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EVALUACIÓN DE LA PREBIOSIS DE UNA DIETA ESTÁNDAR SUPLEMENTADA CON
GRENETINA EN RATAS WISTAR.
Ramos-Ramírez, E. G., Méndez –Castrejón, M.P., Ramos-Tovar, E., Salazar-Montoya, J.A.
Departamento de Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN
Av. IPN 2508 Col. San Pedro Zacatenco, México,D.F. C.P. 07360Email: [email protected]
RESUMEN
El intestino es un órgano con la más diversa colonización y con una alta tasa metabólica. La
sección del colon contiene más de 1000 especies diferentes de bacterias (10 14-1013 UFC/m)
(Luckey 1972). La actividad y composición de la microbiota intestinal pueden influenciar la salud
del hospedero y es considerada estable en la adultez, sin embargo, el estrés ambiental y la dieta
pueden perturbar las comunidades microbianas, influenciando así los estados de saludenfermedad. Entre los grupos que afectan en mayor proporción la salud se encuentran
Lactobacillus y Bifidobacterias. Dentro de los efectos benéficos mostrados por estos
microorganismos se presenta la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas, la estimulación
de funciones del sistema inmune, la reducción de hipercolesterolemia y la disminución de
incidencia de algunos tipos de cáncer, como el de colon. En el presente trabajo se evaluaron los
posibles efectos prebióticos de una dieta estándar comercial suplementada con pellets de
grenetina, en la microbiota cecal y fecal de ratas Wistar macho. El diseño experimental permitió
hacer un seguimiento del perfil de crecimiento y permanencia de la población microbiana
estudiada, así como la contribución del contenido dietario.
INTRODUCCIÓN.
La microbiota del tracto gastrointestinal está sujeta a factores bióticos y abióticos que pueden
alterar sus poblaciones. Entre los factores limitantes, aparte de sus requerimientos nutricionales,
son el pH imperante en cada sección del intestino, el estado de salud del hospedero y balance de
la microbiota. En el colon, por ejemplo, por su baja tensión de oxígeno y pH ácidos se favorece
ampliamente la población de bacterias ácido lácticas, Bifidobacterias, Bacteroides y otros
microorganismos como Clostridium y Stafilococcus. Estos microorganismos también pueden verse
favorecidos en su crecimiento poblacional por factores prebióticos definidos como “sustancias no
digeribles que brindan un efecto fisiológico beneficioso al huésped, estimulando selectivamente el
crecimiento favorable o la actividad de un número de bacterias autóctonas” (GP-OMEG,2008).
Otros factores que puede modificar la microbiota es la presencia de péptidos bioactivos. Donkor et.
al. (2007) estudiaron poblaciones de bacterias ácido lácticas (Lactobacillus y Bacteroides) así
como Salmonella spp y reportaron actividad proteolítica en las especies estudiadas que tuvo como
resultado la liberación de péptidos con efecto hipotensivo (estudios in vitro). La producción de
amino peptidasas fue dependiente del tiempo y de la cepa. Dado que los requerimientos de
nutrientes como aminoácidos o péptidos son grandes, la actividad proteolítica de estas cepas es un
factor determinante como un sistema de autogestión. En diversos estudios se ha usado a la
grenetina (derivado del colágeno) como un material de recubrimiento o vehículo para administrar
microorganismos probióticos (Lozano et al 2011) y para administrar prebióticos en diversos
modelos biológicos (Reyes-Reyes en preparación), sin embargo, la grenetina siendo una proteína
tiene la posibilidad de adicionar algún efecto en dietas que han sido suplementadas con esta
(Gómez-Guillén et al, 2011), Estudios previos han demostrado tanto in vitro como in vivo que los
hidrolizados de grenetina ya sea de fuentes convencionales como son la grenetina de res (Kim et
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al 2001a) o grenetina de cerdo así como la de pescado y diversos productos marinos (GómezGuillén et al 2011; Ramírez-Guerra et al 2013, Kim et al 2001b) pueden tener efecto hipotensivos
así como efectos antimicrobianos y estar involucrados en la inmunidad innata de enfermedades
infecciosas (Rivas-Santiago et al 2006). En este trabajo se pretende estudiar el efecto de dietas
adicionadas con pellets de grenetina de piel de res sobre el crecimiento de ratas Wistar macho y su
efecto sobre la microbiota del colon (en su sección cecal) particularmente de los géneros
Lactobacillus spp, Bifidobacterias spp, Bacteroides spp y Clostridium spp.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Se trabajó con ratas Wistar macho de 100 a 120g de peso corporal. Las ratas fueron colocadas en
jaulas metabólicas a temperatura ambiente con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas. El agua fue
proporcionada ad libitum y el 10% de su peso en alimento (LabDiet 5008). Todos los animales
recibieron el cuidado de acuerdo al Comité de Ética del CINVESTAV y a la NOM-062-ZOO-1999.
Los individuos fueron acondicionados a las condiciones experimentales una semana previa a la
aplicación del tratamiento. Los animales fueron asignados aleatoriamente a cada uno de dos
tratamientos: control (20 animales) que incluyó sólo la administración del alimento comercial;
grenetina (20 animales) el cual consistió en la administración diaria vía oral y en ayuno de 12 horas
un pellet de un gramo de grenetina de piel de res (Gelita 250 Bloom) previamente gelatinizada (gel
al 7%), después de lo cual se administró alimento estándar a ambos grupos de animales.
El registro del peso corporal se llevó a cabo una vez por semana durante siete semanas después
de haber registrado su peso inicial. Una vez por semana los individuos fueron colocados en jaulas
metabólicas para colecta de heces. En tres individuos seleccionados al azar y bajo anestesia
general y en condiciones asépticas se hizo la disección del ciego el cual fue colocado en caja Petri
estéril para su posterior tratamiento. Después de lo anterior los animales fueron sacrificados en
cámara de CO2 cuidando de mantener el nivel de anestesia durante todo el procedimiento.
Bajo condiciones asépticas, 100 miligramos de cada lote de heces y 100 mg del contenido del
ciego de cada individuo fueron homogeneizados en agua peptonada estéril (Bioxon 252606) al 1%
y se hicieron diluciones decimales seriales (Camacho et al 2009). Se usaron medios selectivos
para el recuento de Lactobacillus (MRS, Difco 288130 y 288210) Bifidobacterias (BSM agar, Fluka
88517), Clostridium (Reinforced clostridial agar, Fluka 91365) y Bacteroides (Bile esculin agar,
Fluka 48300). Las cajas se incubaron bajo condiciones anaerobias a 37°C por 72 horas. Los
resultados se expresaron como unidades formadoras de colonias por gramo de peso (UFC/g).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
El incremento en peso (%) (Fig. 1) fue mayor en ratas con dieta estándar aunque sin diferencias
significativas respecto a ratas adicionadas con grenetina. La diferencia entre estos fue significativa
en la semana 7 de tratamiento cuando las ratas adicionadas con grenetina mostraron un
incremento en peso 15% por arriba de las ratas control lo que estaría reflejando una mayor
eficiencia de incorporación de masa por unidad de peso inicial.
La administración del pellet previo al suministro del alimento pudo haber contribuido con una menor
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Fig.1. Porcentaje de incremento en peso de ratas Wistar macho alimentadas con dieta
comercial (Control) y con dieta comercial adicionada con grenetina (Pellet)
ingesta de alimento sobre todo en las primeras semanas lo que se vió reflejado en el menor
porcentaje de incremento en peso durante casi todo el experimento para las ratas adicionadas con
pellet de grenetina. El mayor incremento en peso durante la última semana de experimentación
sugiere un efecto positivo del pellet. De acuerdo con Rodríguez et al (2013), la microbiota está
implicada en la recuperación de energía de la dieta y al parecer de alguna forma la grenetina
podría estar siendo utilizada quizá en la obtención de péptidos que podrían favorecer a mediano
plazo la ganancia de peso.
La modificación semanal de contenido bacteriano en ciego y en heces de ratas alimentadas con
alimento estándar, con y sin suplementación de grenetina se presenta en la figura 2 (a: control y b:
grenetina) y Fig 3 (a: control y b: grenetina). Las UFC/g de contenido cecal (Fig. 2) para
Lactobacillus y Clostridium estuvieron entre 4.00+9 y 2.00+9 (control) y 4.50+09 y 1.50+09
(grenetina) en las dos primeras semanas de experimentación.
El abatimiento del número de UFC/g de contenido cecal fue mayor al 50% en las semanas 3 a 6
volviendo a incrementar casi a su nivel inicial sólo para Lactobacillus, para Clostridium la
recuperación fue menor. En los individuos a los cuales se les suplementó con pellet de grenetina la
recuperación del número de UFC/g de contenido cecal de Lactobacillus fue mayor que para todas
las demás especies bacterianas estudiadas y mayor en un 20.45% que en las ratas control.
El descenso en las poblaciones bacterianas en las ratas control se dio desde la primera semana de
experimentación y en las adicionadas con pellet de grenetina fue a partir de la segunda semana.
Las UFC/g de contenido cecal para Clostridium fueron menores que en ratas control. Las
poblaciones de Bifidobacterias y Bacteroides se mantuvieron en niveles inferiores a 4.70E+08
UFC/g durante todo el experimento excepto en Bifidobacterias que llegó a 7.62E+08 UFC/g en la
semana 3 en los animales suplementados con grenetina.
La población incial de Clostridium en heces fue similar tanto para animales control como para
suplementados con grenetina (2.88E+09 y 1.98E+09 UFC/g respectivamente) (Fig. 2 a y Fig 3 a).
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Figura 2.Dinámica poblacional en ciego de ratas alimentadas con alimento comercial (a) y con
adición de pellet de grenetina (b).
Hubo un incremento de aprox el 20% de la primera a la segunda semana de experimentación y en
ambos grupos pudo notarse que cuando la población de Lactobacillus comenzó a incrementar sus
UFC/g de heces la de Clostridium disminuyó dramáticamente. Las poblaciones de Bifidobacterias y
Bacteroides también estuvieron pobremente representadas en heces con máximos de 4.41E+07 y
4.09E+07 UFC/g.
La presencia de Lactobacillus en mayor cantidad respecto a Clostridium habla de un balance
favorable. Aun cuando la presencia de Bifidobacterias y Bacteroides (bacterias benéficas) es muy
baja en el ciego la presencia de Lactobacillus habla de un estado saludable de la microbiota ya que
de acuerdo a diversos investigaciones las poblaciones de bacterias como Lactobacillus condiciona
la disminución de microbiota dañina como Clostridium (Rodríguez et al 2013).
Figura 3. Dinámica poblacional de bacterias en heces de ratas alimentadas con dieta comercial (a)
y adicionada con pellets de grenetina (b).
De acuerdo con Delgado (2005) las poblaciones de Bifidobacterias normalmente son más
importantes en cuanto a su número en infantes y la tendencia normal es a tener poca presencia de
este género en la edad adulta lo que coincide con lo encontrado en este trabajo. Se ha reportado a
Bifidobacterias como negativa a la licuefacción de grenetina (Scardovi, 1986 en Delgado, 2005) lo
que pudo determinar la carencia de efecto sobre sus poblaciones. Contrario a lo reportado por
Rodríguez et al (2013) y Delgado (2005) el género Bacteroides se mantuvo en niveles por debajo
de 3.30E+07 y 3.50E+07 UFC/g tanto en contenido cecal como en heces.
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CONCLUSIONES.
La adición de grenetina a la dieta de ratas tuvo un efecto significativo sobre el porcentaje de
incremento de masa corporal sólo hasta la semana siete de experimentación lo que sugiere la
necesidad de períodos más largos de experimentación para determinar si este efecto es
permanente en el tiempo. Así mismo los géneros que mostraron ser más susceptibles a la
presencia de grenetina en la dieta fueron Lactobacillus y Clostridium y en menor grado
Bifidobacterium y Bacteroides. Son necesarias pruebas a más largo plazo y evaluar parámetros
como química sanguínea para confirmar si el efecto positivo que se está observando en la
ganancia en peso y en la microbiota efectivamente corresponden a una prebiosis de las dietas
suplementadas con grenetina.
investigación.
BIBLIOGRAFÍA.
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