Download protocolo de electroforesis

Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
Objetivo
Separación de los fragmentos de distinto tamaño de ADN en un gel de
agarosa, en el que dichos fragmentos migraran a diferente velocidad según su
peso molecular al ser sometidos a una corriente eléctrica.
Material
Agarosa (Multipurpose de Roche)
Tampón Tris-Acetato(TAE) solución de trabajo:
Tris-Acetato 0.04M
EDTA 0.001M
Solución stock concentrada (por litro) 50x:
Tris base 242g
Ácido acético glacial 57.1ml
EDTA (pH 8.0) 0.5M 100ml
Tampón de carga 6x:
Azul de bromofenol 0.25%
Xylene cyanol 0.25%
Glicerol 30% en H2O
Bromuro de etidio (10 mg/ml)
Conservar a 4ºC
Método
La concentración del gel de agarosa depende del tamaño de los fragmentos de
ADN a separar, siendo la concentración mínima el 0.7% (fragmentos grandes
de varias Kpb) y la máxima el 4% (fragmentos de 50-150 pb). Se pesa 1gr de
agarosa por tanto por ciento y por 100 ml de volumen de gel.
Mezclar la muestra con el tampón de carga, el volumen de muestra depende
del tamaño de peine con el que se han hecho los pocillos en el gel de agarosa,
normalmente es de 10-30 l. De tampón de carga se añade 1/6 del volumen de
muestra.
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Introducir el gel de agarosa en la cubeta de electroforesis con el tampón TAE y
hacer pasar una corriente de 10 V/cm de gel. Se deja el tiempo necesario para
que el frente migre hasta el final del gel. Después se tiñe el gel con bromuro de
etidio (10 mg/ml) durante 10´, luego pasamos el gel a una cubeta de agua para
retirar el exceso (2´), finalmente observamos las bandas con luz UV y hacemos
una fotografía.
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN HUMANO CCR5
Objetivo
Determinación de las condiciones óptimas de temperatura y concentración de
MgCl2 para la amplificación por PCR del gen CCR5 humano para
determinación posterior de polimorfismos genéticos por electroforesis.
Material
Tris-EDTA:
Tris-HCl 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM
Taq Polimerasa (2,5 U/ l )
Desoxiribonucleótidos trifosfato 10 mM cada uno
MgCl2 50 mM
DMSO
Oligo CCR5+ (100 pmoles/l): 5´CCTCATTACACCTGCAGCTCT3´
Oligo CCR5- (100 pmoles/l): 5´CACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC3´
Tampón de PCR 10X:
(NH4)2SO4 166 mM
Tris-HCl (pH 8,8 a 25ºC)
Tween-20 0,1%
ADN genómico humano (100 ng/l)
Método
Disolver los oligonucleótidos liofilizados a la concentración de 100 pmoles/l
(10-4 M). Para ello calcular el peso molecular de cada oligonucleótido y el
número de moles totales disponibles en función de la cantidad de gramos
suministrada por el fabricante. Después dividir el número de moles por 10 -4 M
par obtener el volumen correcto de resuspensión en Tris-EDTA o agua
destilada. El resultado de la amplificación por PCR depende de la temperatura
de unión al oligonucleótido y de la concentración óptima de MgCl 2 (que varía
para cada pareja de oligonucleótidos). Por ello para determinar las mejores
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
condiciones de amplificación vamos a realizar varias PCR con un rango de
temperaturas de unión de los oligonucleótidos y con 3 concentraciones
diferentes de MgCl2. Para ello cada grupo de 3-4 personas preparará una
mezcla común para 3 PCRs que consta de:
Reactivo
Desoxirribonucleótidos trifosfato 10 mM
DMSO
Oligo CCR5+/ (100 pmoles/l)
Oligo CCR5-/ (100 pmoles/l)
Tampón de PCR 10 X
Taq DNA polimerasa (2,5 U/l)
ADN genómico humano o plasmídico
(100 ng/l)
Volumen final
Cantidad en l
por cada tubo
1
1,25
1
1
2,5
0,25
2
Cantidad en
para 3,5 tubos
3,5
4,4
3,5
3,5
8,75
0,875
7
9
31,5
Se añaden 9 l de esta mezcla a 3 tubos y a cada tubo se le adjunta lo
siguiente:
Tubo 1 (1 mM)
MgCl2 50 mM 0,5
(l)
15,5
Agua (l)
Tubo 2 (2 mM)
1
Tubo 3 (3 mM)
1,5
15
14,5
Los 3 tubos preparados por cada grupo con 3 concentraciones diferentes de
MgCl2 se usará para efectuar la reacción de PCR. Cada grupo trabajará a una
temperatura diferente de unión del oligonucleótido según el siguiente esquema:
Nº ciclos
1
35
1
1
Temperaturas
95ºC
95ºC
54, 56, 57, 59ºC (dependiendo del grupo)
72ºC
72ºC
4ºC
Tiempo
5´
20´´
30´´
1´
15´
Indefinido
A continuación realizar una electroforesis en agarosa al 3%. El fragmento
correspondiente a CCR5 tiene un tamaño de 182 pb aproximadamente.
Resultados e interpretación
l
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Seleccionar las condiciones de temperatura de unión del oligonucleótido y
concentración de MgCl2 que produzca la mayor cantidad de ADN del tamaño
esperado (182 pb).
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE DNA DESDE CÉLULAS BUCALES
Material
Kit GFX Genomic Blood DNA purification
Columnas GFX
Palillos algodonosos
Tampón de extracción conteniendo agentes caotrópicos y detergente.
Tampón de lavado : Tris-EDTA y Etanol absoluto
H2O
Método
Se procederá a la extracción de DNA a partir de mucosa bucal utilizando para
ello palillos algodonosos que se frotarán en la parte interior de la boca.
Extracción
IMPORTANTE: Antes de la extracción poner a calentar el H2O a 70 ºC
Cada persona del grupo se frotará la parte interior de la mucosa bucal con un
palillo algodonoso previamente esterilizado.
Cortar el palillo y
colocarlo en un tubo eppendorf conteniendo 500 µl
de
tampón de extracción. Incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente,
agitando de vez en cuando.
Colocar una columna GFX en un tubo eppendorf para la purificación.
Unión del DNA
Mezclar 200 µl de la extracción de cada persona y añadir de esta mezcla 500
µl sobre la matriz de la columna.
Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min.
Tirar el líquido que sale de la columna
Lavado
Añadir 500 µl de tampon de extracción a cada columna y centrifugar de Nuevo
e las mismas condiciones.
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Repetir los dos últimos pasos pero en este caso centrigugar a 12000 rpm
durante 3 minutos (esto permite secar la columna antes de la elución)
Poner la columna en un tubo eppendorf nuevo.
Elución
Añadir 200 µl de agua calentada sobre la matriz de la columna. Incubar 1 min
a temperatura ambiente.
Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN HUMANO CCR5 A
PARTIR DE DNA DE MUCOSA BUCAL
Objetivo
Determinación la existencia de polimorfismos del gen CCR5 humano en la
población de individuos estudiada.
Material
Tris-EDTA:
Tris-HCl 10 mM, pH 8
EDTA 1 mM
Taq Polimerasa (2,5 U/ l )
Desoxiribonucleótidos trifosfato 10 mM cada uno
MgCl2 50 mM
DMSO
Oligo CCR5+ (100 pmoles/l): 5´CCTCATTACACCTGCAGCTCT3´
Oligo CCR5- (100 pmoles/l): 5´CACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC3´
Tampón de PCR 10X:
(NH4)2SO4 166 mM
Tris-HCl (pH 8,8 a 25ºC)
Tween-20 0,1%
ADN genómico humano (100 ng/l)
Método
Disolver los oligonucleótidos liofilizados a la concentración de 100 pmoles/l
(10-4 M). Para ello calcular el peso molecular de cada oligonucleótido y el
número de moles totales disponibles en función de la cantidad de gramos
suministrada por el fabricante. Después dividir el número de moles por 10 -4 M
par obtener el volumen correcto de resuspensión en Tris-EDTA o agua
destilada.
A partir de las condiciones óptimas de amplificación de este gen, seleccionadas
previamente en la práctica procederemos a la amplificación a partir del DNA de
mucosa bucal extraído.
Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Prácticas de Genética Molecular
Curso 2004-2005
Reactivo
Desoxirribonucleótidos trifosfato 10 mM
DMSO
Oligo CCR5+/ (100 pmoles/l)
Oligo CCR5-/ (100 pmoles/l)
Tampón de PCR 10 X
Taq DNA polimerasa (2,5 U/l)
ADN genómico aislado de mucosa bucal
Volumen final
Cantidad en l
por cada tubo
1
1,25
1
1
2,5
0,25
10
17
Tubo 1
MgCl2 50 mM X
(l)
Hasta 25
Agua (l)
Nº ciclos
1
35
1
1
Temperaturas
95ºC
95ºC
Temp. óptima
72ºC
72ºC
4ºC
Tiempo
5´
20´´
30´´
1´
15´
Indefinido
A continuación realizar una electroforesis en agarosa al 3%.
Los individuos con genotipo homocigoto silvestre producen una banda de 182
pb, los homocigotos mutantes una banda de 150 pb y los heterocigotos dos
bandas de 182 y 150 pb.