Download TPN2-BMyG-2015 - Aula Virtual FCEQyN

Trabajo Práctico N°2
VISUALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Bqca. Marcela Alejandra Guastavino - Dra. María Mercedes
Tiscornia – Cátedra de Biología Molecular y Genética. Carrera
de Bioquímica-2015.
Objetivos
 Comprender el fundamento de la electroforesis en geles de
agarosa.
 Realizar una corrida electroforética de DNA en geles de
agarosa.
 Verificar la extracción del DNA aislado en el TP anterior
mediante electroforesis.
 Interpretar el fundamento de la cuantificación de ácidos
nucleicos mediante espectrofotometría.
ELECTROFORESIS DE DNA EN
GELES DE AGAROSA
PRIMERA PARTE
Microtubo de 1,5 ml con ovillo de DNA
Pasos para la extracción de Ácidos
Nucleicos.
Pesar Agarosa
Preparar el TrisBorato-EDTA a
0,5X y pH=8,2
Fundir, enfriar
(colocar el
colorante) y colocar
en la cama
Sembrar las muestras
(con el colorante) y
correr la electroforesis
con las condiciones
establecidas.
Fundamento de Electroforesis
Geles de Agarosa
Se prepara un gel de
agarosa de
concentración
apropiada al rango de
los fragmentos a ser
separados.
 Antes, no era sencillo conseguir agarosa de
alta pureza, (por que ésta se encontraba
generalmente contaminada con otros
polisacáridos, sales, proteínas, etc.) en la
actualidad se obtienen preparados muy puros
de agarosa y además se dispone
comercialmente de agarosa químicamente
modificadas que funden a baja temperatura
(agarosas “low melting”).
OH
CH2OH
HO
HO
D-Galactosa
3,6 anhidro L-Galactosa
Sembrado de las muestras
Las muestras de DNA
se cargan en las
hendiduras del gel
(“slots” o pocillos)
correspondientes y se
aplica al mismo una
diferencia de potencial
determinada por un
período de tiempo
específico.
 Luego de preparar las muestras utilizando
un buffer de carga conteniendo glicerol y un
colorante que servirá como frente de
corrida, se siembran las muestra en los
pocillos y se permite que la electroforesis
se desarrolle.
Tinción del Gel
El gel es teñido con
bromuro de etidio o
GelRed y analizado
bajo luz UV.
Bromuro de Etidio
Colorante Tóxico
 La tinción puede ser un paso posterior a la
corrida en sí o bien, como veremos más
adelante, el colorante puede agregarse
directamente al gel o a la muestra.
Syber Green Gel Green
Colorante No Tóxico
GelRed
Corrida electroforética
Tamaño del DNA
 Cuando el DNA es sometido al campo
eléctrico aplicado en la electroforesis, la
migración de los fragmentos es
inversamente proporcional a sus pesos
moleculares (la especie más pesada es la que
menos migra).
Corrida electroforética
Concentración
de la agarosa
 La migración depende del tamaño de poro
formado por la agarosa, dicho tamaño
depende de la concentración de agarosa.
Existe una relación lineal entre el logaritmo
y la movilidad electroforética del DNA y la
concentración del gel, descripta a través de
fórmulas matemáticas.
 Así a medida que aumentamos la
concentración de agarosa permitimos la
separación de fragmentos más pequeños de
DNA.
Corrida electroforética
Voltaje aplicado
 El voltaje aplicado a las terminales de un gel de
agarosa genera un campo eléctrico con una fuerza
definida por la longitud entre los electrodos y la
diferencia de potencial total aplicada (se sugiere
que la intensidad no debe exceder los 5 ó 6
V/cm).
 Las moléculas de DNA expuestas a éste campo
eléctrico migran hacia el ánodo (polo positivo)
debido a la carga negativa aportada por los
grupos fosfato del esqueleto molecular. La
velocidad de migración está limitada por la fuerza
de fricción impuesta por la matríz del gel.
Corrida electroforética
Composición de
bases y
temperatura
 Mientras que la carga y/o tamaño molecular pueden
afectar la velocidad a la cual las macromoléculas se
movilizan a través del gel, el cociente de carga a
masa (Q/M) es el mismo para moléculas de DNA
de diferente tamaño. Por ello, el tamaño del DNA es
la característica que determina la velocidad de
migración, permitiendo la separación de mezclas
complejas por electroforesis.
 Además la movilidad electroforética del DNA no se
ve afectada por variaciones de temperatura (rango 4
a 30ºC) por lo que generalmente se llevan adelante
corridas electroforéticas a temperatura ambiente.
Corrida electroforética
Presencia de

colorantes y
Composición
de la solución
tampón
(buffer) de

corrida
electroforética
El bromuro de etidio puede reducir la movilidad
electroforética del DNA lineal en aproximadamente un
15%.
La movilidad electroforética del DNA es afectada por la
composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis.
Sin iones la conductividad eléctrica es mínima y el DNA
migra, si lo hace, muy lentamente.
 Si se usa un buffer de corrida con alta fuerza iónica puede
fundir el gel y/o desnaturalizar el DNA.
 Los más utilizados son:TAE (Tris Acetato EDTA) y TBE
(Tris Borato EDTA)
Buffer de carga
Glicerol 60%;
EDTA 0,01 M; Azul
de bromofenol
0,1%.
Alternativamente
colorante GelRed
Preparación de las muestras
 La muestra debe ser mezclada con un buffer de carga
(“loading buffer”), el cual cumple con 3 funciones
A) Aumenta la densidad de la muestra.
B) Asegura que el DNA se deposite directamente en el
pocillo preparado a tal fin.
C) Otorga color a la muestra, que se utilizado como
“frente de corrida”.
Soporte Horizontal
Siembre en un gel
de agarosa
Muestra para la corrida
electroforética
Fragmentos de PCR
y ADN
Marcador de
tamaño en
pb (ladder)
Muestras
+
ELECTROFORESIS EN GELES DE
AGAROSA DE ADN GENÓMICO
Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con
Bromuro de Etidio de DNA genómico a partir de
sangre entera.
ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA DE RNA
TOTALES
28s
18s
Gel de agarosa al 2% de RNA
totales. Se observan bandas
ribosomales con un peso de
4.5 kb 28S y 1.9 kb para 18S.
Los RNAm no se
pueden fraccionar
individualmente pues son
moléculas menos pesadas y
las proporciones en las que se
encuentran son menores
producen smear 0.5 a12 Kb
Promotor 1
Exón 3 PM Exón 4
PM Exón 10 Exones 12_13
Gel de Agarosa 2 %: Amplificaciones de los cebadores para el promotor 1
(235 pb), los exones 3 (161 pb) , 4 (193 pb), 10 (192pb) y 12_13 (251pb) de
SHP-1. El exón 8 (216pb) y el 13 (173pb).
SEGUNDA PARTE:
CUANTIFICACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LA PUREZA DE ÁCIDOS
NUCLEICOS
Ley de LambertBeer
C = A 260/ E d
A es la absorbancia
E es el coeficinete de extincion molar
d es la longitud de la cubeta
C es la concentración
¿PUREZA?
A 260/ A 280
1.6 a 1.8
< 1.6 a 1.8
2
> 2.3
DNA PURO
PRESENCIA DE
PROTEÍNAS
RNA PURO
PRESENCIA DE
NUCLÉOTIDOS
Muchas gracias por su atención!!