Download Guia TP 2016 - Departamento de Biodiversidad y Biología

ANATOMÍA VEGETAL
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
Profesor responsable: Dra. Sara Maldonado
Docentes auxiliares: Dr. Fabio Causin, Dr. Hernán Burrieza
Departamento de
Biodiversidad y Biología Experimental
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires.
(2016)
T. P. Nº 1a: La organización del cuerpo de las Plantas Vasculares: Revisión de aspectos
exomorfológicos
Objetivo

Identificar las estructuras básicas que componen el cuerpo de una planta en diferentes
ejemplares y realizar un análisis exomorfológico de las mismas.
Análisis de tallo, hoja o raíz
1. En la hoja, indique:
a. Tipos de hoja
b. Partes de la misma: distal, proximal;
c. Estructura de la lámina
d. Venación de la lámina
e. Filotaxis de los diferentes tipos de hojas
2. En el tallo, indique:
a. Los nudos y entrenudos
b. El tipo de ramificación
c. Si el tallo identificado tiene crecimiento primario o secundario
d. La duración de la vida del tallo
e. Los meristemas apicales del brote
3. En la raíz indique:
a. El tipo de sistema radical
b. Si tiene crecimiento primario o secundario
c. La duración de la vida de la raíz
d. Los meristemas apicales de la raíz
4. Si se identifican modificaciones, y en el caso que existieran indique:
a. Cuál es el órgano o parte del órgano modificado;
b. Si las modificaciones están o no relacionadas con la acumulación de reservas
5. Indique la duración de la vida de la plantas (anual, bianual o plurianual)
6. Si el ejemplar analizado pertenece a las Gimnospermas o a las Angiospermas. Si se trata de
Angiospermas, indique si pertenece a las Monocotiledóneas o a las Dicotiledóneas
T. P. Nº 1b: La organización del cuerpo de las Plantas Vasculares: Sistemas de tejidos, tejidos y
meristemas: caracterización de los tipos celulares que los componen
Objetivos
 Diferenciar los tres sistemas de tejidos (dérmico, fundamental y vascular) en distintos órganos y
caracterizar los tipos celulares presentes en los mismos. Analizar comparativamente las principales
diferencias que presenta una célula meristemática típica del resto de las células observadas.
 En tallos y hojas, reconocer las características generales y distribución de los tres tejidos que
constituyen el sistema fundamental. Especialmente identificar:
a. Los distintos tipos de parénquimas
b. Los diferentes tipos de colénquima de acuerdo a los engrosamientos de las paredes celulares
c. Los tipos celulares del esclerénquima.
 Reconocer algunas de las características de estos tejidos relacionadas con el ambiente de origen de
la especie.
Materiales
Secciones histológicas permanentes, de material incluido en parafina o resina
Secciones delgadas realizadas a mano alzada de material fresco.
Secciones ultrafinas de material incluido en resina de Spurr, montadas en grillas de cobre o níquel y
coloreadas con citrato de plomo y acetato de uranilo (preparados para microscopía electrónica de
transmisión)(*).
(*) Las secciones ultra-finas se estudiarán con el Microscopio Electrónico de Transmisión (MET), en fecha a definir.
Metodología:
Se utilizará:
1.- Microscopía de campo claro y reacciones histoquímicas
2.- Microscopía de fluorescencia
3.- Microscopía electrónica de transmisión y tinciones con metales pesados
Para identificar o detectar características de la pared celular y orgánulos o sustancias específicas, utilizar los
colorantes o reactivos histoquímicos y/o fluorocromos indicados en las tablas anexas al TP. En el caso de
utilizar fluorocromos, el preparado se observará en el microscopio de fluorescencia, cuidando de colocar la
combinación de filtros que corresponda en cada caso.
El estudio de los orgánulos usando la microscopía electrónica de transmisión se llevará a cabo en el MET de
la Facultad de Medina de la UBA.
Actividad práctica:
Caracterización de los tipos celulares presentes en los principales sistemas de tejidos: En los materiales
entregados identificar y representar unas pocas células representativas de los diferentes tejidos, indicando
en cada caso (y donde corresponda) la pared celular (mencionando si es primaria o secundaria), la vacuola,
el citoplasma, las principales orgánulos citoplásmicos observables y el núcleo.
1. Células meristemáticas en ápice de vástago y/o de raíz de Pisum sp., Phaseolus sp. o Arabidopsis
thaliana L.
2. Células de parénquima:
- Células con pigmentos
a) En plástidos:
Clorofila: Célula clorenquimática de mesófilo de hoja de Rhoeo sp.
Carotenos y licopenos: en fruto de Capsicum sp. (“ají”) y raíz de Daucus carota L.
(“zanahoria”)
b) En vacuolas: antocianas y flavonoides en epidermis de Rhoeo sp., betalainas en Beta
vulgaris L. (“remolacha”)
- Células reservantes
a) De almidón en tubérculos caulinares (Solanum tuberosum, “papa”), tubérculos radicales
(Ipomoea batatas “batata”) y endosperma de arroz (Oryza sativa). Para la observación de
amiloplastos utilice tanto la tinción específica con lugol como la observación del preparado sin teñir,
usando luz polarizada. Señale cuáles son la/s característica/s diferencial/es que presentan los
amiloplastos de tejidos seminales respecto de los provenientes de tejidos no seminales.
b) De proteínas y lípidos en cotiledones de Helianthus annus “girasol”, Linum sp. “lino” o en
endosperma de Ricinus communis “ricino”;
c) Células con paredes reservantes de hemicelulosas: Allium cepa L. “cebolla”.
- Células con depósitos cristalinos de oxalato de calcio (drusas, rafidios) y carbonato de calcio (cistolitos).
Ej.: Tilia sp. “tilo” (pecíolo), Rhoeo sp., Tradescantia sp., Ficus sp. “gomero”.
- Células con mucílagos o con taninos: Ej.: Eucalyptus sp. (hoja), Pinus sp., Ginkgo sp. (pecíolo).
- Células de aerénquima (ej. en Cyperaceas)
3. Células de colénquima:
- Angular en Dicliptera sp. ó Solanum sp.
- Laminar en Passiflora sp.
- Lacunar en Tilia sp.
- Anular en vena media de hoja de Nerium oleander (“laurel de jardín”)
4. Células de esclerénquima:
- Esclereidas en: fruto de Pyrus communis L. (“pera”); macroesclereidas y osteoesclereidas en Phaseolus
vulgaris L. (“poroto”) (tegumento de semilla); esclereidas filiformes en hoja de Olea europea (“olivo”);
astroesclereidas en hoja de Camelia sp. o Thea sinensis (“té”).
- Elementos de vaso en Populus sp. (”álamo”) u otro.
- Fibras: septadas en Vitis sp. (“vid”) y libriformes en Salix sp. (“sauce”) o Populus sp. (“álamo”).
5. Células del súber o corcho.
En cortes permanentes de tallo de Tilia sp. (“tilo”).
TABLAS DE REACTIVOS HISTOQUÍMICOS
Microscopía de campo claro
Reactivo
Reacción específica
Color
I2-IK (lugol)
Almidón
azul violáceo
Reacción de PAS (ver página anexa)
Carbohidratos en general
rojo
Rojo Congo
Carmín acético o hematoxilina activada
Celulosa
DNA
rojo
rojo
Safranina
Lignina, cutícula, células parenquimáticas
rojo
Sudan IV o Sudan Black
Lípidos
Vanillina ácida
Taninos
naranja a rojizo; pardo
oscuro, respectivamente
pardo
Tricloruro férrico ácido
Taninos
azul
Fast Green
Paredes primarias
verde azulado
Floroglucinol ácido
Lignina
rojo
Rojo de rutenio
Pectinas, laminilla media en pared celular
rojo
Toluidina (Azul de)
Proteínas (aunque puede reaccionar con otros
compuestos por ser metacromático).
Proteínas
azul
Amido black (negro de amido)
azul oscuro- negro
Procedimiento general para cortes a mano alzada: Salvo se indique lo contrario, teñir con unas gotas del colorante
deseado la muestra por aproximadamente 2 a 5 min., dependiendo del colorante, enjuagar y montar en agua destilada
para su observación.
Determinación de proteínas con amido black (negro de amido)
Preparar una solución de amido black al 1% en ac. acético 7%.
Colocar el tejido fresco en la solución durante 1 min. aprox., enjuagar con ac. acético 7% y luego con agua destilada.
Montar en agua destilada. Los cuerpos proteicos (y toda estructura que tenga proteínas, ej. núcleos, etc.) se tiñen de
azul oscuro.
Microscopía de fluorescencia
Reactivo
Azul de anilina
Azul Nilo
Ioduro de propidio
ANSA
DAPI
Reacción específica
calosa
lípidos
DNA
proteínas
DNA
Excitación (filtro)
UV
azul o verde
azul o verde
UV
UV
Fluorescencia
(color)
azulado
amarillo
rojo
azul
azul
Nota: Longitudes de onda de excitación estándar :
Filtro UV: 330-360 nm; filtro azul: 450-490 nm; filtro verde: 510-560 nm
Bibliografía general de técnicas utilizadas
- Harris N and Oparka K. J. 1994. Plant Cell Biology. A practical approach. Oxford University Press.N.Y.
- Stains File: http://stainsfile.info/StainsFile/jindex.html
T. P. Nº 2: Meristemas primarios
Objetivos:
 Identificar los meristemas primarios en el cuerpo de la planta: meristemas primarios de vástago
(SAM) y raíz (RAM). Reconocer las características citológicas generales de los mismos.
 Reconocer la estructura y organización de los mismos en los grandes grupos taxonómicos de las
Plantas Vasculares.
 En los meristemas apicales, detectar las áreas mitóticamente más activas, los centros quiescentes,
las regiones de células derivadas inmediatas y de células iniciando la diferenciación.
 En plantas con meristemas intercalares, detectar su ubicación y relacionar la morfología de plantas
jóvenes y adultos
Materiales:
 En plantas completas con crecimiento primario (Dicotiledóneas herbáceas y Monocotiledóneas) y
ramas con crecimiento secundario (Dicotiledóneas leñosas) identificar la ubicación de los meristemas
apicales del brote y de la raíz. Contar su número. En el caso de crecimiento intercalar, ubicar la
posición de los meristemas intercalares.
 En preparados permanentes de secciones longitudinales medias de ápices caulinares de
dicotiledóneas: Vicia faba L. (“haba”), Pisum sativum L. (“arveja”) y monocotiledóneas: Euterpe edulis
Martius (“palmito”), reconocer las características de las células meristematicas, de las derivadas
inmediatas, de las que integran los tejidos meristemáticos primarios.
 En preparados permanentes de secciones longitudinales medias de ápices radicales de Allium cepa
L. (“cebolla”) (Monocotiledónea) reconocer las características de las células meristematicas, de las
derivadas inmediatas, de las que integran los tejidos meristemáticos primarios.
 En preparados permanentes de tallo de una gramínea analizar las características de los meristemas
intercalares.
T. P. Nº 3: Epidermis, estomas y tricomas
Objetivos:
 Reconocer los diferentes tipos celulares que constituyen la epidermis madura de las Plantas
Vasculares
 Estudiar el desarrollo de la epidermis foliar en un organismo representativo
 Analizar comparativamente las características de la epidermis madura de hojas de diferentes
especies de Dicotiledóneas, Monocotiledóneas y Gimnospermas a fin de establecer:
o su valor taxonómico
o su valor ecológico teniendo en cuenta el ambiente natural de origen de las especies
seleccionadas.
 Estudiar los principales caracteres de la epidermis de raíces jóvenes.
Materiales y metodología:
1) Estudio de epidermis foliar de Gimnospermas:
Realice un corte transversal de hoja de Araucaria bidwillii Hook. o Agathis sp. (Araucariaceae) y analice
las características de las células epidérmicas y la disposición de los estomas.
Separe un trozo de epidermis abaxial y realice un esquema en vista superficial.
2) Estudio de epidermis foliar de Angiospermas:
a) En Poaceae (Monocotiledóneas)
Analice la epidermis en vista superficial y en corte transversal de hojas frescas de algunas de las
siguientes especies de Gramíneas (Poaceae): Sorghum halepense (L.) Pers. “sorgo de alepo”, Cynodon
sp., Zea mays L.”maíz”o Paspalum sp.
En todos los casos reconozca y represente los diferentes tipos celulares (células silíceas, células de
suber, aguijones, pelos, aparato estomático, etc.) en vista superficial de epidermis y en corte transversal
de hoja.
b) En Dicotiledóneas y Monocotiledóneas no Poaceae:
Analice la epidermis en vista superficial y en corte transversal de hojas frescas de las siguientes especies:
- Lámina de Iris Sp. (Iridaceae)
- Lámina de Brassica oleracea L. “coliflor” (Brassicaceae)
- Lámina de Olea europaea L. “olivo”(Oleaceae),
- Lámina de Mentha sp. (Labiadas)
- Pecíolo de Plectranthus australis R. Brown “dólar” (Labiadas).
En todos los casos reconozca y represente los diferentes tipos celulares (tricomas, aparato estomático,
etc.) en vista superficial de epidermis y en corte transversal de hoja.
c) Indique en cuáles de las especies analizadas la epidermis presentan características asociadas
a la xeromorfía o hidrofilia.
4) Estudio del desarrollo de epidermis foliar
Monte un trozo de epidermis abaxial de hojas jóvenes y adultas de Salpichroa origanifolia o Capsicum
annuum y observe la ontogenia de los estomas.
5) Estudio de epidermis radical
Monte un trozo de raíz joven de Triticum aestivum L. “trigo” que contenga el ápice y observe las
características de las células epidérmicas próximas al mismo y en la zona de los pelos absorbentes.
Observe la posición de los núcleos mediante tinción con DAPI, carmín acético o hematoxilina activada.
T. P. Nº 4: Tejidos vasculares primarios
Objetivos:
 Reconocer las características de los tejidos vasculares primarios, xilema y floema primarios y su
posición en los distintos órganos de Dicotiledóneas y Monocotiledóneas.
 Relacionar la estructura de los tejidos adultos con la del tejido procambial del cual proceden cordones
(tallo) o cilindro (raíz) de procambium en ápices de vástago y raíz observados en TP Nro. 2.
 Estudiar las características de los distintos tipos de células que constituyen estos tejidos,
especialmente las de los elementos conductores del xilema y las del complejo del elemento
criboso/célula acompañante del floema.
Materiales:
 Estudio de desarrollo de haces vasculares en preparados permanentes de cortes longitudinales de
plántulas de Phaseolus sp., Pisum sativum L. o Vicia faba L (vástago: xilema endarco) y raíces de
Phaseolus sp., Pisum sativum L. o Vicia faba L. (xilema exarco).
 Estudio de hacecillos colaterales cerrados en preparados temporarios de CT de hoja de Phormium
sp,, Paspalum sp. o CT de tallo de Cyperus sp. (Monocotiledóneas). Identificar protoxilema,
metaxilema, metafloema y protofloema.
 Estudio de hacecillos bicolaterales:
- Abiertos en preparados temporarios de secciones transversales y longitudinales de tallos de
Cucurbita pepo L. “zapallito” (Dicotiledónea). En estos realizar tinción con azul de anilina para detectar la
presencia de calosa en las placas cribosas de los elementos de tubo criboso del floema, mediante
microscopía de fluorescencia. En las secciones longitudinales, identificar los elementos de vasos de
protoxilema y de metaxilema por las características de las paredes secundarias en los elementos que lo
constituyen. (Tener en cuenta que las paredes celulares de los elementos de vaso, por su contenido de
lignina, autofluorescen con la UV). En las mismas secciones, observar la autofluorescencia de la clorofila
en los cloroplastos del clorénquima
 Estudio de hacecillos céntricos:
- Anfivasales en preparados permanentes de cortes transversales de tallos de Aloe sp.
- Anficribales en preparado permanente de CT de pecíolo de fronde de helecho.
 Estudio de un tallo con cilindro vascular primario en Nicotiana glauca Graham (“palán-palán”) (Solanáceas).
T. P. Nº 5: Meristemas laterales: Cambium y felógeno
Objetivos:
 Estudiar la formación del cambium y del felógeno en tallos de Gimnospermas y Dicotiledóneas
leñosas.
 Analizar el origen y desarrollo de los mismos.
 Estudiar las características de los distintos tipos de células derivadas de ambos meristemas.
Materiales y metodología:
1- Cambium
- Estudiar el desarrollo del cambium en cortes frescos de tallo de Coleus sp. o Bidens sp. e identificar
cambium fascicular e interfascicular. En cortes permanentes de Persea americana Mill. (“palta”),
estudiar el cambium y los tejidos derivados del mismo.
2- Felógeno
- Analizar la formación de peridermis en Tilia sp. (“tilo”).
- Estudiar las características de una peridermis múltiple en capas no concéntricas (ritidoma de tipo
escamoso) en preparados permanentes de Pinus sp. (“pino”), y/o Salix sp. (“sauce”).
- Estudiar las características de una peridermis múltiple en capas concéntricas (ritidoma tipo anular) en
preparados permanentes de Vitis vinífera L. (“vid”).
- Analizar las lenticelas en preparados permanentes de Fraxinus sp. (“fresno”) y cortes frescos de Salix
sp. o Populus sp. (“álamo”).
T. P. Nº 6: Xilema secundario
Objetivos:
 Estudiar las principales características de los tipos celulares que conforman el xilema secundario de
Angiospermas y Gimnospermas.
 Estudiar los tres tipos de cortes histológicos que se utilizan para caracterizar las maderas.
 Reconocer algunas de las características de este tejido relacionadas con: (i) el ambiente de origen y
(ii) el nivel evolutivo de la especie.
Materiales:
 Preparados permanentes de cortes transversal, longitudinal radial y longitudinal tangencial de
diferentes maderas de Gimnospermas y Dicotiledóneas leñosas.
 Material macerado de maderas.
A) En los preparados permanentes analice los caracteres generales de leños o maderas (xilema secundario)
teniendo en cuenta los diferentes cortes y complete el cuadro. En todos los casos indique si se trata del leño
de una Angiosperma o una Gimnosperma
Sistema axial:
1- Tipo de células presentes (traqueidas, elementos de vaso, fibras, fibrotraqueidas, parénquima
vertical).
2- Características de los vasos (si están presentes): Tipo de placa de perforación, relación
diámetro/longitud (cuando sea posible).
3- Ordenamiento de los vasos (si están presentes): porosidad circular (con anillos de crecimiento) o
porosidad difusa.
4- Distribución del parénquima axial: apotraqueal (marginal; bandeado), paratraqueal (aliforme;
confluente), otros.
Sistema radial:
1- Estructura de los radios (uniseriados o multiseriados)
2- Composición de los radios (homocelular o heterocelular)
Los materiales analizados clasificarlos utilizando el siguiente cuadro:
Caracteres considerados/
Preparado 1
Preparado 2
Preparado 3
Materiales
Presencia de anillos de
crecimiento
Elementos Porosidad
de vasos
Placa de
perforación
Puntuaciones
Preparado 4
Distribución del parénquima
vertical (axial)
Radios
Estructura
xilemáticos
Tipos de
células
Otras
características
Nota: Al analizar los elementos de conducción (vasos o traqueidas) observe si hay tílides presentes. Asimismo observe en los leños
de Gimnospermas, si las puntuaciones presentan crásulas, torus u otras particularidades.
B) Analice los macerados de leño de 4 especies que previamente han sido procesadas. En base a los
caracteres de las células identificadas en cada caso, ordénelas en grado creciente de desarrollo evolutivo.
Represente gráficamente aquellos elementos en los que se basó para justificar su respuesta.
T. P. Nº 7: Estructuras secretoras
Objetivos
 Reconocer algunas de las estructuras secretoras presentes en el cuerpo de las Plantas Vasculares
 Identificar las características de los tejidos relacionadas con la función de secreción
Materiales
A) Estructuras secretoras externas
1- Pelos glandulares en diferentes materiales
2- Glándulas:
- Nectarios septales en ovario de Liliáceas (ej. Agapanthus sp. “agapanto”)
- Disco nectarífero floral en Ipomoea sp. (“campanilla”)
- Discos nectaríferos extraflorales en hojas de Prosopis sp. (“algarrobo”)
- Hidátodos en hojas de Passiflora sp. (“pasionaria” o “maracuyá”)
- Osmóforos en diferentes flores que emiten perfumes (identificación exomorfológica con rojo
neutro 1:1000 en H2O; análisis histoquímico: uso de lugol y/o PAS para identificación de almidón en el
tejido secretor de los aceites volátiles)
B) Estructuras secretoras internas
1- Células secretoras: de taninos, de mucílagos, cristales (oxalato de Ca, cabonato de Ca, sílice),
resinas, gomas, aceites, etc., en diversos materiales. Algunos de estos ejemplos se observaron en el
TP 1.
2- Espacios secretores (cavidades y conductos):
o Espacios secretores lisígenos en hoja o epicarpio (pared externa del fruto) de Citrus sp.
o Canales resiníferos en Pinus sp. (“pino”) y de mucílago en Ginkgo biloba o médula de tallo de
Tilia sp.
o Laticíferos:
Articulados en Lactuca sp. (“lechuga”) (Teñir con azul de nilo o fucsina ácida y observar con
microscopio de fluorescencia)
No articulados (ramificados) en Euphorbia sp. (“estrella federal”) o pecíolo de Ficus sp.
(“gomero”)
T. P. Nº 8: Anatomía de raíz
Objetivos:
 Reconocer las características histológicas de los tres sistemas de tejidos (dérmico, vascular y
fundamental) en las raíces de las Plantas Vasculares
 Analizar el origen de las raíces laterales
 Estudiar el desarrollo de las raíces con crecimiento secundario
 Relacionar los caracteres anatómicos de distintas raíces con:
a.- El ambiente de origen de la especie: raíces xeromórficas, raíces aéreas, raíces hidromórficas.
b.- La acumulación de reservas
Materiales y métodos
En preparados temporarios, análisis de los siguientes materiales:
1- Crecimiento primario o secundario en preparados temporarios de raíces de:
- Monocotiledóneas: ej. Zea mays (“maíz”); Agapanthus sp., o Clivia sp.
- Dicotiledóneas: ej. Pisum sativum L.“arveja”, Phaseolus sp.
2- Crecimiento secundario anómalo en raíces de Chenopodium album
3- Raíces reservantes de Daucus carota L. (“zanahoria”)
4- Raíces hidromórficas de Eichornia sp. o Pontederia sp.
5- Raíces de epífitas en Oncidium sp. (“orquídea”).
6- Raíces contráctiles de Clivia sp.
T. P. Nº 9: Anatomía foliar
Objetivos:
 Reconocer las características histológicas de los tres sistemas de tejidos (dérmico, fundamental y
vascular) en hojas de Gimnospermas y Angiospermas.
 Relacionar los caracteres anatómicos de distintas hojas con:
o Las características del ambiente de origen de la especie.
o Mecanismo de fijación de CO2.

Practicar la aplicación técnicas inmunohistoquímicas.
Materiales y métodos
1- Representar esquemáticamente cortes transversales de hojas de:
 Gimnospermas: Araucaria sp. o Pinus sp.
 Angiospermas:
- Dicotiledóneas: Portulaca sp. “verdolaga” (C4)
- Monocotiledóneas:
No gramíneas (C3): ej. Clivia sp., Tripogandra sp., Tradescantia sp., o Cyperus sp.
Gramíneas C3: ej. Phyllostachys sp., Paspalum sp.
Gramíneas C4: ej. Sorghum sp. o Zea sp.
En los cortes, analizar los caracteres sobresalientes de la epidermis (si es uniestratificada o
multiestratificada), presencia de cutícula, engrosamiento diferencial de las paredes, presencia de pelos u
otras estructuras, etc.); presencia o no de hipodermis o de endodermis foliar. Caracterizar el mesófilo,
indicando tipo de organización (dorsiventral, isolateral o kranz) y señalar la presencia de canales secretores,
cristales u otras estructuras particulares. Caracterizar los haces vasculares y la presencia o no de vainas.
Analizar comparativamente la localización del almidón en hojas de plantas C3 y C4.
2- Analizar las principales características de la hoja de una epífita con caracteres xeromórficos (ej.
Tillandsia sp.) y de una planta acuática (ej. Elodea sp.).
3- Estudiar cortes de estructuras modificadas que reemplazan en su función a la lámina foliar:
Observación de C.T. de un filodio de Acacia sp. (pecíolo modificado), y filocladio (tallo modificado) en
Ruscus sp.
4- Diferenciar la localización tisular, celular y subcelular de la enzima RUBISCO en el mesófilo de hojas
de plantas con metabolismo C3 y C4 mediante inmunomarcación de la enzima con anticuerpos específicos
(ver abajo). Se utilizarán cortes ultrafinos (1 μm de espesor) de material fijado en paraformaldehído /
glutaraldehído e incluidos en resina LRWhite Gold. Se utilizaran secciones de las diferentes especies, las
cuales serán montadas en portaobjetos no marcados. La identificación de las especies a las cuales
pertenecen las secciones analizadas, se podrá realizar utilizando la clave dicotómica que abajo se anexa.
5- Inmunomarcación para detectar la RUBISCO
1er. día
1. Lavar con buffer fosfato salino + Tween 20 (PBST) pH 7.4 ( 3 lavados de 150 µL x 3 min. c/u).
Remover el líquido colocando el portaobjeto vertical sobre un papel absorbente.
2. Bloqueo: cubrir los cortes con PBST + BSA 1% (aprox. 150 µL). Dejar 1 hora a temperatura
ambiente en un recipiente cerrado ( por ejemplo en una caja de petri)
3. Remover como en el paso 1
4. Lavar con PBST + BSA 0.1 % (3 lavados de 150 µL x 5 min. c/u)
5. Incubación con anticuerpo 1º (anti-RUBISCO, preparado en PBST + BSA 0.1% , dilución 1:200):
Cubrir los cortes totalmente con esta solución (aprox. 100 µL), colocar una película de parafilm y
dejarlos toda la noche en cámara húmeda en heladera. Atención!: Para las placas control la
incubación se hace solo con TBST + BSA 0.1% (v.g. sin anticuerpo primario)
2º día
1. Lavar con PBST + BSA 0.1 % (3 lavados 150 µL x 5 min c/u)
2. Incubación con anticuerpo 2º (preparado en PBST + BSA 0.1%, dilución 1:200): Cubrir totalmente
las secciones de tejido (aprox. 100 µL), colocar parafilm y dejar los portas 1 hora a temp. ambiente en
un recipiente cerrado como en el paso 5.
3. Lavar con 150 µL PBST + BSA 0.1 % ( 5 lavados x 3 min)
4. Fijar con 150 µL Glutaraldehído 2,5% en buffer fosfato 0.1 M PH 7.2 durante 15 min.
5. Lavar con agua bidestilada (2 lavados x 5 min. c/u)
6. Colocar en agua mq o bidestilada en un Coplin y dejar los “portas” sumergidos mientras se preparan
los reactivos para revelar.
Revelado
1- Mezclar volúmenes iguales de las soluciones A y B Sigma Silver Enhancer. Tener mucho cuidado de
no intercambiar las tapas de las botellas para no contaminar las soluciones. No usar pinzas de metal
para tomar los portaobjetos porque los metales pesados catalizan la reacción de precipitación de la
plata
2- Remover el agua del tejido
3- Agregar suficiente Silver Enhancer como para cubrir el espécimen (100 µL). Monitorear la reacción
con el microscopio. Detenerla cuando se logra la intensidad deseada (aprox. 4-5 min). Para esto se
remueve la solución como en los pasos anteriores y rápidamente se agrega agua bidestilada.
4- Se coloca el portaobjetos en un Coplin con agua bidestilada por lo menos media hora haciendo un
cambio a los 15 minutos.
5- Fijar sumergiendo la solución en una solución acuosa de tiosulfato de sodio (2.5%)
por 2-3 min. No dejar en el fijador más de 5 minutos. Este paso puede ser realizado al día
siguiente. En tal caso los preparados se dejarán en el Coplin, en heladera, con agua bidestilada.
6- Lavar con agua destilada, contrastar con 100 µL azul de metileno (1 min) y enjuagar.
7- Montar los cortes.
IMPORTANTE: En ningún momento las secciones deben secarse.
Clave dicotómica para identificación del material inmunomarcado:
1. RUBISCO se detecta en las células del mesófilo:
Hordeum vulgare L. (“cebada”)
2. RUBISCO se detecta sólo en los cloroplastos de las células de la vaina
(i) Cloroplastos se disponen de forma centrípeta respecto del haz vascular:
(ii) Cloroplastos se disponen de forma centrífuga respecto del haz vascular:
Portulacca sp.
Zea mays L. (“maíz”)
T. P. Nº 10: Anatomía del Tallo
Objetivos:
 Estudiar comparativamente la estructura primaria de tallos de especies pertenecientes a distintos
grupos taxonómicos, con especial énfasis en la disposición del tejido vascular (tipo de estela).
 Reconocer los distintos tejidos que componen el tallo.
 Interpretar el desarrollo del tejido vascular en relación con la formación de hojas.Comparar la
estructura nodal y la intermodal de los tallos. Reconocer algunas características histológicas
relacionadas con el ambiente de origen de la especie.
 Estudiar el crecimiento secundario normal y anómalo en Dicotiledóneas y Gimnospermas.
 Estudiar algunos ejemplos de crecimiento secundario en Monocotiledóneas.
Materiales y métodos:
1- Estudio de la organización del tejido vascular en la estructura primaria de tallos con distintos tipos de
estelas:
A) Tallos con protostelas
 Preparados permanentes de secciones transversales de tallos de Psilotum sp. y Lycopodium sp.
 Preparados temporarios de secciones de tallo de Elodea sp. (Dicotiledóneas, hidrófita)
B) Tallos con otro tipo de estelas
 Preparados temporarios de secciones de tallos con crecimiento primario en:
- Monocotiledóneas (ej. atactostela en Sorghum sp.).
- Dicotiledóneas (ej. eustela en Medicago sativa (“alfalfa”); sifonostela ectofloica en Vigna sp.;
sifonostela anfifloica en Solanum sp.)
2- Estudio de anatomía nodal:
Unilacunar en Nicotiana glauca “palán-palán; en Pinus sp.
Trilacunar en Pelargonium sp. “malvón”, o Medicago sativa L. “alfalfa”)
Multilacunar
Relacionado con la vaina: en Sorghum sp., o Tradescantia sp.
Relacionado con la ócrea: en Polygonum sp.)
3- Estudio de crecimiento secundario anómalo en:
Bahuinia sp. “pezuña de vaca”
Chenopodium sp.
4- Estudio de crecimiento secundario en Monocotiledóneas: en Aloe sp.
5- Tallo modificado: Estudio de anatomía de cladodio en Homalocladium platicladum “tenia”.
T. P. Nº 11: Utilización de ESEM
Objetivos:
 Estudio de la estructura de tallos, hojas y raíces usando el Micoscopio Electrónico de Barrido en su
modo ambiental (ESEM = Enviromental Scanning Electron Microscope)
 Identificar la composición de elementos químicos en depósitos cristalinos encontrados en los tejidos
analizados usando EDAX (Energy Dispersive X-Ray Analysis)
Materiales
1- Análisis de cortes de tallo de Pilea sp., Tripogandra sp. y Begonia sp. Análisis EDAX de drusas,
rafidios y cistolitos.
2- Análisis de epidermis de hoja de gramínea, en vista superficial. Análisis EDAX de cuerpos silíceos
3- Análisis de endosperma de semilla de Ricinus sp. Análisis EDAX de globoides incluidos en los
cuerpos proteicos