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ANATOMÍA VEGETAL GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS Profesor responsable: Dra. Sara Maldonado Docentes auxiliares: Dr. Fabio Causin, Dr. Hernán Burrieza Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires. (2016) T. P. Nº 1a: La organización del cuerpo de las Plantas Vasculares: Revisión de aspectos exomorfológicos Objetivo Identificar las estructuras básicas que componen el cuerpo de una planta en diferentes ejemplares y realizar un análisis exomorfológico de las mismas. Análisis de tallo, hoja o raíz 1. En la hoja, indique: a. Tipos de hoja b. Partes de la misma: distal, proximal; c. Estructura de la lámina d. Venación de la lámina e. Filotaxis de los diferentes tipos de hojas 2. En el tallo, indique: a. Los nudos y entrenudos b. El tipo de ramificación c. Si el tallo identificado tiene crecimiento primario o secundario d. La duración de la vida del tallo e. Los meristemas apicales del brote 3. En la raíz indique: a. El tipo de sistema radical b. Si tiene crecimiento primario o secundario c. La duración de la vida de la raíz d. Los meristemas apicales de la raíz 4. Si se identifican modificaciones, y en el caso que existieran indique: a. Cuál es el órgano o parte del órgano modificado; b. Si las modificaciones están o no relacionadas con la acumulación de reservas 5. Indique la duración de la vida de la plantas (anual, bianual o plurianual) 6. Si el ejemplar analizado pertenece a las Gimnospermas o a las Angiospermas. Si se trata de Angiospermas, indique si pertenece a las Monocotiledóneas o a las Dicotiledóneas T. P. Nº 1b: La organización del cuerpo de las Plantas Vasculares: Sistemas de tejidos, tejidos y meristemas: caracterización de los tipos celulares que los componen Objetivos Diferenciar los tres sistemas de tejidos (dérmico, fundamental y vascular) en distintos órganos y caracterizar los tipos celulares presentes en los mismos. Analizar comparativamente las principales diferencias que presenta una célula meristemática típica del resto de las células observadas. En tallos y hojas, reconocer las características generales y distribución de los tres tejidos que constituyen el sistema fundamental. Especialmente identificar: a. Los distintos tipos de parénquimas b. Los diferentes tipos de colénquima de acuerdo a los engrosamientos de las paredes celulares c. Los tipos celulares del esclerénquima. Reconocer algunas de las características de estos tejidos relacionadas con el ambiente de origen de la especie. Materiales Secciones histológicas permanentes, de material incluido en parafina o resina Secciones delgadas realizadas a mano alzada de material fresco. Secciones ultrafinas de material incluido en resina de Spurr, montadas en grillas de cobre o níquel y coloreadas con citrato de plomo y acetato de uranilo (preparados para microscopía electrónica de transmisión)(*). (*) Las secciones ultra-finas se estudiarán con el Microscopio Electrónico de Transmisión (MET), en fecha a definir. Metodología: Se utilizará: 1.- Microscopía de campo claro y reacciones histoquímicas 2.- Microscopía de fluorescencia 3.- Microscopía electrónica de transmisión y tinciones con metales pesados Para identificar o detectar características de la pared celular y orgánulos o sustancias específicas, utilizar los colorantes o reactivos histoquímicos y/o fluorocromos indicados en las tablas anexas al TP. En el caso de utilizar fluorocromos, el preparado se observará en el microscopio de fluorescencia, cuidando de colocar la combinación de filtros que corresponda en cada caso. El estudio de los orgánulos usando la microscopía electrónica de transmisión se llevará a cabo en el MET de la Facultad de Medina de la UBA. Actividad práctica: Caracterización de los tipos celulares presentes en los principales sistemas de tejidos: En los materiales entregados identificar y representar unas pocas células representativas de los diferentes tejidos, indicando en cada caso (y donde corresponda) la pared celular (mencionando si es primaria o secundaria), la vacuola, el citoplasma, las principales orgánulos citoplásmicos observables y el núcleo. 1. Células meristemáticas en ápice de vástago y/o de raíz de Pisum sp., Phaseolus sp. o Arabidopsis thaliana L. 2. Células de parénquima: - Células con pigmentos a) En plástidos: Clorofila: Célula clorenquimática de mesófilo de hoja de Rhoeo sp. Carotenos y licopenos: en fruto de Capsicum sp. (“ají”) y raíz de Daucus carota L. (“zanahoria”) b) En vacuolas: antocianas y flavonoides en epidermis de Rhoeo sp., betalainas en Beta vulgaris L. (“remolacha”) - Células reservantes a) De almidón en tubérculos caulinares (Solanum tuberosum, “papa”), tubérculos radicales (Ipomoea batatas “batata”) y endosperma de arroz (Oryza sativa). Para la observación de amiloplastos utilice tanto la tinción específica con lugol como la observación del preparado sin teñir, usando luz polarizada. Señale cuáles son la/s característica/s diferencial/es que presentan los amiloplastos de tejidos seminales respecto de los provenientes de tejidos no seminales. b) De proteínas y lípidos en cotiledones de Helianthus annus “girasol”, Linum sp. “lino” o en endosperma de Ricinus communis “ricino”; c) Células con paredes reservantes de hemicelulosas: Allium cepa L. “cebolla”. - Células con depósitos cristalinos de oxalato de calcio (drusas, rafidios) y carbonato de calcio (cistolitos). Ej.: Tilia sp. “tilo” (pecíolo), Rhoeo sp., Tradescantia sp., Ficus sp. “gomero”. - Células con mucílagos o con taninos: Ej.: Eucalyptus sp. (hoja), Pinus sp., Ginkgo sp. (pecíolo). - Células de aerénquima (ej. en Cyperaceas) 3. Células de colénquima: - Angular en Dicliptera sp. ó Solanum sp. - Laminar en Passiflora sp. - Lacunar en Tilia sp. - Anular en vena media de hoja de Nerium oleander (“laurel de jardín”) 4. Células de esclerénquima: - Esclereidas en: fruto de Pyrus communis L. (“pera”); macroesclereidas y osteoesclereidas en Phaseolus vulgaris L. (“poroto”) (tegumento de semilla); esclereidas filiformes en hoja de Olea europea (“olivo”); astroesclereidas en hoja de Camelia sp. o Thea sinensis (“té”). - Elementos de vaso en Populus sp. (”álamo”) u otro. - Fibras: septadas en Vitis sp. (“vid”) y libriformes en Salix sp. (“sauce”) o Populus sp. (“álamo”). 5. Células del súber o corcho. En cortes permanentes de tallo de Tilia sp. (“tilo”). TABLAS DE REACTIVOS HISTOQUÍMICOS Microscopía de campo claro Reactivo Reacción específica Color I2-IK (lugol) Almidón azul violáceo Reacción de PAS (ver página anexa) Carbohidratos en general rojo Rojo Congo Carmín acético o hematoxilina activada Celulosa DNA rojo rojo Safranina Lignina, cutícula, células parenquimáticas rojo Sudan IV o Sudan Black Lípidos Vanillina ácida Taninos naranja a rojizo; pardo oscuro, respectivamente pardo Tricloruro férrico ácido Taninos azul Fast Green Paredes primarias verde azulado Floroglucinol ácido Lignina rojo Rojo de rutenio Pectinas, laminilla media en pared celular rojo Toluidina (Azul de) Proteínas (aunque puede reaccionar con otros compuestos por ser metacromático). Proteínas azul Amido black (negro de amido) azul oscuro- negro Procedimiento general para cortes a mano alzada: Salvo se indique lo contrario, teñir con unas gotas del colorante deseado la muestra por aproximadamente 2 a 5 min., dependiendo del colorante, enjuagar y montar en agua destilada para su observación. Determinación de proteínas con amido black (negro de amido) Preparar una solución de amido black al 1% en ac. acético 7%. Colocar el tejido fresco en la solución durante 1 min. aprox., enjuagar con ac. acético 7% y luego con agua destilada. Montar en agua destilada. Los cuerpos proteicos (y toda estructura que tenga proteínas, ej. núcleos, etc.) se tiñen de azul oscuro. Microscopía de fluorescencia Reactivo Azul de anilina Azul Nilo Ioduro de propidio ANSA DAPI Reacción específica calosa lípidos DNA proteínas DNA Excitación (filtro) UV azul o verde azul o verde UV UV Fluorescencia (color) azulado amarillo rojo azul azul Nota: Longitudes de onda de excitación estándar : Filtro UV: 330-360 nm; filtro azul: 450-490 nm; filtro verde: 510-560 nm Bibliografía general de técnicas utilizadas - Harris N and Oparka K. J. 1994. Plant Cell Biology. A practical approach. Oxford University Press.N.Y. - Stains File: http://stainsfile.info/StainsFile/jindex.html T. P. Nº 2: Meristemas primarios Objetivos: Identificar los meristemas primarios en el cuerpo de la planta: meristemas primarios de vástago (SAM) y raíz (RAM). Reconocer las características citológicas generales de los mismos. Reconocer la estructura y organización de los mismos en los grandes grupos taxonómicos de las Plantas Vasculares. En los meristemas apicales, detectar las áreas mitóticamente más activas, los centros quiescentes, las regiones de células derivadas inmediatas y de células iniciando la diferenciación. En plantas con meristemas intercalares, detectar su ubicación y relacionar la morfología de plantas jóvenes y adultos Materiales: En plantas completas con crecimiento primario (Dicotiledóneas herbáceas y Monocotiledóneas) y ramas con crecimiento secundario (Dicotiledóneas leñosas) identificar la ubicación de los meristemas apicales del brote y de la raíz. Contar su número. En el caso de crecimiento intercalar, ubicar la posición de los meristemas intercalares. En preparados permanentes de secciones longitudinales medias de ápices caulinares de dicotiledóneas: Vicia faba L. (“haba”), Pisum sativum L. (“arveja”) y monocotiledóneas: Euterpe edulis Martius (“palmito”), reconocer las características de las células meristematicas, de las derivadas inmediatas, de las que integran los tejidos meristemáticos primarios. En preparados permanentes de secciones longitudinales medias de ápices radicales de Allium cepa L. (“cebolla”) (Monocotiledónea) reconocer las características de las células meristematicas, de las derivadas inmediatas, de las que integran los tejidos meristemáticos primarios. En preparados permanentes de tallo de una gramínea analizar las características de los meristemas intercalares. T. P. Nº 3: Epidermis, estomas y tricomas Objetivos: Reconocer los diferentes tipos celulares que constituyen la epidermis madura de las Plantas Vasculares Estudiar el desarrollo de la epidermis foliar en un organismo representativo Analizar comparativamente las características de la epidermis madura de hojas de diferentes especies de Dicotiledóneas, Monocotiledóneas y Gimnospermas a fin de establecer: o su valor taxonómico o su valor ecológico teniendo en cuenta el ambiente natural de origen de las especies seleccionadas. Estudiar los principales caracteres de la epidermis de raíces jóvenes. Materiales y metodología: 1) Estudio de epidermis foliar de Gimnospermas: Realice un corte transversal de hoja de Araucaria bidwillii Hook. o Agathis sp. (Araucariaceae) y analice las características de las células epidérmicas y la disposición de los estomas. Separe un trozo de epidermis abaxial y realice un esquema en vista superficial. 2) Estudio de epidermis foliar de Angiospermas: a) En Poaceae (Monocotiledóneas) Analice la epidermis en vista superficial y en corte transversal de hojas frescas de algunas de las siguientes especies de Gramíneas (Poaceae): Sorghum halepense (L.) Pers. “sorgo de alepo”, Cynodon sp., Zea mays L.”maíz”o Paspalum sp. En todos los casos reconozca y represente los diferentes tipos celulares (células silíceas, células de suber, aguijones, pelos, aparato estomático, etc.) en vista superficial de epidermis y en corte transversal de hoja. b) En Dicotiledóneas y Monocotiledóneas no Poaceae: Analice la epidermis en vista superficial y en corte transversal de hojas frescas de las siguientes especies: - Lámina de Iris Sp. (Iridaceae) - Lámina de Brassica oleracea L. “coliflor” (Brassicaceae) - Lámina de Olea europaea L. “olivo”(Oleaceae), - Lámina de Mentha sp. (Labiadas) - Pecíolo de Plectranthus australis R. Brown “dólar” (Labiadas). En todos los casos reconozca y represente los diferentes tipos celulares (tricomas, aparato estomático, etc.) en vista superficial de epidermis y en corte transversal de hoja. c) Indique en cuáles de las especies analizadas la epidermis presentan características asociadas a la xeromorfía o hidrofilia. 4) Estudio del desarrollo de epidermis foliar Monte un trozo de epidermis abaxial de hojas jóvenes y adultas de Salpichroa origanifolia o Capsicum annuum y observe la ontogenia de los estomas. 5) Estudio de epidermis radical Monte un trozo de raíz joven de Triticum aestivum L. “trigo” que contenga el ápice y observe las características de las células epidérmicas próximas al mismo y en la zona de los pelos absorbentes. Observe la posición de los núcleos mediante tinción con DAPI, carmín acético o hematoxilina activada. T. P. Nº 4: Tejidos vasculares primarios Objetivos: Reconocer las características de los tejidos vasculares primarios, xilema y floema primarios y su posición en los distintos órganos de Dicotiledóneas y Monocotiledóneas. Relacionar la estructura de los tejidos adultos con la del tejido procambial del cual proceden cordones (tallo) o cilindro (raíz) de procambium en ápices de vástago y raíz observados en TP Nro. 2. Estudiar las características de los distintos tipos de células que constituyen estos tejidos, especialmente las de los elementos conductores del xilema y las del complejo del elemento criboso/célula acompañante del floema. Materiales: Estudio de desarrollo de haces vasculares en preparados permanentes de cortes longitudinales de plántulas de Phaseolus sp., Pisum sativum L. o Vicia faba L (vástago: xilema endarco) y raíces de Phaseolus sp., Pisum sativum L. o Vicia faba L. (xilema exarco). Estudio de hacecillos colaterales cerrados en preparados temporarios de CT de hoja de Phormium sp,, Paspalum sp. o CT de tallo de Cyperus sp. (Monocotiledóneas). Identificar protoxilema, metaxilema, metafloema y protofloema. Estudio de hacecillos bicolaterales: - Abiertos en preparados temporarios de secciones transversales y longitudinales de tallos de Cucurbita pepo L. “zapallito” (Dicotiledónea). En estos realizar tinción con azul de anilina para detectar la presencia de calosa en las placas cribosas de los elementos de tubo criboso del floema, mediante microscopía de fluorescencia. En las secciones longitudinales, identificar los elementos de vasos de protoxilema y de metaxilema por las características de las paredes secundarias en los elementos que lo constituyen. (Tener en cuenta que las paredes celulares de los elementos de vaso, por su contenido de lignina, autofluorescen con la UV). En las mismas secciones, observar la autofluorescencia de la clorofila en los cloroplastos del clorénquima Estudio de hacecillos céntricos: - Anfivasales en preparados permanentes de cortes transversales de tallos de Aloe sp. - Anficribales en preparado permanente de CT de pecíolo de fronde de helecho. Estudio de un tallo con cilindro vascular primario en Nicotiana glauca Graham (“palán-palán”) (Solanáceas). T. P. Nº 5: Meristemas laterales: Cambium y felógeno Objetivos: Estudiar la formación del cambium y del felógeno en tallos de Gimnospermas y Dicotiledóneas leñosas. Analizar el origen y desarrollo de los mismos. Estudiar las características de los distintos tipos de células derivadas de ambos meristemas. Materiales y metodología: 1- Cambium - Estudiar el desarrollo del cambium en cortes frescos de tallo de Coleus sp. o Bidens sp. e identificar cambium fascicular e interfascicular. En cortes permanentes de Persea americana Mill. (“palta”), estudiar el cambium y los tejidos derivados del mismo. 2- Felógeno - Analizar la formación de peridermis en Tilia sp. (“tilo”). - Estudiar las características de una peridermis múltiple en capas no concéntricas (ritidoma de tipo escamoso) en preparados permanentes de Pinus sp. (“pino”), y/o Salix sp. (“sauce”). - Estudiar las características de una peridermis múltiple en capas concéntricas (ritidoma tipo anular) en preparados permanentes de Vitis vinífera L. (“vid”). - Analizar las lenticelas en preparados permanentes de Fraxinus sp. (“fresno”) y cortes frescos de Salix sp. o Populus sp. (“álamo”). T. P. Nº 6: Xilema secundario Objetivos: Estudiar las principales características de los tipos celulares que conforman el xilema secundario de Angiospermas y Gimnospermas. Estudiar los tres tipos de cortes histológicos que se utilizan para caracterizar las maderas. Reconocer algunas de las características de este tejido relacionadas con: (i) el ambiente de origen y (ii) el nivel evolutivo de la especie. Materiales: Preparados permanentes de cortes transversal, longitudinal radial y longitudinal tangencial de diferentes maderas de Gimnospermas y Dicotiledóneas leñosas. Material macerado de maderas. A) En los preparados permanentes analice los caracteres generales de leños o maderas (xilema secundario) teniendo en cuenta los diferentes cortes y complete el cuadro. En todos los casos indique si se trata del leño de una Angiosperma o una Gimnosperma Sistema axial: 1- Tipo de células presentes (traqueidas, elementos de vaso, fibras, fibrotraqueidas, parénquima vertical). 2- Características de los vasos (si están presentes): Tipo de placa de perforación, relación diámetro/longitud (cuando sea posible). 3- Ordenamiento de los vasos (si están presentes): porosidad circular (con anillos de crecimiento) o porosidad difusa. 4- Distribución del parénquima axial: apotraqueal (marginal; bandeado), paratraqueal (aliforme; confluente), otros. Sistema radial: 1- Estructura de los radios (uniseriados o multiseriados) 2- Composición de los radios (homocelular o heterocelular) Los materiales analizados clasificarlos utilizando el siguiente cuadro: Caracteres considerados/ Preparado 1 Preparado 2 Preparado 3 Materiales Presencia de anillos de crecimiento Elementos Porosidad de vasos Placa de perforación Puntuaciones Preparado 4 Distribución del parénquima vertical (axial) Radios Estructura xilemáticos Tipos de células Otras características Nota: Al analizar los elementos de conducción (vasos o traqueidas) observe si hay tílides presentes. Asimismo observe en los leños de Gimnospermas, si las puntuaciones presentan crásulas, torus u otras particularidades. B) Analice los macerados de leño de 4 especies que previamente han sido procesadas. En base a los caracteres de las células identificadas en cada caso, ordénelas en grado creciente de desarrollo evolutivo. Represente gráficamente aquellos elementos en los que se basó para justificar su respuesta. T. P. Nº 7: Estructuras secretoras Objetivos Reconocer algunas de las estructuras secretoras presentes en el cuerpo de las Plantas Vasculares Identificar las características de los tejidos relacionadas con la función de secreción Materiales A) Estructuras secretoras externas 1- Pelos glandulares en diferentes materiales 2- Glándulas: - Nectarios septales en ovario de Liliáceas (ej. Agapanthus sp. “agapanto”) - Disco nectarífero floral en Ipomoea sp. (“campanilla”) - Discos nectaríferos extraflorales en hojas de Prosopis sp. (“algarrobo”) - Hidátodos en hojas de Passiflora sp. (“pasionaria” o “maracuyá”) - Osmóforos en diferentes flores que emiten perfumes (identificación exomorfológica con rojo neutro 1:1000 en H2O; análisis histoquímico: uso de lugol y/o PAS para identificación de almidón en el tejido secretor de los aceites volátiles) B) Estructuras secretoras internas 1- Células secretoras: de taninos, de mucílagos, cristales (oxalato de Ca, cabonato de Ca, sílice), resinas, gomas, aceites, etc., en diversos materiales. Algunos de estos ejemplos se observaron en el TP 1. 2- Espacios secretores (cavidades y conductos): o Espacios secretores lisígenos en hoja o epicarpio (pared externa del fruto) de Citrus sp. o Canales resiníferos en Pinus sp. (“pino”) y de mucílago en Ginkgo biloba o médula de tallo de Tilia sp. o Laticíferos: Articulados en Lactuca sp. (“lechuga”) (Teñir con azul de nilo o fucsina ácida y observar con microscopio de fluorescencia) No articulados (ramificados) en Euphorbia sp. (“estrella federal”) o pecíolo de Ficus sp. (“gomero”) T. P. Nº 8: Anatomía de raíz Objetivos: Reconocer las características histológicas de los tres sistemas de tejidos (dérmico, vascular y fundamental) en las raíces de las Plantas Vasculares Analizar el origen de las raíces laterales Estudiar el desarrollo de las raíces con crecimiento secundario Relacionar los caracteres anatómicos de distintas raíces con: a.- El ambiente de origen de la especie: raíces xeromórficas, raíces aéreas, raíces hidromórficas. b.- La acumulación de reservas Materiales y métodos En preparados temporarios, análisis de los siguientes materiales: 1- Crecimiento primario o secundario en preparados temporarios de raíces de: - Monocotiledóneas: ej. Zea mays (“maíz”); Agapanthus sp., o Clivia sp. - Dicotiledóneas: ej. Pisum sativum L.“arveja”, Phaseolus sp. 2- Crecimiento secundario anómalo en raíces de Chenopodium album 3- Raíces reservantes de Daucus carota L. (“zanahoria”) 4- Raíces hidromórficas de Eichornia sp. o Pontederia sp. 5- Raíces de epífitas en Oncidium sp. (“orquídea”). 6- Raíces contráctiles de Clivia sp. T. P. Nº 9: Anatomía foliar Objetivos: Reconocer las características histológicas de los tres sistemas de tejidos (dérmico, fundamental y vascular) en hojas de Gimnospermas y Angiospermas. Relacionar los caracteres anatómicos de distintas hojas con: o Las características del ambiente de origen de la especie. o Mecanismo de fijación de CO2. Practicar la aplicación técnicas inmunohistoquímicas. Materiales y métodos 1- Representar esquemáticamente cortes transversales de hojas de: Gimnospermas: Araucaria sp. o Pinus sp. Angiospermas: - Dicotiledóneas: Portulaca sp. “verdolaga” (C4) - Monocotiledóneas: No gramíneas (C3): ej. Clivia sp., Tripogandra sp., Tradescantia sp., o Cyperus sp. Gramíneas C3: ej. Phyllostachys sp., Paspalum sp. Gramíneas C4: ej. Sorghum sp. o Zea sp. En los cortes, analizar los caracteres sobresalientes de la epidermis (si es uniestratificada o multiestratificada), presencia de cutícula, engrosamiento diferencial de las paredes, presencia de pelos u otras estructuras, etc.); presencia o no de hipodermis o de endodermis foliar. Caracterizar el mesófilo, indicando tipo de organización (dorsiventral, isolateral o kranz) y señalar la presencia de canales secretores, cristales u otras estructuras particulares. Caracterizar los haces vasculares y la presencia o no de vainas. Analizar comparativamente la localización del almidón en hojas de plantas C3 y C4. 2- Analizar las principales características de la hoja de una epífita con caracteres xeromórficos (ej. Tillandsia sp.) y de una planta acuática (ej. Elodea sp.). 3- Estudiar cortes de estructuras modificadas que reemplazan en su función a la lámina foliar: Observación de C.T. de un filodio de Acacia sp. (pecíolo modificado), y filocladio (tallo modificado) en Ruscus sp. 4- Diferenciar la localización tisular, celular y subcelular de la enzima RUBISCO en el mesófilo de hojas de plantas con metabolismo C3 y C4 mediante inmunomarcación de la enzima con anticuerpos específicos (ver abajo). Se utilizarán cortes ultrafinos (1 μm de espesor) de material fijado en paraformaldehído / glutaraldehído e incluidos en resina LRWhite Gold. Se utilizaran secciones de las diferentes especies, las cuales serán montadas en portaobjetos no marcados. La identificación de las especies a las cuales pertenecen las secciones analizadas, se podrá realizar utilizando la clave dicotómica que abajo se anexa. 5- Inmunomarcación para detectar la RUBISCO 1er. día 1. Lavar con buffer fosfato salino + Tween 20 (PBST) pH 7.4 ( 3 lavados de 150 µL x 3 min. c/u). Remover el líquido colocando el portaobjeto vertical sobre un papel absorbente. 2. Bloqueo: cubrir los cortes con PBST + BSA 1% (aprox. 150 µL). Dejar 1 hora a temperatura ambiente en un recipiente cerrado ( por ejemplo en una caja de petri) 3. Remover como en el paso 1 4. Lavar con PBST + BSA 0.1 % (3 lavados de 150 µL x 5 min. c/u) 5. Incubación con anticuerpo 1º (anti-RUBISCO, preparado en PBST + BSA 0.1% , dilución 1:200): Cubrir los cortes totalmente con esta solución (aprox. 100 µL), colocar una película de parafilm y dejarlos toda la noche en cámara húmeda en heladera. Atención!: Para las placas control la incubación se hace solo con TBST + BSA 0.1% (v.g. sin anticuerpo primario) 2º día 1. Lavar con PBST + BSA 0.1 % (3 lavados 150 µL x 5 min c/u) 2. Incubación con anticuerpo 2º (preparado en PBST + BSA 0.1%, dilución 1:200): Cubrir totalmente las secciones de tejido (aprox. 100 µL), colocar parafilm y dejar los portas 1 hora a temp. ambiente en un recipiente cerrado como en el paso 5. 3. Lavar con 150 µL PBST + BSA 0.1 % ( 5 lavados x 3 min) 4. Fijar con 150 µL Glutaraldehído 2,5% en buffer fosfato 0.1 M PH 7.2 durante 15 min. 5. Lavar con agua bidestilada (2 lavados x 5 min. c/u) 6. Colocar en agua mq o bidestilada en un Coplin y dejar los “portas” sumergidos mientras se preparan los reactivos para revelar. Revelado 1- Mezclar volúmenes iguales de las soluciones A y B Sigma Silver Enhancer. Tener mucho cuidado de no intercambiar las tapas de las botellas para no contaminar las soluciones. No usar pinzas de metal para tomar los portaobjetos porque los metales pesados catalizan la reacción de precipitación de la plata 2- Remover el agua del tejido 3- Agregar suficiente Silver Enhancer como para cubrir el espécimen (100 µL). Monitorear la reacción con el microscopio. Detenerla cuando se logra la intensidad deseada (aprox. 4-5 min). Para esto se remueve la solución como en los pasos anteriores y rápidamente se agrega agua bidestilada. 4- Se coloca el portaobjetos en un Coplin con agua bidestilada por lo menos media hora haciendo un cambio a los 15 minutos. 5- Fijar sumergiendo la solución en una solución acuosa de tiosulfato de sodio (2.5%) por 2-3 min. No dejar en el fijador más de 5 minutos. Este paso puede ser realizado al día siguiente. En tal caso los preparados se dejarán en el Coplin, en heladera, con agua bidestilada. 6- Lavar con agua destilada, contrastar con 100 µL azul de metileno (1 min) y enjuagar. 7- Montar los cortes. IMPORTANTE: En ningún momento las secciones deben secarse. Clave dicotómica para identificación del material inmunomarcado: 1. RUBISCO se detecta en las células del mesófilo: Hordeum vulgare L. (“cebada”) 2. RUBISCO se detecta sólo en los cloroplastos de las células de la vaina (i) Cloroplastos se disponen de forma centrípeta respecto del haz vascular: (ii) Cloroplastos se disponen de forma centrífuga respecto del haz vascular: Portulacca sp. Zea mays L. (“maíz”) T. P. Nº 10: Anatomía del Tallo Objetivos: Estudiar comparativamente la estructura primaria de tallos de especies pertenecientes a distintos grupos taxonómicos, con especial énfasis en la disposición del tejido vascular (tipo de estela). Reconocer los distintos tejidos que componen el tallo. Interpretar el desarrollo del tejido vascular en relación con la formación de hojas.Comparar la estructura nodal y la intermodal de los tallos. Reconocer algunas características histológicas relacionadas con el ambiente de origen de la especie. Estudiar el crecimiento secundario normal y anómalo en Dicotiledóneas y Gimnospermas. Estudiar algunos ejemplos de crecimiento secundario en Monocotiledóneas. Materiales y métodos: 1- Estudio de la organización del tejido vascular en la estructura primaria de tallos con distintos tipos de estelas: A) Tallos con protostelas Preparados permanentes de secciones transversales de tallos de Psilotum sp. y Lycopodium sp. Preparados temporarios de secciones de tallo de Elodea sp. (Dicotiledóneas, hidrófita) B) Tallos con otro tipo de estelas Preparados temporarios de secciones de tallos con crecimiento primario en: - Monocotiledóneas (ej. atactostela en Sorghum sp.). - Dicotiledóneas (ej. eustela en Medicago sativa (“alfalfa”); sifonostela ectofloica en Vigna sp.; sifonostela anfifloica en Solanum sp.) 2- Estudio de anatomía nodal: Unilacunar en Nicotiana glauca “palán-palán; en Pinus sp. Trilacunar en Pelargonium sp. “malvón”, o Medicago sativa L. “alfalfa”) Multilacunar Relacionado con la vaina: en Sorghum sp., o Tradescantia sp. Relacionado con la ócrea: en Polygonum sp.) 3- Estudio de crecimiento secundario anómalo en: Bahuinia sp. “pezuña de vaca” Chenopodium sp. 4- Estudio de crecimiento secundario en Monocotiledóneas: en Aloe sp. 5- Tallo modificado: Estudio de anatomía de cladodio en Homalocladium platicladum “tenia”. T. P. Nº 11: Utilización de ESEM Objetivos: Estudio de la estructura de tallos, hojas y raíces usando el Micoscopio Electrónico de Barrido en su modo ambiental (ESEM = Enviromental Scanning Electron Microscope) Identificar la composición de elementos químicos en depósitos cristalinos encontrados en los tejidos analizados usando EDAX (Energy Dispersive X-Ray Analysis) Materiales 1- Análisis de cortes de tallo de Pilea sp., Tripogandra sp. y Begonia sp. Análisis EDAX de drusas, rafidios y cistolitos. 2- Análisis de epidermis de hoja de gramínea, en vista superficial. Análisis EDAX de cuerpos silíceos 3- Análisis de endosperma de semilla de Ricinus sp. Análisis EDAX de globoides incluidos en los cuerpos proteicos