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UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VIROLOGÍA TEORICO Nº 10 Temario: Virus con genoma de RNA de cadena simple. Picornaviridae (Aphtovirus), Togaviridae (virus de las encefalitis equinas), Flaviviridae (virus de la diarrea vírica bovina). Orthomyxoviridae (virus Influenza), Paramyxoviridae (Virus del Moquillo Canino). PARAMYXOVIRIDAE La mayoría de las enfermedades virales más devastadoras de los animales son causadas por miembros de la familia Paramyxoviridae. La peste bovina, el moquillo canino y la enfermedad de Newcastle podría decirse que han causado más morbilidad y mortalidad que ningún otro grupo de enfermedades. Sin embargo, estas enfermedades son sólo una parte de las amenazas que constituyen los virus de esta familia: las enfermedades generadas por el virus parainfluenza 3 bovino y el virus sincitial respiratorio bovino forman parte del complejo infeccioso de la neumonía bovina, conocido como “fiebre del embarque”, el cual genera graves pérdidas económicas en el ganado vacuno. La familia Paramyxoviridae, junto a las familias Rhabdooviridae, Filoviridae y Bornaviridae integran el orden de los Mononegavirales. Este orden reúne a los virus que comparten relaciones filogenéticas que se reflejan en algunos dominios genéticos conservados, estrategias similares para la replicación viral y la expresión de genes. Todos los virus son envueltos, cubiertos de peplómeros y todos los genomas virales se componen de una molécula de ARN de cadena simple, sentido negativo. Los aspectos que diferencian a cada una de estas familias son: el tamaño del genoma, la estructura de la nucleocápside, el sitio de replicación y transcripción del genoma, la forma de procesar el ARNm, la morfología del virión, la especificidad tisular, el rango de hospedadores y el potencial patogénico. Propiedades de los paramyxovirus Clasificación La familia Paramyxoviridae se sub-divide en 2 subfamilias: Paramyxovirinae y Pneumovirinae. La subfamilia Paramyxovirinae incluye a los géneros Respirovirus, Rubulavirus y Morbillivirus. Propiedades de los viriones Los viriones de los paramyxovirus son pleomórficos (de forma muy variable). Los viriones son envueltos, cubiertos de largos peplómeros y contienen una nucleocápside con simetría helicoidal. El genoma consiste de una molécula lineal de ARN de cadena simple, sentido negativo. Este ADN posee genes que codifica para proteínas estructurales, fundamentalmente. Los peplómeros de la superficie de la envoltura viral se componen de dos glicoproteínas, principalmente: proteínas hemaglutinina-neuraminidasa (NH) y proteínas de fusión (F) (Figura 1). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Peplómeros (Hemaglutinina-Neuraminidasa) Proteínas de Fusión Proteínas (N-P-L) asociadas al material genético viral ARN lineal de sentido (-) Proteínas de la Matriz Envoltura lipídica Figura 1. Estructura de los viriones de los paramyxovirus. Ambas glicoproteínas juegan un rol central en la patogénesis de la infección de todos los paramyxovirus. La adhesión a la célula hospedadora es regulada por las proteínas NH. Estas glicoproteínas inducen la formación de anticuerpos neutralizantes que inhiben la adsorción de los virus a sus receptores celulares. La proteína F está presente en los viriones recientemente formados, como una proteína inactiva, la cual es activada por enzimas proteolíticas celulares. Luego de su activación, esta proteína regula la adherencia del virión a la superficie celular. Esta proteína F es fundamental para garantizar la infectividad viral: cuando la célula hospedadora no posee proteasas celulares, el virión no puede adherirse a las células y la infección no ocurre. Los virus tienen un amplio rango de hospedadores mamíferos y aves. Los viriones son sensibles a los efectos del calor o la desecación y se destruyen fácilmente por los desinfectantes comunes y los solventes lipídicos. Replicación viral La replicación viral en los cultivos celulares es comúnmente lítica. La formación de sincitios en los cultivos celulares e in vivo es una característica particular de la infección con paramyxovirus (Figura 2), así como la formación de cuerpos de inclusión acidófilos en el citoplasma de las células hospedadoras. Aunque la replicación sucede íntegramente en el citoplasma celular, los morbillivirus pueden producir cuerpos de inclusión intranucleares (Figura 2). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Figura 2. Secciones histológicas del cerebro y vejiga urinaria de un cánido infectado con el virus del Moquillo Canino (Morbillivirus). (a) Sustancia blanca cerebral: se observa gliosis con formación de sincitios. (b) Un mayor aumento de (a). Se identifica un sincitio (flecha). (c) Hipotálamo. Se identifican microgliosis (puntas de flecha) y manguitos perivasculares (flechas). (d) Tálamo. Se identifican cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos eosinofílicos en la astroglía (flecha pequeña) y en una neurona (punta de flecha). Se identifica un cuerpo de inclusión intranuclear eosinófillico en la neurona (flecha grande). (e) Necrosis y degeneración del estrato granuloso en la circunvolución dentada. (f) Epitelio transicional de la vejiga urinaria. Se identifican numerosos cuerpos de inclusión intranucleares / intracitoplasmáticos (flechas). Las proteínas F intervienen en la fusión de la envoltura viral con la membrana citoplasmática de la célula hospedadora. La nucleocápside liberada al interior del citoplasma, permanece intacta y asociada a tres proteínas (N, P y L) que son requeridas para la transcripción del ARN (Figura 1). Estas proteínas tienen actividad ARN polimerasa. El genoma ARN es transcripto progresivamente en varios ARNm. También se sintetiza un ARN genómico completo de sentido positivo a partir del genoma original de ARN sentido negativo. Este ARN de sentido negativo, recientemente sintetizado, se asocia con las proteínas N, L y P y se sintetizan las nuevas nucleocápsides. La maduración del virión involucra: 1) la incorporación de glicoproteínas virales en la membrana citoplasmática de la célula hospedadora, marcando el sitio de gemación de los viriones; 2) la asociación de proteínas de la matriz (M) y proteínas no glicosiladas a la membrana celular previamente “marcada”, 3) la incorporación de la nucleocápside dentro de la proteína M y 4) la formación y liberación de los viriones maduros mediante gemación de la membrana citoplasmática de la célula hospedadora (Figura 3). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA ARN viral Figura 3. Maduración de los viriones de paramyxovirus. MOQUILLO CANINO (Distemper canino) El moquillo canino es la enfermedad viral más importante de los caninos, produciendo una alta morbilidad y mortalidad en la población canina no vacunada. Es una enfermedad febril, altamente contagiosa, de curso agudo o sub-agudo que se conoce desde 1760. Aunque la etiología viral fue demostrada por Carré en 1906. En los países desarrollados es una enfermedad comparativamente rara, debido a el eficiente control de la vacunación. Presentaciones clínicas La enfermedad se manifiesta de diferentes maneras. La forma per-aguda de la enfermedad (muy rara) cursa con la aparición repentina de fiebre y la muerte súbita. En la forma aguda (mucho más común) de la enfermedad, luego de un periodo de incubación de 3 a 6 días, los perros infectados desarrollan dos picos de hipertermia superior a los 41 ºC. Debido a estos dos picos de temperatura la enfermedad también se denomina “distemper”. El segundo pico hipertérmico se asocia con una leucopenia severa y signos clínicos como anorexia, letargia, secreción nasal, conjuntivitis y depresión. Algunos perros no muestran los signos respiratorios y evidencian signos gastrointestinales. La enfermedad pulmonar se caracteriza por una inflamación catarral de la laringe y bronquios, tonsilitis y tos. Posteriormente, se desarrolla una bronquitis o bronconeumonía catarral, algunas veces asociada a pleuritis. La enfermedad gastrointestinal se caracteriza por vomitos y diarrea acuosa. Luego de la aparición de estas manifestaciones, pueden presentarse los signos asociados al sistema nervioso central: cambios comportamentales, mioclonias locales, espasmos tónico-clónicos, convulsiones, ataxia y paresia. La duración de la enfermedad depende de las complicaciones causadas por las infecciones bacterianas secundarias. La forma sub-aguda neurológica puede presentarse luego de la ausencia de signos de la forma aguda o puede aparecer luego de la infección sub-clínica. Se produce una franca encefalitis con convulsiones y si el animal sobrevive presenta secuelas neurológicas permanentes tales como “ticks” nerviosos o movimientos involuntarios de sus miembros. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Finalmente, existen dos formas tardías de la enfermedad que se presenta en los perros viejos. Una de ellas recibe el nombre de “encefalitis del perro viejo”, en la cual se produce una pérdida progresiva de las funciones neurológicas. La otra forma tardía se llama “enfermedad de los pulpejos”, en la cual se observa una hiperqueratosis de los pulpejos localizados en las palmas y plantas de las extremidades y del morro. Estas manifestaciones tardías pueden presentarse en caninos que no tuvieron antecedentes de enfermedad aguda o sub-aguda. Los signos neurológicos incluyen: 1) contracción muscular localizada en un musculo o grupo de musculos (corea, espasmo flexor, hiperquinesia); 2) paresia o paralisis que comienza en los miembros posteriores y se evidencia con ataxia y 3) convulsiones caracterizadas por salivación y movimientos masticatorios (petit mal). Las convulsiones puede ser graves y muy frecuentes y los perros pueden quedar postrados, con defecación y micción involuntaria (grand mal). Las dos formas tardías de la enfermedad pueden coexistir y conducir a la muerte del animal. Patogénesis, patología e inmunidad El primer evento patogénico es la replicación local del virus en las células del tracto respiratorio superior o en el epitelio conjuntival. Esto sucede al 2 o 4º día del ingreso del virus. Luego, sucede una multiplicación viral en los linfonódulos regionales y el virus ingresa en el torrente circulatorio. Aquí es transportado por linfocitos, constituyendo la viremia primaria (en sincronía con el primer pico de hipertermia), que asegura la diseminación del virus al sistema reticuloendotelial. Los efectos de la replicación viral en estos sitios se manifiestan con hiperplasia de los órganos linfoides y por la formación de células gigantes (sincitios) en estos tejidos. Los viriones producidos en estos sitios son transportados en linfocitos o monocitos, generando la viremia secundaria, la cual coincide con el segundo pico hipertérmico. En la forma aguda, ocurre una inflamación serosa de la mucosa respiratoria asociada con neumonía intersticial. Los signos intestinales y neurológicos (encefalitis no supurativa) también caracterizan el proceso patológico de esta enfermedad. La inmunidad mediada por células es importante, tanto para la supervivencia como para la protección del animal, durante la infección con los morbillivirus en general. Los animales que no poseen títulos elevados de anticuerpos neutralizantes son inmunes y dicha inmunidad es de por vida. FLAVIVIRIDAE Propiedades de los flavivirus Clasificación La familia Flaviviridae comprende tres géneros, los miembros de estos géneros, aunque comparten similaridades en sus propiedades fisicoquímicas y genéticas son biológicamente diferentes. El género Pestivirus contiene tres especies virales de importancia patógena en los animales: el virus de la diarrea viral bovina (DVB), el virus del cólera porcino y el virus de la enfermedad de la frontera de los ovinos. Estos virus tienen distribución mundial y son considerados importantes patógenos que generan graves pérdidas económicas. El virus de la diarrea viral bovina fue descripto por primera vez en New York en 1946, como una nueva enfermedad del ganado vacuno. Luego en 1956, otra entidad clínica, la “enfermedad de las mucosas”, fue descripta con un patrón y una incidencia similar en el ganado bovino. Los virus aislados de ambas enfermedades eran idénticos. Una nueva variante del virus de la diarrea viral bovina se ha identificado que causa una severa trombocitopenia y un síndrome hemorrágico en las vacas adultas. Esta enfermedad aun está siendo investigada. Propiedades de los viriones UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Los viriones de los Pestivirus son esféricos, poseen una envoltura viral cubierta de peplómeros característicos y una nucleocápside con simetría helicoidal. El genoma consiste de una molécula lineal de ARN de cadena simple, sentido positivo. Este ADN posee genes que codifica para proteínas estructurales: la proteína C de la nucleocápside, el precursor de la proteína M (prM) que es activado a proteína M durante la maduración viral y los peplómeros E1 y E2 anclados en la superficie de la envoltura viral (Figura 4). Además, los genes codifican para proteínas noestructurales: una ARN polimerasa (NS5) y una proteína NS3 con actividad helicasa y proteasa. Proteína M Glicoproteína E Nucleocápside icosaédrica ARN lineal de sentido (+) Envoltura viral Figura 4. Estructura de los viriones de los flavivirus. Los viriones no son estables en el ambiente y son fácilmente inactivados por el calor y los desinfectantes comunes. Replicación viral Los miembros del género Pestivirus replican bien en cultivos celulares continuos y primarios derivados de las células de su hospedador natural (fibroblastos de embriones bovinos o células renales bovinas). Pueden aislarse cepas citopáticas de los tejidos de los bovinos afectados con DVB. Los virus se adhieren a las células mediante la interacción de sus glicoproteínas E con los receptores celulares específicos e ingresan al interior celular, mediante endocitosis del receptor celular (Figura 5). La replicación sucede en el citoplasma. Los virus interrumpen parcialmente la síntesis de proteínas y ARNm de la célula hospedadora. La infección se acompaña con una proliferación característica de las membranas perinucleares. La replicación involucra la síntesis de una cadena de ARN complementaria de sentido negativo, la cual sirve de molde para la síntesis del genoma ARN de sentido positivo (Figura 5). La traducción del ARNm viral genera una sola poli-proteína que sufre modificaciones en la célula hospedadora y a partir de ella derivan las proteínas virales estructurales y no estructurales. El ensamblaje de los viriones ocurre sobre la membrana del retículo endoplasmático (Figura 5). No se han observado la presencia de cápsides pre-formadas ni la salida del virus mediante gemación. Los viriones completamente desarrollados aparecen en las cisternas del retículo endoplasmático y desde aquí son liberados por exocitosis o lisis celular (Figura 5). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Endocitosis virus-receptor Ensamblaje de los viriones en las cisternas del retículo endoplasmático y liberación por lisis celular Denudamiento viral y liberación del genoma ARN Replicación del ARN viral Síntesis de un ARN intermediario, de sentido + Figura 5. Ciclo viral completo de los pestivirus. DIARREA VIRAL BOVINA La DVB y la enfermedad de las mucosas son enfermedades clínicamente diferentes, pero son producidas por el mismo agente viral (pestivirus). La enfermedad aguda se conoce con el nombre de diarrea viral bovina, mientras que el término enfermedad de las mucosas se reserva para la enfermedad crónica asociada a una infección persistente. El virus ocasiona importantes perdidas económicas en el ganado bovino de leche y carne. Presentaciones clínicas Las manifestaciones clínicas y patológicas de la infección del animal individual varían según la edad y el estadio de gestación del animal. Se consideran tres situaciones: infección postnatal en vacas no preñadas, infección de vacas preñadas e infección persistente en terneros (enfermedad de las mucosas). Infección postnatal en vacas no preñadas. Las vacas de todas las edades son susceptibles, pero la infección es más común en animales de 8 a 24 meses de vida. Aunque los terneros reciben anticuerpos calostrales contra el pestivirus, el nivel de anticuerpos declina entre los 3 y 8 meses de vida y a partir de este momento el animal puede infectarse. Después de un periodo de incubación de entre 3 y 7 días, los animales manifiestan fiebre y leucopenia, sin otras manifestaciones y la enfermedad se considera leve. Sin embargo, algunas vacas pueden desarrollar diarrea explosiva, presentar descarga nasal u ocular y una estomatitis erosiva y las vacas lecheras disminuyen drásticamente la producción de leche. Debido a la inmunosupresión asociada a la infección, la enfermedad en los terneros puede complicarse debido a infecciones respiratorias e intestinales oportunistas. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Infección de vacas preñadas. A pesar que la infección en el animal adulto, normalmente no tiene consecuencias graves, puede ocurrir la diseminación viral vía transplacentaria. Esto puede tener algunas consecuencias graves, dependiendo de la edad del feto y de la cepa viral. La infección durante el comienzo del periodo gestacional resulta en muerte embrionaria. La infección entre los 80 y 125 días de gestación (antes del desarrollo inmunológico del feto, el cual sucede cerca de los 125 días de gestación) resulta en lesiones fetales graves y ocasiona retardo del crecimiento fetal, generando muerte fetal o terneros con bajo peso al nacer. Las lesiones fetales son manifestaciones del efecto del virus sobre la organogénesis y se evidencian como defectos congénitos oculares (displasia retinal) y del sistema nervioso central (hipoplasia cerebelar). Los terneros que han sido infectados en el útero y sobreviven, permanecen infectados de por vida. Ellos nunca montan una respuesta inmune efectiva frente al virus, es decir generan una infección persistente tolerante. Tales terneros, los cuales permanecen negativos frente a las pruebas serológicas, liberan grandes cantidades de virus por todas sus secreciones corporales y transmiten muy eficientemente la infección al resto del rodeo. Estos animales tienen una probabilidad muy alta de desarrollar clínicamente la “enfermedad de las mucosas”. Los fetos infectados luego de los 125 días de gestación sobreviven, manifestando daño patológico o no y normalmente generan anticuerpos neutralizantes que eliminan al virus (Figura 6). RUTA MÁS COMÚN (Más del 90%) RUTA MENOS COMÚN (Menos del 10%) Hembra preñada susceptible (no infectada persistentemente), adquiere DVB entre los 80 y 125 días de gestación Hembra infectada persistentemente, con DVB, se preña. Virus de la Diarrea Viral Bovina (DVB) Nace un ternero infectado persistentemente con DVB Ternero Infectado Persistentemente Figura 17. Infección con el virus de la diarrea viral bovina. Las hembras no infectadas que adquieren la infección en el primer tercio de la gestación o aquellas hembras infectadas persistentemente, generan terneros infectados persistentemente que desarrollan la enfermedad. Infección persistente en terneros (enfermedad de las mucosas). En los rodeos susceptibles, donde el virus ha sido recientemente introducido, una muy alta proporción de los terneros nacidos en la siguiente temporada reproductiva estarán infectados persistentemente. La mortalidad de estos terneros puede alcanzar el 50% en el primer año de vida debido a las manifestaciones clínicas de la enfermedad de las mucosas. La enfermedad de las mucosas se presenta solo cuando se presentan dos biotipos del virus de la DVB. La presentación clínica de la enfermedad de las mucosas es similar a la manifestación clínica de la DVB, pero es mucho más severa. El comienzo de la enf. de las mucosas puede ser repentino o demorarse varias semanas a meses en demostrar signos evidentes. Los signos asociados son fiebre, UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA anorexia, diarrea acuosa profusa, descarga nasal, estomatitis erosiva o ulcerativa, deshidratación, emaciación y muerte en pocas semanas o meses. Patogénesis, patología e inmunidad Aquellas vacas que mueren debido a la infección aguda con el virus de la DVB se observan lesiones graves que incluyen lesiones erosivas o ulcerativas que se extienden desde la boca, pasando por el esófago, preéstomagos, abomaso y hasta el intestino. En el intestino, la decoloración de la mucosa se debe a la hiperemia y hemorragia, quedando desprovisto de superficie luminal. Histológicamente se confirma la necrosis epitelial y la destrucción masiva del tejido linfoide. Sucede una necrosis del tejido linfoide, particularmente de las placas de Peyer en el intestino, las cuales se observan hemorrágicas y necróticas. La destrucción del epitelio de las criptas de Lieberkühn en el intestino delgado, ciego y colon es característica de esta enfermedad. Los biotipos virales aislados de los animales que sufren primo-infección son no citopáticos. El mismo biotipo (no citopático) es aislado de las vacas inmunotolerantes infectadas persistentemente, es decir de aquellas vacas que se infectaron in utero, antes del desarrollo de su sistema inmune. Sin embargo, en los animales afectados por la enfermedad de las mucosas, se han aislado tanto los biotipos citopáticos como los no-citopáticos. Existe una estrecha relación genética entre los dos biotipos virales sugiriendo que los biotipos citopáticos pueden originarse por mutaciones de los biotipos no-citopáticos. Las mutaciones ocurridas (recombinación, inserción de secuencias celulares, duplicación, deleción, etc) conducen a la producción de una proteína viral que es responsable del efecto citopático celular, de un modo aún desconocido. BIBLIOGRAFÍA: Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. (1999). Veterinary Virology. Third Edition, Elsevier Ed., U.S.A. Traducción realizada por el Dr. Cs. Vet. Diego Grilli (Octubre, 2013).