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Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 PROTOCOLO DE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Objetivo Separación de los fragmentos de distinto tamaño de ADN en un gel de agarosa, en el que dichos fragmentos migraran a diferente velocidad según su peso molecular al ser sometidos a una corriente eléctrica. Material Agarosa (Multipurpose de Roche) Tampón Tris-Acetato(TAE) solución de trabajo: Tris-Acetato 0.04M EDTA 0.001M Solución stock concentrada (por litro) 50x: Tris base 242g Ácido acético glacial 57.1ml EDTA (pH 8.0) 0.5M 100ml Tampón de carga 6x: Azul de bromofenol 0.25% Xylene cyanol 0.25% Glicerol 30% en H2O Bromuro de etidio (10 mg/ml) Conservar a 4ºC Método La concentración del gel de agarosa depende del tamaño de los fragmentos de ADN a separar, siendo la concentración mínima el 0.7% (fragmentos grandes de varias Kpb) y la máxima el 4% (fragmentos de 50-150 pb). Se pesa 1gr de agarosa por tanto por ciento y por 100 ml de volumen de gel. Mezclar la muestra con el tampón de carga, el volumen de muestra depende del tamaño de peine con el que se han hecho los pocillos en el gel de agarosa, normalmente es de 10-30 l. De tampón de carga se añade 1/6 del volumen de muestra. Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 Introducir el gel de agarosa en la cubeta de electroforesis con el tampón TAE y hacer pasar una corriente de 10 V/cm de gel. Se deja el tiempo necesario para que el frente migre hasta el final del gel. Después se tiñe el gel con bromuro de etidio (10 mg/ml) durante 10´, luego pasamos el gel a una cubeta de agua para retirar el exceso (2´), finalmente observamos las bandas con luz UV y hacemos una fotografía. Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN HUMANO CCR5 Objetivo Determinación de las condiciones óptimas de temperatura y concentración de MgCl2 para la amplificación por PCR del gen CCR5 humano para determinación posterior de polimorfismos genéticos por electroforesis. Material Tris-EDTA: Tris-HCl 10 mM, pH 8 EDTA 1 mM Taq Polimerasa (2,5 U/ l ) Desoxiribonucleótidos trifosfato 10 mM cada uno MgCl2 50 mM DMSO Oligo CCR5+ (100 pmoles/l): 5´CCTCATTACACCTGCAGCTCT3´ Oligo CCR5- (100 pmoles/l): 5´CACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC3´ Tampón de PCR 10X: (NH4)2SO4 166 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25ºC) Tween-20 0,1% ADN genómico humano (100 ng/l) Método Disolver los oligonucleótidos liofilizados a la concentración de 100 pmoles/l (10-4 M). Para ello calcular el peso molecular de cada oligonucleótido y el número de moles totales disponibles en función de la cantidad de gramos suministrada por el fabricante. Después dividir el número de moles por 10 -4 M par obtener el volumen correcto de resuspensión en Tris-EDTA o agua destilada. El resultado de la amplificación por PCR depende de la temperatura de unión al oligonucleótido y de la concentración óptima de MgCl 2 (que varía para cada pareja de oligonucleótidos). Por ello para determinar las mejores Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 condiciones de amplificación vamos a realizar varias PCR con un rango de temperaturas de unión de los oligonucleótidos y con 3 concentraciones diferentes de MgCl2. Para ello cada grupo de 3-4 personas preparará una mezcla común para 3 PCRs que consta de: Reactivo Desoxirribonucleótidos trifosfato 10 mM DMSO Oligo CCR5+/ (100 pmoles/l) Oligo CCR5-/ (100 pmoles/l) Tampón de PCR 10 X Taq DNA polimerasa (2,5 U/l) ADN genómico humano o plasmídico (100 ng/l) Volumen final Cantidad en l por cada tubo 1 1,25 1 1 2,5 0,25 2 Cantidad en para 3,5 tubos 3,5 4,4 3,5 3,5 8,75 0,875 7 9 31,5 Se añaden 9 l de esta mezcla a 3 tubos y a cada tubo se le adjunta lo siguiente: Tubo 1 (1 mM) MgCl2 50 mM 0,5 (l) 15,5 Agua (l) Tubo 2 (2 mM) 1 Tubo 3 (3 mM) 1,5 15 14,5 Los 3 tubos preparados por cada grupo con 3 concentraciones diferentes de MgCl2 se usará para efectuar la reacción de PCR. Cada grupo trabajará a una temperatura diferente de unión del oligonucleótido según el siguiente esquema: Nº ciclos 1 35 1 1 Temperaturas 95ºC 95ºC 54, 56, 57, 59ºC (dependiendo del grupo) 72ºC 72ºC 4ºC Tiempo 5´ 20´´ 30´´ 1´ 15´ Indefinido A continuación realizar una electroforesis en agarosa al 3%. El fragmento correspondiente a CCR5 tiene un tamaño de 182 pb aproximadamente. Resultados e interpretación l Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 Seleccionar las condiciones de temperatura de unión del oligonucleótido y concentración de MgCl2 que produzca la mayor cantidad de ADN del tamaño esperado (182 pb). Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE DNA DESDE CÉLULAS BUCALES Material Kit GFX Genomic Blood DNA purification Columnas GFX Palillos algodonosos Tampón de extracción conteniendo agentes caotrópicos y detergente. Tampón de lavado : Tris-EDTA y Etanol absoluto H2O Método Se procederá a la extracción de DNA a partir de mucosa bucal utilizando para ello palillos algodonosos que se frotarán en la parte interior de la boca. Extracción IMPORTANTE: Antes de la extracción poner a calentar el H2O a 70 ºC Cada persona del grupo se frotará la parte interior de la mucosa bucal con un palillo algodonoso previamente esterilizado. Cortar el palillo y colocarlo en un tubo eppendorf conteniendo 500 µl de tampón de extracción. Incubar durante 10 minutos, a temperatura ambiente, agitando de vez en cuando. Colocar una columna GFX en un tubo eppendorf para la purificación. Unión del DNA Mezclar 200 µl de la extracción de cada persona y añadir de esta mezcla 500 µl sobre la matriz de la columna. Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min. Tirar el líquido que sale de la columna Lavado Añadir 500 µl de tampon de extracción a cada columna y centrifugar de Nuevo e las mismas condiciones. Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 Repetir los dos últimos pasos pero en este caso centrigugar a 12000 rpm durante 3 minutos (esto permite secar la columna antes de la elución) Poner la columna en un tubo eppendorf nuevo. Elución Añadir 200 µl de agua calentada sobre la matriz de la columna. Incubar 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR DEL GEN HUMANO CCR5 A PARTIR DE DNA DE MUCOSA BUCAL Objetivo Determinación la existencia de polimorfismos del gen CCR5 humano en la población de individuos estudiada. Material Tris-EDTA: Tris-HCl 10 mM, pH 8 EDTA 1 mM Taq Polimerasa (2,5 U/ l ) Desoxiribonucleótidos trifosfato 10 mM cada uno MgCl2 50 mM DMSO Oligo CCR5+ (100 pmoles/l): 5´CCTCATTACACCTGCAGCTCT3´ Oligo CCR5- (100 pmoles/l): 5´CACAGCCCTGTGCCTCTTCTTC3´ Tampón de PCR 10X: (NH4)2SO4 166 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25ºC) Tween-20 0,1% ADN genómico humano (100 ng/l) Método Disolver los oligonucleótidos liofilizados a la concentración de 100 pmoles/l (10-4 M). Para ello calcular el peso molecular de cada oligonucleótido y el número de moles totales disponibles en función de la cantidad de gramos suministrada por el fabricante. Después dividir el número de moles por 10 -4 M par obtener el volumen correcto de resuspensión en Tris-EDTA o agua destilada. A partir de las condiciones óptimas de amplificación de este gen, seleccionadas previamente en la práctica procederemos a la amplificación a partir del DNA de mucosa bucal extraído. Universidad de Jaén, Dpto. Biología Experimental, Área de Genética Prácticas de Genética Molecular Curso 2004-2005 Reactivo Desoxirribonucleótidos trifosfato 10 mM DMSO Oligo CCR5+/ (100 pmoles/l) Oligo CCR5-/ (100 pmoles/l) Tampón de PCR 10 X Taq DNA polimerasa (2,5 U/l) ADN genómico aislado de mucosa bucal Volumen final Cantidad en l por cada tubo 1 1,25 1 1 2,5 0,25 10 17 Tubo 1 MgCl2 50 mM X (l) Hasta 25 Agua (l) Nº ciclos 1 35 1 1 Temperaturas 95ºC 95ºC Temp. óptima 72ºC 72ºC 4ºC Tiempo 5´ 20´´ 30´´ 1´ 15´ Indefinido A continuación realizar una electroforesis en agarosa al 3%. Los individuos con genotipo homocigoto silvestre producen una banda de 182 pb, los homocigotos mutantes una banda de 150 pb y los heterocigotos dos bandas de 182 y 150 pb.