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Los fluidos corporales (orina, saliva, secreciones nasales, etc.) han sido utilizados como fuente
para la detección de anticuerpos o antígenos de diversos patógenos virales, para monitoreo de
drogas y para medir el nivel de hormonas en humanos (Detmer et al, 2010). En especial, se han
utilizado los fluidos orales para la detección de virus en humano como los de HIV, Herpesvirus,
Hepatitis A, B y G, Rubeola, Sarampión, Varicela Zoster, el virus del SARS, entre otros
(Zimmerman et al, 2007).
Recientemente, un procedimiento basado en la recolección de fluidos orales para la detección
del virus de PRRS y su respuesta de anticuerpos fue desarrollada en los laboratorios de la
Universidad Estatal de Iowa (Prickett et al. 2006, Zimmerman et al 2007).
Esta novedosa técnica ideada por el Dr. Jeffrey J. Zimmerman ha podido ampliar y cambiar la
visión en cuanto a la recolección de muestras para el diagnóstico y monitoreo de enfermedades
virales y bacterianas en el cerdo, y su seguimiento epidemiológico en los rebaños porcinos.
Este procedimiento se apoya en la premisa llamada "Perfil Pronóstico" que es el proceso de
monitorear la circulación de patógenos en poblaciones porcinas con el objeto de estimar o
pronosticar la salud y productividad de esa población en el futuro inmediato (Prickett et al,
2007).
Por otro lado, el procedimiento se aprovecha en el comportamiento curioso e indagador del cerdo
cuando se le colocan objetos extraños en el corral. Como se observa en la Fig. 1, un grupo de
lechones muerden una cadena colgante.
Las evidencias del pasaje de anticuerpos séricos a los fluidos de la cavidad oral fueron
demostradas por Challacombe et al en 1978 cuando detectó anticuerpos IgG, IgM e IgA
radiomarcados en fluidos orales 30 minutos después de haberlos inyectados en macacos Rhesus.
Corthier (1976) reportó por primera vez la detección de anticuerpos contra el virus de la Peste
Porcina Africana en fluidos orales de cerdos después de la inoculación intranasal de la Cepa
Thiverval.
Figura 1. Lechones destetados mordiendo una
cadena.
(Cortesía del Dr. Jeffrey J- Zimmerman, IUS, USA)
Del mismo modo, Loftager et al (1993) detectaron anticuerpos IgA en fluidos orales de cerdos que
previamente fueron inoculados con una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae (App). Una cosa
relevante de este reporte es que estos anticuerpos fueron detectados antes de que aparecieran
en suero, por lo que los autores concluyen que la detección de anticuerpos IgA en fluidos orales
podría servir como un método práctico para monitorear la infección temprana por App.
El procedimiento y sus alcances:
La toma de muestra mediante la colección de fluidos orales consta de cuatro etapas
primordialmente, las cuales se describen a continuación.
1. Suspender una torunda o gaza en una ubicación accesible a los lechones. La torunda se coloca
en una zona limpia lejos del comedero y bebedero.
2. La torunda o gaza debe estar a una altura por encima del lomo del cerdo para que estos
puedan morderla y depositar los fluidos. El tiempo de exposición de la torunda es de 20 a 30
minutos. En este tiempo se estima que alrededor del 70% de los lechones alojados habrán estado
en contacto con la torunda.
3. Extracción de los fluidos de la torunda insertando la torunda en una bolsa plástica limpia y
exprimiéndola tratando de recolectar los fluidos en una de las esquinas de la bolsa.
4. Drenaje de los fluidos en un contenedor estéril cortando una esquina de la bolsa.
Con esta técnica, Zimmerman et al (2007) mostraron que los niveles de virus de PRRS en suero y
fluidos orales correlacionaban positivamente cuando se utilizo la prueba de PCR reversa
cuantitativa en un rebaño con circulación del virus de PRRS. Es decir, que la cantidad de virus en
los fluidos orales se movía en función de la cantidad presente en sangre, por lo que esta técnica
soporta el concepto que el muestreo de fluidos orales en corrales, a intervalos determinados
puede, efectivamente detectar una infección aguda de PRRS en situaciones como esta.
Más recientemente, se pudo demostrar la valiosa utilidad del uso del muestreo de fluidos orales
en los programas de monitoreo y aclimatación de primerizas. En este caso, cerdas primerizas que
provenían de 5 diferentes sitios fueron alojadas en corrales según su procedencia y fueron
vacunadas con una vacuna comercial a virus vivo de PRRS. Las lechonas fueron monitoreadas al
día 0, 20 y 27 días post vacunación.
Los resultados mostraron que el porcentaje de positividad para PCR fue de 53.7 73.3% para las
muestras de suero individuales o en pool respectivamente, y de 43.4 y 50% para las muestras de
fluidos orales, individuales o en pool respectivamente. Estos resultados sugieren que el muestreo
de fluidos orales para PRRS puede ser un sustituto práctico a la extracción de sangre y que el
hacer pool de las muestras provee adecuada sensibilidad comparado con el suero (Weeks et al,
2010).
El uso de los fluidos orales en el estudio de otras patologías tale como el Circovirus Porcino tipo 2
(PCV2) y el Mycoplasma hyopneumoniae han sido temas tratados en los últimos años.
En este particular, Opriessnig et al (2007) pudieron detectar ADN viral del virus PCV2 comenzando
a los 2 días post infección (DPI) hasta los 98 días. La cantidad de ADN viral fue más alta entre el
día 12 y 18 DPI.
Los trabajos de Kim et al (2007) sugieren que los fluidos orales pueden ser una alternativa para la
detección de ADN del Circovirus Porcino- PCV2 o de anticuerpos contra este virus, además que
esta técnica provee una manera costo efectiva para el monitoreo de la actividad viral y del
estatus inmune en poblaciones porcinas.
En el caso del Mycoplasma, Roe et al. (2010) después de desafiar a cerdos con una cepa de
Mycoplasma hyopneumoniae vía intratraqueal observaron que a las 8 semanas post desafío
resultaron positivos 45% de los sueros, 72% de las muestras nasales y 100% de los fluidos orales.
Una mayor positividad a la prueba de PCR fue detectada en las muestras de los fluidos orales que
en las de muestras nasales.
Esto último demuestra el potencial para monitorear la excreción en el rebaño de M
hyopneumoniae a través del uso de fluidos orales.
En el trabajo con el virus de la Influenza Porcina realizado por Detmer et al 2010, se logró
detectar el virus de Influenza Porcina H1N1 en 3 de 4 cerdos infectados, a los 4, 5 y 6 días postinfección, obteniendo una fuerte correlación con los resultados de muestreo nasales,
demostrando así que el uso de fluidos orales es una alternativa para el muestreo de grupos de
cerdos para esta enfermedad.
Figura 2. Prueba Piloto. La torunda cuelga de una barra de metal
(cabilla) de 1”ø
Figura 3. Se mejoró la recolección cuando se utilizó una viga
3x2”
Figura 4. Lechones mordiendo la torunda de gaza...
Figura 5. Después de 30 minutos se recoge la gaza en una
bolsa plástica.
Figura 6. La gaza es exprimida para extraer los fluidos contenidos. Figura 7. Se observa el fluido recolectado tras exprimir la gaza
(flecha).
Figura 8. Drenaje de los fluidos un tubo recolector. (Foto Dr. Jeffrey Zimmerman, ISU, Ames,
USA.
En nuestra experiencia particular, pudimos iniciar los primeros estudios con esta técnica en el
año 2007.
Con las orientaciones del Dr. Zimmerman, y a pedido de un productor de cerdos muy importante
en Venezuela, comenzamos las pruebas pilotos en Mayo de ese año.
En principio utilizamos una granja Sitio 3 con corrales en donde se alojaban entre 20 a 25
lechones de desarrollo (25 a 30 Kg p.v.).
Decidimos colocar una barra de hierro o cabilla de 1 pulgada de grosor a una altura apropiada
para el tamaño de los cerdos y localizada equidistante a los comederos, los bebederos y la zona
sucia. De esta barra se colgó una torunda de gaza a la altura adecuada (Ver Fig. 1). Al poco
tiempo de iniciar la prueba nos dimos cuenta que la barra de hierro no era lo suficientemente
resistente, por lo que optamos por colocar una viga de 3x2 pulgadas (Ver Fig. 2). En este caso se
solventaron los problemas anteriores y se pudo observar el comportamiento de los cerdos que
prontamente comenzaron a morder la gaza y a depositar los fluidos (Fig. 4).
La gaza se dejó por espacio de 25 a 30 minutos. Una vez transcurrido este tiempo, se retiró la
gaza completamente humedecida y se colocó en una bolsa plástica e inmediatamente se procedió
a extraer los fluidos contenidos en la gaza mediante presión, exprimiéndola hasta que dejaba de
destilar (Ver Fig 6 y 7).
El procedimiento se repitió en 8 corrales por cada semana evaluada (Semana 10, 12, 14, 16 y 18).
En total se obtuvieron 40 muestras.
Una vez separados los fluidos de la gaza, se efectuó la decantación de los fluidos en envases
estériles (colectores de orina) los cuales fueron refrigerados para su transporte al laboratorio en
donde fueron separadas las muestras en alícuotas iguales en tubos vacutainer y congeladas hasta
su ulterior procesamiento. Posteriormente, las muestras fueron descongeladas, centrifugadas y
varias alícuota de unos 0.3 mL del sobrenadante fue colocada en tarjetas de papel de filtro FTA
(Flinders Technology Associates)**.
Por cada muestra de cada corral se efectuaron 3 réplicas a objeto de tener mayor capacidad de
detección ARN viral y ADN bacteriano. En total se procesaron 120 tarjetas de FTA.
Todas las muestras fueron probadas para Mycoplasma hyopneumoniae y PRRS mediante la técnica
de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y RT-PCR.
Los resultados obtenidos nos indicaron una negatividad para PRRS en las edades evaluadas, pero
con positividad de circulación de Mycoplasma en cada una de las semanas escrutadas, siendo las
semanas 14, 16 y 18 en donde la positividad fue más alta para este germen.
En definitiva, la utilización del muestreo de fluidos orales puede ser un método efectivo para el
monitoreo de diversas enfermedades en el cerdo. Además es una técnica que disminuye las
labores de recolección de muestras cuando se compara a la extracción sanguínea, se requiere
menos destrezas para ejecutarla y su costo es relativamente más bajos que las técnicas de
recolección de muestras convencionales (sanguínea, nasal, etc.).
Por otro lado, esta técnica puede ser llevada a cabo por personal no técnico, requiere menos
tiempo y es una técnica no invasiva por lo que se reduce enormemente la labor y el stress tanto
para el personal como para los animales.