Download Ejercicio 3B: Estimulación del ganglio

LABORATORIO CINCO: MICROESTIMULACIÓN
RESUMEN
En este laboratorio, podrás:
1. aprender a preparar la pata de una cucaracha para hacer microestimulación;
2. probar como diferentes estímulos estimulan actividad en las neuronas motoras;
3. observar la diferencia entre los patrones de espigas sensoriales y motoras; e
4. investigar cómo distintos tipos de estímulos afectan a la generación de potenciales
de acción en una pata de cucaracha preparada.
OBJETIVOS
Antes de realizar esta práctico debes entender:
 cómo las neuronas se comunican con las células musculares
 cómo un estímulo eléctrico puede provocar una contracción muscular
Después de hacer esta práctico deberás ser capaz de:
 explicar cómo el sistema nervioso controla el movimiento muscular
 describir cómo movimientos específicos son provocados por patrones
específicos de espigas
 diseñar un experimento para mapear frecuencias ideales para estimulación
MATERIALES
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SpikerBox con un adaptador de cable de audio
Computador con Audacity instalado
Cucaracha
Agua con hielo o acceso a un congelador
Tijeras de disección
Mondadientes
Electrodos de microestimulación
Generador de señal eléctrica (Reproductor de iPhone o MP3)
Splitter de 2 salidas (opcional)
altavoz externo (opcional)
INTRODUCCIÓN
Mucho antes que los científicos fueran capaces de registrar espigas,
podían estimular el sistema nervioso mediante uso de baterías
(botellas de Leyden). Dado que los nervios utilizan electricidad para
comunicarse, pueden ser manipulados por ella también. Luigi Galvani,
un científico italiano del siglo XVIII, descubrió que al aplicar
electricidad a los nervios de las ancas de la rana, sus músculos se
contraían.
Descubrimientos como este dieron lugar a
debates sobre si la "electricidad animal" era
diferente de la electricidad producida en las
tormentas eléctricas. Galvani también
experimentó con esto, colgando ancas de rana
en su patio trasero durante tormentas y
observando los tirones que daban las ancas.
Estos resultados fueron también fuente de
inspiración para "Frankenstein", de Mary Shelley:
"Quizá podía reanimarse un cadáver; el galvanismo había dado prueba de tales
cosas; quizás podía fabricarse las partes componentes de una criatura,
ensamblarlas y dotarlas de calor vital"
-Mary Shelley, Introducción de Frankenstein
Eventualmente, la comunidad científica se puso de acuerdo y descubrió que si bien la
electricidad es capaz de estimular el sistema nervioso y el tejido muscular, el tejido en
sí genera electricidad. Esto llevó a los inicios de la neurociencia contemporánea, que
es lo que estás estudiando hoy.
Aprendimos acerca de los potenciales de acción (PA) y las sinapsis neurona-neurona
en el Laboratorio Uno, pero las respuestas musculares galvánicas son el resultado de
las sinapsis entre las neuronas motoras (NMs) y el músculo esquelético, o uniones
neuromusculares. A diferencia de las conexiones convergentes en las células nerviosas
centrales, una célula muscular postsináptica está usualmente inervada por una única
NM presináptica en una región especializada de la membrana muscular llamada placa
terminal. La acetilcolina (ACh) es liberada por el axón terminal de la NM, que
derechamente abre canales iónicos de Ca+2 dependientes de voltaje en la membrana
muscular, lo que permite la entrada de Ca+2 a la placa terminal con cada potencial de
acción. Las neuronas motoras excitan el músculo mediante la apertura de canales
iónicos en el extremo de la placa, generando un amplio potencial de placa que activa
rápidamente canales de Na+ dependientes de voltaje, y produce un potencial de acción
que se propaga a lo largo de la fibra muscular, generando movimiento.
En otro famoso experimento en 1870, los científicos y
médicos alemanes Eduard Hitzig y Fritsch Gustav
aplicaron una corriente eléctrica a la corteza cerebral
expuesta (la parte arrugada del cerebro) de un perro,
en su propia cocina (sí, en ese tiempo también
sonaba extraño) demostrando que la estimulación de
partes diferentes del cerebro puede causar diferentes
tipos de movimientos.
De manera similar, se ha demostrado que la estimulación del cordón nervioso puede
producir patrones de actividad rítmicos hacia los músculos de las piernas, denominados
generadores centrales de patrones (GCP). Ya en 1911, T. Graham Brown había
demostrado que estos patrones de espigas coordinados pueden inducir respuestas
musculares básicas como la pisada, sin la necesidad de un comando que baje a través
de la corteza.
Hoy en día, estas técnicas de “estimulación central/respuesta
sensorial motora” son utilizadas especialmente en pacientes
afectados por la enfermedad de Parkinson.
Mediante la inserción de un pequeño electrodo,
siempre en una parte específica del cerebro
conocida como el núcleo subtalámico, es posible
disminuir sacudidas y temblores asociados con la enfermedad. Sin embargo, se han
descrito efectos secundarios, como una asociación a la adicción al juego y otras
conductas compulsivas.
Actualmente, algunos grupos de investigación de avanzada están diseñando pequeños
chips que estimulan los nervios del ojo como una cura para la ceguera.
CONFIGURACIÓN
Electrodo de Microestimulación
El electrodo de microestimulación actuará como un intermediario entre el generador de
señal eléctrica y la cucaracha. El electrodo consistirá de un cable de audio que se
conecta al generador de señal como una vía para entregar la estimulación a la
cucaracha. Puedes elegir soldar pines al cable de audio, similares a los utilizados en el
práctico 1, o utilizar pinzas de cocodrilo que se pueden conectar a los electrodos que
vienen con tu SpikerBox.
Generador de señales eléctricas (GSE)
Existen muchos programas que pueden generar estímulos eléctricos ideales para este
práctico. Si estás usando un iPhone o iPad, puedes encontrar las siguientes
aplicaciones gratuitas en la tienda de iTunes, siguiendo estos enlaces:
AudioSigGen
FreqGen
Si estás usando un computador, puedes utilizar este software en línea:
Rhintech
Adicionalmente, puedes simplemente descargar varias frecuencias como archivos MP3
y reproducirlas a través de cualquier reproductor de MP3. Aquí te indicamos un sitio
web desde el que puedes descargar en forma gratuita las frecuencias apropiadas para
este ejercicio:
TestSounds
PROCEDIMIENTO
Ejercicio 1: Preparación de la pata de cucaracha para microestimulación
1. Prepara una pata de cucaracha, como se describe en el Laboratorio 1.
2. Coloca el electrodo de microestimulación. Si se utiliza el electrodo con pinzas de
cocodrilo, conecta las pinzas a los electrodos de registro del SpikerBox insertados en
la coxa y el fémur. Si se utiliza un electrodo directo, coloca los electrodos en la coxa
y el fémur de tu pata de cucaracha.
3. Conecta el electrodo de microestimulación a un GSE, como un computador o
reproductor de MP3.
4. Si eres capaz de hacerlo, programa tu SGE
para producir ondas cuadradas.
5. Ajusta tu SGE a 50% de volumen (amplitud) y
genera una señal con una frecuencia de 200 Hz
(200 repeticiones por segundo).
6. Reproduce el tono y observa la pata de la cucaracha. Si la pata se mueve en
respuesta a la estimulación, prosigue al ejercicio 2. Si la pata no se mueve, continúa
con el Paso 7.
7. Si la pata no se mueve en respuesta al estímulo, asegúrate de tener el electrodo
conectado a la salida de audio y que el tono se está produciendo. Debieras ser
capaz de oír un tono de 200 Hz en la mitad del volumen con ALTAVOCES
EXTERNOS. Si no escuchas el tono, es posible que necesite ajustar la configuración
de audio.
8. Si puedes producir un tono con el GSE, asegúrate a continuación que la pata esté
viva y que los electrodos estén en el lugar adecuado. Utilizando el protocolo del
práctico 1: ejercicio 1, utiliza los electrodos y altavoces de tu SpikerBox para
asegurarte que la pata esté generando espigas. Asegúrate de haber colocado los
electrodos en la coxa y el fémur.
9. Asegúrate que la soldadura en los electrodos esté intacta y que los electrodos no se
toquen entre sí. Consulta con tu profesor si sigues teniendo problemas para
estimular tu pata de cucaracha.
Ejercicio 2: Respuesta de NM de cucaracha a amplitud y frecuencia
Ahora que tienes un aparato de microestimulación funcional, es el momento de medir
las propiedades de frecuencia y amplitud en la respuesta de las neuronas motoras
(NMs) de la cucaracha. Esto se logrará simplemente observando la pata mientras es
estimulada con una gran variedad de tonos.
1. Empieza a estimular la pata a la frecuencia más baja (20 Hz) y menor volumen
(amplitud más baja posible de su dispositivo), y siga como se muestra en la Tabla
1. Ten en cuenta que, si trataras de oír lo que produce tu GSE, no podrías ser capaz de
oír un tono de 20 Hz por más que lo intentaras. El rango de audición humano oscila
entre 20 Hz y 20.000 Hz (20 kHz), si bien existe variación entre los individuos.
CUIDADO: NO USES AUDÍFONOS PARA ESTE EXPERIMENTO SI EL
VOLUMEN DE TU GSE ESTÁ POR SOBRE 50%, YA QUE PODRÍAS CAUSAR
DAÑO A TU OÍDO. UTILIZA SIEMPRE UN ALTAVOZ EXTERNO.
2. Usando la Tabla 1 como guía, prueba la capacidad de respuesta de la pata a todas
las amplitudes de cada frecuencia. Marcar cada prueba con un (+) o (-) para indicar si
la pata se movió en respuesta a la estimulación. Si tu GSE no produce las frecuencias
que aparecen en la Tabla 1, Utiliza las frecuencias que tengas disponibles y ajusta la
Tabla 1 según corresponda.
Tabla 1. Respuesta según frecuencia y Amplitud
Potencia
¼
½
Frecuencia
mínima
Potencia Potencia
20 Hz
40 Hz
80 Hz
150 Hz
200 Hz
1000 Hz
2000 Hz
3000 Hz
5000 Hz
10,000 Hz
¾
Potencia
Potencia
Máxima
Ejercicio 3A: Grabación y patrones de espigas de los ganglios de una cucaracha
Nota: Este experimento requiere que una cucaracha sea sacrificada
1. Coloca una cucaracha en agua con hielo o en
un congelador. Cuando la esté anestesiada,
colócala en tu mesón de laboratorio.
2. Con tijeras de disección, decapita la
cucaracha en la unión entre la cabeza y el
tórax. Coloca un poco de vaselina en el corte.
3. Inserta el electrodo de registro de tu SpikerBox a través del tórax de la cucaracha en
el ganglio metatoráxico. Trata de colocar el electrodo ligeramente a un lado del
ganglio. Inserta el electrodo de tierra en el tórax, donde la cabeza solía estar.
4. Conecta tu SpikerBox a tu computador, enciéndelo, y abre Audacity. Comienza la
grabación en el ganglio metatoráxico. Ajusta el eje Y de la grabación de modo de
maximizar las espigas observadas. Ajuste el eje X (utilizando la herramienta de lupa
que aparece en la barra de menú) para poder diferenciar ráfagas directamente
relacionadas con los movimientos.
5. Supervisa la grabación durante varios minutos, y toma nota sobre como se
corresponden con los movimientos de las patas metatoráxicas. Como las conexiones
entre el cordón nervioso ventral (CNV) y las patas metatoráxicas están intactas, los
potenciales de acción son capaces de propagarse por las neuronas motoras a los
músculos. También debieras ser capaz de observar movimientos espontáneos de la
cucaracha. Ten en cuenta que es probable que estés observando tres tipos de
información mientras estés grabando desde el ganglio: a) información motora
enviada desde el ganglio a los músculos de las patas; b) información sensorial que
se envía al CNV desde las piernas; y c) información que se integra y procesa entre
los ganglios a lo largo del CNV. Tu objetivo es identificar los patrones de espigas que
conducen a movimientos motores.
6. Una vez que te parezca identificar una relación entre movimientos específicos de las
patas y patrones específicos de espigas, anota los siguientes datos en la Tabla 2,
para cinco eventos diferentes: a) el tiempo de las espigas; b) una descripción del
movimiento.
7. Detén la grabación en Audacity y encuentra los patrones de espigas que anotaste en
la Tabla 2. Destaca con el mouse y copia (Control-C) la pequeña sección de una
serie de espigas. Abre un archivo nuevo de Audacity (Control+N) y pega el segmento
de espiga que copiaste (Control-V). Realiza esto para cada uno de los 5 patrones de
espigas de la Tabla 2, de modo que ahora tienes 5 nuevas ventanas de Audacity
abiertas.
8. Para cada patrón de espiga, amplia la traza en efecto-amplificar en la barra de
menú. Haz un boceto simple de cada patrón en la Tabla 2. Guarda cada patrón de
espiga para su uso posterior.
Tabla 2. Base de datos de patrones de espigas
Ejercicio 3B: Estimulación del ganglio metatoráxico
Ahora que tienes los patrones de espigas de actividad motora desde ganglio
metatoráxico a las patas, vas a comprobar si los patrones que registraste darán lugar a
los movimientos específicos que observaste.
1. Si estás usando una pinza de cocodrilo en el electrodo de microestimulación, adjunta
un electrodo al electrodo de registro que ya está situado en el ganglio metatoráxico. Si
estás usando un pin de electrodo conectado a un cable de audio, reemplaza el
electrodo de registro con el electrodo de microestimulación. Trata de insertar el
electrodo en el mismo lugar.
2. Como en el ejercicio 1, comienza a medir la eficacia de tus electrodos de
microestimulación. Registra el efecto de la microestimulación en tu cucaracha
preparada en términos de movimiento, en la Tabla 3. Escribe una breve descripción del
movimiento en respuesta a una estimulación de 5 segundos.
Tabla 3. Efecto de la frecuencia y amplitud en el movimiento
Frecuencia
Potencia Mínima
½ Potencia
Potencia Máxima
20 Hz
80 Hz
200 Hz
1000 Hz
2000 Hz
3. Ahora, utilizando los patrones de espiga generados en el ejercicio 3A, estimula los
ganglios metatoráxicos a diferentes volúmenes. Anota los resultados en la Tabla 4.
Describe el movimiento que observaste (si existió), y si este movimiento es el mismo
que el correspondiente movimiento registrado en la Tabla 2.
Tabla 4. Efecto de los patrones de espiga y de la amplitud en el movimiento
Patrón de
Espiga
Patrón 1
Patrón 2
Patrón 3
Patrón 4
Patrón 5
Potencia Mínima
½ Potencia
Potencia Máxima
PREGUNTAS DE DISCUSIÓN
1. En este experimento probaste la capacidad de respuesta de las patas de cucaracha
a una amplia gama de frecuencias y amplitudes. ¿Existe alguna similitud en los
tipos de frecuencias y/o amplitudes que causaron la mayor capacidad de
respuesta? ¿Por qué crees que podría ser?
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2. ¿Fuiste capaz de identificar patrones de espiga que llevaron a movimientos
motores? Si fue así, ¿cuáles fueron las características de estos patrones? ¿Qué
tipos de movimientos fuiste capaz de encontrar para estos patrones?
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3. Cuando estimulaste los ganglios metatoráxicos con los patrones de espiga que
habías observado durante los movimientos de las patas, ¿pudiste generar algún
movimiento en la pata? ¿Fueron estos movimientos de las piernas los mismos que
observaste durante la grabación de los patrones de espiga? ¿Por qué crees que
esto es así?
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