Download Bases moleculares de la transformación celular.

MECANISMOS
MOLECULARES
IMPLICADOS
TRANSFORMACIÓN TUMORAL BQ32. Dr González Castaño
EN
LA
CARACTERISTICAS DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO
1.- Células normales: puestas en cultivo se mueren en cuestión de días o semanas. Por
ello para el estudio tenemos que utilizar líneas celulares inmortalizadas.
2.- Células inmortalizadas (líneas establecidas): son las que utilizamos en los cultivos
debido a que no se nos mueren. Por otro lado cumplen las características de las células
normales, que son:
1.- Dependencia de anclaje: para que se produzca la división celular necesitan un
soporte al que se puedan anclar
2.- Dependencia de suero: necesitan el suero rico en factores de crecimiento para
poder crecer
3.- Inhibición por contacto: cuando las células contactan entre sí existe una
transmisión de señales que inhiben su crecimiento.
Un ejemplo es la línea celular inmortalizada NIH 3T3. Por tanto son células que
salvo por su carácter inmortal tienen un fenotipo normal, lo que las hace muy útiles para
los cultivos.
3.- Células transformadas: además de ser inmortales, han perdido las características de
normalidad; son por tanto lo contrario de las inmortalizadas:
1.- No necesitan anclaje para dividirse
2.- Menor dependencia de factores de crecimiento.
3.- No hay inhibición por contacto celular: las células proliferan y se van
montando unas sobre otras, no se respeta la topografía.
Son la mayoría de células que utilizamos en el laboratorio. Cuando se inyectan
en un animal forman tumores. Sin embargo no tienen capacidad para invadir,
metastatizar, y por tanto no matan al animal, simplemente forman tumores.
4.- Células tumorales: además de lo anterior (completamente transformadas ) cuando
se inyectan en animales forman tumores, invaden, dan metástasis y matan al animal.
GENES RESPONSABLES DE LA TRANSFORMACIÓN CELULAR
En CONDICIONES NORMALES existen dos tipos de señales:
- unas señales positivas, que estimulan el crecimiento celular. Provienen de los
proto-oncogenes.
- unas señales negativas que ponen freno al crecimiento celular. Provienen de
los genes supresores.
Entre ambas señales existe un perfecto equilibrio.
Proto-oncogenes
+
Crecimiento celular controlado
Genes supresores de
tumores
-
Cuando por alguna circunstancia existe un DESEQUILIBRIO entre ambas señales
(aumentan mucho las positivas respecto a las negativas) la célula empieza a proliferar
de manera descontrolada
Oncogenes activados o
mutados
++
Transformación Tumoral
Pérdida o mutación
de genes supresores
-
A un tumor se puede llegar por alteración en los proto-oncogenes, que haga que estén
anormalmente activados, pasando a llamarse entonces oncogenes, o bien por una
inactivación de los genes supresores, produciéndose una desinhibición del crecimiento.
Existen por tanto dos tipos de genes implicados en la transformación tumoral:
1.- PROTOONCOGENES: 1mutado → TUMOR
Son genes normales implicados en el crecimiento celular (lo favorecen). Cuando
por una mutación se hiperactivan los denominamos oncogenes. Por tanto, el oncogen es
la forma activada del protooncogen. Como supone una ganancia de función respecto
del protooncogen, decimos que los oncogenes son generalmente dominantes (el
oncogen es dominante sobre el alelo normal ( protooncogen)).
Las pérdidas se producen por:
- protooncogen mutado (and “activated”)
- protooncogen capturado por retrovirus y mutado en el proceso
- genes virales propios del virus que se comportan como oncogenes
2.- GENES SUPRESORES: 2MUTADOS → TUMOR
Son genes que suprimen el crecimiento celular. Actúan de forma recesiva: la
pérdida de una de las copias no supone mucho problema porque nos queda otra copia
que puede controlar perfectamente el ciclo celular. Para que se desarrolle un tumor por
inactivación de un gen supresor es necesario que se inactiven las dos copias:
produciendo pérdida de función.
Las pérdidas producen por:
- Pérdida de un gen completo o región cromosómica por delección
- Pérdida de la función génica por mutaciones puntuales que inactivan
Es muy importante recordar que el protooncogen es la forma normal y que el oncogen
es la forma mutada (hiperactiva).
ONCOGEN: DOMINANTE: con un solo alelo mutado basta
GENES SUPRESORES: RECESIVA: tienen que estar los dos alelos mutados
ONCOGENES
Existen 3 tipos de oncogenes:
1.- El oncogén que deriva de la transformación de un protooncogén:
existen 4 posibles mecanismos:
- mutaciones puntuales
- reordenamientos cromosómicos o traslocaciones
- amplificación
- inserción de promotores
2.- Protooncogenes capturados por retrovirus (virus RNA) y que al integrarlos en su
genoma los transforman en un oncogen: consiste en que un retrovirus adquiere un
protooncogen y que al integrarlo en su genoma “ mete la pata “ e introduce mutaciones
en dicho protooncogén, tranformándolo en un oncogén.
No existe evidencia de este mecanismo en humanos; la única excepción sería el
VHC.
También hay virus DNA que son transformantes pero que no intervienen en la
patología tumoral humana. Son los adenovirus y los papovavirus.
3.- genes propios del virus: que se comportan como oncogenes. Por ejemplo, el primer
virus que se descubrió transformante fue virus del sarcoma de Rous.
Os adjunto las tablas que ha dado con los apuntes pero no hizo mucho caso de ellas en
la clase, sólo para decir que el primer virus transformante que se descubrió fue el
del sarcoma de Rous.
VIRUS TRANSFORMANTES
Clase de virus
Tipo de genoma
Adenovirus
ds DNA
Papovavirus
ds DNA
SV40 (mono)
Polioma (humano)
Papilomavirus Humano ds DNA
(HPV) 16 (Cervix)
Retrovirus
ss RNA
Oncogenes
E1A & E1B
T antigens
E6 y E7 inactivan
p53 y pRb (son supresores)
Proto-oncogenes
Mutados (oncogenes)
ONCOGENES VIRALES DERIVADOS DE GENES CELULARES NORMALES
Retrovirus
Oncogén viral
Proto oncogén Celular
c-src (src)
Virus del sarcoma de v-src
Rous
Sarcoma de monos
v-sis
c-sis (sis)
Harvey sarcoma muruno
v-H-ras (H-ras)
c-H-ras (H-ras)
Kirsten sarcoma murino
v-K-ras
c-K-ras (K-ras)
FBJ osteosarcoma murino v-fos
c-fos (fos)
Mielocitomatosis Aviar
v-myc
c-myc (myc)
Virus leucemia Abelson
v-abl
c-abl (abl)
Eritroblastosis Aviar
v-erbB
c-erbB (erbB)
-
Los oncogenes virales son aproximadamente 80-99% homólogos a los proto
oncogenes.
Los oncogenes virales generalmente son copias de mRNA celular y no tienen
intrones.
ORGANIZACIÓN GÉNICA DE UN RETROVIRUS
5’LTR
gag
Pol
env
LTR 3’
ORGANIZACIÓN GÉNICA DE UN RETROVIRUS TRANSFORMANTE
5’ LTR
gag
Pol
env
V-onc
LTR 3’
Procede de la transformación de un gen celular pero no es
un gen celular completo: viene derivado por copia de la
transcriptasa inversa de mRNA; por lo que es una forma
sin intrones. Además se introducen mutaciones en la
secuencia que es lo que le hace ser transformante
FUNCIONES DE LOS PROTOONCOGENES
- Factores de crecimiento
- Receptores de los factores de crecimiento
- Proteínas de membrana implicadas en la transducción de señales
- Proteín-kinasas
- Factores de transcripción de genes implicados en el crecimiento
- Los propios genes
Por tanto se pueden colocar en cada uno de los pasos de la ruta de transducción de
señales.
Ejemplos:
1.- la mutación de un protooncogén que codifica para un factor de crecimiento: en
condiciones normales la producción de factores de crecimiento está muy limitada. La
transformación de este protooncogén hace que haya una sobreproducción de ese factor
de crecimiento (célula que sobreproduce y se vuelve independiente ). P.e: c-sis, que
produce PDFG, que es el factor de crecimiento más universal.
2.- la activación de un protooncogén que codifica para el receptor de un factor de
crecimiento hace que el receptor haya perdido su capacidad de señalizar únicamente
cuando está unido a su factor de crecimiento, es decir, la variante oncogénica se ha
hecho independiente del factor de crecimiento, está continuamente transmitiendo
señales. P.e: c-erb → EGFR ( receptor del factor de crecimiento epidérmico )
3.- implicados en la transducción de señales: H-ras y K-ras codifican para una G –
proteína pequeña p21. La variante oncogénica está constantemente activada y por tanto
enviando señales positivas al núcleo.
4.- proteín kinasas: c-abl, c-src: son las proteínas implicadas en la cascada de las MAP
kinasas
5.- factores de transcripción: c-myc, c-fos y c-jun (estos dos últimos constituyen el AP1, cuya alteración produce que directamente se estimulen genes para iniciar el ciclo
celular).
IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES DE ONCOGENES EN TUMORES
HUMANOS
La mayor parte de los tumores humanos contienen oncogenes o protooncogenes
“activados” (mutados). Se demuestra por el aislamiento de genes mutados de tumores.
El DNA de células tumorales humanas contiene oncogenes activados. Esto se
demuestra repitiendo este proceso cientos de veces. Así se aisló el primer oncogén
humano: ras. La línea celular que se utiliza es NIH3T3 de ratón, que es “normal” ( no es
transformada pero sí inmortalizada ). Si repetimos este experimento con un fibroblasto
normal no funcionaría: para que se produzca una célula tumoral no vale con un solo
daño, con un solo oncogén activado, hay que acumular más fallos.
MECANISMOS DE ACTIVACIÓN DE PROTOONCOGENES (Tipos que se vieron)
Aunque son cuatro, en humanos sólo funcionan los tres primeros:
1.-Mutación puntual: el cambio de un nucleótido produce el paso de proto a oncogén. El
prototipo es c-ras. H, K y N- ras codifican para proteínas que inactivan la actividad
GTPasa de la célula. Se encuentran en los siguientes tumores:
- H-ras: carcinomas de pulmón y de vejiga
- K-ras: carcinoma de pulmón
- N-ras: carcinomas de pulmón y colon y neuroblastoma
Ras está unido a GTP y tiene actividad GTPasa. Si hayGTP, activación. Pero cd se pasa a GDP por la
GTPasa, no hay activación celular. Así, las mutaciones que inhiben la actividad GTPasa producen un
estado permanente de activación celular.
H, K y N ras normales tienen Gly (posición 12), Ala (pos 59) y Gln (pos 61) y el producto es la
normalidad. En cambio, la mera sustitución de Val por Gly (pos 12) produce H-ras mutado → Ca. Vejiga.
2.- Reordenamientos cromosómicos traslocaciones:
- linfoma de Burkitt: la traslocación más frecuente es la t(8;14) (80%).
Consiste en la traslocación del protooncogén c-myc a un lugar próximo al
promotor de las inmunoglobulinas (Ig G). Como este promotor es mucho
más potente que el promotor normal del c-myc, existe sobreexpresión de cmyc.
Las otras traslocaciones menos frecuentes son: t(8;22) (15%) y t(2;8) (5%)
- leucemia mieloide crónica: en el 95% de los pacientes se detecta el
cromosoma Philadelphia, resultado de una traslocación t(9;22). Se trata de
un cromosoma 22 acortado debido a la traslocación con el 9. se produce la
transferencia del protooncogén abl del 9 al 22, donde se acopla al gen BCR
(Breakpoint Clusters Region), que es justo donde se rompe el 22. la fusión
-
del abl con lo que queda del BCR en el cr.22 da lugar a un oncogén muy
potente. La proteína que se genera de esta fusión abl-BCR tiene una
actividad tirosínkinasa constante.
leucemia linfocítica aguda: aparece la t(9;22) en un 10-15% de casos, lo que
da lugar a la fusión BCR- abl, como en el caso anterior.
3.- Amplificación de un protooncogén: si tengo más copias del protooncogén tengo
más material para traducir, y por tanto más producto. Pero es que la amplificación no
sólo lleva a un aumento de expresión, sino que también aumenta el riesgo de cometer
más fallos.
ONCOGÉN
c-myc
N- myc
AMPIFICACIÓN
20 veces
5-1000 veces
L-myc
10-20 veces
c-abl
5 veces
c-myb
5-10 veces
c-erbB
K-ras
30 veces
4-20 veces
30-60 veces
TUMOR
Leucemia y pulmón
Neuroblastoma
y
retinoblastoma
Cáncer de pulmón de
células pequeñas
Leucemia mieloide crónica
Leucemia mieloide aguda
Carcinoma de colon
Carcinoma epidermoide
Carcinoma de colon
Carcinoma adrenocortical
4.- Inserción de promotores: (en humanos no se da, aunque dijo en clase que ahora sí existe debido
a una terapia utilizada que recientemente se descubrió que producía esto, lo cual generó una gran
polémica, aunque no nos dijo el nombre del producto, ya que lo va a comentar en las próximas clases de
tumorogénesis). Si se inserta un promotor muy potente al lado de un protooncogén éste
potenciará su transcripción. Este también sería uno de los mecanismos por el cual
algunos retrovirus llevan oncogenes. El retrovirus adquiere un protooncogén y al
insertarlo en su genoma da la casualidad que se integra al lado de un promotor (aunque
el retrovirus no lleve oncogén con su promotor puede producir el inicio del ciclo).
GENES SUPRESORES
Como hemos dicho, son los genes que controlan de forma negativa el ciclo
celular, suponen un freno. Recordad que actúan de forma recesiva, que para que se
desarrolle un tumor por inactivación de un gen supresor es necesario que se inactiven
las dos copias.
Un ejemplo de tumor por inactivación de genes supresores es el RETINOBLASTOMA.
Existen dos formas:
- la forma familiar: debuta en la infancia y cursa con múltiples tumores
retinianos en ambos ojos.
- La forma esporádica: aparece en adultos y afecta a los individuos de forma
unilateral
Para que se desarrolle el tumor es necesario que las dos copias del gen Rb estén
inactivas, es decir, son necesarias dos mutaciones, una para cada copia; esto es lo que se
llama la “ hipótesis de knudson del doble insulto o two hits ”.
- en las formas esporádicas se nace con las dos copias normales. En la vida
postnatal se produce la primera mutación sobre un alelo del gen. Si con el
tiempo se produce la mutación del otro alelo, se desarrollará el
-
retinoblastoma. Por tanto en los casos esporádicos, el tumor suele ser único y
de aparición tardía.
En las formas familiares (mendelianas) en lugar de necesitar dos eventos
necesitan sólo uno, porque ya han heredado una copia mutada. Como es una
copia que está en todas las células somáticas del individuo, todas las células
están predispuestas a desarrollar un tumor en el momento en que se inactive
la otra copia. En los casos familiares es más fácil desarrollar retinoblastomas
múltiples porque cualquier célula es susceptible de mutar el otro alelo.
¿CÓMO FUNCIONA EL GEN RB? este gen se localiza en el cr.13. la proteína Rb es la
que se encarga de que la célula no se salga de G0, de que no abandone la quiescencia, y
de que, en el caso de que lo haga, se quede en G1.
Pero también Rb es capaz de atrapar una serie de proteínas nucleares, entre ellas el
factor de transcripción E2F (implicado en la transcripción de numerosos genes).
Conforme avanza el ciclo celular se fosforila Rb y E2F se libera del “pesado” Rb y ya
puede transcribir. Si no hay Rb no hay freno del ciclo celular.
¿ CÓMO SE PIERDE LA FUNCIÓN? PÉRDIDA DE HETEROZIGOSIDAD
A
a
Herencia de genotipo con
Rb
w
un alelo mutado:1º hit
B
b
en la célula tumoral: eventos
somáticos que dan lugar al
2º hit
A
Rb
B
a
Rb
b
Mutaciones locales
(poco frecuentes)
A
Rb
B
a
Rb
B
A
Rb
B
Recombinación
Pérdida
somática
cromosómica
A
Rb
B
A
Rb
B
Pérdida
cromosómica
y duplicación
Recombinación somática: en nuestra especie es poco frecuente (sólo durante la
meiosis). Sí se produce en otras especies. Pero parece ser que en este caso sí que se
produce en humanos. De esta forma se produce la pérdida de la heterozigosidad.
Además este cambio es un marcador de la posible presencia en el entorno de un gen
supresor, por lo que constituye una técnica potentísima para detectar genes supresores.
Pérdida cromosómica + duplicación: también gracias a este mecanismo podemos
detectar un montón de genes.
ENLACE TUMOROGÉNESIS (BQ33): Para entender el mec de acción de los genes
supresores hay que entender el mec de control del ciclo celular. Ver siguiente clase.