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Universidad Nacional de San Martín
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
GENÉTICA MOLECULAR 2009
GUíA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
Docentes
Dra. Paula ALVAREZ
Lic. Lara AVILA
Lic. Alejandro CASSOLA
Dra. Alejandra D’ANTUONO
Dr. Javier DE GAUDENZI
Lic. Georgina MORETTI
Lic. Cintia SANCHEZ
Lic. María Paula ZAPPIA
CONDICIONES DE CURSADA Y APROBACIÓN DEL TP
El horario de los TP será los martes y viernes de 14:00 a 19:00 hs.
Los TPs son de asistencia obligatoria. Durante el cuatrimestre los alumnos serán
evaluados en: (1) Un seminario de bibliografía, (2) Un parcialito después de cada clase de
seminarios, (3) Un parcialito antes de cada práctico y (4) Un informe final donde se
explique el trabajo realizado y los resultados obtenidos con el fin de integrar todos los
trabajos prácticos y demostrar comprensión de la estrategia global. El mismo deberá tener
formato de manuscrito científico (Título, Resumen, Introducción, Métodos, Resultados y
Discusión) y no deberá exceder de 10 páginas tamaño A4 escritas con letra Times New
Roman 12 pts a simple espacio. (5) Un parcial práctico.
Régimen de aprobación- Se deberá asistir como mínimo al 80% de las clases de
seminarios y laboratorios. Dos asistencias computadas como TARDE equivalen a un
AUSENTE. Se podrá faltar o desaprobar un máximo de 2 parcialitos de TP y dos
parcialitos de seminarios. Se deberá aprobar el informe final con nota = 5. De ser
desaprobado este informe podrá ser presentado por segunda vez. Se deberá aprobar un
examen práctico con nota = 5. Este parcial puede ser recuperado.
Composición de la nota- Nota final de TP = 10% Nota de Concepto* + 15% Nota de
Seminario de bibliografía + 15% Nota del informe + 60% Nota de Parcial práctico. Los TP
se aprobarán con una nota final = 5, mientras que para promocionar será necesaria una
nota = 7.
*Obtenida a partir del trabajo realizado por el alumno en el laboratorio, de la participación
en los distintos seminarios de bibliografía y resolución de problemas durante la cursada
del TP.
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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OBJETIVO GENERAL DEL TP
Introducir al alumno en técnicas básicas de biología molecular las cuales se utilizarán
para resolver un problema concreto. El objetivo central del TP será que el alumno enfrente
problemas reales del laboratorio realizando diversos protocolos de manipulación y
clonado de moléculas de ácido desoxiribonucleico (ADN). En particular se subclonará un
gen de Aequorea victoria, que codifica para una proteína verde fluorescente, en un vector
de expresión procariota para obtener la proteína recombinante con actividad biológica. La
misma emite luz visible al ser excitada con luz ultravioleta (UV) debido a su estructura
tridimensional particular. Para ello se partirá de un clon proveniente de una biblioteca
genómica de fragmentos grandes del ADN de A. victoria sobre el cual se realizará UNA
AMPLIFICACION POR PCR para obtener el gen completo de la proteína verde. Luego se
realizará el subclonado del gen completo a un plásmido que permita su expresión
inducible en la bacteria Escherichia coli.
ADNg de A. victoria
?
Diseño de oligonucleótidos para PCR
?
Amplificación del gen gfp por PCR a partir de ADNg
?
Ligación en vector pBlueScript del gen gfp
(paso llevado a cabo por los docentes)
?
Subclonado del gen gfp en vector de expresión procariota (pGEX)
?
Inducción de la expresión de la proteína GFP
Purificación de la proteina recombinante
?
Inmunodetección de GFP por Western blot
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
3
TP #1
DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS
Uno de los parámetros más importantes para tener éxito en la amplificación por reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) es el diseño de los oligonucleótidos cebadores
(comúnmente denominados, oligos o “primers”). Si éstos no están bien diseñados la PCR
puede no proceder eficientemente; el resultado es la amplificación baja o nula del
producto debido a amplificación no específica o a la formación de dímeros de primers que
pueden competir con la amplificación del producto deseado.
¿Qué factores debemos tener en cuenta a la hora de diseñar oligonucleótidos para PCR?
1. Tamaño del oligonucleótido
2. Temperatura de fusión o “melting”
3. Especificidad
4. Secuencias complementarias
5. Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G)
6. Secuencia 3’ terminal
7. Secuencia 5’ terminal y regiones centrales
1. Tamaño del oligonucleótido. El tamaño del oligonucleótido influye en la especificidad,
en la temperatura de fusión y en el tiempo necesario para la hibridación del
oligonucleótido a su secuencia complementaria, y por lo tanto es decisivo para que ocurra
la reacción.
Los oligonucleótidos de 18 a 24 bases son muy específicos de secuencia, siempre que la
temperatura de hibridación sea óptima.
El tamaño del oligonucleótido es proporcional a la eficiencia de hibridación. En general,
cuanto más largo sea el oligonucleótido más ineficiente será la hibridación. Si en cada
paso de PCR hay pocas secuencias de ADN molde con su oligonucleótido hibridado, el
resultado va a ser muy poco producto amplificado.
Los oligos no deberían ser demasiado cortos a menos que se especifique lo contrario en
el protocolo. La meta es diseñar un oligonucleótido con una temperatura de hibridación (la
que programamos en el termociclador) de al menos 50°C.
La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es muy importante
en la PCR. Como regla general la temperatura de hibridación (o “annealing” en inglés)
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debe ser 5-8°C más baja que la de fusión (o “melting” en inglés). Por tanto, si queremos
un oligonucleótido con una temperatura de hibridación de al menos 50°C, correspondería
a un oligonucleótido con una temperatura de fusión de ~55-58°C. A menudo, la
temperatura de hibridación así determinada no resulta óptima y es necesario determinarla
empíricamente. Se puede hacer fácilmente con un termociclador con gradiente (por ej. el
Mastercycler® gradient de Eppendorf).
2. Temperatura de fusión. La temperatura de fusión (Tm) de un oligo depende de varios
factores: longitud, secuencia, contenido G+C, y el tipo y concentración de los cationes
presentes en la reacción, particularmente el ión Na+. Pueden emplearse diversas
fórmulas para estimar este valor, una buena aproximación surge de utilizar la regla de
Wallace (generalmente válida para oligos en el rango de 18–24 bases) donde la Tm se
puede calcular con la siguiente fórmula:
Tm = 2 * (A+T) + 4 * (C+G)
(1)
En la siguiente tabla hay valores de Tm de oligonucleótidos de varios tamaños usando la
fórmula de Wallace asumiendo un contenido en G/C del 50%.
Tamaño
Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)
del
Tamaño del
Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)
Oligonucleótido
Oligonucleótido
4
12°C
22
66°C
6
18°C
24
72°C
8
24°C
26
78°C
10
30°C
28
84°C
12
36°C
30
90°C
14
42°C
32
96°C
16
48°C
34
102°C
18
54°C
36
108°C
20
60°C
38
114°C
Notar que las temperaturas calculadas usando esta regla son inexactas en los valores
extremos.
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En la materia emplearemos la fórmula de Wallace para calcular el Tm de los primers. Sin
embargo, para oligos que varián entre 20 y 100 bases también puede aplicarse la
siguiente fórmula:
Tm = 67.5 + 0.34*[%(C+G)] - 395/longitud
(2)
Una tercera ecuación incluye factores como concentración de formamida (F) y de cationes
monovalentes (M):
Tm = 81.5 + 16.6 log M + 0.41(%(C+G)) - 500/longitud - 0.6*F
(3)
y es recomendable para oligos mayores de 50 bases en un rango de pH de 5 a 9.
Es importante tener en cuenta que en una reacción de PCR hay dos oligonucleótidos y
que ambos deben diseñarse de manera que tengan temperaturas de fusión similares. Si
los oligonucleótidos no tienen Tm parecidas, la amplificación será menos eficiente o
incluso puede no funcionar ya que el oligonucleótido con la Tm más alta hibridará mal o
inespecíficamente a bajas temperaturas mientras que el oligonucleótido con la Tm más
baja puede no hibridar a temperaturas más altas.
Además hay que cuidar que la Tm del producto sea lo suficientemente baja para asegurar
que esté totalmente desnaturalizado a 92-94°C. Este parámetro ayudará a asegurar una
PCR más eficiente, pero no siempre es necesario para amplificar por PCR. En general,
productos entre 100–600 pares de bases se amplifican eficientemente en muchas
reacciones de PCR. En caso de duda, la Tm del producto también puede calcularse
empleando la fórmula 3 indicada anteriormente.
3. Especificidad. La especificidad del oligonucleótido depende parcialmente del tamaño
del oligonucleótido. Es evidente que hay más combinaciones de oligos de 24 bases que
de 15 bases. Con todo, debemos elegir oligonucleótidos que tengan una secuencia única
en el molde de ADN que queremos amplificar. Por ejemplo: un oligonucleótido diseñado
con
una
secuencia
altamente
repetitiva
resultará
en
un
“manchado”
cuando
amplifiquemos ADN genómico; sin embargo, el mismo oligonucleótido puede dar una sola
banda si amplificamos un clon de una genoteca de ADN.
Como la enzima Taq Polimerasa es activa en un amplio rango de temperaturas, puede
extender el oligonucleótido a temperaturas bajas de hibridación. Si la temperatura es
demasiado baja, puede suceder una hibridación no específica que será extendida por la
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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polimerasa con que haya una pequeña similitud en el extemo 3’ del oligonucleótido. En
general, una temperatura de fusión de 55-72°C es la más adecuada (Notar que
corresponde a un tamaño de oligonucleótido de 18–24 bases según la regla de Wallace).
4. Complementariedad en la secuencia de los oligonucleótidos. Es conveniente que
los oligonucleótidos no tengan secuencias complementarias en más de 4-6 pares de
bases dado que se pueden formar estructuras intracatenarias de doble cadena que
interferirán con la hibridación al ADN molde.
Otro problema es la complementariedad entre los dos oligonucleótidos. Similitud parcial
en las regiones medias de dos oligonucleótidos puede interferir con la hibridación. Si el
apareamiento ocurriese en el extremo 3' de cada oligonucleótido, se dará la formación de
dímeros de oligonucleótido que impedirán la formación del producto por competición.
5. Contenido en G/C y extensiones de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G). La
composición de bases de los oligonucleótidos debería ser del 45% al 55% en GC. La
secuencia del oligonucleótido debería elegirse de manera que no contenga zonas de
poli(G) o poli(C) que puedan llevar a hibridación no específica. Hay que evitar también las
zonas ricas en poli(A) y poli(T) ya que es por donde puede desestabilizarse el complejo
molde–oligonucleótido lo que llevaría a una menor eficiencia de amplificación. También
hay que evitar secuencias ricas en polipirimidinas (T, C) y polipurinas (A, G). Idealmente
el oligonucleótido deberá tener una mezcla casi a alzar de nucleótidos, un contenido en
GC del 50% y ~22 bases (en este caso la Tm estará en el rango de 60-66°C).
6. Secuencia 3’-terminal. Se sabe que la posición 3' terminal de los oligonucleótidos de
PCR es esencial para controlar el apareamiento incorrecto. Ya hemos visto el problema
de la complementariedad del oligonucleótido en esas regiones. Otra variable que hay que
considerar es que haya algún residuo de G ó C en el extremo 3' del oligonucleótido. Este
“cepo de GC” (en inglés “CG Clamp”) ayuda a asegurar que el extremo 3’ hibride
correctamente debido a los enlaces de hidrógeno que se dan entre los residuos de GC.
También ayuda a mejorar la eficiencia de la reacción de PCR minimizando cualquier
desestabilización que pudiese ocurrir. Por lo general, esta condición se puede cumplir
incluyendo como mucho dos residuos G ó C en la últimas cinco bases del extremo 3’
terminal.
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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7. Secuencia 5’-terminal y regiones centrales. Es conveniente incluir en esas zonas
secuencias ricas en residuos GC para dar mayor estabilidad a la hibridación del
oligonucleótido con su secuencia blanco.
A modo de resumen, los primers deben cumplir los siguientes criterios:
Criterios “positivos” para el diseño de primers
Temperatura de melting (Tm)
Tm FORWARD = Tm REVERSE
Tm = 60-66ºC
T hibridación = Tm – 5°C
Tamaño del primer
15-30 nt, óptimo 18 a 24 nt
Contenido en G+C
Ideal del 45% al 55%
Contenido GC en 3’
Termina en T; G ó C en dos (máx.) de cinco últimas bases
Contenido GC en 5’
Incluir varias G ó C en las últimas bases
Apareamiento de primers
Únicos
Criterios “negativos” para el diseño de primers
Evitar apareamientos incorrectos
Evitar interacción primer-primer (Tm)
Evitar estructuras en horquilla
EJERCICIO
1. Realice una búsqueda en bases de datos para conseguir la secuencia completa del gen
que se quiere aislar. Para ello realice una búsqueda por similitud de secuencia empleando
el programa BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) y el fragmento del gen proporcionado
en el Apéndice. Indique descripción del gen, organismo y número de acceso del primer
“hit” obtenido.
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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2. Identifique los nucleótidos correspondientes a los codones de inicio y fin de la
traducción y diseñe oligonucleótidos para amplificar dicha región codificante.
Oligo Reverse (de 5’ a 3’)
..................................................................................
Oligo Forward (de 5’ a 3’)
..................................................................................
3. Calcular la Tm de los primers por la fórmula de Wallace.
Oligo Reverse: ….. °C.
Oligo Forward: ….. °C.
4. Busque herramientas bioinformáticas disponibles online (o consulte a los docentes) y
compruebe los siguientes parámetros de los primers que acaba de diseñar:
a) Cálculo de Tm, contenido en GC, tamaño y peso molecular de los oligos.
b) Estructuras secundarias, hibridaciones entre los dos primers, repeticiones o
palíndromos.
5. Por último, se quiere clonar el gen gfp en el sitio múltiple de clonado de un vector de
expresión (BamHI, SmaI, EcoRI) para poder expresar la proteína. Diseña (o modifica)
unos primers para que contengan secuencias de enzimas de restricción. ¿En que extremo
de la molécula las adicionarías? Calcular el Tm de los primers.
Oligo Reverse 5’..............................................................................................
Oligo Forward 5’..............................................................................................
¿Cómo son los oligos Forward y Reverse en relación a la secuencia blanco que se quiere
amplificar? Uno de ellos es complementario y el otro es idéntico en secuencia. Diga cuál
es cuál.
Bibliografía
El contenido teórico de este TP fue extraído de “Ingeniería Genética. Curso 2004-2005”
Universidad de Málaga, Área de Genética, Facultad de Ciencias, Licenciatura en Ciencias
Biológicas. Profesora: Ana Grande Pérez.
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TP #2
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
DIA 1
A) Reacción de PCR
1. Colocar en un tubo Eppendorf una mezcla de reacción considerando volúmenes
suficientes para …. tubos de PCR.
Discutir que controles se deben incluir en este u otro ensayo y que dato puede aportar.
Concentración final
x 1 rxn
x … rxns
0; 1; 2,5; 5; 10; 20 ng
Templado
Buffer Taq Polimerasa 10X
1X
0; 0,5; 1; 2; 5 mM
MgCl2 (50 mM)
0, 50,100, 250, 500 µM
dNTP (10mM c/u)
Primer I (100 ng/µl)
0; 0,1; 0,5; 1; 10 ng/? l
Primer II (100 ng/µl)
0; 0,1; 0,5; 1; 10 ng/? l
Enzima Taq Polimerasa (5U/? l)
0; 0,05; 0,5; 1; 2 U/rxn
25 ? l
H2O csp
?
Enzima. Taq ADN polimerasa, aislada de Thermus aquaticus. ¿Por qué se utiliza este organismo
como fuente de una ADN polimerasa? Buscar la definición de unidad.
?
Buffer: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4), KCl 500 mM.
?
MgCl2. Concentración final: entre 1 y 5 mM. ¿En que fenómeno de la reacción está actuando este
ion? ¿En qué afectan los extremos de este rango?
?
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Concentración final 100 µM.
Discutir en que fenómeno de la reacción está actuando
? Oligonucleótidos: Se utilizarán los oligonucleótidos específicos GFPs y GFPa (ver apéndice) separados
por 200 pb. Llevar a concentración final: 1 ng/µl. Discutir diseño y especificidad. Cálculo de Tm para cada uno
de los oligos de acuerdo a la secuencia nucleotídica de los mismos y al Tm que usted utilizaría para la PCR.
?
Templado: ADNg de A. victoria.
¿Tiene alguna importancia la topología del ADN molde en el rendimiento de la reacción?
2 Completar y llevar a cabo la reacción de PCR bajo el siguiente protocolo:
a) 1 ciclo
94°C
3 min (desnaturalización)
b) 35 ciclos
….°C
30 seg (desnaturalización)
….°C
30 seg (apareamiento)
….°C
….seg (elongación)
….°C
10 min (elongación final)
c) 1 ciclo
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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¿En que se basa para elegir las temperaturas y tiempos de desnaturalización, annealing
de los primers y polimerización?
DIA 2
B) Análisis de los productos obtenidos en geles de agarosa
1 Colocar la solución de agarosa (aproximadamente 50 ml/gel) por 1 minuto en
microondas. Esta solución contiene: Agarosa 1-2% TBE 0,5 X
2 Cuando la solución se encuentre fundida y homogénea dejarla enfriar hasta que se
pueda tocar con la mano y agregar Bromuro de etidio 0,5 µg/ml.
? ¡El Bromuro de Etidio es un potente mutágeno, manejar todas las soluciones que
lo contengan con guantes!
3 Volcar la solución de agarosa en la cuba, que debe tener colocados el peine y los
separadores. Evitar la formación de burbujas. Esperar hasta que gelifique completamente
antes de usar
4 Agregar TBE 0,5 X hasta cubrir el gel y retirar cuidadosamente el peine y los
espaciadores.
Preparación de las muestras y siembra del gel
1 Mezclar la solución de ADN con el buffer de siembra (que se encuentra preparado 6
veces por encima de su concentración de uso; esto es, 6X en la jerga)
2 Cargar la pipeta con la muestra. Apoyar con delicadeza en uno de los bordes del
pocillo (calle, en la jerga). Descargar lentamente la pipeta hasta el primer tope. No llevar
al segundo tope aunque no haya descargado por completo para evitar la formación de
burbujas.
3 Conectar la fuente teniendo cuidado de que el polo positivo este en el lado opuesto al
sitio de siembra. Correr a voltaje constante (se usan unos 5 Volt/cm, midiendo la distancia
entre los polos de la cuba) hasta lograr una buena resolución de fragmentos.
4
Apagar la fuente. Colocar el gel sobre un transiluminador de luz UV.
? ¡Observar manteniendo en todo momento los ojos protegidos de la radiación UV!
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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Soluciones utilizadas
TBE 1X
Tris Base
135 mM
Ac. Bórico
45 mM
EDTA
2,5 mM
Buffer de siembre 6X:
Orange G o Azul de bromofenol
0,25%
Glicerol
30%
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TP #3
CLONADO y SUBCLONADO
Cada grupo recibirá un plásmido recombinante que porta el gen gfp completo de A.
victoria. A partir de este plásmido, y mediante una restricción del mismo, se purificará el
fragmento correspondiente al inserto gfp (714 pb) y se lo ligará al vector pGEX (GE
Healthcare
Life
Sciences).
Los
productos
de
ligación
serán
introducidos
por
transformación en bacterias E. coli DH5a competentes. Las colonias portadoras del
plásmido recombinante serán identificadas por digestión.
El vector de expresión de la línea pGEX, permite obtener una proteína de fusión a
Glutatión-S-transferasa (GST). Utilizando los mapas de ambos vectores y del inserto (ver
apéndice) se determinarán los sitios de restricción a utilizar.
NOTA. Los manuales de laboratorio recomiendan la utilización de 1 U de enzima de restricción por
µg de ADN a digerir. En la práctica, debido a las concentraciones en que vienen las enzimas y a
que las enzimas no se pueden guardar diluídas, se suele utilizar un exceso de las mismas (5 - 10
U/µg). Realizar las reacciones de acuerdo a los protocolos elaborados en la clase.
DIA 1
A) Digestión con enzimas de restricción
1) Colocar en un tubo Eppendorf:
DNA (1 µg/µl)
Buffer de reacción
____ µl
____ µl
Enzima 1 (10 UE/µl) ____ µl
Enzima 2 (10 UE/µl) ____ µl
H20 csp
____ µl
2) Incubar a 37 °C por 2 horas. Transcurrido este tiempo, guardar los tubos a -20°C hasta
el próximo TP.
DIA 2
A) Desfosforilación del ADN
Las fosfatasas alcalinas catalizan la eliminación de un grupo fosfato 5’ de una cadena de
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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ADN. Es conveniente desfosforilar un vector que ha sido digerido con una enzima de
restricción con la finalidad de evitar la religación del mismo. Esto impediría la ligación del
fragmento de ADN que se quiere ligar. En este caso el ADN doble cadena del inserto
aporta dos grupos fosfatos 5’ para participar en dos de los cuatro enlaces que serían
necesarios para formar 1hebra de ADN doble cadena recombinante circular cerrado.
Procedimiento
Agregar al mismo tubo donde se hizo la reacción de digestión del plásmido pGEX, 1U
de CIP (Calf Intestinal Phosphatase) por pmol de terminales de ADN.
El alumno deberá calcular la cantidad de enzima necesaria y las condiciones exactas
de reacción de acuerdo a los manuales de laboratorio.
B) Electroforesis preparativa - Purificación de fragm. de ADN utilizando QIAEX II
1 Sembrar en un gel de agarosa la reacción de digestión del plásmido pGEM-T-GFP, así
como el vector pGEX desfosforilado
2 Correr hasta obtener una buena resolución de los fragmentos
3 Terminar la electroforesis y poner el gel sobre un transiluminador UV.
Comprobar que la digestión fue total. ¿Qué espera obtener para cada caso?
? ¡Protegerse los ojos de la radiación UV!
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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4 Cortar la porción de gel correspondiente al fragmento de ADN deseado usando un
escalpelo (cuidado de no rayar el transiluminador), colocarla dentro de un tubo eppendorf
de 1,5 ml y pesarla
5 Purificar utilizando el kit comercial QIAEX II
Procedimiento QIAEX II
1 Agregar 3 volúmenes de una solución NaI 6M (buffer QX1) e incubar durante 5 min a
52ºC para derretir la agarosa
2 Controlar el pH de la solución mediante el indicador coloreado de la solución QX1.
Debe permanecer amarillo (ácido), en caso de virar al rojo, reajustar el pH agregando 10µl
AcONa 3M pH 5.2
3 Agregar 10 µl de resina Qiaex II, resuspender bien con vórtex e incubar por 10 min a
52ºC agitando ocasionalmente
4
Centrifugar durante 1 min a 14000 rpm
5 Descartar el sobrenadante y resupender el pellet en 500 µl de solución de lavado
(buffer PE). Para el caso del inserto, proveniente de gel, repetir el lavado con QX1, previo
al lavado con PE
6 Repetir el lavado 2 veces
7 Extraer la solución del último lavado y dejar secar 5 min en un bloque a 37ºC.
8 Resuspender el pellet en 15 µl de agua, vortexear e incubar 10 min a 50ºC agitando
ocasionalmente.
9 Centrifugar durante 1 min a 14000 rpm y guardar el sobrenadante.
10 Cuantificar el rendimiento en gel de agarosa con Bromuro de etidio.
Alternativa. Purificación de fragmentos de ADN por precipitación con etanol
1
Realizar una extracción con cloroformo y centrifugar (conservar la fase acuosa).
2 Agregar 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M pH 5,2 y luego 3 volúmenes de etanol 100%
frío.
3 Incubar a -20°C 30 min.
4 Centrifugar durante 30min en microcentrífuga a 14.000 rpm.
5 Secar el pellet y resuspender en buffer TE.
¿En qué propiedades se basa cada método para la separación?
C) Ligación de fragmentos de ADN
El fragmento purificado por cada grupo se ligará al vector pGEX en diferentes relaciones
molares.
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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Se incluirán dos controles de “background”, uno de vector solo sin ligasa (para conocer la
cantidad de vector no cortado por ninguna enzima) y otro de vector solo con ligasa (para
conocer la cantidad de vector capaz de recircularizarse sin inserción, es decir cortado con
sólo una de las dos enzimas utilizadas).
¿Podría realizar un control adicional?
Los componentes de la mezcla de ligación son:
?
Inserto y Vector (usar de 20-50 ng)
Recuerde que:
ng Inserto = ng Vector x kb Inserto x relación molar Inserto:Vector
kb Vector
?
Buffer T4 ADN ligasa 10X: 50 Mm Tris pH7.5, 10 Mm Cl2Mg, 10 Mm DTT, 1 Mm
ATP, 25 µg/ml BSA
?
T4 ADN ligasa: se usan 20 a 40U/por reacción de ligación (1 µl de una dilucion
1/10)
?
Agua: csp 10 µl
1) Rotular tubos eppendorf como A, B, C, D, E y F y agregarles (las cantidades están en
µl):
Componentes
A
B
C
D
Inserto (0,7kb – X ng/µl)
Vector (5,6kb – 20 ng/µl)
E
F
-
-
-
Buffer 10X
1
1
1
1
1
1
T4 ligasa (40U/µl)
1
1
1
1
1
-
H2Odd csp
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
10 µl
Nota. Si los volumenes de inserto a agregar lo permiten, se sugiere realizar la reacción de
ligación utilizando 50 ng de vector en vez de 20 ng y ajustar las cantidades de inserto
acorde a esta modificación. Discutir esta opción con los docentes.
2) Incubar a temperatura ambiente durante 4 horas. Alternativamente puede dejarse toda
la noche a 16°C.
3) Guardar a -20°C hasta el momento de la transformación bacteriana.
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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TP #4
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
A) Transformación baceriana
1 Descongelar las bacterias y dejarlas inmediatamente en hielo 10 min. Cada tubo
contiene 200 µl de bacterias E. coli competentes por el método de Cl2Ca.
2
Agregar 10 µl de la reacción de ligación.
3 Incubar en hielo 30 min.
4 Incubar 30-45 segundos a 42°C y luego reposar 2 minutos en hielo (shock térmico).
5 Inocular tubos conteniendo 1 ml de LB y agitar 1 hora a 37°C (recuperación).
6 Sembrar 200 µl en placas de petri con LB agar conteniendo ampicilina 100 µg/ml final.
B) Preparación de placas de LB agar
1 Se derrite una solución de LB agar en el microondas y se deja enfriar hasta que pueda
ser tocada con la mano (aprox. 50ºC).
2 Agregar ampicilina 100 µg/ml concentración final.
3 Alicuotar en esterilidad (aproximadamente 15 ml/placa) y dejar solidificar.
4 Incubar a 37ºC en forma invertida para secarlas.
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TP #5
PURIFICACION DE ADN PLASMIDICO. SCREENING
A) Purificación de ADN plasmídico por el método de lisis alcalina
1 Inocular las colonias aisladas de las transformaciones en 4 ml de medio LB con
ampicilina (100µg/ml), dejar crecer ON a 37 °C con agitación
2 Centrifugar el cultivo bacteriano (3 ml total) durante 2 minutos a 6000 rpm a
temperatura ambiente en microcentrífuga
3
Descartar el sobrenadante por inversión
4
Resuspender completamente el pellet bacteriano en 200 µl de buffer P1
5 Agregar 200 µl de buffer P2. Mezclar suavemente por inversión del tubo (4-6 veces).
Incubar a temperatura ambiente 5 minutos exactos!
6 Agregar 200 µl de buffer P3 frío. Mezclar inmediatamente y muy suavemente. Incubar
en hielo 10 minutos.
7
Centrifugar 15 minutos a 10000 rpm.
8 Transferir el sobrenadante a otro tubo eppendorf y mezclar con 0.7 volúmenes de
isopropanol. Agitar por inversión 4-5 veces y centrifugar inmediatamente a 14000 rpm
durante 30 minutos
9
Descartar el sobrenadante cuidadosamente
10 Lavar el ADN con 200 µl de etanol 70 % (no agitar ni resuspender)
11 Centrifugar 5 minutos a 14000 rpm
12 Descartar el sobrenadante cuidadosamente
13 Secar el pellet durante 5 minutos a 37ºC y resuspender en 30 µl de H2O o Tris/HCl
10mM pH 7
14 Cuantificar en gel de agarosa el rendimiento de la purificación por comparación de la
intensidad de fluorescencia con cantidades conocidas de ADN del fago ?.
Buffer P1 (buffer de resuspensión)
RNasa A
100 µg/ml
Tris/HCl pH 8 50 mM
EDTA pH 8.0 10 mM
Buffer P2 (buffer de lisis)
NaOH
200 mM
SDS
1%
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Buffer P3 (buffer de neutralización)
AcK pH 5.5
3.0 M
B) Identificación de clones positivos por restricción
1) Colocar en un tubo Eppendorf:
DNA (1 µg/µl)
Buffer de reacción
____ µl
____ µl
Enzima 1 (10 UE/µl) ____ µl
Enzima 2 (10 UE/µl) ____ µl
H20 csp
____ µl
2) Incubar a 37 °C por 2 horas;
3) Analizar en gel de agarosa.
¿Qué otras metodologías podría emplear para determinar los clones que contienen el
inserto de intrés?
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TP #6
PROTEINAS RECOMBINANTES
DIA 1
A) Inducción de la expresión proteica
1 Tomar 0,3 ml del cultivo crecido O.N. (pGEX-Gfp) e inocular 3 ml de medio Terrific
Broth. Realizar la operación por duplicado (uno será el control sin inducir)
2 Incubar 1 h a 37ºC con agitación
3 Inducir uno de los cultivos por agregado de IPTG a una concentración final de 0.2 mM,
e incubar 2 h a 37ºC con agitación
4 Cosechar 3 ml de cada cultivo, centrifugando 1,5 ml por 5 min a 5000 rpm. Descartar el
sobrenadante por volcado y volver a cosechar 1,5 ml en el mismo tubo. Descartar el
sobrenadante.
5 Observar al UV y comparar los pellets de cultivos inducidos y no inducidos. Guardar los
pellets congelados a –70ºC hasta el próximo TP.
DIA 2
A) Purificación de proteinas recombinantes fusionadas a GST
1 Resuspender los pellets congelados en 500 µl de TBS conteniendo inhibidores de
proteasas (PMSF1mM y EDTA 3mM)
2 Sonicar las muestras 3 pulsos de 20 segundos con intervalos de otros 20 segundos en
hielo
3 Agregar a cada muestra Triton X-100 1% final e incubar en hielo por 10 minutos
4 Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm
5 Tomar el sobrenadante e incubarlo con la resina (glutation agarosa) previamente
hidratada en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente
6 Centrifugar 1 min a 3000 rpm, sacar sobrenadante y guardarlo en tubo nuevo en hielo.
7 Realizar 3 lavados con 500 µl TBS-Triton X100 1%. Se centrifuga 1 min a 3000 rpm
entre lavados. Descartar los lavados.
8 Realizar la elución en dos pasos:
8.1 Incubar la resina en presencia de Trombina (1 Unidad), durante 1 hora con agitación,
en un volumen final de 100 µl de TBS-CaCl2 3 mM. Esta es una proteasa que corta
específicamente en la secuencia de reconocimiento presente en la proteína de fusión
(Donde cree usted que está ubicada la secuencia de corte para la Trombina en la proteína
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
20
de fusión? Para que cree usted que se incluye un sitio de corte para una proteasa como
parte de esta proteína de fusión?). Luego guardar el sobrenadante en hielo (4ºC).
8.2 Lavar la resina con 1 ml de con TBS-Triton X100 1%
8.3 Incubar la resina con 100 µl de glutation reducido 15 mM por 10 minutos en agitación
y guardar el sobrenadante
9 Congelar los tubos hasta el próximo TP.
DIA 3
A) Electroforesis en condiciones desnaturalizantes
A.1) Preparación de la muestra para geles desnaturalizantes (SDS-PAGE )
1 Mezclar 14 µl de cada muestra con DTT (0.1M final) y Cracking buffer 5X (1X final) e
incubarlo por 3 minutos a 100 ºC
2 Centrifugar 2 min a 10000 rpm
3 Sembrar las muestras en geles 10% acrilamida-bisacrilamida 29:1 de acuerdo a la
indicación del docente.
A.2) Preparación geles desnaturalizantes y electroforesis
Gel Separador 10% (10ml gel)
Acri: Bis (29:1)
3.33 ml
Agua
2.76 ml
SDS 10%
0.1 ml
Tris-HCl 1M pH 8.8 3.75ml
APS 10%
100 µl
Temed
10 µl
Gel Stacking 5% (5 ml gel)
Acri: Bis (29:1)
0.83 ml
Agua
3.45 ml
SDS 10%
0.05 ml
Tris-HCl 1M pH 6.8 0.625 ml
APS 10%
50 µl
Temed
5 µl
Running Buffer 5X (1litro)
Glicina
72g
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Tris
15g
SDS
5g
A.3) Coloración
Una vez corrido el gel, se lo separa de los vidrios cuidadosamente (utilize guantes!).
Colorear el gel con Coomasie Blue R-250 (0.2% Coomasie, 50% Metanol y 10% Acético)
durante 1 hora. Decolorar realizando varios cambios de solución fijadora (20% Metanol,
10% ácido acético, 70% agua)
B) Electroforesis en condiciones nativas
B.1) Preparación de la muestra para geles nativos
1
Mezclar 14 µl de cada muestra con Cracking buffer nativo hasta 1X final
2 Sembrar los geles PAGE nativos 8% y correrlos a 120V constantes.
B.2) Preparación geles nativos
Gel Separador 8% (10ml gel)
Acri: Bis (29:1)
2.5 ml
Agua
3.6 ml
Tris-HCl 1M pH 8.8 3.75
APS 10%
100 µl
Temed
10 µl
Gel Stacking 5% (5 ml gel)
Acri: Bis (29:1)
0.83 ml
Agua
3.45 ml
Tris-HCl 1M pH 6.8 0.625 ml
APS 10%
50 µl
Temed
5 µl
B.3) Visualización de GFP en geles nativos
Una vez corridos los geles, se los separa de los vidrios cuidadosamente utilizando
guantes. Los geles nativos se irradian con luz UV onda corta (~245nm) con el objetivo de
identificar la proteína de fusión con GFP producida y purificada.
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TP #7
TRANSFERENCIA Y WESTERN BLOT
A) Transferencia
Materiales
- dos casetes de transferencia (son parte del set de transferencia);
- cuatro papeles Whatman (3MM o similar);
- filtro de nitrocelulosa o nylon, cortados del tamaño del gel a transferir (levemente más
grandes).
Precauciones I
?
Todo el material a utilizar debe equilibrarse en el buffer de transferencia. En el
caso de la membrana primero se humedece en agua destilada y recién después se
equilibra en el buffer de transferencia;
?
El sandwich de transferencia debe armarse siempre sumergido en el buffer para
evitar burbujas de aire;
?
UTILIZAR EN TODO MOMENTO GUANTES (el contacto con la piel puede
engrasar la membrana y/o el gel de poliacrilamida y evitar la transferencia).
Una vez embebido el material en el buffer de transferencia colocar por orden:
1. Tapa plástica negra (se ubicará
en el electrodo negativo)
2. dos unidades de papel Whatman
3. gel de electroforesis (pasarlo con
cuidado)
4. membrana de nitrocelulosa o
nylon
5. dos unidades de papel Whatman
6. cerrar con la tapa plástica blanca
(será el positivo)
Precauciones II
Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos 2009
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Cuidar que no queden burbujas de aire en ningún lugar del sandwich, pues no pasará
corriente eléctrica en ese punto. RECOMENDACION: entre el paso 5 y 6 anteriores (es
decir, antes de cerrar la segunda tapa de plástico) ayudarse con una varilla de vidrio o
pipeta para sacar todas las burbujas que pudieran haber quedado.
Condiciones de transferencia
?
200 mA en 1 hs (corriente limitante), ó 30 mA O.N.
Hecha la transferencia, desarmar el dispositivo y secar la membrana sobre un papel de
filtro (este filtro se puede guardar o pasar directamente a su procesado).
NOTA: En este punto se pueden teñir las membranas de nitro o nylon para ver todas las
proteínas que se han transferido, con el colorante rojo Ponceau en TBS.
B) Inmunodetección
Todo el procesamiento se lleva a cabo a temperatura ambiente.
a) Bloquear un mínimo de 30 min. en TBS - 5% leche descremada - 0,3% Tween;
b) Incubar con el anticuerpo primario diluido en TBS - 2% leche descremada - 0,3%
Tween por el lapso de una hora (la dilución a usar depende de la calidad y título del
anticuerpo; se definirá en el momento de hacerlo) (todo a temperatura ambiente).
c) Lavar
TBS
10min
TBS + Tween 0,3%
10min
TBS
10min;
d) Incubar con el anticuerpo secundario (anti-Ig de conejo conjugado con fosfatasa
alcalina) diluido 1:2000 en TBS - 2% leche descremada - 0,3% Tween, una hora.
e) idem punto c)
Revelado
a) Pasar el filtro a recipiente con 10 ml de solución de DAB (di-amino benzidina).
b) Detener la reacción cambiando el filtro a un recipiente con abundante agua.
Soluciones
Buffer de transferencia :
Tris-base
9.09 g
Glicina
43.2 g
Metanol
600 ml
llevar a 3 litros con agua deionizada
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TBS (Tris buffered saline):
Tris.HCl pH 7.6 50mM
NaCl
150mM
Solución de revelado (DAB):
6mg en 10ml de PBS + 10 ? l de peróxido de hidrógeno.
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APÉNDICE
I. SECUENCIA “Query” Y OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS
>partial_cds
aacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactgggaagctacctgttccatgg
ccaacacttgtcactactttctcttatggtgtacaatgcttctcaagatacccagatcata
tgaaacagcatgactttctcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactat
attttacaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggtgatacc
cttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggac
acaaaatggaatacaactataactcacataatgtatacatcatgggagacaaaccaaagaa
tggcatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattaaagatggaagcgttcaattagca
Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados son (de 5´ a 3´):
GFPs / GGGATGAGTAAAGGAGAAGAACTT
GFPa / CATATGACTGGGTATCTCGC
II. VECTORES
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