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BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR Primer cuatrimestre – Año 2016 Autores: Rensonnet Pablo; Smucler Joaquín. PRIMER PARCIAL Conceptos previos Tipos de enlace Simple: Permite girar a la molécula alrededor del mismo. Es un enlace más largo que los dobles o triples Doble: No permite el giro. Es un enlace un poco más corto que el anterior. Los átomos se encuentran todos sobre un mismo plano. Triple: No permite el giro y el enlace es aún más corto pero es el más fuerte. Estructura lineal. Compuestos hidrofílicos Por lo general son aquellos que contienen grupos polares como los alcoholes. Se sienten atraídos por el agua ya que pueden formar unión hidrogeno. Compuestos hidrofóbicos Por lo general son compuestos no polares que entre ellos forman interacciones transitorias. Los aceites en agua, por ejemplo, tienden a unirse ya que es favorable energéticamente para el agua que ellos se encuentren todos juntos. Isómeros Estructurales: Tienen la misma fórmula química pero están dispuestos de manera distinta. 1 Geométricos: Vinculados por el doble enlace. Los residuos pueden ser voluminosos y el enlace no permite la rotación. Estereoisomeros o enantiomeros: Un átomo de carbono unido a cuatro átomos o moléculas diferentes entre sí. Se forman dos estructuras cuyas imágenes son especulares entre sí. Se denominan conformeros. Hidratos de carbono Son polialcoholes muy solubles en agua. Cuando están en presencia de la misma se ciclan. Los azucares más simples se denominan monosacáridos. Estos pueden unirse entre sí mediante reacciones de deshidratación, donde se extrae agua y se unen los azucares mediante un enlace glucosídico entre dos de sus átomos de carbono. Los monosacáridos sirven para generar energía y forman parte de los nucleótidos (ADN y ARN). Además, los polisacáridos son formas de reserva de los azucares y constituyen componentes estructurales de la célula. Asimismo, pueden actuar como marcadores para una variedad de procesos de reconocimiento celular, incluyendo la adhesión entre células. Disacáridos: Sacarosa: Glucosa + Fructosa Lactosa: Glucosa + Galactosa Maltosa: Glucosa + Glucosa Polisacáridos: Almidón: reserva de energía (almacenamiento de glucosa) en células vegetales. Glucógeno: reserva de energía (almacenamiento de glucosa) en células animales. Celulosa: función estructural, es el principal componente de la pared celular (es insoluble y no puede ser degradada por el hombre). 2 Lípidos Serie heterogénea con propiedades físicas comunes. Son solubles en solventes no polares pero insolubles en agua. Desempeñan tres funciones básicas en células: Proporcionan una importante fuente de energía Son el componente principal de las membranas celulares Desempeñan importantes papeles en la señalización celular, bien como hormonas esteroideas o como mensajeros moleculares que trasladan señales desde los receptores de la superficie celular hasta dianas dentro de la célula. Dentro de ellos encontramos: Ácidos grasos Son los lípidos más simples, consistentes en largas cadenas hidrocarbonadas con un grupo carboxilo (COO-) en un extremo. Por ende, la “cabeza” es polar (hidrofílica) y el resto de la cadena es no polar (hidrofóbica). Las cadenas pueden o no presentar insaturaciones y además en caso de existir, se ve que si tienen una posición cis la cadena se tuerce, mientras que si es trans sigue recta. En medios acuosos se ubican de la forma más energéticamente favorable, denominada micela. Acilgliceridos Provienen de esteres del glicerol con ácidos grasos saturados e insaturados. Existen mono, di y triglicéridos. Son hidrolizables (se rompe la unión éster). Además, son insolubles en agua y son una forma de almacenamiento de energía más eficaz que los hidratos de carbono ya que producen más del doble de energía por peso de material degradado (debido a que son osmóticamente inactivos, no “arrastran” agua). Grasas animales (solidas): ácidos grasos saturados lineales. Grasas vegetales (liquidas): ácidos insaturados. 3 Fosfolípidos Son los principales componentes de las membranas celulares. Se componen de dos ácidos grasos unidos a un grupo polar de cabeza. En los fosfogliceridos, los dos ácidos grasos están ligados a átomos de carbono del glicerol, con una unión éster en el carbono tres con un grupo fosfato. Son moléculas anfipaticas. En medios acuosos se ubican de la forma más energéticamente favorable, denominada liposoma. Esteroides Son derivados del colesterol. Este compacta la membrana celular, le otorga rigidez. Las hormonas esteroides funcionan como moléculas de señalización, tanto dentro como fuera de la célula. Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son las principales moléculas de información de la célula. Estos son polímeros de nucleótidos y están compuestos por bases de purina y pirimidina ligadas a azucares fosforilados. El ADN es una molécula de doble hebra que consiste en dos cadenas de polinucleótidos que discurren en direcciones opuestas. Las bases se encuentran en la parte interna de la molécula y las dos cadenas están unidas por enlaces de hidrogeno entre pares de bases complementarias. La guanina se aparea con la citosina y la adenina con la timina. Las bases están ligadas a azucares (2´desoxirribosa) para formar nucleosidos. La función del ADN es el almacenamiento y la transmisión de la información biológica. En la célula se encuentran varias clases de ARN que cubren una amplia variedad de funciones, por ejemplo: ARNr (ribosomal): junto a algunas proteínas son los componentes de los ribosomas, complejos que llevan a cabo la síntesis de proteínas. ARNm (mensajero): actúan de intermediarios, transportando la información desde un gen o unos pocos genes hasta el ribosoma. 4 ARNt (transferencia): moléculas adaptadoras que alinea a los aminoácidos a lo largo del molde de ARNm. Las bases que contiene el ARN son adenina, guanina, citosina y uracilo. Además, están ligadas a la ribosa. Los polinucleótidos siempre se sintetizan en la dirección 5´ a 3´, añadiéndose un nucleótido libre al grupo 3´OH de la cadena en formación. La polimerización de nucleótidos para formar ácidos nucleicos implica la formación de enlaces fosfodiester entre el 5´fosfato de un nucleótido y el 3´hidroxilo de otro. Proteínas Son polímeros de veinte aminoácidos distintos, moléculas dinámicas cuya función depende de la interacción con otras moléculas. Cada aminoácido consiste en un átomo de carbono ligado a un grupo carboxilo, un grupo amino, un átomo de hidrogeno y una cadena lateral característica. Las propiedades químicas específicas de las diferentes cadenas laterales de los aminoácidos determinan los papeles de cada aminoácido en la estructura y función proteica. Los aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos entre el grupo amino de un aminoácido y el grupo carboxilo del siguiente. Como la unión es en trans, las cadenas laterales quedan alternadas, una arriba y otra abajo. Se sintetizan desde el N-terminal (amino) hasta el C-terminal (carboxilo). Los aminoácidos pueden agruparse en cuatro categorías: Diez son no polares Cinco son polares no cargados Tres son polares positivos Dos son polares negativos 5 Estructura primaria Secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptidica de la proteína. Está dominada por uniones covalentes. Estructura secundaria Ordenamiento regular de aminoácidos dentro de regiones localizadas del polipéptido. Hay dos tipos de estructuras particularmente comunes: alfa hélices y hojas beta. Ambas se mantienen por enlaces de hidrogeno entre los grupos CO y NH de los enlaces peptídicos. La primera se forma cuando una región de una cadena polipeptidica se pliega sobre sí misma. En contraste, la hoja beta se forma cuando dos partes de una cadena polipeptidica se encuentran una junto a otra con enlaces hidrogeno entre ellas. Estructura terciaria Plegamiento global de una cadena polipeptidica debido a las interacciones entre las cadenas laterales de los aminoácidos situados en distintas regiones de la secuencia primaria. Dominada principalmente por interacciones electrostáticas, unión hidrogeno, interacciones no polares y puentes di sulfuro. En la mayoría de los casos la información de plegado está en la estructura primaria. Estructura cuaternaria Es la unión de varios polipéptidos 6 Motivos estructurales y dominios Los primeros están compuestos de unos pocos elementos de la estructura secundaria. Algunos ejemplos son: HSH (Hélice – Vuelta – Hélice), lazo beta, barril beta y guarda griega. (Estructura secundaria). Los dominios son subestructuras o unidades modulares que se pueden plegar independientemente en una estructura compacta y estable. En general, los diferentes dominios se asocian a diferentes funciones. (Estructura terciaria). Ligando Molécula que se une reversiblemente a una proteína. Esta unión es fundamental ya que permite al organismo responder rápida y reversiblemente a cambios en el entorno o el metabolismo. Ajuste inducido Las proteínas son flexibles y la unión del ligando genera un cambio conformacional que hace que el sitio de unión sea aún más complementario. Grupo hemo Es un grupo prostético, un grupo no proteico unido covalentemente a la proteína. Es un tetrapirrol. Ejemplos: Mioglobina Es una proteína que facilita la difusión de O2 en el musculo. Es monomérica, globular y está compuesta por 153 aminoácidos y un grupo hemo. Este último se encuentra dentro de un bolsillo hidrofóbico. Además, presenta aminoácidos hidrofílicos en la superficie. La histidina distal está presente en el bolsillo hidrofóbico y modifica la afinidad del grupo hemo por el CO2 y el O2, mientras que la histidina proximal se une al Fe para estabilizar la unión. Tiene unión reversible al O2. Ejemplos: Hemoglobina Es una proteína tetramérica (dos estructuras denominadas alfa y dos denominadas beta) lo que le permite coordinar cuatro moléculas de oxígeno. Cada subunidad se parece a la mioglobina. En el interior está estabilizada por fuerzas de van der Waals y fuerzas hidrofóbicas. En el exterior presenta aminoácidos hidrofílicos. Al igual que en la mioglobina, la histidina distal modifica la afinidad del grupo hemo por el O2 y el CO2. Sin embargo, la proximal se encarga de la unión con el O2. Presenta cuatro grupos hemo. Al contrario que la hemoglobina, la mioglobina no es transportadora de O2. En la primera, la unión con O2 es cooperativa (carga facilitada). Los cambios se inician en el grupo hemo pero las rupturas ocurren lejos del mismo. Se rompen uniones salinas al pasar del estado tenso al estado relajado. 7 Efectos del CO La mioglobina no tiene efecto cooperativo. La misma tiene una mayor afinidad por el O2, lo que la hace útil para reserva pero no para transporte. Al contrario sucede con la hemoglobina. En presencia de CO la hemoglobina toma CO y O2 por lo que no puede pasar al estado relajado. Sigue funcionando pero a una tasa mucho menor y además al llegar a las células del cuerpo no libera el O2. Efectores alostéricos No se unen al grupo hemo. Buenos ejemplos de los mismos son el pH y la presión parcial de CO2. Se une un BPG (bi – fosfoglicerato) por hemoglobina a una cavidad llena de aminoácidos positivos. Se une al sitio alostérico alejado del sitio de unión del O2 y baja la afinidad por el O2 porque estabiliza al confórmero T. En ausencia de BPG la hemoglobina almacena O2. Hay una alta concentración de BPG en los eritrocitos. En altura, el cuerpo aumenta la producción de BPG y luego de un tiempo también de eritrocitos para compensar el cambio en el ambiente. Esta reacción favorece los puentes salinos, lo que a su vez favorece la forma T de la hemoglobina. Por lo tanto, se liberan la mayor cantidad de O2. A menor concentración de H+, se desplaza el equilibrio hacia la derecha, se favorecen aún más los puentes salinos y por lo tanto baja la afinidad por el O2, liberando más del mismo. Hemoglobina fetal Posee cadenas gama en vez de las beta. Este tetrámero tiene menos afinidad por el BPG. Entonces esto provoca una mayor afinidad por el O2. Niveles de organización Termodinámica Estudio de los principios generales que gobiernan todas las transformaciones energéticas. 1° Ley: La energía no se crea ni se destruye, se transforma. 2° Ley: Todos los procesos individuales tienden a ocurrir de una forma tal que se aumente la entropía (S) del universo. Los procesos exergonicos son aquellos en los que se libera energía. Los endergonicos, en cambio, son aquellos en los que se absorbe energía. 8 Energía y trabajo celular Metabolismo: Conjunto de reacciones que ocurren dentro de una célula. La degradación de moléculas complejas a simples (procesos exergonicos) se denomina catabolismo. La síntesis de moléculas simples a complejas (procesos endergonicos) se denomina anabolismo. Un sistema aislado es aquel que no intercambia materia ni energía con el ambiente. Uno cerrado intercambia energía pero no materia. El abierto es aquel en el que se intercambian ambos, es el caso de una célula. La célula se encuentra en estado estacionario (no está en equilibrio con el ambiente) para poder realizar trabajo. Es un sistema isotérmico, todas sus partes tienen la misma temperatura. Las células no pueden usar calor para realizar trabajo biológico, solo mecánico y químico. La adenosina trifosfato (ATP) es el transporte de energía de la célula. Al romper un enlace liberando un fosfato se transforma el ATP en ADP y se libera una cantidad relativamente grande de energía. Gradiente Cambio gradual de un estado concentrado a otro repartido equitativamente. Es una fuerza impulsora. Las reacciones desfavorables energéticamente suceden porque se acoplan con otras muy favorables. Cuando la energía de activación es muy alta, se disminuye mediante enzimas. Enzimas Catalizadores biológicos que disminuyen la energía de activación de una reacción, es decir, la energía mínima requerida para que la reacción se lleve a cabo. Generalmente son proteínas globulares (hay también moléculas de ARN que desempeñan en ocasiones papeles catalíticos). Son altamente especificas (sustrato particular) y muy eficientes en pequeñas cantidades. Además se recuperan después de la reacción. Su actividad catabólica depende de la forma estructural. Son termolábiles y sensibles al pH. Al aumentar la temperatura la molécula se despliega y no puede cumplir con su función. Al alterar el pH, se cambian las atracciones electrostáticas presentes, lo que afecta tanto a la estructura como a la función. Cuando varias reacciones acopladas degradan nutrientes orgánicos transformándolos en productos finales simples con el fin de extraer de ellos energía química y convertirla en una forma útil para la célula se denomina catabolismo. 9 Cofactores Las enzimas a veces requieren de cofactores (como un pH óptimo) o coenzimas para desarrollar su estructura o función. Por ejemplo algunas requieren de una fosforilacion o una glicosilacion. Sitio activo Se denomina así a la región de la enzima que reacciona con el sustrato. Es el responsable de la especificidad de la enzima (solo entra un determinado tipo de sustrato). En él se encuentran: Residuos de unión: aminoácidos que intervienen en la unión. Residuos catalíticos: aminoácidos que participan en la transformación química del sustrato. Unión enzima – sustrato Las uniones son débiles y reversibles. Modelos de esta unión son el de llave – cerradura y el de ajuste inducido. Hay cuatro eventos de la reacción enzimática: Reducción de la entropía: correcta alineación del sustrato con la enzima y restricción del movimiento (Formación de uniones débiles): La formación de dichas uniones desolvatan al sustrato (reemplazan las uniones hidrogeno). Estas uniones del estado de transición ayudan a compensar termodinámicamente cualquier redistribución electrónica y deformación para que el sustrato pueda reaccionar. Ajuste inducido. La enzima sufre un cambio conformacional que induce muchas interacciones débiles con el sustrato. Cesión de electrones. Los grupos funcionales se reacomodan para que ocurra la reacción. Cinética enzimática La concentración del sustrato y de la enzima, la temperatura, el pH y la presencia de inhibidores afectan la velocidad con la que una enzima provoca la reacción sustrato -> producto. Inhibidores Sirven para controlar las funciones catalizadas por las enzimas. Inhibición competitiva: el inhibidor y el sustrato compiten por el mismo lugar en la enzima. Este se une reversiblemente a la enzima y si aumenta la concentración del sustrato puede llegar a desplazar al inhibidor. 10 Inhibición no competitiva: el inhibidor se une en un sitio diferente al sustrato. Evito que el sustrato pase a producto. Es como si hubiera menos enzima disponible. Inhibición acompetitiva: Una vez formado el complejo enzima sustrato se une el inhibidor y lo inhibe de pasar a producto. En algunas enzimas este paso no es reversible. Esto disminuye la velocidad máxima, a diferencia de la inhibición competitiva. Regulación Alostérica: Hay un compuesto modulador alostérico que tiene un ciclo propio distinto del sitio activo. Genera un cambio conformacional en la enzima que modifica la estructura del sitio activo. Compartimentalización: Un ejemplo típico son los lisosomas. Como estos se encargan de cortar macromoléculas, si estuvieran libres en el citoplasma destruirían a la célula. Se aíslan en compartimientos con pH específico para evitar este gran peligro para la célula. Covalente reversible: Se fosforila o desfosforila la enzima para activarla o desactivarla. La quinasa se encarga de agregar fosfato y la fosfatasa los remueve. Síntesis: Puede ser por inducción o por represión. Significa sintetizar más o menos enzimas según la necesidad de la célula. Complejo multienzimatico: Se crea una vía de enzimas y sustratos generando un producto final que desactiva la primera enzima para “cerrar” el ciclo. Célula procariota No poseen compartimentalización, todo se encuentra suelto en el citoplasma. El cromosoma es circular cerrado. Poseen plásmidos, pequeñas cantidades de ADN que pueden proporcionar un gen que fortalezca la resistencia de la bacteria bajo determinadas condiciones. Además poseen cilios que pueden ser flagelos (permiten el movimiento) o pilis (permiten la interacción entre bacterias). La estructura de la envoltura celular varía según el tipo de bacteria. Algunas presentan membrana externa e interna, otras solo poseen esta última. Su morfología permite clasificarlas en cuatro categorías: cocos, bacilos, micoplasmas y spirochetas. Archaebacterias Son extremófilas similares a las bacterias en forma y tamaño. Sus enzimas y rutas metabólicas son similares a las de las células eucariotas. Sin embargo, poseen una membrana celular distinta (es una monocapa lipídica). Presentan reproducción asexual por fisión binaria, fragmentación o gemación. 11 Célula eucariota Todas las células tienen, al menos durante una parte de su ciclo vital, un núcleo o un nucleoide en el que se almacena y replica el genoma. Las células en las que el núcleo contiene el material nuclear que se halla englobado en el interior de una membrana doble (llamada envoltura nuclear) constituyen el amplio grupo Eukarya. Existen dos principales tipos de célula eucariota, la célula animal y la célula vegetal. Estas tienen una variedad de estructuras colectivamente llamadas sistema de endomembranas. Se define como organela a una estructura especializada dentro de la célula que lleva a cabo una determinada función. Dentro de estas podemos encontrar: Núcleo: Contiene el ADN. Posee una doble membrana que se forma generando el complejo del poro. Además posee una lámina nuclear que brinda soporte y forma. Los poros sirven para regular el paso selectivo. La capa externa posee ribosomas asociados y la continuación de la misma da lugar al retículo endoplasmático. Los poros pueden estar formados por hasta mil proteínas ensambladas. Retículo endoplasmatico rugoso: Posee ribosomas asociados en la cara citoplasmática (De aquí su nombre). En él se sintetizan proteínas, que generalmente son de exportación. Retículo endoplasmatico liso: No presenta ribosomas asociados. Es el lugar de síntesis de lípidos y de metabolismo de fármacos. Aparato de Golgi: Procesa, empaqueta y distribuye proteínas a otros orgánulos para su exportación. Aquí se lleva a cabo la modificación de azucares, ya que produce las modificaciones necesarias en moléculas no listas. Tiene forma de sacos aplanados con polaridad: Lado cis: Formadora, hacia el núcleo. Lado trans: Gemación, hacia la membrana. Mitocondria: Se lleva a cabo la respiración celular, esto es oxidar combustible (como ácidos grasos, azúcar) para producir ATP. Presenta ADN mitocondrial muy parecido al procarionte. Son autoreplicativas. Poseen una membrana externa y una interna, separadas por un espacio intermembranal. La primera es más permeable. Esta invaginada ya que sobre la membrana interna se ubican ATP sintasas y de esta forma puede tener más de estas en un espacio menor. Los picos de dicha invaginación se llaman crestas y en su interior hay un líquido denominado matriz. 12 Peroxisoma: En él se lleva a cabo la degradación de ácidos grasos. Posee enzimas oxidativas, tiene grandes cantidades de O2 y produce H2O2, el cual utiliza para oxidar alcoholes y fenoles. Lisosoma: Degrada los restos intracelulares. Produce la digestión de macromoléculas. Son hidrolíticos (pH < 5) para proteger a la célula en caso de que se liberen al citoplasma. Vesículas: Pequeños compartimientos que se encargan del transporte de moléculas extra e intracelular. Cloroplastos: Solo presentes en células vegetales. Son los encargados de la fotosíntesis. Es decir, trasforman la energía lumínica del sol en energía química aprovechable, produciendo ATP y glúcidos. Al igual que la mitocondria, son autoreplicativos y poseen ADN cloroplastico parecido al procarionte. Tienen tres sistemas de membrana y en la más interna llamada membrana tilacoide se encuentra la clorofila. Vacuola: Solo presentes en células vegetales. Almacena agua y moléculas nocivas. Degrada y recicla macromoléculas y almacena metabolitos. Mantiene la turgencia de la célula. Es necesario mencionar la existencia de dos estructuras (no organelas) muy importantes. Pared celular: Solo presente en células vegetales. Confiere forma y rigidez a la vez que protege a la célula del hinchamiento osmótico. Membrana celular: Separa la célula de su entorno, regula el movimiento de materiales hacia dentro y fuera de la célula. Transporte activo de macromoléculas El proceso de incorporación de materia a la célula se llama endocitosis. En él, la membrana se invagina y cierra formando vesículas. El proceso opuesto es la exocitosis. Se lleva a cabo cuando la célula quiere eliminar algún compuesto. 13 Virus Son parásitos intracelulares incapaces de replicarse por sí mismos. Se reproducen mediante la infección de células huésped y la usurpación de la maquinaria celular para producir más partículas virales. En sus formas más simples consisten solamente en ácido nucleico genómico (ADN o ARN) rodeado de una cubierta proteínica. Son importantes para la biología porque proporcionan sistemas simples que pueden ser utilizados para investigar las funciones de las células. Tipos de ARN ARNm (mensajero): Transporta información desde el ADN a los ribosomas, donde sirve como molde para la síntesis de proteínas. Son transcritos por una enzima (ARN polimerasa) que cataliza la síntesis de ARN a partir de un molde de ADN. ARNt (transferencia): Funciona como una molécula adaptadora que alinea los aminoácidos a lo largo del molde de ARNm. Asegura la ubicación de cada aminoácido en el sitio correspondiente. En cada célula existen distintas especies de ARNt, específicos para cada uno de los aminoácidos. El anticodón es el responsable de la función de adaptador y de la especificidad. ARNr (ribosomal): Junto a las proteínas son los componentes de los ribosomas, que luego intervendrán en la síntesis de proteínas. ARN polimerasa: Son un conjunto de proteínas con carácter enzimático capas de formar los ribonucleótidos para sintetizar ARN a partir de una secuencia de ADN molde. 14 Membrana celular Es una bicapa lipídica de fosfolípidos, glicolípidos y colesterol. No es rígida sino que es más bien como un mosaico fluido. Esto es debido a que los lípidos tienen libertad para moverse sobre una misma cara. Está formada principalmente por: Fosfogliceridos: Toman como base al glicerol. Poseen una cadena saturada y una insaturada, lo que les permite una menor rigidez, debido a que hay menos fuerzas de van der Waals involucradas. Colesterol: Garantiza mayor impermeabilidad de la membrana. Evita que los lípidos cristalicen, dando fluidez en, por ejemplo, condiciones de baja temperatura. Esfingolipidos: Toman como base la esfingocina. Glicolípidos: Son derivados de la esfingocina (animales) o del glicerol (vegetales). Apuntan a la cara opuesta al citosol. Son receptores y participan en la adhesión celular. Un tipo de estos son los gangliosidos, los cuales tienen una carga neta negativa, brindando ciertas propiedades eléctricas. La membrana celular tiene una distribución asimétrica. Los traslocadores de fosfolípidos generan y mantienen la distribución asimétrica. Estas propiedades permiten la detección y conversión de señales externas. Un ejemplo es la translocación de fosfatildiserina, ya que en una célula viva esta se encuentra solo del lado citosólico de la membrana. Debido a la diferencia de carga entre el interior de la membrana (negativa) y el exterior (positiva) los iones no pueden simplemente pasar por la membrana. Esto si lo pueden hacer moléculas hidrofóbicas y, en menor medida, pequeñas y grandes moléculas polares sin carga. Para que puedan ingresar iones se usan transportadores o canales especializados. Proteínas de membrana Existen proteínas asociadas a la membrana. Las proteínas integrales de membrana están embebidas directamente dentro de la bicapa lipídica. Las proteínas periféricas de membrana no están insertadas en la bicapa lipídica pero están asociadas con la membrana indirectamente, generalmente a través de interacciones con las proteínas integrales de membrana. Algunas proteínas atraviesan la bicapa una o más veces y otras están ancladas en la membrana a través de lípidos que están ligados de forma covalente a la cadena polipeptidica. 15 Transporte trans – membrana Sirve para transportar elementos que no pueden simplemente pasar la membrana. Para que cualquier soluto pase por la membrana se debe deshidratar, debido a que el interior es hidrofóbico. La difusión simple se da espontáneamente. Los canales proteicos se abren o cierran permitiendo el paso diferenciado. El transporte pasivo se da por gradiente, no conlleva gasto de energía. El transporte activo, en cambio, requiere energía ya que se produce contragradiente. Cuando un solo elemento atraviesa un canal proteico se denomina uniporte. Cuando son dos a la vez se llama coporte. Además, si se desplazan en un mismo sentido es un simporte. Caso contrario, antiporte. Las acuaporinas dejan pasar las moléculas de agua ordenadas en fila. Son impermeables a los iones. El poro es muy delgado y presenta, de un lado oxígenos carboxílicos y del otro aminoácidos hidrofóbicos. La bomba sodio – potasio es una proteína electrogénica, contribuye al potencial de la membrana. Cambia su conformación luego de fosforilarse. Ingresa dos iones potasio y libera tres iones sodio. Los canales iónicos son selectivos para iones y se pueden desensibilizar. Se abren o cierran en respuesta a reacciones químicas (cambios en ligandos o voltaje). Pueden censar el voltaje y cambian la posición de las hélices que tienen según la carga presente para abrir o cerrar el paso. La ventaja de los canales de transporte es que no se saturan. 16 Citoesqueleto Es una compleja red de filamentos proteicos que se extiende por el citoplasma. Involucrado en la forma y el movimiento coordinado de una célula. Está involucrado también en el rearreglo de los componentes internos de la célula. Es una estructura muy dinámica compuesta por: Microtúbulos (de tubulina): Posición de organelas y transporte intracelular directo. Se agrupan en tubos huecos y poseen polaridad estructural. El extremo positivo es capaz de crecer a gran velocidad mientras que el negativo es capaz de despolimerizarse si no está estabilizado. Se pueden estabilizar mediante proteínas especiales pero se pierde dinamismo. Todos surgen a partir del centro organizador de microtúbulos. El centrosoma contiene dos centriolos ubicados perpendicularmente y es único por célula. Las organelas viajan a través de la célula unidas a microtúbulos. Filamentos de actina: Forma celular y movimiento (son los de menor rigidez). Forman redes por presencia de proteínas accesorias. Tienen un extremo positivo y uno negativo. Se observa que el extremo positivo crece más rápido que el negativo y además se desensambla más rápido. Mientras que las subunidades se van uniendo el ATP pasa a ADP. Si se unen muy lento pero el ATP pasa rápidamente a ADP, el polímero se desarma. Estos componentes se centran en el cortex, redes debajo de la membrana plasmática. Filamentos intermedios: Otorgan fuerza mecánica, solo están presentes en células animales ya que en las vegetales la pared celular cumple esta función. Participan de las uniones intercelulares. Forman la lámina nuclear que se encuentra por debajo de la membrana nuclear. Tienen un dominio a modo de varilla que se enrosca entre si formando dímeros y estos a su vez formando tetrámeros. Proteínas accesorias: Controlan y regulan el ensamblaje y desensamblaje de y entre los filamentos. Respuesta a señales intra y extracelulares. Las unidades que forman los distintos componentes deben ser pequeñas y solubles, unidas por uniones no covalentes para poder armarse y desarmarse para permitir el movimiento. Tipos de unión intercelular Uniones estrechas u oclusivas: Red de proteínas que generan adhesión entre células. Generalmente presentes en células de absorción. Uniones de anclaje: Forma uniones adherentes entre los filamentos de actina creando una red transcelular. Los desmosomas sirven como lugares de anclaje para filamentos intermedios. Los hemidesmosomas vinculan la célula con la matriz extracelular. Uniones en hendidura / GAP: Formado por dos hemicanales en posiciones abierta/cerrada. Permite el paso directo de iones. Plasmodesmos: Interconecta células con pared celular. 17 Reparación del ADN El ADN es una molécula compleja que es muy susceptible a cambios. Estos cambios pueden ocurrir por la exposición a la radiación, durante la replicación o de manera espontánea bajo condiciones celulares normales. En el caso de la replicación, ya vimos que la polimerasa tiene una subunidad que se encarga de detectar errores pero hay que considerar que pasa por millones de nucleótidos y hay lugar a error. Si los errores llevan a un cambio en la secuencia de bases del ADN, y este se replica, se vuelven permanentes y se llaman mutaciones. Hay estudios que demuestran que estas mutaciones están altamente relacionadas a la predisposición a enfermedades como el cáncer. La reparación del ADN son una serie de procesos que se activan para corregir los errores. Gracias a la reparación, menos del 0,02% de los errores terminan en mutaciones. Además, la reparación es posible gracias a la estructura de doble hélice, ya que si una de las cadenas está dañada, la otra sirve como modelo para repararla. Base Excision Repair Escisión significa cortar, entonces consiste en cortar una base que no corresponde al ADN. También se aplica cuando falta una base y se encuentra un sitio apirimidínico o apurínico, dependiendo del tipo de base faltante. Esto puede ocurrir debido a los procesos de desaminación y de depurinación. DEPURINACIÓN: es la ruptura del enlace entre las bases que son purinas y la desoxirribosa/el azúcar. Es decir que le ocurre a la adenina o a la guanina y el resultado es que el nucleótido pierde la base. DESAMINACIÓN: es la pérdida del grupo amino de una base nitrogenada, le puede suceder a la citosina, adenina o guanina. En el caso de la citosina, el resultado es el uracilo. El proceso de reparación empieza con la enzima ADN glicosilasa que es específica para cada tipo de base. Esta enzima se encarga de cortar la unión de la base errónea al backbone del ADN y de removerla, generando un sitio AP. Como no existe una enzima que directamente pueda insertar la base faltante, hay que remover un par de nucleótidos y reemplazarlos primero. La segunda enzima involucrada es la endonucleasa AP, que corta este enlace fosfodiester en el backbone. Luego la enzima ADN polimerasa I se encarga de cortar nucleótidos y al mismo tiempo inserta nuevos, dejando un corte al final. Por último, la enzima ligasa sella el corte faltante y finaliza el proceso de reparación por escisión de base. Dímero de Timina Es una lesión muy grave en el ADN producida por la radiación ultravioleta ya que los fotones que chocan contra la doble hélice inducen un enlace covalente entre dos timinas en dos nucleótidos sucesivos. El proceso general encargado de reparar esta lesión es la escisión de nucleótido. Es importante la remoción de los dímeros de timina ya que pueden causar melanoma, es decir cáncer de piel. 18 Escisión de nucleótido Se va a describir en E.Coli por simplicidad: El complejo enzimático clave es la ABC-Excinucleasa. Está formada por 3 enzimas diferentes: UvrA, Uvrb, Uvrc. Se asocian dos unidades de UvrA con una de Uvrb, escaneando el ADN hasta encontrar el dímero de timina en la cadena afectada. A continuación las dos unidades de UvrA se van de la zona produciendo un cambio conformacional que deja bien ajustada la UvrB a la cadena. Luego se une UvrC realizando dos cortes alrededor del sitio problemático. Uno 5 enlaces fosfodiester del lado 3 prima de la lesión y otro 8 enlaces para el lado 5 prima. El fragmento resultante de 12 o 13 nucleótidos es eliminado por la Helicasa-UvrD. El hueco es re sintetizado por la ADN-Polimerasa I y sellado por la ADN-Ligasa. Mismatch Los apareamientos incorrectos tras la replicación del ADN se corrigen siempre de acuerdo a la información contenida en la cadena molde. Por eso el sistema tiene que saber distinguir la cadena molde (vieja) de la recién sintetizada. Esto se logra marcando el ADN molde con grupos metilo. Regulación de la expresión genética Switches genéticos Interacciones proteína – ADN. Los factores de transcripción son proteínas regulatorias con motivos de unión a ADN. Las secuencias regulatorias son secuencias nucleotidas especificas reconocidas por los factores de transcripción. La unión proteína – ADN se da por complementariedad extensiva entre las características químicas en la interface proteína – ADN. Regulación en procariontes Regulada principalmente a nivel transcripcional. Está regulada en respuesta a señales, en su gran mayoría ambientales. Todo el genoma procariota es codificante y los genes se organizan en operones (arreglo adyacente de genes que se transcriben a partir de un único promotor). El operon sirve de elemento regulador de la expresión de genes involucrados en una misma ruta metabólica. Todos los genes se transcriben juntos en una única molécula de ARNm. Los genes en un operon son expresados en conjunto o no son expresados. Regulación negativa (triptofano): El triptofano se une en la proteína que se une al operador del ARN y no le permite la unión a la ARN polimerasa. Regulación negativa y positiva (LAC): Se requiere de una unión con un cap (permite iniciar a la ARN pol) y que el represor esté ausente. 19 Regulación en eucariontes Control transcripcional: Control de cuanto y cuando se transcribe. Control de procesamiento de ARNm: Colocarle o no el capuchón, splicing, cola de poli A. Control traduccional: Cual ARNm es exportado y cual no. Control postraduccional. Promotores, enhancers, silencers. A pesar de tener el mismo genoma las proteínas reguladoras varían. Organización del genoma Funciones del núcleo Almacena y protege la información genética contenida en el ADN. Convierte la información del ADN en ARN. En bacterias el ADN es circular mientras que en eucariotas es lineal. Además dirige la actividad celular a través de proteínas. Cromatina en eucariontes Eucromatina: genes en activa transcripción (10%) y genes que no se transcriben. Cromatina densa: inactiva. Cariotipo Representación gráfica de los cromosomas presentes en una sola célula somática Empaquetamiento de ADN Primer nivel: Fibras de ADN asociadas a histonas. Se llama fibra de cromatina. Segundo nivel: Enrollamiento sobre si misma de la fibra de cromatina. Tercer nivel: La fibra forma bucles estabilizados por un andamio proteico. 20 Telómeros Se componen de repeticiones en tándem de secuencias simples de ADN. Son los extremos de los cromosomas. Su función principal es la estabilidad estructural de los cromosomas en las células eucariotas, la división celular y el tiempo de vida de las estirpes celulares. Son replicados por la acción de una única enzima llamada telomerasa, que es capaz de mantener a los telómeros catalizando de su síntesis en ausencia de una hebra molde de ADN. La telomerasa es una transcriptasa inversa, sintetiza ADN a partir de un molde de ARN. Esta porta su propio molde de ARN. Replicación del ADN El ADN actúa de molde para la replicación y la transmisión de la información genética: cada una de las cadenas es complementaria de la otra. La replicación del ADN es semiconservadora. Cada cadena actúa de molde para la síntesis de una nueva cadena. El resultado son dos moléculas de ADN nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja. La replicación empieza en un lugar de origen y normalmente avanza en forma bidireccional. Los lazos de replicación siempre se inician en un punto único denominado origen. La replicación es normalmente bidireccional. En las moléculas de ADN circular, las dos horquillas de replicación (extremos del lazo) vuelven a encontrarse en un punto del círculo, en el lado opuesto al origen. La síntesis del ADN progresa en dirección 5´ 3´ y es semi-discontinua. Una de las cadenas es sintetizada de modo continuo y la otra de modo discontinuo. La hebra conductora es aquella cuya síntesis en dirección 5´ 3´ transcurre en la misma dirección que el movimiento de la horquilla de replicación. La hebra rezagada es aquella cuya síntesis en dirección 5´ 3´ transcurre en dirección opuesta a la dirección del movimiento de la horquilla. Esta se sintetiza en forma de trazos cortos, denominados fragmentos de Okazaki. Hay dos requerimientos básicos para la polimerización del ADN. 1. Todas las ADN polimerasas (I, II y III) requieren de un molde. 2. Las polimerasas requieren de un cebador. Esto es, un segmento de cadena (complementario del molde) con un grupo 3´hidroxilo libre al cual pueden añadirse nucleótidos. El extremo 3´del cebador se denomina extremo terminal de cebador. 21 La replicación en E. Coli necesita polimerasas enzimas y proteínas. El conjunto completo se denomina replisoma. El acceso a las cadenas de ADN que tienen que actuar de molde requiere de la separación de las dos cadenas parentales. Esta tarea corre a cargo generalmente de enzimas denominadas helicasas, que se mueven a lo largo del ADN y separan las cadenas utilizando la energía química del ATP. Esta separación crea una tensión en la estructura helicoidal que es relajada por acción de las topoisomerasas. Las cadenas separadas son estabilizadas por proteínas de unión al ADN. Los cebadores (segmentos cortos de ARN sintetizados por enzimas denominadas primasas) tienen que estar unidos al ADN antes que las polimerasas puedan empezar la síntesis. Posteriormente los cebadores de ARN son eliminados y reemplazados por ADN. En E. Coli esta es una de las muchas funciones de la ADN polimerasa I. Después de la eliminación del cebador de ARN y del relleno del hueco con ADN queda una mella en la cadena azúcar fosfato en forma de un enlace fosfodiester roto. Estas mellas son selladas por enzimas que se llaman ADN ligasas. INICIACION Es la única fase de la replicación que se sabe que está regulada para que solo tenga lugar una vez en cada ciclo celular. La proteína ADNa reconoce la secuencia origen y abre el dúplex en sitios específicos del origen. La helicasa desenrolla el ADN, muchas moléculas de proteína de unión al ADN de cadena sencilla se unen y estabilizan las hebras separadas, mientras las topoisomerasas liberan la tensión torsional generada por el desenrollamiento del ADN. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando súper enrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si éstos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los súper enrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada ELONGACION La síntesis de las dos cadenas es muy diferentes. La de la cadena conductora, empieza con la síntesis de un corto cebador de ARN por la primasa en el origen de replicación. Este es sintetizado en dirección opuesta a la del movimiento de la helicasa. Los desoxiribonucleotidos son añadidos a este cebador por un complejo de ADN polimerasa III unida a la helicasa anclada en la hebra de ADN opuesta. Seguidamente la síntesis de la hebra conductora transcurre de manera continua, al mismo ritmo que el desenrollamiento de ADN en la horquilla de replicación. 22 La síntesis de la hebra rezagada se realiza a trozos de corta longitud llamados fragmentos de Okazaki. Primero la primasa sintetiza un cebador de ARN y la polimerasa III se une al cebador de ARN y añade desoxiribonucleotidos. Como ambas hebras son producidas por un único dímero asimétrico de ADN polimerasa III la hebra rezagada debe formar un lazo que aproxima los dos puntos de polimerización. Una vez finalizada la síntesis de un fragmento de Okazaki su cebador de ARN es eliminado y reemplazado con ADN por la ADN polimerasa I y la mella restante es sellada por la ADN ligasa. Actividad exonucleasa: capacidad de degradar el ADN. Esto les da a las polimerasas función correctora y reparadora (3 a 5 y también 5 a 3). Actividad polimerasa: síntesis de nuevas cadenas de ADN (5 a 3). TERMINACION Finalmente las dos horquillas de replicación del cromosoma circular se encuentran en una región terminal que contiene múltiples copias de una secuencia de 20 pares de bases denominadas Ter. Estas secuencias están dispuestas en el cromosoma para crear una especia de trampa donde una horquilla de replicación puede entrar pero no salir. La replicación del ADN entre las horquillas de replicación opuestas deja los cromosomas recién completados encadenados, es decir, ligados topológicamente. Los círculos no están unidos covalentemente pero no pueden separarse porque están entrelazados. Una topoisomerasa de tipo II tiene el papel principal en la separación de los cromosomas encadenados, corta transitoriamente las dos hebras de ADN de uno de los cromosomas, permitiendo que el otro cromosoma pase a través de la brecha. Transcripción en eucariotas Presentan tres ARN polimerasas. Pol I se encarga de la síntesis de pre ARNr. Pol II se encarga de la síntesis de ARNm y algunos especializados. Pol III lleva a cabo la síntesis de ARNt, ARNr y algunos especializados. Los eucariontes presentan promotores (tata box), enhancers, proteínas activadoras y mediadores. Maduración del transcripto primario Casquete 5´: Capping. Se adiciona un cap de 7 – metilguanosina. Esta estabiliza el ARN además de alinear los ARNm eucarióticos sobre el ribosoma durante la traducción. Splicing: Existen intrones y exones. Son dos subunidades en las que solo las últimas poseen información útil. Se cortan los intrones dejando solo los exones. Corte y empalme. Cola de poli A: La ARN pol sigue transcribiendo pero copia una secuencia, una región que atrae un complejo enzimático (endonucleasa) que corta la cadena (transcripto primario) y se agrega una secuencia (cola) de adeninas. 23 Transcriptoma Todo el ARN que se transcribe en un determinado momento. Solo una pequeña porción de ADN codifica para proteínas y sin embargo gran parte de ADN se transcribe en ARN. Traducción Conversión del código de cuatro elementos al código de veinte aminoácidos Codón: secuencia de tres nucleótidos. Código degenerado. Codón stop: donde terminan de sintetizar la proteína. Codón inicio: Metionina (AUG). ARNt Molécula adaptadora, se une al codón por un extremo (anticodón) y al aminoácido por el otro extremo (3´). La aminoacil – ARNt sintetasa es la que se encarga de cargar el aminoácido al ARNt. Une ARNt con aminoácidos utilizando energía de ATP. Es un enlace de alta energía. ARN ribosomal y ribosomas Dan el lugar para que ocurra la síntesis de proteínas. Tiene un lado mayor y otro menor. Iniciación: El ribosoma se une al extremo 5´de ARNm. Elongación: A medida que el ARNm entra al núcleo del ribosoma. El ARNt lee la secuencia y si el codón es correspondiente con el anticodón se agrega cada aminoácido en la secuencia correcta para formar un polipéptido. Terminación: Se agrega un codón stop y termina la síntesis. 24 Marco de lectura Secuencia de ADN comprendido entre el codón de inicio de la traducción y el codón de terminación, descontando los intrones. Inserciones: Se agregan nucleótidos a la cadena. Deleciones: Se le quitan nucleótidos a la cadena. Tecnicas de estudio El objetivo es alcanzar la pureza deseada con el mayor rendimiento posible. El aislamiento de una molécula se logra a partir de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de la misma. Fases de la purificación Preparación, extracción y clarificado: Se obtiene la biomasa y se produce el disgregamiento celular mediante lisis (ruptura de células sin pared celular en medio hipotónico) o mediante un mortero o sonicacion. Es importante tener en cuenta el pH ya que podrían romperse proteínas, la temperatura y presencia de proteasas (a baja temperatura hay menos velocidad de reacción de las proteasas), la fuerza iónica, etc. Captura: Mediante centrifugación diferencial se obtienen fracciones celulares. Se distinguen el sobrenadante (macromoléculas) y el pellet (restos celulares grandes). Purificación intermedia: Puede ser por salting – out o por diálisis. La primera es una técnica de precipitación diferencial a elevadas concentraciones salinas. Aprovecha la diferencia de solubilidad de las distintas proteínas. Luego se separan por centrifugación a baja velocidad. Diálisis es una técnica de separación por tamaño. El extracto parcialmente purificado se coloca en una membrana que permite el paso de moléculas pequeñas. Refinamiento: Puede ser por cromatografía en columna o por electroforesis. La primera es un método físico de separación de mezclas por el principio de retención selectiva. Hay una fase móvil y una fase estacionaria. Existen cuatro tipos: Exclusión molecular cuyo principio de separación es por tamaño. Intercambio iónico cuyo principio de separación es por carga. Afinidad cuyo principio de separación es la bioafinidad (alta pureza en menos pasos). Interacción hidrofóbica cuyo principio de separación es por hidrofobicidad. 25 Electroforesis es una técnica de separación de moléculas con carga en una matriz porosa bajo la aplicación de un campo eléctrico. La matriz es un polímero entrecruzado de tamaño regulable. El principio de separación es por carga y tamaño. El revelado se hace con agentes intercalantes que se insertan entre las bases de ADN o ARN. Hay dos tipos principales de electroforesis: Electroforesis en gel de agarosa: Corrida horizontal (matriz sostenida por enlaces no covalentes). Para separación de polinucleótidos. Preparativa o cuantitativa. Debo colocar un buffer de corrida. Electroforesis en gel de poliacrilamida: Corrida vertical. Separación de proteínas y oligonucleótidos pequeños. Preparativa o cuantitativa y con mayor resolución. En moléculas de ADN la carga es proporcional al tamaño, a mayor cantidad de bases más carga negativa. Para obtener este efecto en proteínas se usa SDS. Como este detergente tiene carga negativa, al unirse a una parte hidrofóbica y formar una hidrofílica compensa la relación carga – tamaño. Hay que tener en cuenta que el SDS rompe los enlaces disulfuro. Cromatografía en columna 26 SEGUNDO PARCIAL El ciclo celular La división de todas las células ha de ser finamente regulada y coordinada con el crecimiento celular y con la replicación del ADN, para asegurar la formación de una progenie de células que contengan sus genomas completos. En las células eucariotas, la progresión a lo largo del ciclo celular la controla una serie de proteínas quinasas que se han conservado desde las levaduras hasta los mamíferos. El ciclo celular se divide en dos etapas fundamentales: mitosis e interfase. Durante la interfase los cromosomas se descondensan y se distribuyen por el núcleo, por lo que el mismo presenta un aspecto uniforme. Sin embargo, a nivel molecular, en la interfase es cuando ocurren el crecimiento celular y la replicación del ADN de manera sucesiva, lo que deja a la célula preparada para la división. El ciclo de las células eucariotas se divide en cuatro fases diferenciadas. La fase M del ciclo corresponde a la mitosis a la que suele seguir la citocinesis. A esta fase le sigue la G1 (Gap 1) que corresponde al intervalo entre la mitosis y el comienzo de la replicación del ADN. Durante G1 la célula es metabólicamente activa y está creciendo, pero no replica su ADN. Seguidamente tiene lugar la fase S, durante la cual se produce la replicación del ADN (además sigue creciendo la célula). Tras finalizar la síntesis del ADN se produce la fase G2 durante la que prosigue el crecimiento de la célula y en la que se sintetizan proteínas en preparación para la mitosis. Algunas células del animal adulto cesan por completo su división (como las células nerviosas) y muchas otras solo se dividen ocasionalmente, cuando es necesario reemplazar la perdida de las células debido a una lesión o a la muerte celular. Por ejemplo, fibroblastos de la piel, células del hígado, riñón o pulmón. Estas células salen de G1 para entrar en un estado de reposo del ciclo denominado G0, en el que permanecen activas metabólicamente pero no proliferan a no ser que sean requeridas para ello mediante las señales extracelulares apropiadas. 27 Distintas parejas constituidas por ciclinas y proteína quinasas relacionadas con Cdk 1 regulan la progresión a través de las etapas del ciclo. La actividad de las Cdk se regula mediante su asociación con las ciclinas, mediante fosforilaciones activadoras e inhibidoras, y mediante la unión de inhibidores de Cdk. La progresión de las células a través del ciclo de la división celular también se regula por señales extracelulares del medio, así como por señales internas que supervisan y coordinan los diversos procesos que tienen lugar durante las diferentes fases del ciclo celular. Esto se consigue mediante una serie de puntos de control que regulan la progresión a través de las diferentes fases del ciclo celular. Uno de los puntos de regulación principales del ciclo celular, en muchos tipos celulares, se encuentra avanzada la fase G1, y controla el paso de G1 y a S. Este punto de regulación se definió por primera vez en estudios de levadura de gemación, donde se le conoce como START. Una vez que las células han rebasado el START, quedan determinadas a entrar en la fase S y a sufrir un ciclo de división celular. Sin embargo, rebasar el punto START es un proceso que esta finamente regularizado en el ciclo celular de la levadura, siendo controlado a través de señales externas, como la disponibilidad de nutrientes, y por el tamaño celular. Además de servir como un punto de decisión para supervisar señales extracelulares, START es el punto en el que se coordina el crecimiento de la célula con la replicación del ADN y con la división celular. La proliferación de la mayoría de las células animales se regula en la fase G1 del ciclo celular. Concretamente, un punto de decisión de la G1 avanzada, denominado punto de restricción en las células animales, funciona de manera análoga a como lo hace START en las levaduras. Sin embargo, a diferencia de las levaduras, el paso de las células animales a través del ciclo celular se regula, principalmente, por factores de crecimiento extracelulares que son señales de proliferación celular, en vez de por la disponibilidad de nutrientes. En presencia de los factores de crecimiento apropiados, las células atraviesan el punto de restricción y entran en la fase S. Si los factores de crecimiento adecuados no están disponibles en G1, la progresión a través del ciclo celular se para en el punto de restricción. La célula entra en un estado de reposo del ciclo celular (G0) en el que puede permanecer indefinidamente sin proliferar. Cabe destacar que algunos ciclos celulares se controlan, en cambio, en G2. 28 Los sucesos que tienen lugar durante las diferentes etapas del ciclo celular han de coordinarse entre sí de tal manera que ocurran en el orden adecuado. Por ejemplo, la célula no debe entrar en mitosis hasta haber finalizado la replicación del genoma. En la mayoría de las células, esta coordinación entre las diferentes fases del ciclo celular depende de un sistema de puntos de control que previenen la entrada en la siguiente fase del ciclo celular hasta que los eventos de la fase precedente hayan sido completados. Varios puntos de control de daños al ADN garantizan que el ADN dañado no se replicará ni se transmitirá a las células hijas. Estos detectan secuencias de ADN dañado o replicado parcialmente y coordinan la progresión del ciclo celular para completar la replicación o reparación del ADN. Por ejemplo, el punto de control en G2 impide el comienzo de la mitosis en tanto la célula no haya completado la replicación o reparado lesiones existentes. De esta manera similar, en G1 se repara cualquier lesión en el ADN con anterioridad al inicio de la fase S, en la que se replicaría el ADN dañado. Otro punto de control importante tiene lugar al final de la mitosis. Este supervisa que los cromosomas se alineen de manera correcta en el huso mitótico, lo que asegura que se distribuya un juego completo de cromosomas a cada célula hija. Existe una familia de proteínas (denominadas proteínas MCM) que se unen a los orígenes de replicación junto con las proteínas del complejo del origen de replicación (ORC). Estas proteínas MCM se encargan de regular y restringir la replicación del ADN a una vez por ciclo celular. La fase M es en la que se produce la reorganización de casi todos los componentes de la célula. Durante la mitosis (división nuclear) los cromosomas se condensan, la envoltura nuclear de la mayoría de las células se desintegra, el Citoesqueleto se reorganiza para formar el huso mitótico y los cromosomas migran a polos opuestos. Tras la segregación de los cromosomas se suele producir la división de la célula (citocinesis). La mitosis se divide en cuatro etapas: Profase, metafase, anafase y telofase. El comienzo de la profase queda determinado por la aparición de los cromosomas condensados, cada uno de los cuales está constituido por dos cromátidas hermanas (las moléculas de ADN hijas que se produjeron en la fase S). Las cromátidas hermanas condensadas se mantienen unidas a través del centrómero, región cromosómica a la que se unen proteínas dando lugar al cinetocoro (lugar de anclaje de los microtúbulos del huso). Además, durante la profase se producen cambios en el citoplasma que conducen al desarrollo del huso mitótico. El huso mitótico está compuesto por microtúbulos que forman dos tipos de fibras: fibras polares y fibras cinetocóricas, que se extienden desde cada polo hasta insertarse en los cinetocoros de los cromosomas duplicados. La mayor parte de los dímeros de tubulina que forman los microtúbulos del huso, provienen del citoesqueleto que se desarticula al comienzo de la mitosis. Después de la división celular, el huso se desarma de nuevo, el citoesqueleto se reorganiza y la célula adopta su configuración de aparente reposo. 29 Los centrosomas (que se duplicaron en la interfase) se separan y migran a lados opuestos del núcleo. Ahí actúan como los dos polos del huso mitótico, que comienza a formarse durante la profase tardía. En los eucariotas superiores el final de la profase se corresponde con la rotura de la envoltura nuclear. Sin embargo, algunas eucariotas unicelulares sufren mitosis cerrada en la que la envoltura nuclear permanece intacta. Una vez terminada la profase, la célula entra en prometafase. Durante esta, los microtúbulos del huso mitótico se anclan a los cinetocoros de los cromosomas condensados. Los cinetocoros de las cromátidas hermanas se disponen a los dos lados opuestos del cromosoma, por lo que se unen a los microtúbulos que surgen de los polos opuestos del huso. Los cromosomas se mueven hasta que se alinean en la placa metafásica en la mitad del huso. Llegado a este punto, la célula ha alcanzado la metafase. La transición de metafase a anafase se produce por la rotura de la unión entre las cromátidas hermanas, las cuales se separan migrando a polos opuestos del huso. La mitosis finaliza con la telofase, durante la cual los núcleos se regeneran y los cromosomas se descondensan. La citocinesis normalmente comienza durante la anafase tardía y se completa al final de la telofase, dando lugar a dos células hijas en interfase. Normalmente, tras la conclusión de la mitosis se produce la citocinesis. Esta suele comenzar, 30 en la mayoría de los casos, en la anafase tardía y se desencadena por la activación del Cdk 1. La citocinesis de las células animales se produce mediante un anillo contráctil de filamentos de actina y miosina II que se forma debajo de la membrana plasmática. La célula finalmente se divide por un plano que atraviesa la placa de metafase perpendicular al huso. A medida que los filamentos de actina y miosina se contraen, estos tiran de la membrana plasmática, lo que hace que la célula se estrangule y quede dividida en dos. A continuación, se rompe el puente entre las dos células hijas y la membrana plasmática se vuelve a sellar. El mecanismo de la citocinesis es diferente en células de plantas superiores. En vez de ser estranguladas y divididas en dos por el anillo contráctil, estas células se dividen mediante la formación de nuevas paredes celulares y de nuevas membranas plasmáticas dentro de la célula. Meiosis: La reproducción sexual requiere en general de dos progenitores y siempre involucra dos procesos: la meiosis y la fecundación. Cada organismo tiene un número de cromosomas característico de su especie. Las células sexuales o gametos tienen exactamente la mitad del número de cromosomas que las células somáticas del 31 organismo. El número de cromosomas de los gametos se conoce como numero haploide y el de las células somáticas como numero diploide. Cuando un gameto masculino fecunda a un gameto femenino, los dos núcleos haploides se fusionan (n + n = 2n). La célula diploide producida por la fusión de dos gametos se conoce como cigoto. En toda célula diploide cada cromosoma tiene su par. Los pares de cromosomas se conocen como pares homólogos y los miembros de cada para se asemejan en tamaño y forma y también en el tipo de información genética que contienen. La meiosis además de mantener un número constante de cromosomas de generación en generación, es una fuente de nuevas combinaciones de material genético. Esta consiste en dos divisiones nucleares sucesivas que da por resultado final 4 células hijas. Cada núcleo hijo contiene la mitad del número de cromosomas presentes en el núcleo progenitor. La interfase de la meiosis es igual a la de la mitosis. Las ocho fases de la meiosis son: Profase I: los microtúbulos del huso se organizan y se extienden radialmente desde los polos de la célula. Se desintegra la envoltura nuclear y se aparean y entrecruzan los cromosomas homólogos. Metafase I: los pares homólogos se alinean en el plano ecuatorial. La región del centrómero de cada homologo se duplica y las fibras del huso se asocian con los cinetocoros. Anafase I: los homólogos formados por dos cromátidas hermanas se separan siendo tironeados por las fibras cinetocóricas, sin embargo, las dos cromátidas hermanas de cada homologo no se separan como en la mitosis. Telofase I: los cromosomas homólogos se han movido hacia los polos. Según las especies pueden formarse o no nuevas envolturas nucleares y la citocinesis puede ocurrir o no. Profase II: las envolturas nucleares se desintegran y comienzan a aparecer nuevas fibras del huso. Metafase II: Las fibras del huso se asocian otra vez a los cinetocoros y se extienden otras fibras del huso. Anafase II: al igual que en la anafase de la mitosis, las cromátidas se separan una de otra, se mueven hacia uno de los polos. Telofase II: los microtúbulos del huso desaparecen y se forma una envoltura nuclear alrededor de cada conjunto de cromosomas. 32 Citocinesis: se produce la división del citoplasma, tal como ocurre luego de la mitosis. Al comienzo de la profase de la primera división meiótica ocurre un hecho clave para la meiosis: los cromosomas homólogos de acercan y se aparean en el proceso de sinapsis. Mientras los cromosomas homólogos están apareados se produce el entrecruzamiento o crossing over. En los puntos donde hay entrecruzamiento, un fragmento de cromátida de un homologo se rompe y se intercambia por un fragmento de cromátida del otro homologo. Este mecanismo permite la recombinación del material genético de los dos progenitores En la imagen se ve la comparación entre la mitosis y la meiosis, partiendo de una célula 2n = 4. Lo obtenido de cada una es: Mitosis: 2 x (2n = 4) Meiosis: 4 x (n = 2) 33 Fotosíntesis Es el proceso por el cual se transforma la energía lumínica del sol en energía química que puede ser aprovechada. Alimento: compuesto orgánico que puede ser degradado por un ser vivo para obtener energía y materia prima para sintetizar sus moléculas. Nutriente: sustancias inorgánicas y agua. Heterótrofos: se alimentan degradando otros organismos. Autótrofos: fabrican su propio alimento. Fase lumínica y fase biosintética: En las reacciones de la fase lumínica, la energía de la luz solar dirige la síntesis de ATP y NADPH, acoplada a la formación de O2 a partir del H2O. En las reacciones de la fase biosintética, el ATP y el NADPH producido en la fase lumínica dirigen la síntesis de glucosa. En las células eucariotas, tanto la fase lumínica como la biosintética tienen lugar en los cloroplastos, (las reacciones de la fase lumínica en la membrana tilacoidal y las reacciones de la fase biosintética en el estroma). Cloroplastos Son depósitos de energía, almacenan almidón. Como almacenan tanto hay lípidos (“gotitas de aceite”) repartidos. No todas las células vegetales realizan fotosíntesis (el tallo, por ejemplo). Los cloroplastos son responsables de la conversión fotosintética de CO2 en carbohidratos. Además, los cloroplastos sintetizan aminoácidos, ácidos grasos y los componentes lipídicos de sus propias membranas. Transporte de electrones La luz solar es absorbida por los pigmentos fotosintéticos, siendo las clorofilas los más abundantes en las plantas. La absorción de luz excita un electrón a un estado energético más elevado, convirtiendo así la energía de la luz solar en energía química potencial. Los pigmentos están organizados en fotosistemas en la membrana del tilacoide. Las numerosas moléculas de pigmento en cada fotosistema actúan como antenas, absorbiendo la luz y transfiriendo la energía de sus electrones excitados a una molécula de clorofila que sirve como centro de reacción. 34 La clorofila del centro de reacción transfiere a continuación su electrón de alta energía a una molécula aceptora de una cadena de transporte de electrones. Los electrones de alta energía se trasfieren entonces a través de una serie de transportadores de membrana, acoplados a la síntesis de ATP y de NADPH. La transferencia de electrones esta acoplada a la transferencia de protones a la luz del tilacoide, estableciéndose así un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide. La energía almacenada en este gradiente de protones se obtiene posteriormente por un complejo de proteínas de la membrana del tilacoide, la ATP sintasa, que acopla un flujo retrogrado de protones, a través de la membrana, a la síntesis de ATP. Una diferencia importante entre el trasporte de electrones en los cloroplastos y en las mitocondrias es que la energía derivada de la luz solar durante la fotosíntesis no solo es convertida en ATP, sino que también se utiliza para generar el NADPH requerido para convertir el CO2 en carbohidratos. Esto se consigue utilizando dos fotosistemas diferentes en la fase lumínica de la fotosíntesis, uno para generar ATP y el otro para generar NADPH. Los electrones se transfieren de forma secuencial entre los dos fotosistemas, interviniendo el fotosistema I para generar NADPH y el fotosistema II para generar ATP. El flujo de electrones se inicia en el fotosistema II. En este la energía derivada de la absorción de los fotones se utiliza para romper moléculas de agua en oxigeno molecular y protones, con el fin de obtener electrones. Esta reacción tiene lugar en la luz del tilacoide, por lo que la liberación de protones a partir de H2O determina un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide. Los electrones de alta energía derivados de este proceso se transfieren a través de una serie de transportadores a la plastoquinona. Esta trasporta los electrones desde el fotosistema II al complejo citocromo B-F (que es la única bomba de H+), en el que los electrones son transferidos a la plastocianina. De esta manera, el transporte de electrones a través del fotosistema II esta acoplado a la generación de un gradiente de protones, que dirige la síntesis qumiosintética de ATP. Desde el fotosistema II, los electrones son transportados por la plastocianina (proteína periférica de membrana) hasta el fotosistema I, donde la absorción de otros fotones vuelve a generar electrones 35 de alta energía. El fotosistema I, sin embargo, no actúa como una bomba de protones, sino que utiliza estos electrones de alta energía para reducir el NADP+ a NADPH. La clorofila del centro de reacción del fotosistema I transfiere sus electrones excitados a través de una serie de transportadores hasta la ferredoxina, una pequeña proteína de la membrana del tilacoide que da al estroma. Esta puede formar un complejo con la enzima NADP reductasa, que transfiere los electrones de la ferredoxina al NADP+, generando NADPH, que son utilizados por las enzimas del ciclo de Calvin en el estroma del cloroplasto para convertir CO2 en carbohidratos. Una segunda ruta de transporte de electrones, denominada flujo cíclico de electrones, genera ATP sin la síntesis de NADPH, proporcionando de este modo ATP adicional para otros procesos metabólicos. En el flujo cíclico de electrones, la energía de la luz obtenida en el fotosistema I se utiliza para la síntesis de NADPH. Por tanto, la transferencia de electrones desde el fotosistema I puede generar ATP o NADPH, dependiendo de las necesidades metabólicas de la célula. Ciclo de Calvin En las reacciones biosintética, el ATP y el NADPH producidos en las reacciones luminosas promueven la síntesis de carbohidratos a partir del CO2 y H2O. Las moléculas de CO2 se añaden una a una al ciclo de Calvin que conduce a la formación de carbohidratos. En total, el ciclo de Calvin consume 18 moléculas de ATP y 12 de NADPH por cada molécula de glucosa sintetizada. Se necesitan dos electrones para convertir cada molécula de NADP+ a NADPH, así que deben pasar 24 electrones por la cadena de transporte de electrones para generar suficiente NADPH para sintetizar una molécula de glucosa. Estos electrones se obtienen de la conversión de 12 moléculas de H2O a seis moléculas de O2, lo que produce la formación de seis moléculas de O2 por cada molécula de glucosa. En la imagen se muestra la síntesis de una molécula de glucosa a partir de seis moléculas de CO 2. Cada molécula de CO2 se añade a la ribulosa 1,5 – bifosfato para producir dos moléculas de 3 – fosfoglicerato. Estas seis moléculas de CO2 conducen, de este modo, a la formación de 12 moléculas de 3 – fosfoglicerato, que son convertidas en 12 moléculas de gliceraldehido 3 – fosfato con un gasto de 12 moléculas tanto de ATP como de NADPH. Dos moléculas de gliceraldehido 3 – fosfato son 36 empleadas a continuación para la síntesis de glucosa y diez moléculas continúan en el ciclo de Calvin para dar lugar a seis moléculas de ribulosa 5 – fosfato. El ciclo se completa entonces con el uso adicional de seis moléculas de ATP para la síntesis de ribulosa 1,5 – difosfato. Respiración Glucolisis Ciclo de Krebs Fosforilacion Oxidativa Glucolisis En este proceso se degrada una molécula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas enzimáticamente dando 2 moléculas del compuesto de 3 carbonos llamado piruvato. Parte de la energía libre cedida se conserva como ATP y NADH. El proceso ocurre en el citosol. La glucolisis está dividida en 2 fases: 1) Fase preparatoria: Glucosa Glucosa-6-fosfato (por lo que queda atrapada en la membrana) Fructosa-6-fosfato + Pi Fructosa 1,6 bifosfato Rotura de un azúcar fosfato de 6 carbonos a 2 azucares fosfato de 3 carbonos = Gliceraldehido 3 - fosfato y dihidroxiacetona fosfato. Estos son pasos enzimáticos no reversibles. 2) Fase de Beneficios: (2) Gliceraldehido 3-fosfato Se oxida y fosforila 2 NADH + H+ y 1,3 bifosfoglicerato (2) 3 fosfoglicerato + 2 ATP 2 - fosfoglicerato (2) fosfoenalpiruvato (2) + Agua Piruvato (2) + 2 ATP 37 1) Fosforilacion de la glucosa y su conversión en gliceraldehido-3- fosfato (2) 2) Conversión oxidativa del gliceraldehido-3-fosfato en piruvato con formación acoplada de ATP y NADH. En total se obtienen 2 moléculas de ATP y 2 NADH+. El piruvato contiene todavía una gran parte de la energía que se encontraba almacenada. 38 Vías del Piruvato Si no hay oxígeno en el medio, el aceptor final de electrones es un compuesto diferente, esta vía se denomina anaeróbica, en la que encontramos: En presencia de oxigeno es una respiración aeróbica, que consta de la oxidación progresiva del ácido pirúvico a CO2 y agua. Paso intermedio: oxidación del piruvato. Antes de ingresar al ciclo de Krebs la molécula de piruvato debe oxidarse quedando así un grupo acetilo de 2 carbonos. Cada grupo acetilo es aceptado momentáneamente por un compuesto llamado Coenzima A. Esto ocurre en la mitocondria, en el espacio intracelular. Piruvato Acetil CoA + CO2 39 Al encontrarse en un medio aeróbico entonces, entra en el: Ciclo de Krebs Al entrar al ciclo de Krebs, que ocurre en la matriz mitocondrial el grupo acetilo se combina con un compuesto de 4 carbonos (oxalacetato) y produce un compuesto de seis carbonos (ácido cítrico). En el curso de este ciclo, cuya función principal es obtener electrones de alta energía en NADH y FADH2, dos de los seis carbonos se oxidan a CO2 y se regenera el ácido oxalacetico y de esta forma se arma un ciclo: Fosforilacion Oxidativa: Cadena de transporte de electrones Esto ocurre dentro de la membrana mitocondrial. El Oxigeno es el último aceptor de la cadena de transporte de electrones. O2 H2O 40 Su objetivo es generar un gradiente, se bombea al espacio intermembranal una gran cantidad de protones esto a su vez, va a generar una fuerza protón- motriz, que impulsara a la ATP-Sintasa a la síntesis de ATP. Únicamente los complejos I, III y IV bombean protones. En el complejo II entra el FADH2 para generar FAD. ATP Sintasa: Gracias al gradiente la ATP sintasa utiliza un H+ para lograr un doceavo de vuelta, sus subunidades cuentan con un espacio vacío, otro con ATP y otro con ADP + Pi. Esta vuelta fuerza a un cambio conformacional que desprende el ATP, forma un ATP nuevo (con ADP + Pi) y agrega ADP + Pi en la hendidura vacía. Neuronas e Impulso Nervioso Las células nerviosas distan formadas por un cuerpo o soma que contiene al núcleo. El núcleo presenta múltiples prolongaciones cortas, las dendritas, y una prolongación extensa, el axón. Las neuronas reciben información a través de las dendritas, esta información se procesa en el soma y se conduce a lo largo del axón hasta la siguiente sinapsis con otra neurona. La excitabilidad de los tejidos nervioso y muscular depende de cambios eléctricos que se producen a través de su membrana plasmática. Así, el potencial eléctrico de membrana puede permanecer constante en el tiempo o puede variar y conducirse de un lado a otro de las células excitables como un impulso nervioso. Cuando las células excitables no están estimuladas se encuentran en un potencial de reposo y cuando están frente a cambios transitorios en respuesta a estímulos se encuentran en un potencial de acción. El potencial en el reposo a través de la membrana es negativo. La acción continua de los sistemas de transporte activo y pasivo le permite a una célula mantener estados estacionarios. Por ejemplo, a través de canales iónicos específicos de Na+ y K+, se mantiene la concentración de Na+ extracelular 41 mucho mayor que la intracelular y viceversa con K+. La migración iónica se debe a la diferencia de potencial electroquímico del ion entre dos puntos. El K+ tiene canales abiertos y su gradiente electroquímico favorece su pasaje hacia el exterior. Esta fuga de K+ produce un déficit de cargas positivas en el interior celular y una acumulación de esas cargas en el exterior. Debido a que dentro de la célula predominan las cargas negativas de las proteínas, aminoácidos, nucleótidos, etc., en el potencial de reposo, el interior de la célula es negativo con respecto al exterior. Cuando un estímulo químico o eléctrico alcanza la membrana y hace que su potencial de membrana supere un potencial umbral determinado, induce la apertura de un gran número de canales de Na+ sensibles al potencial eléctrico, lo cual provoca un aumento repentino de la permeabilidad al Na+. El potencial de membrana cambia con rapidez y se torna a +40mV. Este cambio de potencial de membrana hacia valores positivos se denomina despolarización y constituye la etapa inicial del potencial de acción. El cambio de permeabilidad al Na+ dura aproximadamente 0.5 ms. Luego estos canales pasan a un estado inactivo y así la membrana torna a su estado previo de baja permeabilidad a Na+. Mientras tanto en respuesta al cambio del potencial hacia valores positivos, aunque más lentamente, otros canales de K+ fueron aumentando la permeabilidad de la membrana al mismo. Como resultado, frente a la salida de cargas positivas acarreadas por el K+, esta entra en una fase llamada repolarización, en la que vuelve a aproximarse al potencial de reposo negativo. Al final se lleva a un breve estado de hiperpolarizacion, para volver a cerrar los canales de K+. Etapas del potencial de acción: Reposo. Despolarización. Sobreexcitación. Repolarización. 42 Propagación del impulso nervioso Una vez que la inversión transitoria del potencial de membrana se inicia, continúa desplazándose a lo largo del axón (auto propaga), renovándose continuamente (auto refuerza). Esto se debe a que al desencadenarse el potencial de acción por la apertura de canales de Na+ sensibles al potencial eléctrico, la inversión del potencial de membrana también afecta a áreas adyacentes en donde se encuentran canales de Na+ similares. Los axones largos de los vertebrados por lo general están envueltos en vainas de mielina, formadas por células gliales especializadas. En el sistema nervioso central, ciertas células especializadas, los oligodendrocitos, proveen la vaina de mielina, mientras que en el periférico la forma las células de Schwann. La vaina de mielina no es simplemente un aislante, su característica más importante es que esta interrumpida a intervalos regulares en los llamados nodos de Ranvier. Solo en los nodos los iones de Na+ y K+ pueden moverse a través de la membrana del axón. Así en las fibras mielinizadas el potencial de acción “salta” de un nodo a otro. Esta conducción saltatoria incrementa en gran medida la velocidad. Si bien en el axón la conducción puede ser bidireccional, en la naturaleza el impulso nervioso se mueve en una sola dirección desde el cono axonico hacia el teledendron, la arborización terminal de axón. Esto se debe a que el origen de los potenciales de acción se encuentra en la zona inicial del axón. Los canales de Na+, inmediatamente luego de abrirse, pasan a un estado inactivo y debe transcurrir cierto tiempo para que de nuevo estén las condiciones de abrirse. Así el segmento del axón tiene un periodo refractario que dura varios milisegundos. Sinapsis Sinapsis eléctrica: Los iones fluyen a través de uniones comunicantes, que se producen entre las membranas celulares de las neuronas involucradas en la unión, estas uniones comunican los citoplasmas de neuronas íntimamente yuxtapuestas (Gap Junctions) y las corrientes iónicas pre sinápticas pueden transmitirse de forma pasiva a la siguiente neurona y regenerar el potencial de acción Sinapsis Química: Las dos neuronas nunca se tocan, un espacio conocido como hendidura sináptica, separa a la célula que transmite la información de la célula que recibe la información. La información se transmite a través de la hendidura sináptica por medio de moléculas señalizadoras. 43 Cuando un potencial de acción llega a la terminal axonico, altera el potencial de membrana y se abren entonces los canales de Ca2+ que permite que estos fluyan hacia el interior del axón. Este flujo hace que las vesículas sinápticas se fusionen con la membrana celular y vacíen su contenido de transmisores químicos en la hendidura sináptica. Las moléculas transmisoras se unen con moléculas receptoras, esta unión desencadena una serie de acontecimientos que puede o no disipar un potencial de acción. Musculo y Placa Neuromuscular Un musculo consiste en cientos de miles de fibras musculares unidas por tejido conjuntivo. Cada fibra es una sola célula multinucleada y está rodeada por una membrana celular externa, el sarcolema, que posee invaginaciones denominadas tubos T. El sarcolema puede disparar y propagar un potencial de acción. Dentro del citoplasma de cada fibra muscular hay unas 1000 a 2000 miofibrillas, pequeñas unidades estructurales y funcionales de la fibra muscular. Las miofibrillas- formadas por microfilamentos de actina y miosina- corren paralelas y fuertemente compactadas a lo largo de la célula. Cada miofibrilla está rodeada por el retículo sarcoplasmatico. Los sacos del retículo sarcoplasmatico contienen grandes concentraciones de iones Ca2+. Las miofibrillas están organizadas en unidades llamadas sarcomeros, los cuales se repiten uno tras otro, en serie dándole al musculo su patrón estirado característico. También hay una proteína de peso molecular muy alto, muy elástica que mantiene en su posición a los filamentos de miosina llamada titina. 44 Cuando se estimula una fibra muscular y se da comienzo a la contracción muscular, las cabezas de las moléculas de miosina se aproximan al filamento delgado de actina, al cual se unen formando los “puentes cruzados”. Las cabezas describen un movimiento como el de un remo, empujando y deslizando a ambos tipos de filamentos entre sí. El resultado es el acortamiento de las líneas Z que bordean el sarcomero y finalmente, el de toda la fibra muscular. La hidrolisis del ATP por la molécula de miosina provee la energía para el ciclo de formación de los puentes cruzados entre la cabeza de miosina y el filamento de actina y la rotación de las cabezas de miosina La regulación de la contracción en el musculo depende de dos proteínas, la troponina y la tropomiosina, y del ion Ca2+.Las moléculas de tropomiosina corren a lo largo de las moléculas de actina del filamento delgado; bloquean así los sitios activos de unión de los puentes cruzados de actina-miosina. Las moléculas de troponina se ubican a intervalos regulares sobra las cadenas de tropomiosina. Frente a la presencia de Ca2+, las moléculas de troponina cambian su conformación, lo cual provoca el desplazamiento de las cadenas de tropomiosina y la exposición de los sitios activos de unión de la actina que permiten la formación de los puentes cruzados. La disponibilidad de Ca2+ y el consecuente inicio de la contracción dependen de la estimulación del musculo como resultado de una señal recibida desde una neurona motora que secreta acetilcolina activando canales de sodio. Comunicación Celular Señalización celular: mecanismos empleados por las células para comunicarse entre sí. Moléculas de señalización celular: representan información que es enviada de una célula a otra para comunicarse (extracelulares). Recepción de señales: Depende de proteínas receptoras ubicadas en la membrana que se unen con la molécula señal lo que activa uno o varios caminos de señalización intracelular. 45 Las proteínas efectoras se encargan de: Alterar el metabolismo (enzimas). Alterar la expresión genética (proteínas de regulación de transcripción). Alterar la forma o movimiento (células del citoesqueleto). Todo cambio físico o químico es recibido por receptores que desencadenan una respuesta celular. Transducción de señales Es la conversión de una señal extracelular (información) en una señal intracelular (respuesta). Es una propiedad universal de las células vivas ya que estas responden a antígenos, hormonas, luz, etc. Características de la transducción de señales: Especificidad y alta afinidad: Complementariedad reversible y precisa entre la molécula señal y el receptor. Además, los receptores para una señal determinada solo están presentes en ciertos tipos de células. Una misma señal puede tener diferentes significados para diversas células diana. Amplificacion por cascadas enzimáticas: La activación de una enzima primaria cataliza la activación de nucleasas enzimas secundarias, cada una de las cuales activa muchas enzimas terciarias y así sucesivamente. El número de moléculas activadas crece geométricamente. Desensibilización: Cuando una señal está presente continuamente se produce una desensibilización del receptor. La presencia del ligando activa un circuito de retroalimentación que desconecta al receptor. Integración: Es la capacidad del sistema para recibir múltiples señales y producir una respuesta unificada apropiada. El análisis de Scatchard cuantifica la interacción receptor – ligando. Por ejemplo, se busca medir la afinidad de la adrenalina a un determinado receptor. Primero se introduce una gran concentración de adrenalina marcada (radioactivamente) y se cuantifica la fijación total. Luego se aumenta en gran medida la concentración de la adrenalina no marcada y se cuantifica la fijación inespecífica. Mediante estas dos curvas se puede obtener la fijación específica de la adrenalina al receptor. Tipos de señales: Señales parácrinas: Una célula libera una señal al medio extracelular que llega a las células vecinas. Señales sinápticas: Neuronas transmiten señal eléctrica por el axón y se liberan neurotransmisores. 46 Señales endocrinas: Viajan por el torrente sanguíneo. Es la comunicación de células muy alejadas entre sí. Contacto dependiente: Es necesario el contacto de las membranas mediante Gap Junctions. Estas conectan eléctrica y metabólicamente a las células. Promueven la rápida propagación de señales. Las células pueden intercambiar iones y pequeñas moléculas solubles. Además pueden responder a señales extracelulares coordinadamente. Mecanismos de señalización intracelular Receptores acoplados a proteína G Las proteínas G son proteínas heterotrimericas, poseen tres subunidades diferentes. En su estado inactivo la subunidad alfa lleva GDP unido. Cuando el ligando se une al receptor, este complejo se asocia con la proteína G y le provoca un cambio conformacional que induce el intercambio de GDP por GTP. La proteína G se desplaza hacia otra proteína de membrana inactiva y se une activándola. Esto provoca que se altere la actividad de dicha proteína y desencadena una respuesta celular. Tomemos como ejemplo la vía de las adenilil ciclasas (adrenalina) La adrenalina se une a su receptor específico. El receptor ocupado cambia la conformación de su dominio intracelular que promueve un cambio en la proteína G. La subunidad alfa desplaza el GDP y une GTP. Esto induce la disociación de la proteína G en alfa y beta – gama. Se activa la subunidad alfa y se desplaza hacia la adenilil ciclasa y la activa. La adenilil ciclasa cataliza el ciclado de AMP en AMP cíclico que funciona como segundo mensajero (moléculas que se producen en exceso como respuesta a una señal de afuera). El AMPc activa a la PKA que puede fosforilar sus sustratos. Esta fosforila a la glucógeno fosforilasa b quinasa que inicia el proceso de movilización del glucógeno para satisfacer las necesidades energéticas de la célula, alterando finalmente el metabolismo. Como la subunidad alfa es auto limitante, convierte el GTP unido en GDP auto desconectándose. Se disocia de la proteína a la que se había unido y vuelve a unirse a las otras dos subunidades. De esta forma, la proteína queda desactivada al irse la proteína G. Además, el incremento de AMPc es transitorio porque es transformado en 5’ –AMP por la fosfodiesterasa cerrándose el ciclo de señalización. 47 Receptores acoplados a enzimas El mejor ejemplo es el receptor de insulina. La unión de insulina produce la unión de dos receptores formando un dímero. Esto activa la parte enzimática, la tirosina quinasa. Las tirosinas adicionan Pi provenientes de ATP. Ahora la tirosina quinasa puede fosforilar proteínas intracelulares. Se produce una cascada de señalización, una amplificación de la señal y la fosforilacion de proteínas específicas. Luego se traduce la señal del ligando al interior de la célula, se activan vías para la respuesta celular mediante interconexiones entre las vías de señalización. Aquí se lleva a cabo la integración y regulación de múltiples efectos hormonales. Canales iónicos de compuerta Células excitables detectan una señal externa, la convierten en una señal eléctrica y la transmiten. La excitabilidad de estas células depende de canales iónicos. Existen canales iónicos dependientes de voltaje (como los que se ubican en los nodos de Ranvier de las células nerviosas) y otros dependiente de ligando (como los que se ubican en el soma de las células nerviosas). Receptores nucleares La regulación se lleva a cabo por hormonas esteroides, tiroideas, retinoides y vitamina D. La hormona es transportada por proteínas hacia sus tejidos diana. Difunden a través de la membrana plasmática y se unen a proteínas receptoras específicas en el núcleo. Provoca cambios conformacionales en el receptor y de esta forma se puede unir a secuencias específicas de ADN. 48 Vía de las guanilil ciclasas Las guanilil ciclasas son receptores enzimáticos que cuando se activan convierten el GTP en el segundo mensajero GMPc. El aumento de GMPc activa a la proteína PKG la cual fosforila proteínas diana específicas. El NO es una molécula pequeña que difunde por la membrana. Se une al grupo hemo de la guanilil ciclasa activándola. De esta forma se activa la producción de GMPc lo que estimula la PKG produciendo la relajación del musculo cardiaco. Las fosfodiesterasas catalizan la transformación en 5’ – GMP y esto lleva al fin de la señal. Tecnicas de Biología Molecular II El siguiente link lleva a un pdf que contiene brevemente explicadas la mayoría de las técnicas de biología molecular: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/23IngenGenet1_23749.pdf Blotting Es una técnica que permite la detección de una secuencia determinada en una mezcla compleja resultante de una corrida electroforética. Hibridación por sondas: Una sonda es un fragmento de tamaño variable que puede ser ADN o ARN, que se une específicamente por complementariedad de bases a la secuencia que se encuentra en la membrana de nylon junto con cientos de fragmentos más. La sonda hibrida con el fragmento específico. Una característica fundamental de la sonda es que lleva alguna marca para que pueda detectarse la unión y, por ende, identificar la secuencia de interés a la cual se unió. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas para marcar la sonda es la incorporación de un nucleótido radioactivo. Existen nucleótidos comerciales marcados con fosforo radioactivo que al incorporarse en una sonda por diferentes técnicas le permite ser detectada mediante la exposición de la membrana a una placa autorradiografica (como la de los rayos x). Extracción Digestión Electroforesis en gel Desnaturalización Transferencia a membrana Hibridación con sonda radioactiva Lavado Revelado Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda 49 Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Electroforesis Electroforesis Cuantitativa: Cuantificar que cantidad tengo en cada banda. Electroforesis Preparativa: Preparar para un trabajo posterior. La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa. La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipéptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida. SDS-Page Es una técnica para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores). Gracias al SDS las proteínas se desnaturalizan, perdiendo su conformación tridimensional. De este modo se obtiene un fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas. La disolución de proteínas que se van a analizar se mezcla en primer lugar con SDS, un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas, eliminando sus estructuras secundaria y terciaria (pero sin alterar los enlaces disulfuro y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa). Sin SDS, las distintas proteínas que tienen masas moleculares similares migran de forma diferente debido a diferencias en la proporción carga/masa, ya que cada proteína tiene un punto isoeléctrico distinto. Si la electroforesis se realiza así, sin añadir SDS, se habla de PAGE nativa. El problema se resuelve añadiendo SDS, puesto que al unirse y desplegar la proteína, le proporciona una carga negativa casi uniforme a lo largo de la longitud de la cadena polipéptidica. 50 PCR y otros El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar. Aislamiento y multiplicación de fragmentos específicos. Ensayo cíclico, de corta duración, alta especificidad y alta reproducibilidad. Pequeñas cantidades de ADN. Se necesita conocer la secuencia o al menos la secuencia flaqueante. Elementos necesarios: ADN molde que contiene la región de ADN a amplificar. ADN polimerasa termoresistente. Desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs). Dos primers. Una solución buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN pol. Termociclador, mantiene la temperatura necesario en cada etapa que conforma el ciclo. Un chip de ADN (microarray) es una superficie sólida a la cual se une una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicona. Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se monitorean de manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la sonda específica, y la molécula diana (target), y se indican generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo cual indica el nivel de expresión del gen. 51 Un enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 6 pares de bases, con las que son reconocidos. Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción: Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores. Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP. Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosilmetionina) como cofactores. Clonación del ADN La clonación del ADN comporta la separación de un gen especifico o de un fragmento de ADN de un cromosoma mucha mayor y su unión a una pequeña molécula de ADN portador, para después replicar este ADN modificado miles o millones de veces, como efecto a la vez del aumento del número de células del huésped y de la creación de múltiples copias del ADN clonado. 1: Cortar el ADN en lugares precisos: las endonucleasas específicas de secuencia (enzimas de restricción) hacen de tijeras moleculares. 2: Selección de una pequeña molécula de ADN capaz de autorreplicarse. Estos ADN se denominan vectores de clonación. Normalmente se trata de plásmidos o de ADN virosos. 3: Unión covalente de dos fragmentos de ADN: La enzima ADN ligasa une el vector de clonación y el de ADN que se desea clonar. Las moléculas de ADN compuestas de segmentos unidos covalentemente, procedentes de dos o más fuentes se denominan ADN recombinante. 52 4: Traslado de ADN del tubo de ensayo a una célula huésped, que proporcionara la maquinaria enzimática necesaria para la replicación del ADN. 5: Selección o identificación de las células huésped que contienen el ADN recombinante. Las endonucleasas de restricción reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas, generando una serie de fragmentos más pequeños. Luego el fragmento de ADN que debe clonarse se una a un vector de clonación adecuado mediante las ADN ligasas. Algunas endonucleasas de restricción realizan cortes indentados en las dos hebras del ADN, que dejan nucleótidos desapareados en cada extremo resultante, extremos cohesivos, ya que pueden aparearse entre sí o con otros extremos cohesivos. Otras cortan ambas cadenas del ADN en los enlace fosfodiester y no dejan ningún extremo, estas son extremos romos. Plásmidos: son moléculas de ADN circulares que se replican con independencia del cromosoma huésped. Pueden introducirse en las células bacterianas mediante un proceso llamado transformación. La estrategia más común consiste en incluir en el plásmido un gen que permita que la célula huésped crezca en determinadas condiciones, por lo que se puede regular que células sobrevivirán y cuáles no. Mendel Primera Ley o principio de uniformidad: Cuando se cruzan dos individuos de raza pura, los híbridos resultantes son todos iguales. AA x aa = Aa Segunda ley o principio de segregación: Ciertos individuos son capaces de transmitir un carácter, aunque en ellos no se manifieste. Dos individuos de la filial 1 (Aa) darán origen a una segunda filial en la cual reaparece el fenotipo a Tercera ley o principio de la combinación independiente: Mendel concluyó que diferentes rasgos son heredados independientemente unos de otros, no existe relación entre ellos, por lo tanto, el patrón de herencia de un rasgo no afectará al patrón de herencia de otro. Solo se cumple en aquellos genes que no están ligados (es decir, que están en diferentes cromosomas) o que están en regiones muy separadas del mismo cromosoma. 53 Fenotipo: El carácter visible del individuo. Apariencia física del organismo. Genotipo: El set especifico de alelos que forman el genoma de un individuo. Composición genética de un organismo (letras). Caracteres: Atributos (color, rugosidad, tamaño). Generación parental (p): Generación genéticamente pura. Filial: Es la descendencia (F1, F2). Alelo: Formas alternativas de los genes. Locus: Lugar que ocupan físicamente los genes. Dominante: Rasgo que se expresa en la F1. Recesivo: Rasgo que esta “escondido” en la F2. Homocigosis: Ambos alelos iguales. Heterocigosis: Ambos alelos distintos. Cruce mono híbrido: Son los que ocurren entre organismos que difieren en un solo carácter. Cruce di híbrido: Son los que ocurren entre organismos que difieren en dos caracteres. Genes ligados al sexo: En los cromosomas sexuales, además de existir genes relacionados con el sexo, existen otros genes para caracteres no sexuales o caracteres somáticos, cuya manifestación dependerá del sexo del individuo al ir en el cromosoma X o Y. En el caso de enfermedades como la hemofilia o el daltonismo, cuya manifestación se debe a la presencia de un alelo recesivo ligado al cromosoma X, por lo que en varones nunca puede aparecer en homocigosis, o existe el alelo dominante, o el recesivo, desarrollándose la enfermedad, mientras que en mujeres pueden existir individuos homocigotos dominantes, normales, heterocigotos, también normales pero que llevan el alelo de la enfermedad (mujeres portadoras) y se lo podrán pasar a sus hijos varones, e individuos homocigotos recesivos, que desarrollarán la enfermedad (en el caso de la hemofilia, el alelo recesivo en homocigosis es letal y provoca la muerte, por lo que no existen mujeres hemofílicas, sólo portadoras). Dominancia incompleta: La dominancia incompleta es la interacción genética en la cual los homocigotos son fenotípicamente diferentes a los heterocigotos. Los cruzamientos que tienen una dominancia incompleta son aquellos en los que no existe rasgo dominante, ni recesivo. Alelos múltiples: Es posible que existan más de dos formas de un gen. A pesar de que un organismo diploide puede poseer solamente dos alelos de un gen (y un organismo haploide solamente uno), en una población pueden existir un número total bastante alto de alelos de un mismo gen. Estos numerosos alelos, se denominan alelos múltiples y forman toda una serie alélica. El concepto de alelismo es crucial en genética. Los grupos sanguíneos ABO están determinados por alelos múltiples. En ellos existen tres alelos, tres dominantes A y B, y uno recesivo O. De estos tres alelos pueden existir cuatro grupos: A, B, AB, y O. 54 Herencia poligenica (Color de la piel): Algunos rasgos tienden a modificarse en sólo un gen. Estos rasgos siguen patrones simples de herencia. Sin embargo, muchas otras características están determinadas por genes múltiples de diferentes regiones del genoma. Éstas se denominan características poligénicas, y la herencia poligénica es el modo en que estos rasgos son heredados. El color de ojos y la altura son dos ejemplos comunes. Genes letales: Cuando la expresión de un alelo concreto provoca un cambio en el individuo, tal que induce su muerte, se denomina alelo letal, y el gen involucrado se denomina gen esencial. Se define entonces gen esencial como aquel gen que al mutar puede provocar un fenotipo letal. Un gen letal es por tanto un gen cuya expresión produce la muerte del individuo antes de que este llegue a la edad reproductora. Si la expresión de un gen en vez de causar la muerte del individuo causa un acortamiento de su ciclo biológico, un empeoramiento de su calidad de vida o algún daño en su organismo, se denomina gen deletéreo. Al igual que el resto de los genes, los alelos de los genes letales, así como los de los deletéreos, sus variables, pueden tener un carácter recesivo o dominante. Pueden existir genes letales dominantes que, con sólo presentar una copia de uno de los alelos, el individuo muere, pero no son muy abundantes, ya que con la muerte del individuo desaparece. Sin embargo, los genes letales recesivos se pueden transmitir a la descendencia, ya que para que causen su efecto, han de encontrarse ambas copias en el mismo individuo. Normalmente estos individuos no llegan a nacer ya que mueren en los primeros estadíos de desarrollo durante el desarrollo fetal. Codominancia (factores sanguíneos): Se denomina codominancia al proceso por el cual una especie manifiesta dos características dominantes en su fenotipo. En el caso de los grupos sanguíneos los alelos para el grupo A y para el grupo B son ambos dominantes (tener un alelo A y uno 0 es suficiente para que la persona sea grupo A, igual con B) por lo tanto cuando una persona tiene un alelo A y un alelo B ambos se expresan y la persona tiene grupo sanguíneo AB. 55 NAD+ Y NADH El dinucleótido de nicotinamida adenina, al igual que todos los dinucleótidos, está formado por dos nucleótidos unidos por un par de grupos fosfato que actúan como puente. Dichos nucleótidos consisten en dos anillos de ribosa: uno con adenina unida al primer átomo de carbono (en la posición 1') y otro con nicotinamida en la misma posición. La porción de nicotinamida se puede unir con dos orientaciones distintas a su átomo de carbono anomérico. Debido a estas dos posibles estructuras, el compuesto existe como dos diastereoisómeros, de los cuales el diastereoisómero β-nicotinamida de NAD+ es la forma que se encuentra en los organismos. Estos nucleótidos se unen juntos por un puente de dos grupos fosfato a través de los carbonos de la posición 5'. En el metabolismo, el compuesto acepta o cede electrones en reacciones redox. Tales reacciones (resumidas en la fórmula de abajo) implican la extracción de dos átomos de hidrógeno desde el reactivo (R), en la forma de un ion hidruro (H-), y un protón (H+). El protón se libera en la solución, mientras el reductor RH2 se oxida y el NAD+ se reduce a NADH debido a la transferencia del hidruro a los anillos de nicotinamida. RH 2 + NAD+ → NADH + H+ + R FAD Y FADH2 El FAD es una coenzima que interviene como dador o aceptor de electrones y protones (poder reductor) en reacciones metabólicas redox; su estado oxidado (FAD) se reduce a FADH2 al aceptar dos átomos de hidrógeno (cada uno formado por un electrón y un protón). Por tanto, al reducirse capta dos protones y dos electrones, lo que lo capacita para intervenir como dador de energía o de poder reductor en el metabolismo. Por ejemplo, el FAD (y también el NAD) se reduce en el ciclo de Krebs y se oxida en la cadena respiratoria (respiración aeróbica). La función bioquímica general del FAD es oxidar los alcanos a alquenos, mientras que el NAD + (una coenzima con similar función) oxida los alcoholes a aldehídos o cetonas. Esto es debido a que la oxidación de un alcano (como el succinato) a un alqueno (como el fumarato) es suficientemente exergónica como para reducir el FAD a FADH2, pero no para reducir el NAD+ a NADH. La reoxidación del FADH2 (es decir, la liberación de los dos electrones y dos protones capturados) tiene lugar en la cadena respiratoria, lo que posibilita la formación de ATP (fosforilación oxidativa). 56 Gusto y olfato Sentido químicos Los sentidos químicos, el gusto y el olfato, se encuentran entre las respuestas más elementales del ser vivo a su entorno. Los receptores del gusto y del olfato son quimioreceptores, se activan ante estímulos de naturaleza química. Los receptores del gusto son receptores secundarios, mientras que los del olfato son las neuronas aferentes primarias modificadas. La diferencia entre ambos respecto al estímulo radica en que los quimiorreceptores gustativos detectan moléculas que están en solución, y los olfativos, moléculas que además de ser solubles han de ser también volátiles. Sensibilidad gustativa En la mucosa lingual se encuentran pequeñas proyecciones denominadas papilas gustativas, en ellas se alojan los botones gustativos (10.000). Los botones están formados por células de sostén y células sensoriales (50/botón), estas células derivan de células epiteliales. Las células receptoras envían prolongaciones en forma de microvellosidades por su extremo apical y a través de una pequeña apertura, el poro gustativo, quedan expuestas a los estímulos químicos. En la cara basal o polo opuesto las células receptoras hacen sinapsis con fibras aferentes. Existen clásicamente cuatro sabores primarios: dulce, salado, ácido y amargo. El sabor dulce corresponde a moléculas de naturaleza glucídica y a otras como algunos aminoácidos, alanina, glicina, o incluso ciertas proteínas. El sabor ácido se debe a la concentración de H+, pero con el mismo pH no todos los ácidos proporcionan la misma sensación. El sabor salado está causado normalmente por cationes como el Na+ o el Li+, pero la presencia de diferentes aniones (Cl–, SO42–, NO3–) modifica la cualidad del sabor. El sabor amargo está causado por compuestos orgánicos muy diferentes, quinina, cafeína, nicotina, morfina, etc. Normalmente el sabor dulce es considerado agradable porque suele corresponder a sustancias nutritivas, los otros sabores son considerados agradables siempre que sea en baja concentración. La complejidad del sabor de los alimentos es debida a la mezcla de las diferentes modalidades gustativas y añadidamente a la información olfatoria. El reconocimiento de un sabor determinado depende de la actividad de una población de células gustativas. La transducción de la señal varía de acuerdo con las cuatro modalidades de gustos: Estímulo ácido: El sabor ácido se debe a los iones H+. Estos bloquean los canales de K+ localizados en la membrana produciéndose su despolarización. Estímulo salado: La mayor parte de la sal proporciona una elevada concentración de iones Na+ en el espacio extracelular, dichos iones entran a favor de gradiente a través de canales pasivos, provocando una despolarización. Estímulo amargo: Existen proteínas receptoras para sustancias amargas. Da lugar a una activación de la fosfolipasa C, que aumenta la concentración de insitol trifosfato y éste libera Ca++ de los depósitos intracelulares produciendo la despolarización. Estímulo dulce: Las sustancias dulces son un grupo variado al que pertenecen no sólo el grupo de biomoléculas glucídicas. Interaccionan con receptores específicos acoplados a una proteína G, que activa la adenilcilasa y aumenta la concentración de AMPc. Este incremento conduce a la activación de una proteinquinasa y a la fosforilación y bloqueo de los canales de K+ despolarizando la célula. 57 Los potenciales de acción desencadenados por un estímulo gustativo se transmiten a los nervios gustativos a través de sinapsis. A la hora de determinar si un sabor es agradable o desagradable no sólo interviene el tipo de estímulo, sino que la concentración del estímulo también participa en la sensación. Su función es la protección, con el objeto de no introducir en el organismo sustancias lesivas. La mayor parte de las sustancias tóxicas presentan un sabor amargo que da lugar a su rechazo con lo que son suficientes concentraciones muy bajas para detectar dicho sabor (4 mg/litro); en cambio, otras sustancias menos peligrosas requieren concentraciones mucho más altas para hacer una identificación del sabor. Las fibras aferentes gustativas inervan de forma muy ramificada los botones gustativos. A nivel del bulbo establecen la primera sinapsis en una parte del núcleo del tracto solitario denominada núcleo gustativo, las fibras secundarias realizan la segunda sinapsis en núcleo ventral posteromedial del tálamo, y las terciarias alcanzan la corteza sensorial gustativa, localizada en la posición inferior del lóbulo parietal, al lado de la información somatosensorial de la lengua. Sensibilidad olfatoria El sentido del olfato no está muy desarrollado en el ser humano. Se trata de un sentido que es relevante en otros animales, pero que en la evolución de la especie humana ha quedado relegado a favor de otras modalidades sensoriales. El aire al penetrar en la cavidad nasal, debido a lo tortuoso de sus paredes, desarrolla una serie de turbulencias permitiendo a las sustancias contactar con el epitelio o mucosa olfatoria. En dicho epitelio hay células de sostén y células sensoriales o células olfatorias (10 millones) que se recambian cada 30 días. Estas células son neuronas bipolares, con una prolongación dendrítica ciliada (de 5 a 20 cilios) que acaba en la superficie del epitelio nasal recubierta por una capa de moco. Los estímulos olorosos son difíciles de clasificar, existen unos 10.000 estímulos diferentes que son agrupados de forma muy subjetiva en múltiples clasificaciones. Cualquier estímulo ha de ser una molécula volátil, que alcanza el epitelio olfatorio a través de la vía aérea; debe a continuación disolverse en la capa mucosa para estimular la célula olfatoria. Los receptores olfatorios son muy sensibles, es decir tienen umbrales de estimulación muy bajos, unas pocas moléculas de una sustancia química son suficientes para detectar la sensación de un olor. El umbral de excitabilidad o límite absoluto define la concentración mínima de una sustancia necesaria para reconocer que huele a algo. 58 La transducción olfatoria se realiza al unirse una molécula disuelta en la capa de moco a las moléculas receptoras situadas en los cilios de los receptores olfatorios. La unión activa la adenilciclasa vía una proteína G. Se produce un aumento de la concentración de AMPc y, en consecuencia, la apertura de los canales de Na+ en la membrana celular del receptor y la despolarización de la célula. Los axones amielínicos pertenecientes a las células olfatorias forman la fila olfatoria o par craneal I. Penetran en la cavidad craneal a través de la lámina cribosa del etmoides y sinaptan en el bulbo olfatorio donde se encuentran las células mitrales y células en penacho, sobre estas células se realiza una fuerte convergencia y están sometidas además a control eferente. Las fibras secundarias forman la cintilla olfatoria o tracto olfatorio, que discurre por la base del encéfalo y se divide en dos fascículos principales uno medial y otro lateral. El medial establece sinapsis en el núcleo olfatorio anterior y en el tubérculo olfatorio. El núcleo olfatorio anterior es un centro de integración que procesa información bilateral. Desde el tubérculo olfatorio las neuronas de segundo orden se proyectan al núcleo medial dorsal del tálamo, y desde aquí a la corteza orbito-frontal. Oído y equilibrio Los órganos de la audición y del equilibrio se encuentran situados en el oído interno. Cada uno de ellos está diseñado para recibir una información diferente. Estructura funcional del oído El oído se divide en tres partes: 1. Oído externo. Está formado por el pabellón auricular y el conducto auditivo externo. El pabellón funciona como una superficie de captación de las ondas sonoras, ayudando a localizar el origen del sonido. El conducto auditivo externo, transmite las ondas sonoras hacia el tímpano, membrana de forma cónica que es el límite entre el oído externo y el medio. Además, funciona también como un resonador dentro de las frecuencias de 3-4 KHz que corresponden a la región de máxima sensibilidad auditiva. 2. Oído medio. Está formado por una cadena de tres huesecillos que funcionan como un sistema de palancas para transmitir la energía de la onda sonora desde el tímpano hasta la cóclea. Las funciones que se desarrollan en esta sección son: a) Adaptador de impedancia. La impedancia es una medida de la dificultad al paso de las ondas sonoras y depende directamente de la densidad del medio así la transmisión de sonido de aire a líquido es muy ineficaz. Así, si se compara la impedancia a nivel del aire es con la que hay a nivel de 59 líquido, la relación es 1:30, es decir es 30 veces superior en el líquido. La estructura del oído medio permite salvar esta diferencia y realizar una transmisión que garantice que la onda no se agote en su recorrido y pase al siguiente elemento con suficiente intensidad. b) Amplificador. El oído medio permite un incremento de la energía de la onda sonora, obtenida mediante la proporción de superficies de las membranas descritas anteriormente; y, por otro lado, la cadena de huesecillos que une ambas membranas y actúa como una palanca mecánica multiplicando x2 o x3 la energía de la onda sonora. c) Regulación de la intensidad de la onda sonora. La cadena de huesecillos está fijada a las paredes de la caja del tímpano mediante unos músculos. Cuando se produce la llegada de sonidos fuertes se desarrolla el denominado reflejo timpánico, mediante este mecanismo se modifica el grado de contracción de los mismos eliminando tensión sobre las membranas y disminuyendo la transmisión de la onda sonora. Es un sistema de protección, para impedir el posible daño que pudiera producirse sobre las membranas ante una vibración excesivamente fuerte. 3. Oído interno. Alojado en el peñasco del temporal presenta una estructura de conductos bastante compleja, de ahí que también reciba el nombre de laberinto. Está formado por el laberinto óseo y en su interior el membranoso. Tiene dos regiones: El vestíbulo y los canales semicirculares que constituyen el órgano del equilibrio. La cóclea o caracol, que es un tubo enrollado de unos 3,5 cm que da dos vueltas y ¾ sobre su eje donde se localizan los receptores auditivos. La cóclea o caracol se divide mediante dos membranas en tres canales o rampas. La membrana de Reissner separa la rampa vestibular de la media, y la membrana basilar separa la rampa media de la timpánica. La rampa vestibular y la timpánica están llenos de un líquido de composición similar al líquido intersticial denominado perilinfa y la rampa media o conducto coclear está lleno de un líquido de composición similar al intracelular y que se llama endolinfa. La rampa vestibular y la timpánica se continúan en el extremo del caracol a través del helicotrema y cada una de ellas en su origen o base tienen una membrana, la rampa vestibular la membrana de la ventana oval y la rampa timpánica la membrana de la ventana redonda que comunica con el oído medio. Los receptores sensoriales se encuentran agrupados en el órgano de Corti, situado a lo largo de toda la rampa media sobre la membrana basilar. Contiene diversos tipos de células, entre ellas dos tipos de células ciliadas (células receptoras). Las 60 células ciliadas forman cuatro hileras, tres externas y una interna. Los cilios (30-150) se proyectan dentro de la endolinfa y están cubiertos por una membrana gelatinosa llamada membrana tectorial. En la base de las células ciliadas se encuentran células de sostén. Transducción de la vibración La oscilación de la membrana de la ventana oval, debido a la vibración de la cadena de huesecillos, transmite esta oscilación a la perilinfa situada en la rampa vestibular. A través de la membrana de Reissner, las oscilaciones de la perilinfa son transmitidas a la endolinfa de la rampa media, desde donde se transfieren a su vez a la membrana basilar, causando la movilización de las células ciliadas del órgano de Corti contra la membrana tectorial. Las ondas transmitidas a través de la endolinfa son absorbidas por la perilinfa en la rampa timpánica y llegan a la ventana redonda, donde se disipan. Al ser la membrana basilar más elástica que la membrana tectorial, su oscilación produce la movilización de los cilios de las células auditivas. En reposo estas células presentan un potencial de membrana de Vm= –60 mV, el movimiento de los cilios produce la apertura de canales de K+, que penetran en el interior de la célula debido a que la endolinfa presenta una elevada concentración de este ion. El flujo de cargas positivas hacia el interior da lugar a la aparición de un potencial receptor despolarizante (Vm= –50 mV). El potencial receptor produce la liberación del neurotransmisor y la presencia de un PEPS en la fibra sensorial. El movimiento de los cilios en la dirección contraria produce un cierre de los canales de K+ y se produce una hiperpolarizacion. Vías auditivas A través de las vías auditivas con sus correspondientes sinapsis o relevos, se lleva la información de la onda sonora hasta la corteza donde se obtendrá la sensación auditiva. En una sensación auditiva se pueden diferenciar los siguientes componentes: 1. Tono o altura del sonido. Es decir, la capacidad de diferenciar la frecuencia del sonido. La deformación de la membrana basilar tiene una amplitud máxima en zonas diferentes dependiendo de la frecuencia de la onda sonora. Como la membrana basilar es más ancha y menos rígida en el vértice que en la base del conducto coclear, los sonidos de alta frecuencia, o tonos agudos, dan el máximo de desplazamiento en la base de la cóclea, mientras que los de baja frecuencia, o graves, dan el máximo cerca del vértice de la cóclea. Por lo tanto las células sensoriales que son preferentemente estimuladas se localizan en regiones diferentes atendiendo al tono del sonido. Las distintas señales procedentes de las diferentes porciones de la cóclea ascienden de forma ordenada hacia la corteza auditiva, lo que significa que, en estas vías hay una organización de las fibras en función de su origen o lo que es lo mismo en función de las frecuencias. Esta organización por tonos, es similar a la observada en la sensibilidad somatoestésica y, recibe el nombre de organización tonotópica. 2. Intensidad del sonido. Viene dada por la frecuencia de potenciales de acción en las fibras sensoriales y permite diferenciar sonidos fuertes de débiles. 3. Localización del sonido. El origen del sonido con respecto a nuestro cuerpo es posible conocerlo por la forma con que se procesa la información procedente de cada oído. Si la fuente del sonido está más próxima a un oído que a otro, existirá un retraso sonoro, entre la llegada del estímulo a cada oído. Esta diferencia temporal en el procesado de la información permite determinar la localización. 61 Sentido del equilibrio El sentido del equilibrio desempeña una función importante en el mantenimiento de la postura corporal y también en la estabilización de los ojos, en especial durante el movimiento. 1. Estructura del sistema vestibular. El órgano del equilibrio está situado en la región vestibular del laberinto u oído interno. Consta de dos cámaras el utrículo y el sáculo y tres canales semicirculares. Utrículo y sáculo se disponen horizontal y verticalmente, y los tres canales se sitúan en ángulos rectos entre sí. El líquido que contienen cámaras y canales es la endolinfa y toda la estructura flota en la perilinfa. Cada canal semicircular en su base presenta una dilatación conocida como ampolla, el órgano sensorial de los canales se sitúa en el interior de la ampolla, mientras que en las cámaras se sitúa en las paredes de la misma en unas regiones denominadas máculas. Existen dos tipos de células sensoriales: A nivel de las máculas del utrículo y sáculo, situadas horizontal y verticalmente respectivamente se encuentran las células ciliadas sensoriales. Disponen de 70-80 cilios y un kinocilio imbuidos en una membrana gelatinosa (membrana estatolítica) que contiene pequeños cristales de carbonato cálcico (estatolitos u otoconias). Al modificar la orientación de la cabeza se produce el movimiento de la membrana y la inclinación de los cilios hacia el kinocilio provoca la apertura de canales de K+ y la generación de un potencial receptor despolarizante; la inclinación en sentido contrario cierra los canales e hiperpolariza la célula. La información procedente de estas células mantiene al cerebro informado de manera continua respecto a la posición de la cabeza, permitiéndole detectar aceleraciones lineales (de traslación). A nivel de los canales semicirculares, las células ciliadas se sitúan en las crestas ampollares (proyección hacia el interior de la pared del canal), y sus cilios están imbuidos en una estructura gelatinosa denominada cúpula que cierra el conducto al contactar con la pared del canal. Cuando se produce un giro de la cabeza la endolinfa debido a su inercia queda atrasada y la cúpula se mueve en sentido contrario al giro, de tal forma que se activarán las células de unos canales y se inhibirán las de otros. La colocación de los conductos en el espacio: anterior, posterior y horizontal, permite su estimulación cuando se producen movimientos con aceleración rotatoria o angular. Además, las señales procedentes de los canales semicirculares controlan los movimientos oculares mediante los reflejos vestíbulo-oculares permitiendo que la mirada permanezca fija mientras se va moviendo la cabeza. 2. Vías vestibulares. Las fibras primarias, que junto con las auditivas forman el octavo par craneal, sinaptan en los núcleos vestibulares en la protuberancia. De estos núcleos salen fibras secundarias hacia: * Cerebelo. * Formación reticular. * Motoneuronas de la médula espinal que controlan los músculos del cuello. * Núcleos de los músculos oculares. 62 Las conexiones que se establecen son complejas ya que están implicadas en funciones principalmente motoras como son el control del equilibrio corporal, los reflejos posturales y la acomodación ocular. Visión Los ojos son órganos visuales que detectan la luz y la convierten en impulsos electroquímicos que viajan a través de neuronas. La célula fotoreceptora más simple de la visión consciente asocia la luz al movimiento. En organismos superiores el ojo es un sistema óptico complejo que capta la luz de los alrededores, regula su intensidad a través de un diafragma (iris), enfoca el objetivo gracias a una estructura ajustable de lentes (cristalino) para formar la imagen, que luego convierte en un conjunto de señales eléctricas que llegan al cerebro a través de rutas neuronales complejas que conectan, mediante el nervio óptico, el ojo a la corteza visual y otras áreas cerebrales. Los ojos con resolución han evolucionado en diez diferentes tipos fundamentales y el 96 % de las especies animales poseen un sistema óptico complejo. Los ojos con resolución están presentes en moluscos, cordados y artrópodos. En la parte de atrás de la retina llegan fotones de luz hasta la denominada capa pigmentaria. En esta hay grandes cantidades de melanina (pigmento que impide la reflexión) y vitamina A (precursor de las sustancias fotosensibles). Pegados a la capa pigmentaria hay conos y bastones. Los conos tienen la capacidad de “identificar” colores, necesitan alta intensidad de luz. Los conos son menos sensibles a la luz que los bastones. La visión diurna (visión de cono) se adapta más rápidamente a los cambiantes niveles de luz, ajustándose a un cambio como salir del interior hacia afuera a la luz solar en pocos segundos. Como todas las neuronas, los conos "disparan" la producción del impulso eléctrico en la fibra nerviosa, y luego deben restablecerse para poderse "disparar" de nuevo. La adaptación de la luz se cree que ocurre, mediante el ajuste de este tiempo de reposición. Los conos son los responsables de toda la visión de alta resolución. El ojo se mueve continuamente para mantener la luz del objeto de interés cayendo sobre la central fóvea donde reside el grueso de los conos. Los bastones son los más numerosos de los fotorreceptores, unos 120 millones, y son más sensibles que los conos. Sin embargo, no son sensibles al color. Son responsables de nuestra adaptación a la oscuridad, o visión escotópica. Los bastones son unos fotorreceptores increíblemente eficientes. Según unos informes, bajo condiciones óptimas, pueden ser disparados por fotones individuales. La visión óptima adaptada a la oscuridad, se obtiene después de un periodo considerable de oscuridad, digamos 30 minutos o más, porque el proceso de adaptación de los bastones es mucho más lento que el de los conos. Con la visión diurna, la sensibilidad de los bastones se desplaza hacia longitudes de onda más corta, de aquí el mayor brillo aparente de las hojas verdes con la luz del atardecer. Mientras que la agudeza visual o la resolución visual son mucho mejor con los conos, los bastones son mejores sensores del movimiento. Como los bastones predominan en la visión periférica, esta es más sensible a la luz, permitiéndonos ver objetos tenues en visión periférica. Si se ve una estrella tenue en nuestra visión periférica, puede desaparecer cuando se mira directamente, puesto que entonces estamos moviendo la imagen hacia la región fóvea rica en conos que es menos sensible a 63 la luz. Se puede detectar mejor el movimiento con la visión periférica, puesto que es primariamente visión de bastones. Traducción de la señal Oscuridad: El pigmento de la rodopsina se encuentra en su forma cis – retinal. El GMP cíclico abre conductos inespecíficos que permiten el paso de Na+ dentro de los bastones. La membrana se despolariza (estado en el cual libera un neurotransmisor llamado glutamato) y no se produce potencial de acción. Luz: Al llegar un fotón a la rodopsina transforma al cis – retinal en trans – retinal y esto genera un cambio conformación en la rodopsina (este es el proceso fotodependiente de la visión). Cuando la rodopsina cambia su forma, se une a la transducina (proteína G). Luego de que esta intercambia GDP por GTP, la subunidad alfa/GTP transporta una señal a una fosfodiesterasa que está unida a un inhibidor. Este se une a la subunidad alfa y la fosfodiesterasa comienza a convertir GMPc a GMP. Esto produce una disminución en la concentración de GMPc lo que provoca que se cierren canales iónicos (impidiendo el paso de Ca2+ y Na+). Este proceso lleva a la hiperpolarizacion de la membrana, la cual no va a liberar más glutamato. La célula bipolar adyacente se despolariza y aumenta la liberación de neurotransmisores exitatorios, los cuales excitan a las células ganglionares. Para revertir el proceso, lo que sucede es que al disminuir la señal lumínica la subunidad alfa hidroliza GTP a GDP. Como bajo la concentración de calcio al entrar la luz, se activó la guanilil ciclasa (inhibida por altas concentraciones de calcio) la cual devuelve el GMPc a los niveles iniciales. Esto provoca que se abran los canales de sodio y calcio y la membrana vuelve a su polarización original. En el siguiente link hay un video con una explicación clara de cómo se lleva a cabo el proceso: https://www.youtube.com/watch?v=AuLR0kzfwBU Vías visuales La retina es una porción de encéfalo situada fuera del sistema nervioso central, formando parte de la misma se encuentran, además de los fotorreceptorres, otros cuatro tipos de neuronas. Las células bipolares (1) establecen contacto sináptico con el terminal de los fotorreceptores, estas neuronas responden al glutamato de dos formas, las denominadas células bipolares off, generan respuestas despolarizantes y una segunda variedad células bipolares on generan respuestas hiperpolarizantes. Las células bipolares off se despolarizan en ausencia de luz (al aumentar la liberación de glutamato) y las células on se despolarizan en presencia de luz (al disminuir el glutamato). Los campos receptores de estas células tienen en su centro a los fotorreceptores y en su periferia a las células horizontales (2), las cuales liberan un neurotransmisor inhibitorio. Así las células bipolares de centro on, se activan cuando los fotorreceptores centrales son iluminados y la periferia permanece en la oscuridad y las células bipolares de centro off, se activan cuando los fotorreceptores periféricos son iluminados y el centro permanece en la oscuridad. 64 Este patrón antagónico centroperiferia, se mantiene en las células ganglionares (3). Estas neuronas reciben información de las bipolares y de las amacrinas (4), que a su vez han sido excitadas por las células bipolares. La retina tiene tres tipos de células ganglionares, los potenciales de acción sólo se generan en ellas, las señales entre las células previas son de naturaleza electrotónica, suficientes para recorrer pequeñas distancias. Los axones de las células ganglionares mientras se extienden por el interior del globo ocular son amielínicos y transparentes, cuando han salido del ojo son mielínicos. Del total de fotorreceptores que hay en cada ojo, unos 126 millones tan sólo salen un millón de fibras en el nervio óptico, lo que proporciona una idea de la fuerte convergencia que debe establecerse en este circuito. Las fibras convergen en las papilas ópticas (punto ciego) donde forman el nervio óptico de cada ojo. Cada nervio óptico discurre por la base anterior del encéfalo uniéndose en el quiasma óptico donde se produce el entrecruzamiento de fibras. 65