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XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE CONSERVACIÓN POR EL MÉTODO DE MILES Y MISRA. Laura Angélica Robles Chávez, Facultad de ingeniería, universidad autónoma de baja california, [email protected], M. en C. Marcos Daniel Martínez Peña, Centro Nacional de Recursos Geneticos (CNRG-INIFAP) [email protected] PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Gardnerella vaginalis son bacterias que presentan el fenómeno de autolisis por lo que su conservación se dificulta por los diversos métodos de conservación a largo plazo. El objetivo fue evaluar tres métodos de conservación, liofilización, ultracongelación a -80oC y vitrificación, los métodos se evaluaron mediante el método de Miles y Misra antes y después de la conservación, para determinar cuál es el mejor método de conservación para estas bacterias. METODOLOGÍA Se reactivaron las cepas criopreservadas o liofilizadas mediante siembra por estría cruzada y se incubaron a 35 C en atmosferas de CO2 al 5%, para verificar la viabilidad y pureza. Se sembraron por estría masiva para obtener suficiente biomasa de las cepas para hacer una suspensión de bacterias ajustada al tubo N.° 7 del Nefelómetro de McFarland que representa aproximadamente 2,100x106/ml bacterias. Para liofilizar las cepas se colocaron 500 µL de solución bacteriana y 500 µL de leche al 20% en un criovial, se colocó una tapa; los crioviales llenos se congelaron a -70 °C por 24 h y después se colocaron en la liofilizadora, el proceso duró 3 días con base al protocolo de liofilización de la CM-CNRG. Para crioconservar se colocaron 500 µl de suspensión bacteriana y 500 µl de caldo ToddHewitt con glicerol al 20% en criotubos, por triplicado para cada cepa. Las cepas se congelaron a –20°C por 24 h, después se transfirieron al ultracongelador a -80 oC y al tanque de nitrógeno líquido a -196 oC. En caldo tioglicolato y se realizaron diluciones seriadas 1:10 desde 1x10-1 a 1x10-12, se inocularon cajas con gel de las ultimas 6 diluciones, se incubaron y contaron las UFC/mL. Se consideró un método adecuado cuando la pérdida de viabilidad fuera menor a un log después del proceso de conservación, el método se realizó antes y después del proceso de conservación. . RESULTADOS Y CONCLUSIONES La Gardnerella vaginalis y la Neisseria meningitidis se evaluaron después del método de conservación por Miles y Misra, teniendo colonias incontables tanto en el método de liofilizado como en el de crioconservación. Hasta el momento se puede observar que los tres métodos son viables con las condiciones aplicadas para estas cepas ya que no se pierde más de un log de viabilidad. © Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del Pacífico Agosto 2014
