciones preparadas
con anterioridad, se agregaron 25µl de cada dilución de los extractos realizando combinaciones
dobles en una microplaca de 24 pozos (en cada uno de estos se completó el volumen a 1000µl
con agar nutritivo) con el fin de obtener las concentraciones finales de 1,25%, 0,62%, 0,31%,
0,15% y 0,07%. Así mismo se prepararon los controles de esterilidad y crecimiento con DMSO
y Agar Nutritivo de los extractos con la concentración más alta. Posteriormente se agregaron 3
µl del inoculo estandarizado incluyendo a los controles de crecimiento,exceptuando los
controles de esterilidad. Finalmente se procedió a la incubación a 37°C por 24 horas, para
observar la interacción que presenta los extractos etanólicos con el crecimiento de la bacteria S.
aureus. Este procedimiento se realizó por triplicado. Por otra parte se realizó el mismo
procedimiento para evaluar la actividad combinada triple, en un tubo eppendorf se agregaron 60
µl de cada uno de los extractos de las diluciones preparadas con anterioridad, a partir de la cual
se agregaron 50 µl en cada uno de los pozos de la microplaca (24 pozos) según correspondiera
la concentración, en cada pozo se completo el volumen a 1000µl con agar nutritivo, lo anterior
con el fin de obtener las concentraciones finales de 1,25%, 0,62%, 0,31%, 0,15% y 0,07% con
lo cual se aplicó el mismo procedimiento de las dos pruebas anteriores. ? Análisis Estadístico
Inicialmente se realizará un análisis descriptivo básico para consolidar e interpretar los datos
obtenidos de los sets de concentraciones de cada extracto (21,23). Finalmente, para la
determinación del efecto en las mezclas, se utilizará la formula reportada por Davidson y Parish
(1989) de Concentración Fraccionada Inhibitoria (CFI) (15,24).
Resultados
Resultados preliminares: Cada una de las plantas se identificó según la colección del Herbario
Nacional Colombiano, para Annona muricata se identificó a partir del registro COL000214609,
Annona squamosa con el registro COL000214543 y Annona cherimola COL000214532. Con
respecto a los extractos etanolicos, luego de su correspondiente preparación se obtuvo un peso
final del extracto crudo de 18.58g, 16.22 y 15.65 (Annona muricata, Annona squamosa y
Annona cherimola respectivamente). A partir del test de sensibilidad con antibióticos se
lograron observar los halos de inhibición, los cuales dieron como resultado diámetros de 36mm,
21.5mm 36.5, 14mm y 24.5mm (Ampicilina, Eritromicina, Amoxicilina/Acido clavulanico,
Gentamicina y Cefalexina respectivamente) para S. aureus, a partir de estos resultados se
decidió tener como referencia y control positivo la Ampicilina. Para el test de sensibilidad con
Ampicilina, bajo las concentraciones trabajadas, no hay crecimiento de la bacteria y para el test
de sensibilidad con DMSO, aunque en todas las concentraciones crece la bacteria, se observa
una pequeña diferencia en coloración y crecimiento de la bacteria correspondiente a un 10%,
por tal motivo se decidido trabajar con una concentración al 5% para que este no interviniera en
el crecimiento de la bacteria. Finalmente, para la evaluación de la actividad independiente de los
extractos, los resultados obtenidos muestran un crecimiento de la bacteria en todas las
concentraciones, lo que no permitió determinar el MIC.
Conclusiones
N/A
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