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1 INSTITUCIÓN EDUCATIVA “INEM JOSÉ FÉLIX DE RESTREPO” MEDELLÍN DEPARTAMENTO DE CIENCIAS NATURALES Y EDUCACION AMBIENTAL LABORATORIO MICROBIOLOGÍA. BACTERIAS PROFESORA: Rosa Ramírez Suárez GRADO: 11º. BIOLOGIA Sección: Fecha: NOMBRE: _______________________________________________________________________ EQUIPO Nº _____ LOGROS: 1. Prepara frotis bacterianos empleando las técnicas adecuadas para hacerlo. 2. Aplica con propiedad los pasos para la tinción de Gram y reconoce los grupos de bacterias como Gram + ó Gram – 3. Identifica algunos microorganismos presentes en medios de cultivo y conoce algunas diferencias morfológicas entre ellos. 4. Prepara medios de cultivo para microorganismos PARTE A: CULTIVO DE BACTERIAS MATERIALES Microscopios compuestos. Azul de metileno al 1 % Portaobjetos y Cubreobjetos Cajas de Petri. Papel limpia lentes. Frascos de compotas Goteros. Pañuelos desechables. Algodón Gelatina sin sabor Papel absorbente. NaCl (sal de cocina) Solución de lugol al 1 % Soporte universal Mecheros de alcohol Erlenmeyer Aceite de inmersión Tapón de algodón y gasa Asas de metal Agua destilada. Agujas de disección o estiletes Copitos de algodón. Cultivos de bacterias y hongos. Tres velas de parafina. Colorante de Gram Material de limpieza Bolsa para desperdicios. PROCEDIMIENTO MOMENTO UNO PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. (Se realizará con anterioridad en la casa de los estudiantes. La institución facilitará las cajas de petri y el erlenmeyer) Sigue las instrucciones representadas en las ilustraciones y/o las dadas por la docente. 2 Utiliza los 3 sobres de gelatina sin sabor, 1 gr. de azúcar y 1 gr. de caldo de carne agrégalos a un erlenmeyer con 100 ml de agua y una pizca de NaCl Consigue estos materiales: gelatina sin sabor (3 sobres), caldo de carne, cajas de petri, frascos de compotas Calienta el contenido del erlenmeyer y déjalo hervir durante un minuto. Revuelve de vez en cuando. Deja hervir la olla durante 15 minutos. Saca la caja, el erlenmeyer y los frascos de compota y colócalos junto al mechero encendido, O tres velas encendidas. ( Cloruro de sodio) Tapona el erlenmeyer con algodón y colócalo en una olla pequeña junto con la caja de petri y los frascos de compota todo limpio y envuelto en papel. Luego, coloca todo esto dentro de una olla a presión, a la que has agregado previamente 1 cm. de altura de agua. Vierte, con cuidado y en partes iguales, el contenido del erlenmeyer en la caja de Petri y los frascos de compota. Déjalos enfriar tapados con papel aluminio o papel encerado y luego colócalos en la nevera 3 Ya están listos los medios de cultivo, mínimo 2 por equipo, en la siguiente sesión, se hará la siembra. MOMENTO Nº 2 SIEMBRA Cerca de un mechero encendido, toma con un copito de algodón estéril, una muestra de la mucosa de la boca de un compañero de equipo. Rotúlala con los siguientes datos: fecha y lugar donde fue tomada la muestra. Toma la caja y sostenla, cerca del mechero, entreabierta con tu mano izquierda, y haz la siembra de la muestra tomada al compañero, haciendo surcos. Ciérrala inmediatamente. Colócala en la incubadora a una temperatura de 20 a 25°C. Si no hay incubadora en tu colegio, constrúyela con una caja de cartón y bombillas; es importante, entonces, que revises la temperatura del interior, que sea la adecuada para el crecimiento microbiano. Realiza el mismo procedimiento para tomar muestras de: la piel de un compañero, una parte del salón, alguna silla o jardinera del exterior, el baño y el aire (para lo cual debes dejar abierta la caja durante algunos minutos). Para cada toma de muestras utiliza copitos nuevos; para las muestras en el baño y las partes exteriores no necesitas utilizar el mechero, sólo toma la muestra y rápidamente realiza la siembra. Observa el crecimiento en las cajas, yendo día por medio a revisarlas. En el día número cinco observa los microorganismos, como se indica a continuación. 1. Observación de bacterias Coloque en el portaobjetos una o dos gotas de agua destilada, con el asa tome una pequeña cantidad del cultivo de las bacterias, mézclela con el agua y extienda la preparación unos 2 cm. a lo largo del portaobjetos formando una película delgada. Pásela varias veces sobre la llama de un mechero, controlando la temperatura con el dorso de la mano para evitar un excesivo calentamiento. Una vez seca la preparación agregue azul de metileno hasta cubrir toda la muestra y deje actuar el colorante 4 durante un minuto. Luego elimine el colorante lavando la placa con un chorro suave de agua, seque con papel absorbente sin frotar la muestra y pásela nuevamente por la llama unas tres veces controlando también la temperatura. Sin colocarle cubreobjetos, enfoque en el microscopio. Esquematice lo observado con el objetivo de 100X utilizando aceite de inmersión y compare con los diagramas de la figura 1. ¿Para que calentó la preparación antes de colorear? ¿Qué estructuras pudo observar en las bacterias? Si no se tinturaron las bacterias repita el proceso agregándole el colorante de Gram. Observar el proceso. Cerca del mechero, toma la muestra de una caja de Petri con ayuda de un asa. Deja secar el agua y luego pasa rápidamente la lámina sobre la llama para fijar la muestra. GRAFICO N 1 Colócala sobre un portaobjetos, en el que has colocado previamente una gota de agua destilada. Disuelve bien la muestra en el agua. Agregue azul de metileno hasta cubrir toda la muestra y deje actuar el colorante durante un minuto. Luego elimine el colorante lavando la placa con un chorro suave de agua, seque con papel absorbente sin frotar la muestra y pásela nuevamente por la llama unas tres veces controlando también la temperatura. Si no se tiñen las bacterias repetir el proceso con colorante de Gram. 5 PREGUNTAS 1. ¿Qué formas de asociación pudo usted observar en los cocos? ¿Cómo se llama cada una de esas asociaciones? ¿Qué otros tipos existen? Dé un ejemplo de cada uno de los tipos de asociación de los cocos? 2. Consulte algunos procesos industriales que se realizan basados en las bacterias. 5. En general, ¿cómo se nutren las bacterias? PARTE B: CULTIVOS DE BACTERIAS Y TINCIÓN DE GRAM MATERIALES: Asa para siembra. Porta objetos. Cubreobjetos Mechero de alcohol Fósforos o encendedor Material de limpieza y bolsa de basura Guantes Aceite de inmersión Solución de tinción de Gram Frasco lavador Gasa Alambre domestico Cultivos bacterianos Alcohol industrial Alcohol antiséptico Puente de coloración PROCEDIMIENTO: 1. Elaboración del asa para siembra: Consiste en un alambre (generalmente fabricado con una aleación de níquel y cromo), en nuestro caso con alambre de uso domestico lo más delgado posible, que por un extremo se fija a un mango que lo sostiene (de madera, o se adhiere a un mango de bisturí, o se enrolla en un plástico) y por el otro se dobla formando un pequeño circulo. Para hacer el asa se utiliza una pinza y cuidando que quede centrada la figura. El tamaño no debe ser mayor a 10 mm. Observe el dibujo. 2. Preparación del frotis: El portaobjetos que se va a utilizar debe ser lavado con agua y jabón, bañado con alcohol antiséptico y secado con gasa. Se enciende el mechero y se flamea el asa hasta que se ponga al rojo vivo, para ello se sostiene el asa inmediatamente arriba de la porción azul de la llama. El asa se debe colocar tan cerca de la posición vertical como sea posible. Deje enfriar unos 20 segundos. Tome una porción de la muestra de bacterias que se va a analizar, la cual se encuentra en los cultivos de los tubos de ensayo, o en los cultivos preparados por cada equipo de trabajo. Coloque el asa sobre el portaobjetos y aplane ligeramente en el centro de este, enumere el portaobjetos. Sosteniendo todavía el asa aplanada sobre el portaobjetos muévala trazando una espiral del centro a la periferia. Deje cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados del portaobjetos. Deje secar la muestra al aire. Flamee de nuevo el asa hasta que este al rojo vivo para destruir cualquier bacteria que se encuentre en ella. 6 Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre. Pase el portaobjetos 3 veces a través de la llama con la muestra hacia arriba. Déjelo enfriar antes de aplicar la tinción. 3. Tinción: Coloque el portaobjetos en un puente de coloración Bañe el portaobjetos con colorante de Gram. Deje actuar por 1 minuto. Escurra la solución y enjuague el portaobjetos con agua corriente. Séquela al aire libre. 4. Observar al microscopio. Enfoque en el menor aumento, sin cubreobjetos Luego pase a 45X y empiece a buscar los mejores espacios para observar. Pase al objetivo de 100X, utilizando aceite de inmersión. Realice esquemas o dibujos de los diferentes grupos de bacterias que pudo observar. Repita el proceso para mínimo 2 muestras por equipo. Elabore informe con esquemas, análisis y conclusiones. 5. Buscar: Bacterias teñidas de color violeta oscuro o Gram positivas, como estafilococos, estreptococos, neumococos algunos bacilos. Bacterias teñidas de color rosa o Gram negativas, como gonococos, meningococos, bacilos coliformes, salmonelas. NOTA: OBSERVA LA GRAFICA Nº 1: Como preparar un frotis bacteriano. GRAFICA Nº 2: Diversos grupos de bacterias. Recopilado y adaptado por: Rosa Isabel Ramírez Suárez. Con base en el texto: Manual de técnicas básicas para un laboratorio de salud. Publicación científica Nº439. Organización Mundial de Salud.1993.