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Módulo de Estrés Oxidativo y Salinidad
Laboratorio Avanzado de Fisiología Vegetal
2007/2008
LABORATORIO AVANZADO DE FISIOLOGÍA
Curso 2006/2007
MÓDULO ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR SALINIDAD
Comisión Docente de Fisiología Vegetal
Luis E. Hernández
Soledad Sanz
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Módulo de Estrés Oxidativo y Salinidad
Laboratorio Avanzado de Fisiología Vegetal
2007/2008
INTRODUCCIÓN
El objeto de esta práctica es la utilización de diversas técnicas bioquímicas y de biología
molecular para estudiar un problema fisiológico. La salinidad es un importante factor de estrés
especialmente relevante para la agricultura, y en concreto en el área mediterránea. En la
actualidad, más del 20% de los suelos cultivados y aproximadamente el 50% de las tierras
irrigadas, están catalogados como potencialmente salinos. Uno de los cultivos más afectados por
este problema es el de tomate (Lycopersicon esculentum), que se crece intensivamente en amplias
zonas del litoral almeriense y huertas murcianas bajo cubierta. El uso de aguas freáticas de un
modo indiscriminado ha provocado su salinización, mediante la entrada de agua del mar en
dichas aguas subterráneas.
El efecto más común de la salinidad sobre las plantas es la reducción del desarrollo debido a la
disminución del potencial osmótico del medio y en consecuencia del potencial hídrico del suelo y
a una toxicidad específica asociada con la absorción excesiva de Na + y de Cl–. Esto último
produce un desequilibrio nutricional debido a la interferencia de estos iones con otros nutrientes
esenciales. Como consecuencia de estos efectos primarios, ocurren otros estreses secundarios,
como el daño oxidativo.
Entre los síntomas característicos del estrés inducido por salinidad es común encontrar el
aumento de especies reactivas de oxígeno (EROs), como el ión superóxido (O2–) y peróxido de
hidrógeno (H2O2). Para atenuar la toxicidad celular de estas sustancias, las plantas disponer de
varios enzimas, entre los que cabe mencionar superóxido dismutasa (SOD) y ascorbato
peroxidasa (APX), de las que existen varios isoenzimas distribuidos en diferentes compartimentos
subcelulares (Fig. 1). Dichos enzimas forman parte de un complejo mecanismo de detoxificación
de EROS, donde intervienen glutation y ascorbato como compuestos reductores.
Fig 1. Ciclo ascorbato-glutation para la eliminación de especies reactivas de oxígeno (EROs).
SOD y APX juegan un papel central en su eliminación.
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Aunque en condiciones ambientales adecuadas para el desarrollo de la planta se generan EROs en
diversos procesos metabólicos, éstos se acumulan en concentraciones “peligrosas” cuando se
somete a aquellas a condiciones de estrés. Está descrito que exposición a altas intensidades de luz,
aplicación de xenobióticos (p. ej. herbicidas), alta temperatura, congelación, interacción con
patógenos, etc., supone el aumento de EROs, en ocasiones en un fenómeno llamado estallido
oxidativo. En nuestro caso, hemos preferido centrar nuestro interés en el estrés oxidativo
inducido por salinidad, de la que hay bastante información en la bibliografía.
En el transcurso del módulo, se analizará la respuesta de las plantas a varios niveles, estudiando
diversos índices de estrés. Así, determinaremos el posible cambio en el nivel de expresión de genes
que codifican proteínas implicadas en la respuesta a salinidad, como son ascorbato peroxidasa
(APX) y 1-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (P5CS). En segundo lugar, se detectará la actividad
de APX in gel, y se medirán varios parámetros de estrés como la peroxidación de lípidos y la
degradación de clorofilas.
El tomate se ha mostrado como una planta capaz de tolerar niveles moderados de salinidad. Por
esta razón se va ha utilizar una concentración elevada en los ensayos de estas prácticas (NaCl 200
mM), que será suministrado durante cinco días, en un medio hidropónico, que nos permite
controlar exhaustivamente la concentración de nutrientes aplicados en nuestro cultivo.
Bibliografía
Armengaud R, Thiery L, et al. 2004. Transcriptional regulation of proline biosynthesis in
Medicago truncatula reveals developmental and environmental specific features. Physiologia
Plantarum, 120: 442-450.
Dionisio-Sese ML, Tobita S. 1998. Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress.
Plant Science, 135:1-9
Fujita T, Maggio A, et al. 1998. Comparative analysis of the regulation of expression and
structures of two evolutionarily divergent genes for 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase
from tomato. Plant Physiology, 118: 661-674.
Mittova V, Theodoulou, et al. 2004. Comparison of mitochondrial ascorbate peroxidase in the
cultivated tomato, Lycopersicon esculentum, an its wild salt-tolerant relative, L. pennellii – a role
for matrix isoforms in protection against oxidative damage. Plant, Cell Environment, 27: 237250
Vieira-Santos CL, Campos A, et al. 2001. In situ and in vitro senescence induced by KCl stress:
nutritional imbalance, lipid peroxidation and antioxidant metabolism. Journal Experimental
Botany, 52:351-360
Zhu JK. 2001. Plant salt tolerance. Trends Plant Science, 6:66-71.
MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CULTIVO
El sistema biológico que vamos a utilizar es plantas de tomate (Lycopersicon estulentum, cv.
Marmande), que se han crecido durante tres semanas en un medio semi-hidropónico,
empleando perlita como sustrato inerte y siendo regadas semanalmente con disolución
comercial Gamborg a una concentración de ½ (Duchefa, G0209.0050). La disolución
nutritiva se prepara utilizando 15 g del preparado, a disolver en 10 L de agua desionizada,
ajustándose el pH a 6.0. 72 h antes de la toma de muestras, el lote de plantas que van a sufrir
el estrés por salinidad se riega con 2 L de disolución Gamborg ½ suplementada con NaCl 200
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mM (Se prepara añadiendo 23,38 g NaCl a 2 L de disolución nutritiva). Durante todo el
cultivo de las plantas, éstas se mantuvieron en una cámara de cultivo de condiciones
ambientales controladas (16 h luz, 8 h oscuridad; 27 ºC y 18 ºC, respectivamente).
Tabla 1. Concentración de sales minerales de la disolución nutritiva Gamborg
Sales de macronutrientes (mg·L-1)
(NH4)2SO4
134.00
KNO3
2500
CaCl2·2H2O
113.23
MgSO4·7H2O
121.56
NaH2PO4
130.44
Sales de micronutrientes (mg·L-1)
KI
0.75
H3BO3
3.00
MnSO4·4H2O
10.00
ZnSO4·7H2O
2.0
Na2MoO4·2H2O
0.25
CuSO4·5H2O
0.025
CoCl2·6H2O
0.025
Na2·EDTA
37.3
FeNaEDTA
36.70
ANÁLISIS POR RT-PCR DE LA EXPRESIÓN GÉNICA
El funcionamiento de un organismo se controla básicamente a dos niveles: actividad génica,
lo que supone la expresión de sus genes, y regulación fina de enzimas por mecanismos posttraduccionales. La expresión de un gen consta de una serie de etapas: en primer lugar la
transcripción de la secuencia de DNA a RNA, en segundo la maduración de ese RNA hasta la
formación de los mRNA, y por último, la traducción del mRNA a la secuencia de
aminoácidos de la proteína que codifica.
Entre los métodos de análisis de la expresión génica se encuentra el estudio de la acumulación
de los tránscritos de mRNA. Hay fundamentalmente dos técnicas para realizar esto. Por un
lado, mediante una hibridación por Northern-blot, en la que se prepara una sonda,
generalmente marcada con 32P, que es homóloga a la secuencia de nucleótidos del gen que se
quiere analizar. Este marcaje radiactivo puede visualizarse mediante su exposición a un film
fotográfico (del tipo de las autoradiografías de rayos-X). Esta técnica es laboriosa, y requiere
el empleo de radioisótopos, con el consiguiente riesgo para la salud.
El segundo método es la utilización de la Polymerase Chain Reaction (PCR), que se basa en
la reacción de una DNA polimerasa tolerante a altas temperaturas. Empleando unos cebadores
específicos para la secuencia del gen a estudiar, se puede amplificar, esto es, multiplicar
geométricamente, el número de fragmentos de DNA flanqueados por dichos cebadores (Fig.
2). Para que pueda estudiarse el nivel de tráscritos, previamente a la PCR, hay que sintetizar
una cadena de DNA a partir de RNA (DNA complementario o cDNA), para lo que emplea
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una transcriptasa reversa (RT). Tras la PCR, los fragmentos amplificados de DNA se separan
en un gel de agarosa, visualizándose el DNA por su tinción con bromuro de etidio
(SUBSTANCIA
CARCINOGÉNICA
QUE
HAY
QUE
MANIPULAR
CORRECTAMENTE).
Preparación del material vegetal para RNA
Para facilitar el procesado de las muestras, se congelará el tejido y se homogeneizará en el
mortero con nitrógeno líquido (N2(l)). Una vez obtenido un polvo congelado homogéneo, se
transferirá 0,1 g a un tubo Eppendorf de 1.5 mL esterilizado, que ya contendrá 250 µL
del tampón de homogeneización (SV RNA Lysis Buffer; ver apartado de procedimiento
extracción RNA).
Procedimiento:
Todo el material se manipulará con guantes, para evitar su contaminación con
RNAasas. Para limitar su presencia, ha de prepararse el material para la homogeneización del
tejido: se lavan exhaustivamente los morteros a utilizar y se tratan con una disolución NaOH
1 M durante 30 min. Seguidamente, los morteros se lavan bien con H2O miliRO y se secan
con papel. Alternativamente, los morteros han de autoclavarse con suficiente antelación
utilizando el ciclo corto de esterilización. Este proceso de esterilización YA HA SIDO
REALIZADO POR LOS PROFESORES, por lo que los alumnos encontrarán el material
LISTO para su uso.
Se recolectan las plantas del tratamiento que corresponda, que se han cultivado en tiestos con
perlita. Se va a estudiar exclusivamente la expresión en la parte aérea. Tras lavar
cuidadosamente con H2O miliRO estéril y se seca el material vegetal ligeramente con toallita
de papel.
Seguidamente se introducen en el mortero limpio y se añade N2(l). PRECAUCIÓN: el N2(l)
puede causar quemaduras debido a su extrema baja temperatura. Una vez comprobado que el
material vegetal se ha congelado, se tritura con un movimiento de cizalla circular. NUNCA
GOLPEÍS EL MORTERO CON SU MANO, pues es extremadamente frágil a las bajas
temperaturas empleadas.
Muestra vegetal a preparar del tratamiento asignado
Extracción de RNA
0.1 g
Se añaden directamente a los tubos con el tampón ya preparados (ver apartado de extracción de RNA)
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Extracción de RNA
Para extraer el RNA del material vegetal a analizar, se va a emplear un kit comercial, SV Total
RNA Isolation System de Promega (EE.UU.), que permite la obtención de suficiente RNA de
calidad para reacciones de RT-PCR. Se procede de la siguiente manera:
1.
Se transfiere 250 µL del tampón de homogeneización (SV RNA Lysis Buffer) a un tubo
Eppendorf de 1.5 mL estéril.
2.
Escoger 4 o 5 hojas de tomate. Se congelan con N2(l) y se pulverizan con un mortero
estéril.
3.
Se transfiere 100 mg del polvo congelado al tubo Eppendorf que contiene el tampón de
homogeneización. Se emplea una espátula que previamente se ha enfriado en N2(l), para
evitar la descongelación del material vegetal.
4.
Mezclar muy bien por repetidas inversiones. Añadir 450 µL de la disolución de dilución
(SV RNA Dilution Buffer, de color azul), y mezclar por inversión 3-4 veces.
5.
Incubar la suspensión a 70ºC durante 3 min. Evitar tiempos prolongados de incubación,
pues se puede degradar el RNA
6.
Extraer el montaje de purificación de RNA del kit de su embalaje y situarlo en una
gradilla adecuada. Marcar con el nombre de la muestra tanto el tubo recolector como el
contenedor de la matriz de purificación (de color blanco; y aprx. 1 mm de espesor).
7.
Centrifugar durante 10 min a 12.000-14.000 x g en una centrífuga refrigerada a 4ºC.
Una vez centrifugado se transfiere el sobrenadante a un tubo Eppendorf limpio y estéril
con la pipeta. NO REMOVER EL PRECIPITADO, hay que pipetear suavemente.
8.
Añadir 300 µL de etanol 95%, mezclar por pipeteado y transferir rápidamente al
montaje de purificación del kit, cuidando de mantenerlo vertical y asegurándose de que
se moje bien la matriz blanca homogéneamente.
9.
Centrifugar durante 1 min a 12.000-14-000 x g. Vaciar el tubo de recolección
10.
Añadir 50 µL de la disolución de DNAasa, que hidrolizará el DNA que se haya podido
extrear y evitará posibles contaminaciones de DNA (Stock preparado por los profesores:
12 µL DNAase, 240 µL disolución amarilla, 30 µL MnCl2, 30 µL H2O).
11.
Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Parar la reacción añadiendo 200 µL de
la disolución de parada (SV DNAase Stop Solution con etanol). Centrifugar el montaje
de purificación a 12.000-14.000 x g durante 1 min.
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Añadir 600 µL de disolución de lavado (SV RNA Wash Solution, con etanol).
Centrifugar a 12.000-14.000 x g durante 1 minuto.
13.
Vaciar el tubo de recolección en el contenedor de residuos orgánicos. Añadir 250 µL de
disolución de lavado (SV RNA Wash Solution) y centrifugar a alta velocidad (14.000 x
g) durante 2 min.
14.
Descartar el tubo de recolección usado y quitar la tapadera del tubo con la matriz blanca.
Insertar éste en un tubo limpio de elución (que tiene tapadera y viene sólo en su
embalaje). Añadir 100 µL de H2O libre de nucleasas (Nuclease-free Water), presente en
un Eppendorf en el kit. Centrifugar a 12.000-14.000 x g durante 1 min. Descartar el tubo
de purificación y guardar la muestra de RNA a -20ºC hasta su utilización.
Separación electroforética de RNA y tinción con bromuro de etidio
Para analizar con mayor precisión los resultados que se obtendrán en la RT-PCR, es preciso
visualizar la cantidad de RNA extraído y determinar su calidad. Esto es, si está o no
degradado. Esto se realizará mediante su separación electroforética en gel de agarosa
desnaturalizante y posterior tinción con bromuro de etidio, con objeto de visualizar
adecuadamente las bandas mayoritarias de RNA ribosómico (25S y 18S).
Procedimiento
Preparación del gel de agarosa desnaturalizante: Se añade 1.8 g de agarosa a 140
mL de agua desionizada y 20 mL tampón RNA 10X en un matraz Erlenmeyer de 250 mL.
Una vez disuelta la agarosa en el horno de microondas (MUCHO CUIDADO CON LA
SOBRETEMPERATURA DEL PREPARADO), se deja enfriar hasta 60ºC para añadir 20
mL de formaldehído. Se mezcla por rotación, evitando la formación de burbujas, y se
dispensa en la cubeta de electroforesis correspondiente en la que se ha ajustado el peine.
Esperar hasta que gelifique, momento en que se sumergirá en el tampón de electroforesis
(Dilución 1/10 del tampón de RNA 10x).
Preparación de las muestras: Se prepara en fresco el tampón desnaturalizante para las
muestras (1 mL formamida desionizada, 0.38 mL formaldehído y 0.20 mL tampón RNA 10x).
Se tomará 5 µL de la muestra de RNA a analizar al que se añade 10 µL del tampón
desnaturalizante. Se desnaturaliza a 55ºC en una placa calefactora durante 15 min, e
inmediatamente se introduce en un baño de hielo. Finalmente, hay que añadir 2 µL de la
disolución de carga de RNA, se mezcla bien y se carga el gel.
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Separación electroforética y tinción con bromuro de etidio: Una vez cargadas las
muestras, cuidando de no perforar el fondo del pocillo, se separan las muestras a 70 V, hasta
que se vea bien separados los colorantes azules incluidos. Posteriormente, se introduce con
sumo cuidado el gel en una bandeja en la que se dispensa un volumen suficiente de una
disolución de bromuro de etidio, que se prepara en fresco (Diluir en 100 mL de agua MiliRO
20 µL de disolución madre de BrEt). Se escurre bien, y se procede a visualizar el gel en un
transiluminador UV.
Reactivos para la electroforesis de RNA
Tampón electroforesis RNA 10X, pH 7.0
Volumen de 1 L
42.26 g
 MOPS 200 mM
4.1 g
 Acetato sódico 50 mM
20 mL
 Disolución EDTA 0.5 M pH 7.0
Este tampón hay que esterilizarlo por filtración, dado que MOPS es termolabil
Disolución EDT 0.5 M pH7.0
Volumen 250 mL: 46.53 g
Tampón electroforesis RNA de trabajo
Dilución 1/10 del anterior
Disolución de carga de RNA, preparada en H2O miliRO estéril. Volumen 50 mL
125 mg
 Bromofenol azul 0.25%
125 mg
 Xilencianol 0.25%
15 mL
 Glicerol 30%
Disolución madre de BrEt 10 mg/mL
Volumen 100 mL: 1 g
Formamida desionizada (Dowex50)
Formaldehído
Agarosa
Amplificación de cDNA mediante RT-PCR acoplada
Para facilitar la práctica se va a emplear un kit preparado para conseguir en una sola reacción
tanto la síntesis de cDNA como, posteriormente, la amplificación para poder ser analizado en
un gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio (BrEt).
Para poner la cantidad adecuada de RNA para la reacción de RT-PCR hay que diluir una
alícuota 1/5. Esto es: como molde de RNA se prepará una muestra con 10 µL del RNA
extraído al que se añade 40 µL de H2O pura libre de RNAasas.
Se empleará el kit Access RT-PCR System de Promega (EE.UU.). En primer lugar se
realiza la reacción de transcripción inversa, catalizada por la enzima AMV-RT (Reverse
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Transcriptase de Avian Myeblastosis Virus); seguida de la amplificación de la cadena sencilla
de cDNA mediante una enzima DNA polimerasa termoestable (Tfl, DNA polymerase de
Thermus flavus. Para utilizarlo se dispone de un tubo Eppendor de 0,2 mL, especial para PCR,
al que se añaden 35 µL de una Mezcla Maestra (MM) de reacción, que contiene un tampón de
reacción adecuado, los nucleótidos (dNTPs), la AMV-RT, Tfl-DNA polimerasa, MgCl2 y
agua libre de RNasas. La MM será preparada por los profesores, y se entregará una alícuota
por cada dos grupos. Además los alumnos tienen que incluir los volúmenes correspondientes
de molde de RNA, cebador positivo (Forward) y cebador negativo (Reverse). Para adicionar
correctamente los distintos componentes de la mezcla seguir las indicaciones de la tabla que
se
adjunta
más
abajo.
CORRESPONDIENTES
ES
MUY
empleando
IMPORTANTE
pipetas
automáticas
AÑADIR
y
puntas
los
de
volúmenes
PIPETA
ESTÉRILES.
Componentes de la Mezcla Maestra para la reacción de RT-PCR
Para una reacción
Para 24 reacciones
Buffer 5x (AMV-RT/Tfl polimerasa)
dNTP Mix 10 mM (cada uno)
10
1
300
30
MgSO4 25 mM
2
60
AMV-RT
1
30
Tfl DNA polimerasa
1
30
H2O libre de RNAsas
20
600
297.5
1050
TOTAL
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Combinación de componentes del medio de reacción de RT-PCR
+NaCl P5CS
Control P5CS
+ NaCl APX
Control APX
Componente
Cebador +
LeAPXF
CEBADOR (10 µM)
Muestra de RNA (1/5)
LeAPXR
Control
LeP5CSF LeP5CSR
5 µL
Cebador -
5 µL
Molde de RNA
Cebador +
+ NaCl
5 µL
5 µL
Cebador -
5 µL
Molde de RNA
5 µL
Cebador +
5 µL
Cebador -
5 µL
Molde de RNA
5 µL
Cebador +
5 µL
Cebador -
5 µL
Molde de RNA
5 µL
Mezcla Maestra
35 µL
35 µL
35 µL
35 µL
35 µL
35 µL
TOTAL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
50 µL
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Programa del termociclador
Temperatura (ºC)
Tiempo
42
30 min
94
5 min
Desnaturalización
94
1 min
Anillamiento
59
1 min
Extensión
68
1 min
 Extensión final
68
5 min
 Final reacción
4
Hasta el siguiente día
Transcripción reversa
PCR
 Desnaturalización
 30 ciclos a baja temperatura
Para cada muestra de RNA se estudiará la expresión de una APX (LeAPX, presumiblemente
citosólica) y de 1-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (LeP5CS2), el cual se sobreexpresa como
respuesta de las plantas a exceso de sal, para lo que se han diseñado cebadores específicos.
Como puede observarse en la tabla adjunta, cada par de cebadores tienen un rango de
temperatura de anillamiento recomendada, calculada utilizando el programa Oligos,
desarrollado por el Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finlandia
(http://www.biocenter.helsinki.fi). Para asegurar la amplificación de todos los fragmentos se
puede programar el termociclador para iniciar el anillamiento de la PCR a una temperatura
inicial menor, para subirla en una segunda tanda de ciclos.
Cebadores específicos utilizados
GEN
Cebador positivo
Cebador negativo
Tª ani.
LeAPX
(410 pb)*
CTTGCCGGATGCCACCAAGGG GTCACCACACCCAGCTCTTCC
57,0-60,7
LeAPX01F
LeAPX02R
LeP5CS2
(536 pb)*
CCTGCAATGCGATGGAAACAC GCATAATCACCCTTGCTGAGT
56,5-61,5
LeP5CS01F
LeP5CS02R
*Tamaño estimado de los diversos amplicones de cDNA, en base a la secuencia conocida en la base de datos
GENEBANK.
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Fig. 2. Esquema de amplificación de fragmento de cDNA empleando PCR.
Análisis de la RT-PCR: separación de los fragmentos en gel de agarosa
Los nucleótidos se separarán mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de agarosa en
tampón TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0). Las bandas correspondientes
al cDNA amplificado se visualizarán en un transiluminador con luz ultravioleta teñidos con
bromuro de etidio (BrEt, Fig. 3). Idealmente, la señal de la amplificación específica se ha de
normalizar con la obtenida de la tinción con BrEt del RNA tras la electroforesis
desnaturalizante de formaldehído/formamida.
Fig. 3. Estructura del bromuro de etidio. Se forma un aducto con las cadenas de ácidos nucleícos, que
fluoresce cuando se ilumina con luz ultravioleta. Dada la alta energía de esta luz y su posible carácter
ionizante, hay que trabajar con extremo cuidado, protegiéndonos de su exposición.
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Reactivos para la electroforesis de DNA
Tampón TAE. Madre 50x
Volumen de 1 L
Tris base
242 g
Ácido acético glacial
57.1 mL
Disolución 0.5 M EDTA pH 8.0
100 mL
Tampón TAE de trabajo
Dilución 1/50 del anterior
Disolución de carga de muestras, preparada en H2O miliRO
Bromofenol azul
0.25%
Xilencianol
0.25%
Glicerol
30%
Disolución madre de BrEt
10 mg/mL
Escalera de DNA de 100 pb, preparada directamente para cargar
Preparación del gel de agarosa 2%
En un matraz cónico de 100 mL se pesa 1 g de agarosa y se añaden 50 mL del tampón TAE.
Se pone a calentar en un horno microondas hasta conseguir la disolución de todo el agarosa,
agitando suavemente hasta que desaparezcan los grumos. PRECAUCIÓN: el agarosa fundido
puede estar a muy alta temperatura. Se ruega trabar con extremo cuidado para evitar
quemaduras.
Cuando el agarosa no queme al tacto (el calor soportable normal es aproximadamente de
60ºC), se añaden 4 µL de la disolución madre de BrEt. Temperaturas superiores pueden hacer
que se degrade, y posteriormente no veríamos nada. PRECAUCIÓN: el bromuro de etidio es
altamente carcinogénico. HAY QUE MANIPULARLO CON MUCHO CUIDADO, siempre
usando guantes, y desprendiéndose de los residuos (puntas de pipeta, cintas, guantes, etc.) en
el contenedor destinado a ello. NO TIRAR NADA CONTAMINADO A LA BASURA
NORMAL.
Una vez que el gel se ha solidificado se pone en la cubeta de electroforesis, se cubre
suficientemente con TAE y se cargan las muestras. Para ello, se usan 15 µL del medio de
reacción de PCR a los que se ha añadido 2 µL de disolución de carga. CON CUIDADO DE
NO PERFORAR EL POCILLO DE AGAROSA, se transfieren 15 µL a cada pocillo.
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Finalizado el proceso de carga, se conectan los cables a la fuente de electroforesis. Se
enciende el equipo, se ponen a correr a 70 V y se espera aproximadamente 30 min para que se
separen los colorantes añadidos a la muestra.
Por último, se visualiza el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y, si ha habido reacción
de RT-PCR se toma una foto con la cámara digital. El resultado será, esperemos, similar a lo
mostrado en la Fig. 4.
Fig. 4. Visualización de gel de agarosa con cDNA amplificado, empleando BrEt. Se muestran
varias muestras de guisante, y alguno de los amplicones esperados. 1) CuZnSOD citosólica, 2)
CuZnSOD plastidial, 3) APX citosólica y 4) control de carga y amplificación derivado del 18S
rRNA (315 pb) empleando los cebadores de Ambion.
DETERMINACIÓN
SALINIDAD
DE
PARAMETROS
DE
ESTRÉS OXIDATIVO
Y
Identificación de actividad enzimática de APX mediante gel
nativo de poliacrilamida
Fundamento
En la práctica se pone de manifiesto los cambios en la actividad de APX en hoja de tomate
entre plantas control y las tratadas con NaCl 200 mM. Se pretende, asimismo, comparar
dichos cambios de actividad con las variaciones en la expresión de los genes que codifican
APX, que se ha estudiado previamente. Para dicho análisis emplearemos un ensayo de
actividad in gel, separando las proteínas mediante una electroforesis de poliacrilamida no
desnaturalizante.
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Reactivos
Tampón de extracción (TE): con
este tampón haremos la extracción del material congelado a -
80ºC. Está compuesto por:
MOPS 30 mM, (Pm: 209,3; 3,1395g)*
Ácido ascórbico 10mM, (Pm: 176,13; 0,8806g)
EDTA-Na 5mM, (Pm: 372,24; 0,9306 g)
PVP soluble 0,6% (p/v), (3g)**
DTT 10mM, (Pm: 154,2; 0,771g)
*Los pesos en paréntesis son para preparar 500 mL de tampón de extracción.
**El PVP es muy insoluble, tarda bastante en disolverse y es mejor echarlo al final del todo.
Los pesos indicados son los necesarios para el volumen final de 500 mL, este volumen es suficiente para realizar
unas 250 extracciones, ya que cada gramo de material precisa unos dos ml de tampón de extracción.
Una vez que se haya disuelto todo, se ajusta el pH a 7.3 y se conserva en alícuotas de 15 mL a
-20ºC hasta su utilización. Hay que evitar en lo posible la reutilización de tampón
descongelado, dada la labilidad de varios de sus componentes.
Mezcla extractora (ME ):
Se prepara en fresco justo cuando vayamos a hacer las
extracciones, en un tubo muy limpio de ensayo de 15 mL. Mientras no se use, mantenerlo en
baño de hielo. Con estas cantidades tenemos suficiente para preparar 12 extractos
enzimáticos en total (dos por grupo), utilizando 0.5 g de tejido:
14 mL de TE
10 µL de PMSF 200 mM (preparado en isopropanol)
1 mL de cocktail inhibidor de proteasas (Sigma, cat. P2714; preparado en 10 mL de H2O miliRO)
La función del PMSF y del cóctel de inhibidores es evitar la degradación por proteasas de las
proteínas extraídas, una vez que las muestras empiezan a descongelarse. Esto es fundamental,
pues proteínas degradadas pueden alterar el patrón de bandas a observar.
Gel de poliacrilamida:
Hay que emplear todo el tiempo necesario en limpiar perfectamente
los cristales, peines etc., realizando un lavado con agua jabonosa y esponja suave (EVITAR
RAYAR LOS CRISTALES). Se aclara bien todo el material con agua del grifo, a
continuación con agua miliRO, y por ultimo se rociará con etanol al 70%, secándolo
perfectamente todo. Una vez comprobada su estanqueidad del montaje, se preparará la
disolución de acrilamida.
En el momento de la carga del gel hay que poner especial atención para que no nos quede
ninguna burbuja y dejamos que se polimerice con los peines puestos. La polimerización del
15
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sobrante de gel que nos quede en el Falcón nos indicará cuando nuestro gel esta listo y se
puede guardar en la nevera con total seguridad.
Se preparará un gel nativo de acrilamida al 10%, capaz de resolver adecuadamente las
proteínas que vamos a estudiar. Antes de preparar la disolución del gel, el sándwich del
mismo ha de estar bien ensamblado y seco. Dado que la acrilamida es extremadamente
tóxica, se ruega se extremen las medidas de seguridad durante su manipulación. Los
volúmenes indicados nos dan un volumen final de 20 ml, suficiente para dos geles. Se prepara
en un Falcón de 50ml. Se añaden los reactivos en este orden:
Disolución
Volumen
Tampón Tris-HCl 0,3 M pH 8,8
6 mL
Acrilamida/bis-acrilamida 30/1
6,6 mL
H2O mili RO
7,2 mL
Mezclar bien
Polimerización:
TEMED
8 µL
Amonio persulfato (APS) 10% (p/v) FRESCO
200 µL
Una vez añadido los componentes mayoritarios, el TEMED y el APS se emplear para
polimerizar la acrilamida. Por tanto, a partir de entonces, deberemos trabajar con presteza y
diligencia a la hora de cargar el gel para evitar que polimerice antes de montar el gel. Para
asegurar una adecuada polimerización, el APS hay que prepararlo fresco en el día.
Tampón de electroforesis (Running Buffer, RB):
Está compuesto por Tris, glicina y ácido
ascórbico. Se prepara un litro diez veces concentrado, sin el ácido ascórbico, se tapa con papel
de plata y se guarda a 4º C. Cuando preparemos un gel prepararemos el 1x y justo antes de
correr el gel añadiremos el ácido ascórbico.
Disolución madre 10x
Cantidad para 1 L
Tris 25 mM, (Pm: 121,1)
30,28 g
Glicina 190 mM (Pm: 75,07;)
142,26 g
Ajustar pH a 8.3 con HCl, y enrasar a 1 L
Disolución de trabajo 1x
Disolución RB 10x
100 mL
Ácido Ascórbico 2 mM, (Pm: 176,13)
0,3522 g
Enrasar a 1 L
16
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Pre-correr el gel durante 30 min para asegurar la entrada de ascorbato en el gel de
electroforesis. Se emplea para estabilizar las APX y evitar la pérdida de su actividad.
Tampón de carga (TC):
Este tampón permite que las muestras adquieran mayor densidad y se
depositen en el fondo de los pocillos del gel. Además, para aquellas muestras incoloras, el
azul de bromofenol nos permite visualizar que la carga se ha realizado correctamente. Por otro
lado, este colorante migra junto al frente de electroforesis permitiendo discriminar cuando se
han separado suficientemente las proteínas en el gel. Para un volumen final de 10 mL
añadimos:
Disolución
Cantidad
Tampón Tris-HCl 0,3 M pH 8,8
2,5 mL
Glicerol al 80%
4 mL
Azul de bromofenol 1%
1.5 mL
H2O miliRO
Hasta 10 mL
Procedimiento: separación de proteínas en PAGE nativo
Extracción:
Se parte del material vegetal fresco, pesando 0,5 g de hoja. En un mortero frío
(mantenido en un baño de hielo) se coloca el material diseccionado, se añade 1 mL de ME y
se homogeneiza hasta obtener una pasta homogénea. Ayudándose de la mano del mortero, se
transfiere a un tubo Eppendorf de 1.5 mL y se mantienen en un baño de hielo hasta que se
centrifuguen todos los tubos de los distintos grupos juntos a 14.000 x g durante 15 min a 4º C.
Separación por electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida:
Se saca el gel de la nevera y se monta en la cubeta de electroforesis, cuidando que se conecten
correctamente los cables al ánodo y al cátodo. Se añade el RB 1x con el ascorbato
suplementado en fresco. Se hace un prerrecorrido a 15 mA durante 30 min para permitir la
entrada del ascorbato en el gel.
Siempre trabajando en un baño de hielo, se preparan las muestras para cargar mientras se
completa la pre-electroforesis. En un Eppendorf de se añaden 75 μl de TC y 125 µl de
extracto enzimático. La mezcla se agita ligeramente para mezclar bien todos los componentes.
17
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Pasada media hora, se lavan bien los pocillos del gel con una jeringuilla, utilizando el RB.
En cada pocillo se cargan 20 μl de muestra preparada anteriormente, cargando un pocillo por
extracto enzimático. Una vez cargadas todas las muestras en cada cubeta, se corren los geles a
30 mA. Cuando las muestras hayan entrado en el gel, y los montajes de electroforesis se
pueden manipular con seguridad, las cubetas se introducen en un baño de hielo, para
refrigerar el tampón durante la separación de las proteínas. Después de 1,5-2,0 horas de
espera, y cuando el azul de bromofenol nos indique que el frente de electroforesis ha llegado
al final del gel, se desenchufará el montaje de electroforesis, apagando la fuente de
alimentación. Seguidamente, se extraen los geles del montaje, separando los cristales y
separadores. Se parten los geles para que los respectivos grupos puedan analizar sus
resultados, efectuando la tinción de APX.
Fig. 5. Esquema del revelado de actividad de APX “in gel”. Es preciso el equilibrado del tampón de reacción
enzimática que permita la reducción de ascorbato en presencia de H 2O2. El ascorbato no eliminado por la
reacción de APX, reacciona con ANT, reduciéndolo en presencia de TEMED.
Revelado de APX
Fundamento:
El ANT es reducido por el ascorbato, actuando el TEMED como catalizador
esta reacción. Se produce azul de formazano, que es insoluble, tiñendo aquellas áreas donde
hay exceso de ascorbato de un color azul muy intenso. En el lugar donde esté la APX se podrá
18
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ver una banda acromática debido a que en ese lugar la APX ha consumido el ascorbato para
reducir el peroxido de hidrógeno durante la fase de incubación
Reactivos:
Tampón fosfato madre 100 mM pH 7.0. Preparar 1 L a partir de dos disoluciones madre de
Na2PO4 1M (57,7 mL) y NaH2PO4 1M (42,3 mL).
Tampón fosfato madre 100 mM pH 7.8. Preparar 1 L a partir de dos disoluciones madre de
Na2PO4 1M (89,6 mL) y NaH2PO4 1M (10,4 mL).
Disolución madre de ascorbato 20 mM (0,176 g en 50 mL). Preparar siempre fresco en
un tubo Falcon de 50 mL, para cada grupo de alumnos
Buffer de equilibrado (BE): se utiliza para equilibrar el gel una vez que ha acabado de
correr. Preparar 50 mL para cada grupo de alumnos, pesando siempre en fresco Está
compuesto por:

Fosfato sódico 50 mM pH 7.0; añadir 25 mL de la madre de 100 mM

Ácido ascórbico 2 mM; añadir 5 mL de la disolución madre 20 mM

H2O miliRO hasta 50 mL (esto es, 20 mL).
Buffer de incubación (BI): se utiliza para que embeber bien el gel y que la APX comience
a reducir el H2O2, utilizando ascorbato como donador de electrones. Se Preparar 50 mL
para cada grupo de alumnos en fresco y en un tubo Falcon. Está compuesto por:

Fosfato sódico 50mM pH 7.0; añadir 25 mL de la madre de 100 mM

Ascorbato 4mM; añadir 10 mL de la disolución madre 20 mM

H2O miliRO hasta 50 mL (esto es, 15 mL).

H2O2 2 mM (11,5 μl). Se añade justo antes de echar al gel.
Buffer revelador de APX (BRAPX): es el buffer que se utiliza para poder ver las bandas de
APX. Como en el caso anterior, se preparan 50 mL para cada DOS grupos y está
compuesto por:

Fosfato sódico 50mM pH 7,8; añadir 25 mL de la madre de 100 mM.

NBT 0,5 mM (pipetear 20 mL de la disolución 1.25 mM).

H2O miliRO hasta 50 mL (esto es, 5 mL).
19
Módulo de Estrés Oxidativo y Salinidad

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TEMED 28 mM (212 μl). Se añade justo antes de echar al gel.
Procedimiento: Primero se equilibran los geles con 20 mL del BE durante unos 30
minutos. en una placa Petri. El gel de APX se incuba después del equilibrado con el BI
durante 20 minutos. Después de estos 20 minutos se lava el gel durante 1 minuto con el BE.
Después del lavado se le añade el BRAPX. Pasados unos cinco minutos deben empezar a
verse bandas acromáticas en el lugar donde estén las APXs, el resto del gel se ve de un color
azul muy oscuro. Durante todos estos procesos los geles deben agitarse ligeramente. Se deja
que la reacción continúe durante otros cinco minutos, más o menos, se lava con agua
desionizada y se fotografía
Peroxidación de lípidos: colorimetría de malondialdehido
Fundamento
El desajuste del estado redox celular da lugar a la aparición de especies reactivas de oxígeno,
como H2O2, O2·- y diversos radicales orgánicos, que provocan daños irreversibles en
substancias vitales para el funcionamiento celular como son proteínas y ácidos nucleícos.
La peroxidación de lípidos es un proceso complejo que implica la formación y
propagación de radicales lipídicos, la toma de oxígeno, un reordenamiento de los dobles
enlaces en los lípidos insaturados. Entre los lípidos afectados se pueden encontrar lípidos
complejos presentes en membranas biológicas, lo que puede provocar pérdida de su
funcionalidad. Como consecuencia de la oxidación de dichos lípidos, se acumula
malondialdehído (MDA) y otros productos de escisión, como endoperóxidos, alcoholes,
cetonas, aldehídos y éteres.
MDA, formado de la ruptura de ácidos grasos insaturados, sirve cano un índice adecuado
para determinar el daño oxidativo causado en las células. Para su determinación se hace
reaccionar el material vegetal con ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), definiéndose el índice del
material reactivo con TBA (TBA-rm). Se genera un cromóforo de color rojo que tienen un
máximo de absorbancia a 535nm. La presencia de cofatores hemo y metales de transición
pueden alterar el grado de reactividad al TBA, dado que la incubación que se precisa a alta
temperatura puede generar diversos peróxidos orgánicos. Para limitar este artefacto se incluye
en el reactivo de TBA un reductor, como el butil-hidroxítolueno (BHT), que se añade justo
antes de utilizar el reactivo de TBA. Asimismo, compuestos como el acetaldehído y la
sacarosa también reaccionan con el TBA dando especies químicas que absorben a 535 nm. Si
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estos compuestos se encuentran en presentes en concentraciones del rango mmolar, pueden
interferir en la detección del MDA.
Por tanto, aunque se pueden producir artefactos durante el análisis del MDA, el empleo del
reactivo de TBA sigue siendo una herramienta útil para determinar el grado de peroxidación
lipídica, dada su alta sensibilidad y sencillez en procedimiento.
Material y Equipo
Tubos Eppendorf de 2.0 mL de rosca
Espectrofotómetro
Pipetas automáticas (P200 y P1000)
Cubetas desechables
Termoblock
Balanza de precisión
Centrífuga para tubos Eppendorf
Reactivo de tiobarbitúrico TCA-TBA-HCl
El reactivo, cuya composición es tricloroacético (TCA) 15%, tiobarbitúrico (TBA) 0,37% y
HCl 0,25M, se prepara como se indica: se disuelven 15g de TCA, 0,37g de TBA, 2,4mL de
HCI concentrado y 0,01g de BHT en aproximadamente 70 mL H2O miliRO, un vaso de
precipitado de 100 mL y con ayuda de un agitador magnético. Una vez conseguida la total
disolución, se enrasa a 100 mL.
Procedimiento
Incubación: Se pesa 0,1 g de hoja y se introducen en un mortero. Se añade 1 mL del
reactivo TCA-TBA-HCI con pipeta automática (200-1000 µL), y se homogeneiza bien. La
pasta se transfiere a un tubo Eppendorf de 2.0 mL con rosca. En paralelo, hay que preparar un
tubo de blanco, en el que no se añade material vegetal, pero al que se añade el reactivo de
tiobarbitúrico. Seguidamente, los tubos se incuban durante 30 minutos a 90°C. Pasado este
período, los tubos se introducen en hielo para enfriarlos y luego se centrifugan a 12.000 x g
durante 15 minutos. Finalmente, se transfieren con la pipeta automática 750 µL del
sobrenadante a un tubo Eppendorf limpio de 1.5 mL evitando disturbar el precipitado.
Medición del MDA en el espectrofotómetro UV-visible: Se va a realiza la medida a
dos longitudes de onda ():1=535nm y 2=600nm. Por tanto, se hará primero el ajuste del
blanco a , y se mide la absorbancia de todas las muestras. Posteriormente, se cambia el
aparato para mediar la absorbancia a 2, ajustando en primer lugar el autocero con el blanco.
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Cálculos
Se calcula la concentración del TBA-rm a partir de la absorbancia utilizando el coeficiente de
extinción ( = 1,56 105 M-lcm-1), para lo que se emplea la ley de Lambert-Beer. Se mide a dos
longitudes de onda para corregir la turbidez no específica del sobrenadante de las muestras,
debido al material que puede suspenderse por la incubación a 90ºC.
El nivel de TBA-rm se expresa como nmoles MDA·g-1PF, para lo cual se realizan los
siguientes cálculos:
nmol MDA A 535  A 600  x mmol 106 nmol
1 ml

x
x
5
gPF
1 mmol
0.1 gPF
1.56 x 10 ml
Bibliografía
Buege JA, Aust SD. 1978. Microsomal Lipid Peroxidation. Meth. Enzymol.. 52:302-310
Lozano-Rodríguez E, Hemández LE, et al. 1997. Distribution of cadmium in shoot and root
tissues of maize and pea plants: physiological disturbances. J. Exp. Bot. 48:123-128
Análisis de clorofilas
Fundamento
Se puede extraer fácilmente las clorofilas de hojas de plantas con diversos disolventes
orgánicos, y mediante un espectro de aborbancia determinar la concentración de dichos
pigmentos. La clorofila a (Cla) y clorofila b (Clb) tienen un pico de máxima absorbancia en el
rango del rojo, cuyas longitudes de onda son 663 y 645 nm, respectivamente, cuando se
realiza su extracción con una disolución de acetona al 80% (Arnon, 1949). Los cambios
observados en el contenido de estos pigmentos están muy relacionados con efectos
generalmente deletéreos causados por diversos estreses ambientales.
Reactivos
Acetona 80% (v/v)
Procedimiento
Se recoge una hoja grande (expandida) y se pesan exactamente 50 mg de tejido. Se transfiere
el material a un mortero, se añaden 10 mL de acetona 80% y homogeneiza bien. El extracto se
filtra a través de un filtro de pliegues de papel para eliminar materiales en suspensión, y se
mide su absorbancia a dos longitudes de onda: 1 = 663 nm y 2 = 645 nm.
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Cálculos
La ecuación experimental desarrollada por Arnon para extractos con acetona al 80% es:
 µg 
10 mL acetona
  12 ,7  A663   2 ,60  A645 
Cla  Clorofila a 
0 ,05 g MF
 gMF 
 µg 
10 mL acetona
  22 ,9  A645   4 ,68  A663  
Clb  Clorofila b 
0 ,05 g MF
 gMF 
Clorofilas totales  Cla  Clb
Bibliografía
Arnon DI. 1949. Copper enzymes in isolated chloroplasts - polyphenoloxidase in Beta vulgaris.
Plant Physiology 24:1-15
Determinación del contenido de L-prolina
Fundamento
La L-prolina se acumula en muchas plantas como respuesta a diversos estreses, siendo los
más ampliamente estudiados la escasez de agua y salinidad. Se piensa que juega un papel
relevante en el ajuste osmótico en plantas de patata y tomate, entre otras especies, aunque esta
función también se piensa que la realizan otras substancias (por ejemplo, polialcoholes del
tipo del sorbitol o el manitol). Asimismo, la acumulación de prolina podría estar asociado a la
protección de proteínas frente a su desnaturalización o, incluso, como substancia reductora de
ROS.
En estas prácticas vamos a determinar el contenido de L-prolina en las hojas de tomate
sometidas a tratamiento control y con NaCl 200 mM. Para su análisis se emplea una reacción
colorimétrica, en la que la prolina extraída se hace reaccionar en un medio ácido con
ninhindrina. Tras su incubación a 95ºC, determinaremos la absorbancia a 520 nm, una vez que
se realiza una extracción final con tolueno. La cuantificación de la cantidad de L-prolina en el
tejido fresco (µmol/g PF) se realiza interpolando en una recta de calibrado, en la que se hace
reaccionar cantidades conocidas de L-prolina en las mismas condiciones que las muestras
problema.
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Material y Equipo
Tubos Eppendorf de 2.0 mL de rosca
Pipetas automáticas (P200 y P1000)
Termoblock
Centrífuga para tubos Eppendorf
Tolueno
Espectrofotómetro
Cubetas de vidrio resistentes a tolueno
Balanza de precisión
Tijeras
Reactivo de ninhidrina
Se prepara disolviendo 2,5 g de ninhidrina en 100 mL de una mezcla formada por ácido
acético glacial:H2O desionizada:ácido ortofosfórico (6:3:1, v/v/v).
Disolución extractora de prolina
La extracción se realiza en un medio ácido desnaturalizante de proteínas. Se emplea una
dilución ½ de una disolución madre de ácido sulfosalicílico 6% (conc. final 3%).
Procedimiento
Muestra problema: Se homogeneizan 0,1 g de hoja madura (expandida) en 1 mL de la
disolución extractora con ayuda de un mortero. El extracto se transfiere a un tubo Eppendorf
de 1,5 mL y se centrifuga a 12.000 x g durante 15 min a 4ºC. Del sobrenadante se transfieren
0,5 mL a un tubo Eppendorf de 2.0 mL con rosca, al que posteriormente se añade 0,5 mL del
reactivo de ninhidrina. Se mezcla bien por agitación vigorosa y se pone a incubar a 90ºC,
JUNTO CON LOS TUBOS DE LA RECTA PATRÓN (ver más abajo). Tras 30 min, se
pasan a un baño de hielo para que se enfríen. Seguidamente, se añade 1 mL de tolueno, se
agita de nuevo vigorosamente y se separan las fases acuosa y orgánica mediante
centrifugación a 12,000 x g por 5 min. Unos 800 µL de la fase orgánica superior se transfieren
a un tubo Eppendorf de 1.5 mL limpio, y se procede a la medida de la absorbancia a 520 nm.
Recta patrón: La concentración de prolina en los extractos anteriores se determina mediante
interpolación en una recta de calibrado elaborada con disoluciones de concentraciones
conocidas, a partir de una disolución madre de prolina 25 mM. Para que sea más precisa, se
procederá de igual manera que con las muestras problema: las disoluciones patrón se
disuelven asimismo en ácido salicílico, y se procesan exactamente Y AL MISMO TIEMPO
que las muestras problema. La recta de calibrado se elabora siguiendo los volúmenes
indicados en la siguiente tabla:
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Volúmenes para elaboración de la recta de calibrado (µL)
Concentración recta (mM)
0.00
0.05
0.10
0.20
0.50
1.00
2.00
0
4
8
16
40
80
160
dH2O
500
494
492
484
460
420
340
Disolución sulfosalicílico 6%
500
500
500
500
500
500
500
Disolución prolina 12,5 mM
Como se hace con las muestras problema, se utilizan 0,5 mL que se hacen reaccionar con 0,5
mL del reactivo de ninhidrina. Para el correcto ajuste del equipo de espectrofotometría, HAY
QUE PREPARAR DOS TUBOS BLANCO (Tubos con 0 mM de prolina). Asimismo,
INSITIMOS: todos los tubos se ponen a incubar a 90ºC SIMULTÁNEAMENTE con los de
las muestras problema. Los siguientes pasos analíticos son idénticos a los descritos
anteriormente.
Cálculo de la concentración de prolina: se dispone el equipo de espectrofotometría para
medir absorbancias a 520 nm, y se ajusta el autocero con los dos tubos blancos preparados. Se
determina la absorbancia de los tubos de la recta de calibrado, que se reflejan en la gráfica
adjunta. Posteriormente se miden las muestras problema y se interpola la absorbancia
obtenida para determinar su concentración. Los datos hay que mostrarlos en unidades de µmol
prolina·g PF-1. MUY IMPORTANTE: hay que usar cubetas espectrofotométricas de VIDRIO
Absorbancia a 520 nm
resistente a tolueno.
L-prolina (mM)
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CALENDARIO DE LA PRÁCTICA
JUEVES
Electroforesis de RNA
Preparación de geles de proteínas en condiciones nativas
Reacción de RT-PCR
VIERNES MAÑANA
Extracción de proteínas y separación electroforética de proteínas nativas
Electroforesis de DNA: visualización de Resultado de RT-PCR
Medición de peroxidación de lípidos
VIERNES TARDE
Revelado de actividad de APX
Extracción de clorofilas
Determinación del contenido de L-prolina
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