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APLICACIÓN DE TECNICAS BASADAS EN BIOLOGIA MOLECULAR PARA EL
DIAGNÓSTICO Y TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DE GUMBORO (IBDV)
Blas ALI Sánchez Peral, Mª José Rodríguez*.
INGENASA. Hermanos García Noblejas 41, 28037. Madrid. Spain.
*Corresponding autor: [email protected]
EL VIRUS DE GUMBORO
El virus de la enfermedad de Gumboro (IBDV), es un avibirnavirus, familia Birnaviridae, género
Birnavirus, [1]el género comprende dos serotipos: el serotipo 1 que afecta a aves de corral [2] y el
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serotipo 2 que es apatogénico en este tipo de aves. Los miembros de esta familia presentan como
material genético ARN de doble banda segmentada. La enfermedad de Gumboro es altamente
contagiosa, afecta fundamentalmente a aves jóvenes. Está caracterizada por afectar al sistema inmune
provocando necrosis y atrofia de la bolsa de Fabricio de estas aves, secundariamente produce una
depleción de linfocitos en todos lo órganos linfoides, lo que da lugar a una inmunodepresión severa [3]
El cuadro clínico presenta diarrea, anorexia, depresión, erizamiento de las plumas y finalmente
postración En el mundo, se pueden encontrar dos formas diferentes de la enfermedad. La forma
subclínica producida por variantes antigénicas y la forma clínica producida por cepas de alta virulencia.
Desde el punto de vista del diagnóstico la forma clínica de la enfermedad de Gumboro es la más
interesante, se caracteriza por presentar elevadas morbilidades (100%) y mortalidades (50%)
produciendo grandes pérdidas en la industria avícola La forma clínica producida por cepas de alta
virulencia es la responsable de los numerosos brotes que han aparecido en diversos países a lo largo de
todo el mundo.
BIOLOGIA MOLECULAR, TRASCENDENCIA
Las técnicas de Biología Molecular ocupan un papel cada vez más importante en lo referido al
diagnóstico, a todos los niveles, desde la Sanidad Humana en la comenzaron a utilizarse hace ya
algunos años, hasta la Sanidad Animal en la que cada vez son más utilizadas como herramientas de
diagnóstico complementarias a los ensayos serológicos. Entre las más utilizadas se encuentran la
reacción en cadena de la polimerasa o PCR y todas sus variantes, el enzimoinmunoensayo o ELISA
sobre amplificado, las técnicas de caracterización como la secuenciación automática, la restricción
enzimática, etc. Por su rapidez, sencillez y elevada sensibilidad y especificidad, la PCR es una de las
técnicas más populares, hasta el punto de constituir un pilar central dentro de la mayoría de los
protocolos en las pruebas de diagnóstico molecular conocidas. La PCR es una técnica que utiliza
fundamentalmente tres propiedades; por un lado, dos intrínsecas a los ácidos nucleicos como son la
complementariedad de bases y la desnaturalización/renaturalización de las cadenas de los ácidos
nucleicos por efecto de la temperatura (temperatura de fusión o Tm) y por otro, la capacidad
polimerizante de las enzimas termoestables denominadas polimerasas capaces de sintetizar ácidos
nucleicos en presencia de sus monómeros específicos, es decir nucleótidos. La técnica de amplificación
mediante un suceso cíclico que consta de tres fases (desnaturalización, hibridación y elongación), puede
amplificar específicamente y con elevada sensibilidad secuencias cortas del ácido nucleico de interés.
La técnica de amplificación génica por si sola o acoplada a otras ya mencionadas (ELISA, secuenciación
automática, restricción enzimática), permite diseñar ensayos diagnósticos fiables, rápidos y de fácil
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interpretación dirigidos específicamente para cada patología, con el objetivo de identificar la presencia
del patógeno y si es posible, su posterior caracterización.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE IBDV
El uso de técnicas moleculares en estos últimos años para detección de IBDV ha sido muy notable ([4];
[5]; [6]) la detección del virus esta basada en una transcripción reversa acoplada a amplificación por
PCR o RT-PCR sobre la región hipervariable del gen vp2 . Los amplificados resultantes son procesados
por restricción enzimática [7]; [8]; [9]), o directamente por secuenciación automática ([10]) a partir de
Bursa de Fabricio. En ambos casos es posible caracterizar el tipo de virus: salvaje, salvaje muy virulento
o vacunal ([11]; [12]; [13]; [14]) si bien, la secuenciación ofrece más información que la restricción. En
ocasiones, es necesario aumentar la sensibilidad de la técnica, para ello se realiza una nested o segunda
PCR después de la RT-PCR sobre el primer amplificado que da lugar a un fragmento de menor tamaño
(o bien directamente una RT-PCR, Banda y Villegas, 2003), el resultado se revela por gel de agarosa del
mismo modo que en la RT-PCR. Mediante restricción enzimática se puede determinar el grupo molecular
al que pertenece. En el caso del primer amplificado que tiene 744pb, se utilizaban inicialmente 2 enzimas
([15]) pasando posteriormente a 7 enzimas o a una combinación de varias enzimas [16]; [17, 18]) lo que
ofrece un patrón más completo. La diana Ssp I es en la mayoría de los casos, no en todos, un marcador
de alta virulencia, aunque hay cepas altamente virulentas que no tienen la diana y cepas que tienen la
diana Ssp I y no son de alta patogenicidad (encontradas en Georgia por el Dr. P. Villegas). En el caso
que se detecte IBDV mediante nested PCR o bien directamente una RT-PCR, el fragmento es de 248 pb,
en este caso se utilizan 4 o más enzimas para la tipificación.
En nuestro laboratorio se realiza un protocolo muy similar al descrito (ver esquema de detección /
tipificación), es decir, una RT-PCR sobre extraído de Bursa de Fabricio con oligonucleótidos específicos
para la región hipervariable del gen vp2; si la muestra resulta positiva por un lado se secuencia el
amplificado de 744pb y por otro se realiza la restricción enzimática con 7 enzimas: Mbo I, Bst NI, Sac
I, Sty I, Nco I, Ssp I, Taq I; con ello se obtiene toda la información posible sobre el tipo de virus,
dianas de virulencia (Ssp I), tipo de cepa, etc; valorando la correlación del tipo de cepa y la
presencia/ausencia de diana Ssp I. Si el resultado de la RT-PCR es negativo se realiza una nested PCR
sobre el primer amplificado de 744bp dando lugar a un fragmento de 248bp, con ello se descartan
posibles falsos negativos. Para este caso se procede del mismo modo, realizando secuenciación (más
limitada en cuanto a la información que en el caso anterior) y restricción enzimática con 4 enzimas: Sac
I- Taq I -Sty I- Ssp I.
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En general, la determinación de los grupos moleculares mediante restricción enzimática, en particular en
INGENASA se realiza teniendo en cuenta las publicaciones, los estudios y trabajos realizados por
especialistas reconocidos tales como el Dr. P. Villegas, el Dr. A. Banda, el Dr. D. Jackwood, el Dr. A.
Pàges, y la Dra. N. Majó, entre otros. Para ello se utilizan una serie de tablas muy accesibles, referidas a
ambos segmentos (744bp, 248bp) que clasifican las distintas cepas en 6 grupos moleculares, en cada
caso el valor diagnóstico de la restricción enzimática viene determinado por la ausencia o presencia de
las diferentes dianas indicadas en el esquema así el como del tamaño de los fragmentos originados en la
región hipervariable VP2, de esta forma se pueden valorar potencialmente no sólo las cepas clásicas o
vacunales (incluso multivalentes) también aquellas de alta virulencia y variantes emergentes. La
información que ofrece la restricción enzimática es importante aunque limitada por las características
propias de la técnica, de ahí que exista la posibilidad adicional de secuenciar la muestra para conocer en
detalle el tipo virus ([10]), es decir la cepa concreta, es actualmente el ensayo de tipificación más
recomendable debido a la información que ofrece frente a la restricción enzimática.
En nuestra experiencia en el diagnóstico de IBDV se analizaron en el laboratorio un total de 35 bolsas de
Fabricio representativas en este caso de diferentes lotes enviados con sintomatología relacionada con
IBDV, incluso en algún caso con estudios histológicos y anatomopatológicos, procedentes de pollos
entre los 20 y 50 días de edad. El 54% (19) de las cepas se identificaron como muy virulentas (vvIBDV,
dentro del grupo molecular VI), sólo en un caso se encontró una cepa vvIBDV sin diana Ssp I. El 29%
(10) de las muestras positivas se identificaron como vacunales dentro de los grupos moleculares IV
(228E, D78) y grupo V (Bursine-2) además de algunas cepas relacionadas con cepas clásicas tipo VG311, VG-262, VG-208. EL 11% (4) de las muestras remitidas no se pudieron estudiar por ausencia de
amplificación. Finalmente, el 6% (2) de las muestras presentaron coinfecciones o al menos presencia de
dos tipos de virus procedentes de diferentes grupos moleculares en concreto del grupo IV y grupo VI (ver
fotos del esquema tipificación en el fragmento de 744bp). Respecto del total de muestras analizadas, en
el 43% se pudo estudiar el fragmento de 744bp; dentro del 57% restante, el 46% se analizaron sobre el
fragmento de 248bp, en el resto no se pudo identificar la presencia de IBDV. Este dato nos pareció muy
significativo, puesto que pone de manifiesto la importancia de la nested PCR en esta prueba en
particular. De otro modo no hubieran sido consideradas como positivas la mayoría de las muestras.
Respecto de los últimos estudios publicados por otros colegas, decir que se esta trabajando en la misma
línea descrita en cuanto al diagnóstico molecular se refiere. Se han publicado recientemente trabajos
sobre análisis molecular y de patogenicidad en pollos de Malasia ([19]) y Egipto ([20]), análisis de
secuenciación sobre la región hipervariable Vp2, caracterización de cepas exóticas por restricción
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enzimática con Bmr I ([21]), amplificación y diferenciación de cepas muy virulentas y vacunales por RTPCR ([22]), detección de IBDV mediante la nueva generación de técnicas de amplificación a tiempo real,
más eficientes y rápidas que la PCR convencional, permiten incluso la cuantificación del virus y la
tipificación de IBDV mediante curvas de fusión de los amplificados, entre otras ventajas ([23]).
Detección y tipaje de IBDV mediante RFLP-RT PCR realizado en INGENASA
Bursa de Fabricio
Método de extracción de RNA
Chomczynski y
Sacchi
ARN vírico
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Proteína Vp2
RT-PCR (SET oligos Vp2)
Actividad RT
Secuenciación
ARN
Amplificación por PCR
ADN
DNA vírico (744 bp)
RFLP
Nested PCR (SET oligos )
Mbo I- Bst NI- Sac I- Sty I- Nco I- Ssp I- Taq I
Secuenciación
DNA vírico (248 bp)
Grupo molecular IV (vacuna)
RFLP
Sac I- Taq I -Sty I- Ssp I
Gpo molec VI (Bursine 2)
Grupo molecular VI (vvIBDV)
Coinfección Gpo molec IV/VI
REFERENCIAS
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