Download Proyecto Bacteriocinas

2009
OBTENCIÓN DE NISINA A PARTIR
DE SUERO DE QUESERÍA
MEDIANTE UNA BACTERIA
LACTICA
INTEGRANTES
BARRENO MAYRA
QUILLUPANGUI CRISTINA
GEOVANNA SALAZAR
VIZCAINO KARINA
BIOTECNOLOGIA
Dra. Bravo Blanca
1
INDICE
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 3
CONTAMINACIÓN AMBIENTAL POR LACTOSUERO ......................................................... 3
PROCESOS CONVENCIONALES ................................................................................................... 3
PROCESOS NO CONVENCIONALES ............................................................................................ 3
ANTECDENTES…………………………………………………………………………....................4
IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION ....................................................................................... 4
OBJETIVOS ........................................................................................................................... 5
OBJETIVO GENERAL. .................................................................................................. 5

OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................................... 5
HIPOTESIS ............................................................................................................................. 6

HIPOTESIS NULA: ........................................................................................................ 6

HIPOTESIS ALTERNA .................................................................................................. 6
ALCANCE .............................................................................................................................. 6
MARCO TEORICO ................................................................................................................. 6
CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS .................................................. 7
PRODUCCION DE NISINA .......................................................................................... 8
MARCO METODOLOGICO .................................................................................................... 9

MUESTREO ................................................................................................................... 9
TECNICA DE AISLAMIENTO PARA LACTOCOCCUS…………………………………………………………………….9





REVIVIFICACIÓN .......................................................................................................................... 9
AISLAMIENTO .............................................................................................................................. 9
SELECCIÓN ................................................................................................................................. 9
ADAPTACIÓN ............................................................................................................................. 10
PRESERVACIÓN ........................................................................................................................ 10
FACTIBILIDAD ......................................................................................................................11
BIBLIOGRAFIA .....................................................................................................................12
CRONOGRAMA ....................................................................................................................13
2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Contaminación ambiental por lactosuero:
La industria láctea en el mundo genera 420 millones de leche en toneladas por año de las
cuales 145 mil millones de ton/año corresponden a suero lácteo.
La alta capacidad contaminante del suero de leche por su contenido en proteínas y lactosa
(materia orgánica) permite la reproducción de microorganismos produciendo cambios en el
DBO que varía entre 30,000 a 50,000 mg/l, además de la cantidad de ácido láctico presente
va alterar los procesos biológicos que se llevan a cabo en las plantas de tratamiento
aumentando los costos.
Según estudios realizados en la FAO han demostrado que en una fábrica de queso que
procesa 280.000 litros de leche cruda por día, por ejemplo, produce alrededor de 250.000
litros de suero líquido y puede contaminar tanta agua como una ciudad de 50.000
habitantes.
En el Ecuador existen 30 empresas industrializadas, se conoce que ALPINA es una de las
empresas que ha implementado un sistema de tratamiento de aguas desde el año 2005 y
las 250 empresas artesanales de las cuales se desconoce algún tratamiento de los residuos
lácteos. En nuestras industrias se produce 444.195 ton/año de lactosuero que es
descargado al drenaje y llega a ríos y suelos, causando un problema serio de contaminación
alterando sus propiedades fisicoquímicas ya que por cada 1,000 litros de lactosuero genera
aproximadamente 35 kg de demanda biológica de oxígeno (DBO) y 68 kg de demanda
química de oxígeno (DQO). En el caso de los suelos, disminuye el rendimiento de las
cosechas, pero además se observa el fenómeno de lixiviación. Este se presenta porque el
lactosuero contiene nitrógeno, convirtiéndose en un peligro para la salud de los animales y
humanos.
Para el tratamiento de suero lácteo, preferentemente se aplican tratamientos biológicos,
para ello se plantean procesos convencionales y no convencionales:
1. Los procesos convencionales depuran aguas residuales y no el suero en sí.
2. Los procesos no convencionales su objetivo es utilizar el residuo industrial para
obtener diversos productos de fermentación, utilizando levaduras y bacterias lácticas
en el lactosuero que puede ser utilizado como medio de cultivo para la producción de
biomasa, metabolitos (lípidos, alcoholes, ácidos orgánicos, etc.), y enzimas. En este
medio la lactosa es la principal fuente de carbono para los microorganismos.
3
ANTECEDENTES
Se describieron por primera vez bacteriocinas como las colicinas producidas por Escherichia
coli (Gratia, 1925), Rogers (1928) identificó una sustancia de naturaleza peptídica (nisina),
producida por Lactococcus lactis subsp. lactis que inhibía a microorganismos Gram
positivos, incluyendo patógenos y alterantes de alimentos.
Se piensa que el 99% de las bacterias pueden producir cuando menos una bacteriocina y la
unica razón de que no se hayan aislado es debido a que han sido muy poco estudiadas
(Gordon y O’Brien, 2006).
De Vuyst y Vandame (1994) citan diferentes generos de microorganismos productores de
bacteriocinas dentro de los más empledos, Lactococcus lactis subsp lactis, Pediococcus
acidilactici, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Carnobacterium divergens
Lactobacillus helveticus, en función de sus características bioquímicas y modo de acción.
La nisina es la única bacteriocina autorizada como aditivo alimentario especialmente por su
actividad frente a los clostridios, reconocida por la FDA.
En países desarrollados como Estados Unidos, México, China se está prestando especial
interés el aprovechamiento de este residuo, en el Ecuador no se conoce datos de
aprovechamiento de suero por lo cual se toma como referencia Alpina-Ecuador que realiza
tratamientos de sus líquidos residuales para minimizar la carga orgánica, indicando que un
kilo gramo de leche puede obtener 100 gramos de queso y el 90% restante corresponde a
suero, contaminando, 2000 veces más que el agua residual doméstica, haciéndola más
difícil y costosa para tratar, de esta manera se aprovecha una cantidad de 33.600 toneladas
evitando tratar más de 1.507 toneladas de DQO, generando alimentos de valor agregado
como lactosa en polvo.
IMPORTANCIA Y JUSTIFICACION
El propósito de este proyecto es aprovechar el lactosuero ya que contiene la mayor parte de
los compuestos hidrosolubles, el 95% de lactosa, el 25% de las proteínas y el 8% de la
materia grasa de la leche, siendo un alimento de enorme desperdicio de nutrimentos.
Un aprovechamiento de este desperdicio lácteo se consigue mediante la utilización de
bacterias ácido-lácticas
que son de importancia en la industria de alimentos,
siendo
utilizadas para la obtención de ácido láctico, saborizantes, espesantes y bacteriocinas,
este grupo de microorganismos son empleados en la industria de
alimentos para la
conservación y mejora tecnológica de los productos lácteos, cárnicos y vegetales
fermentados. Los conservantes artificiales presentan problemas para la salud humana, ya
4
que pueden formar toxinas butílicas, por lo que la utilización de nisina como conservante
natural es otra importante opción para su obtención.
Las bacteriocinas de las bacterias Lac, únicamente la nisina y la pediocina han encontrado
aplicaciones comerciales en la industria alimentaria. La Bacteria lactica que produce este
antibiotico es el lactococcus,
El impacto de este proyecto se enfoca en el aspecto ambiental y educativo; por la
reutilización previa de lactosuero cuyo destino final era el desfogue en drenajes y
posteriormente a ríos, alternativas de aprovechamiento y elaboración de aditivos
alimentarios que aporten con la conservación y alarguen el tiempo de vida útil de los
alimentos y promover a la investigación.
Los beneficiarios directos de este estudio serán las instituciones interesadas a brindar
servicios de remediación ambiental y/o industrias lácteas interesadas en obtener nuevos
recursos, los beneficiarios indirectos son los pobladores que mejorarían su calidad de vida y
se lograría proteger a la biodiversidad.
OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.
Obtener microorganismos lácteos (LACTOCOCCUS) a partir del lactosuero para la
producción de nisina mediante un sistema de bioproceso.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Aislar
y seleccionar microorganismos lactococcus a partir de
una muestra de
lactosuero.
2. Adaptar un proceso con un sustrato fermentable (lactosa) para el desarrollo de
lactococcus.
3. Preservar el microorganismo lactococcus mediante crioviales con glicerol al 20%.
4. Propagar el crecimiento de lacctococus para producir biomasa y el metabolito nisina
5. Comprobar el efecto bacteriocina de la nisina en alimentos contaminados con
microorganismos patógenos y alterantes del genero gram positivos.
5
HIPOTESIS

HIPOTESIS NULA:
No se obtuvo microorganismos (lactococcus ) a partir de lactosuero para la producción
nisina.

HIPOTESIS ALTERNA:
Se obtuvo microorganismos (lactococcus ) a partir de lactosuero para la producción de
nisina.
ALCANCE
Este proyecto abarca la obtención de microorganismos lactococcus a partir del aislamiento,
selección, adaptación, preservación y propagación para producir bacteriocina (nisina).
MARCO TEORICO
FUENTE
DE
ENERGIA
Reaccione
s de
OxidoReducción
a partir de
compuest
os
orgánicos.
FUENTE
DE
CARBONO
Compuesto
s
Orgánicos:
Lactosa
CATEGORIA
QUIMIORGANOTROFOS
LACTOCOCCUS
BACTERIA
6
GRUPO
ACEPTOR DE
ELECTRONES
La
lactosa
del
suero de queso
sirve
como
donador y aceptor
de electrones.
Se da un proceso
de
FERMENTACION
en
que
la
Oxidación
es
parcial
de
los
átomos de carbono
presentes en
la
lactosa.
METABOLISMO
FERMENTACION
catabolismo anaeróbico.
Homofermentativas.
Auxotrofo
Son
anaerobios
aerotolerantes
ya
que
carecen
de
catalasa,
poseen
peroxidasas
y
superóxido dismutasas que
destruyen el H O y el O 2
2
2
que
se
forman
en
condiciones de aerobiosis.
Produce un grupo de
antibióticos polipeptídicos
llamados nisinas.
FORMACION DE LA NISINA
BACTERIOCINA
NISINA
ESPECTRO DE ACCION
(A PARTIR DEL METABOLISMO DEL
LACTOCOCCUS)
Es
muy
eficaz
como
conservador frente a bacterias
Gram-positivas. No es eficaz
con
las
bacterias
Gramnegativas.
Es capaz de impedir el
desarrollo de clostridios y
bacilos, destruyendo la pared de
la espora.
La sensibilidad a la nisina varía
de unas bacterias a otras.
La dosis mínima de eficacia no
es siempre la misma.
En la síntesis de la nisina participan un grupo de
genes ordenados como nisABTCIP, nisRK, y
nisFEG que regulan la expresión del gen
estructural nisA.
El precursor inactivo NisA es modificado
químicamente por los productos de nisB y nisC
que deshidratan a los residuos de treonina y
serina y originan la formación de los enlaces
tioeter característicos de los antibióticos.
Una vez modificado el precursor, este es
transportado, procesado y secretado; para
proteger a la célula productora, existen las
proteínas NisL y NisFEG que le confieren
inmunidad.
CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS
CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS
4,00E+09
3,35E+09
3,50E+09
3,00E+09
2,50E+09
2,00E+09
1,50E+09
1,00E+09
5,00E+08
1,00E+02 3,20E+03 1,02E+05
3,28E+06
1,05E+08
0,00E+00
-5,00E+08 0
5
10
Gráfico.1
7
15
20
25
30
PRODUCCION DE NISINA
Gráfico.2
En la grafica.1 muestra una tendencia de crecimiento exponencial del lactococcus teniendo
como referencia una tasa de crecimiento de (µmax =0.523h-1) y un tiempo generacional de
(tg =1h) cuyo tiempo transcurrido es cada 5 horas, partiendo de una concentración inicial
de1x102ufc/ml.
El Lactococcus es un microorganismo auxotrofo capaz de fermentar la lactosa y producir
altas cantidades de acido láctico, ya que contienen un complejo proteolítico que les permite
hidrolizar la caseína, este exige un suministro exógeno de aminoácidos para su crecimiento,
siendo incapaz de efectuar su síntesis a partir de una fuente nitrogenada mineral simple. Es
capaz de producir algunas substancias antibacterianas entre las cuales destacan la nisina.
En la gráfica 2 existe una comparación entre el medio M17 y lactosuero donde sigue la
misma tendencia en ambos medios. Sin embargo, el pH disminuyó hasta alcanzar valores
de 4.2 en el cultivo crecido en suero de quesos mientras que en M17 se estabilizó en 5.5.
La producción de nisina en ambos medios
aumenta progresivamente a lo largo del
crecimiento del lactococcus. No obstante, en los dos medios existe una disminución de los
niveles de actividad una vez que las células alcanzan la fase estacionaria, formando el
metabolito secundario (nisina).
8
MARCO METODOLOGICO

MUESTREO
El experimento se realizara en laboratorio de microbiología de la Facultad de ciencias
químicas con muestras de suero lácteo obtenidas de la fábrica de quesos La Andina en
Machachi Ecuador.
Las muestras de suero lácteo serán escogidas totalmente al azar y serán empacadas en
bolsas herméticas selladas y guardadas en una cooler, con hielo para mantener la muestra
fresca, una vez en el Laboratorio se mantendrán en refrigeración hasta los análisis. El
tiempo trascurrido entre toma de muestra y análisis es de un día
TECNICA DE AISLAMIENTO PARA LACTOCOCCCUS.

Revivificación:
Se toman 10ml de suero lácteo con 90 ml de caldo M17se debe incubar en condiciones de
anaerobiosis a 37ºC por 72horas en una estufa, para adaptar a los microorganismos que se
encuentran dañados o debilitados.

Aislamiento:
Realizar diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-4 .Tomar el tubo de la dilución menos
concentrada y sembrar por estriado en superficie con el medio selectivo y diferencial M17
agar por duplicado, las cajas se incubaran a 37ºC por 48 horas, manteniendo las
condiciones de anaerobiosis.
Realizar una resiembra con el mismo medio selectivo y diferencial M17 agar por duplicado
para obtener cepas puras.
Para comprobar la pureza del cultivo, las colonias deben aislarse nuevamente en un medio
no selectivo como agar nutritivo a una temperatura de 37ºC por un día con el método de
estrías, ya que en el medio selectivo M17 puede ocurrir que una colonia característica del
microorganismo que estamos buscando pueda contener como contaminantes en muy bajo
número otros microorganismos que no hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero
al subcultivarlos en condiciones favorables puedan crecer.

Selección:
Se debe tomar las colonias que muestran distinta morfología en función tamaño, forma,
borde, elevación, transparencia, color y velocidad de crecimiento.
9

Adaptación:
A los lactococcus seleccionados se procede a pasar a suero de quesería pasteurizado
suplementado con caseína hidrolizada obteniéndose mejores resultados de producción de
nisina a una concentración de 15g por litro y a un pH menor de 5 después de 24 horas de
fermentación según el Centro de Estudios y de Investigación en Biotecnología (CIBIOT)
Colombia.

La determinación de la biomasa se realizó por peso seco:
1. Tarar cajas (105ºC) y enfriar en desecador
2. Inocular cepas en medio liquido
3. Previo a incubación retirar 5 ml para obtener blanco
4. Prepara inoculo concentración 1x102cel/ml sembrar 24h
5. Retirar 5ml del inoculo inicial y filtrar, para obtener peso seco.
6. Incubar a temperatura a 30ºC en anaerobiosis cada cepa
7. Por cada cierto tiempo retirar 5ml de suspensión y filtrar
8. Colocar el filtro en cajas y colocar en una estufa 105ºC
9. Retirar la caja, enfriar y pesar.

La actividad de la nisina se evaluó por difusión de agar:
Un
método comúnmente utilizado para estudiar la acción antimicrobiana es el
método de difusión en agar.
1. Preparar una placa que contenga un medio con agar
2. Inocular de forma uniforme con el organismo control (listeria monocytogenes)
3. A continuación se colocan discos de papel filtro impregnado con concentraciones
conocidas de los diferentes antibióticos.
4. El antibiótico difundirá desde el papel filtro al agar en forma radial.
5. Se incuba la placa por 18/24 horas a 37ºC (respetar este parametro, porque
temperaturas menores pueden disminuir la velocidad del crecimiento del germen
y la difusion del antibiotico dando halos irregulares.)

Preservación:
Las cepas de Lactococcus aisladas se transfieren a caldo BHI con glicerol (40% v/v) y se
congelaron a -80 ºC hasta su posterior análisis.
10
FACTIBILIDAD
TECNICA
LACTOCOCCUS
LACTIS
MEDIOS Y
REACTIVOS
M 17 BROTH
CALDO
Suero de
Quesería con
caseína
hidrolizada
GLICEROL
BHI
M 17AGAR
AGAR
NUTRITIVO
MUELLERHINTON
CAJAS PETRI
Antibiograma
CANTIDAD
CANTIDAD
DE
NECESARIA
DISPONIBILIDAD REFERENCIA
PRECIO
ml
g
ml
g
$/500g
$
necesaria
950
48,25
110
11.38
68
1,55
si
1000
15
10
0,15
35
0,01
si
si
si
500
1000
950
100
40
48,25
0.9
3
80
0,18
0,2
4,06
85
45
68
3,06
0,02
0,55
1000
50
40
2
55
0,22
1000
38
250
9,5
40
0,76
―
―
―
―
―
―
―
―
―
―
3,19
si
si
si
si
si
TOTAL
11
5
14,36
BIBLIOGRAFIA:


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
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
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http://www.universia.com.ar/contenidos/investigacion/unl/TECNOLOGIA/cs_alimenta
cion/648.htm
12
12 Diciembre 2009
9 Diciembre 2009
9 Diciembre 2009
X
8 Diciembre 2009
3 Diciembre 2009
1 Diciembre 2009
30 Noviembre 2009
29 Noviembre 2009
X
X
11 Diciembre 2009
Inoculación y
Revivificación
Preparación medios de
aislamiento
Aislamiento
Preparación medio para
resiembra
Resiembra
Selección
Criopreservación
Imprevistos
7 Diciembre 2009
Muestreo
Preparación de medios
4 Diciembre 2009
Recolección y Revisión de
Documentos
28 Noviembre 2009
ACTIVIDADES
2 Noviembre 2009
CRONOGRAMA
X
X
1 MES
X
X
X
X
X
X
X
X
13
14