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[Escribir el título del documento] IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) EN ESTUDIANTES DE CIENCIAS DE LA SALUD. INTRODUCCIÓN El VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. El Virus del Papiloma Humano representa una de las infecciones de transmisión sexual más comunes, aunque todavía poco conocida. La familia de los VPH cuenta con más de 150 tipos virales que, en relación con su patogenia oncológica, se clasifican en tipos de alto y de bajo riesgo. El paradigma de los primeros constituye los Virus del Papiloma Humano del tipo 16 y 18 y el de los segundos, los Virus del Papiloma Humano de tipo 6 y 11. Las infecciones por tipos de alto riesgo siguen predominantemente un curso silente, tienden a establecer infecciones persistentes y generan alteraciones citológicas características englobadas mayoritariamente en grupos de las neoplasias cervicales. En una proporción menor, las infecciones por Virus del Papiloma Humano de alto riesgo pueden progresar a lesiones escamosas intraepiteliales de alto grado y a cáncer de cuello de útero. Algunos de los tipos virales de alto riesgo también asociados a tumores en otras localizaciones ano genitales. Los Virus del Papiloma Humano de tipo 6/11 rara vez se encuentran en lesiones neoplásicas y cursan predominantemente con infecciones clínicamente visibles, denominadas verrugas genitales o condilomas acuminados. El Virus del Papiloma Humano infecta las áreas de las mucosas del cuello del útero, vagina, la vulva, el ano y el pene. La detección de los tipos del Virus del Papiloma Humano se realiza mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), no obstante se han detectado Virus del Papiloma Humano en manos, boca, lengua, cara, etc. En menor cantidad pero relacionadas al mismo. Duración de la infección por Virus del Papiloma Humano Las infecciones por tipos del Virus del Papiloma Humano de alto riesgo parecen persistir durante más tiempo que las producidas por tipos de bajo riesgo. Entre los tipos de alto riesgo, existe cierta evidencia de que el Virus del Papiloma Humano tipo 16 puede persistir durante más tiempo que los otros tipos. La infección por el Virus del Papiloma Humano en los hombres también parece tener una duración corta, y en la mayoría de las infecciones no son detectables, transcurridos 1 año, aunque se dispone de cierta evidencia de una mayor persistencia de infecciones masculinas de alto riesgo frente a las de bajo riesgo. 1 MARCO TEÓRICO El diagnóstico basado en el estudio del ácido desoxirribonucleico (ADN) ha experimentado un avance considerable en el último decenio fruto de la identificación, caracterización y cartografiado de un elevado número de genes implicados en patologías humanas. En la actualidad, el análisis de numerosas patologías genéticas puede ser abordado en los laboratorios de genética molecular humana, tanto con una finalidad clínica como de investigación básica. OBJETIVO Usando las técnicas de la biología molecular vamos a identificar la existencia del Virus del Papiloma Humano (VPH) en estudiantes de Ciencias de la Salud en la Universidad Veracruzana. MATERIALES. Muestras sanguíneas Muestras de Exudado Vaginal Tubos Eppendorf Tubos Falcon TBE Agarosa Matraz Probeta Bromuro de etidio EDTA Etanol (aldrich) METODOLOGIA La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas 2 entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (94 ºC en algunos momentos) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras con corrección de errores (Pfu, Vent). Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador. TÉCNICA Para realizar la técnica se necesita: Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores (primers), oligonucleótidos, que cada uno es complementario a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que se usan para iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia (no más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN a amplificar. Iones de magnesio (Mg 2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2) Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de polimerasas. ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada paso del ciclo. Ciclo de amplificación La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC durante 5-10 minutos, en el cuál se activa la ADN polimerasa, en caso de necesitarlo. Posteriormente tiene tres pasos que se repiten entre 20 y 40 veces: Desnaturalización. Unión del cebador. Extensión de la cadena. 3 Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa, normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su conservación. Este ciclo (desnaturalización-hibridación-extensión) se repetirá un número de veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee. Generalmente son 30 ciclos, ya que un número mucho mayor de ciclos no implica un mayor rendimiento. Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. Otros métodos, raramente empleados, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización. Unión del cebador Unión del cebador. A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC, aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. Extensión de la cadena. Extensión de la cadena. Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC, temperatura a la cual la ADN polimerasa presenta su máximo de actividad, produciéndose una copia del fragmento que se desea amplificar. GLOSARIO DIAGNÓSTICO MOLECULAR: Es la aplicación de una técnica encaminada al estado de los ácidos nucleicos y proteínas. BIOLOGÍA MOLECULAR Es la disciplina científica que tiene como objetivo el estudio de los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular. ELECTROFORESIS 4 Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN) Es una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria. RESUMEN DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 5 Las bases teóricas de la reacción de la Reacción en cadena de la polimerasa son simples. En la reacción intervienen tres segmentos del ácido desoxirribonucleico (ADN): el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos pequeños fragmentos de cadena sencilla, los oligonucleótidos (primer´s u oligos), que tienen la misma secuencia que los extremos flanqueantes del ácido desoxirribonucleico (ADN) molde. Además, participan en el reacción el enzima Taq polimerasa (Taq), de oxinucleótidos - trifosfato (dNTPs), sales, y un tampón. Los oligos se añaden a la reacción en exceso con respecto al ácido desoxirribonucleico (ADN) que desea amplificarse. Los oligos hibridarán con las regiones complementarias del ácido desoxirribonucleico (ADN), quedando orientados con sus extremos 3´ enfrentados, de modo que la síntesis mediante la ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerasa (que cataliza el crecimiento de nuevas cadenas 5´® 3´) se extiende a lo largo del segmento de ácido desoxirribonucleico (ADN)que queda entre ellas. El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos. Este tipo de productos se irá acumulando de forma geométrica, con cada ciclo de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de la reacción. Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez como moldes, generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de síntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de forma exponencial. El primer paso necesario en este proceso de la síntesis es la desnaturalización del ácido desoxirribonucleico (ADN). Puesto que el molde es una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena, será necesaria la separación de estas para que los oligos puedan acceder a sus secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de alineamiento ("annealing"). Una vez que los oligos se han unido a las cadenas, sirven como cebadores para la acción de la ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de ácido desoxirribonucleico (ADN) complementarias, en el proceso de elongación. Estos tres pasos consecutivos (desnaturalización, alineamiento y elongación) constituyen un ciclo de síntesis. Para las reacciones de PCR de secuenciación se ha diseñado una Taq polimerasa específica, Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus aquaticus y modificada genéticamente de forma que posee muy baja actividad exonucleasa 5´->3´ con lo que los resultados son más limpios con menos ruido de fondo y apenas falsas terminaciones. Además este enzima incorpora los ddNTPs marcados fluorescentemente más eficientemente, con lo cual son necesarios menos ddNTPs-fluorescentes y menos ácido desoxirribonucleico (ADN) molde para conseguir la misma señal. Reactivo Cantidad 6 DNA 1ml BUFFER 5ml dNTPs 10ml Primers (oligo) 1ml/1ml Mg Cl2 4ml Taq DNA 0.3ml D H2O 3.7ml Aceite mineral 1gota Tabla de factores utilizados en el termociclador tiempo 30 seg. 30 seg. 45 seg. temperatura 95o C 57o C 70o C intervalo 2 3 4 PCR CORE KIT Reagents sufficient for 250 units of taq DNA polymerase P-2192 PCR buffer (10x) 1vial P-2317 PCR buffer II 1vial M-8787 Magnesium Chloride 1vial W-1754 Water 3 vial D-7295 Deoxidnucleotide Mix 0.25ml MB-345 Technical Bulletin The PCR processing covered by patents 7 Resumen de la preparación del gel de agarosa La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agaragar, pero de composición más homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0,5 a 2%) poseen la propiedad de permanecer líquidas por encima de aprox. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas, embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas de ácido nucleico a su través, en mayor medida cuanto más grande sea esta Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde adecuado, se dejan en él unos huecos o pocillos para poder introducir luego en ellos la muestra, y que así ésta se vea obligado a introducirse en el seno del gel cuando apliquemos el campo eléctrico. Se preparó el gel al 1.5% en 50ml de TBE al 0.5% Procedimiento En un matraz se depositó 50ml de TBE al 0.5% y 75gr de polvo de agarosa y se calentó hasta que la solución quedara transparente sin partículas de agarosa, después de esto se agregaron 5ml de bromuro de etidio y se procedió a decantar en la cámara electroforética hasta que enfrié. El bromuro de etidio es un sólido rojo, un potente mutagénico de efecto acumulativo, es nocivo por ingestión, tóxico por inhalación e irritante para los ojos, la piel y las vías respiratorias; debe ser manipulado única y exclusivamente por personal capacitado El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante usado comúnmente como marcador de ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular para procesos como la electroforesis en gel de agarosa. Compuestos fluorescentes son formados por intercalación y estos compuestos se pueden ver por irradiación con luz ultravioleta. 8 TÉCNICA DE EXTRACCIÓN DE DNA DE LEUCOCITOS 1. Extraer 3 ml de sangre periférica y colocarlos en tubo de 13 x 100 con EDTA al 10%. Posteriormente se transfiere la sangre a tubos de Falcon de 10 ml y se adicionan 3 ml de TTS (tris-tritón-sacarosa) 2. Se centrífuga a 3000 r.p.m. durante 10 min. 3. Se decanta el sobrenadante a un vaso con color (desechar). Este es un punto muy importante puesto que en el fondo queda un botón espeso que no se debe perder al decantar. 4. Agregar al botón 1ml de TTS y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, homogeneizar fuerte (con la mano o con un vortex con disco agitador para tubos Eppendorf) hasta disolver el botón y centrifugar a 12 000 r. p. m. Durante dos minutos a 4°C. 5. decantar el sobrenadante y agregar 1 ml más de TTS y otra vez disolver el botón y centrifugar otros dos minutos a 4°C . (este paso se tiene que repetir hasta que se obtenga un botón blanco y también el sobrenadante). 6. Una vez que se haya decantado el sobrenadante blanco y da un botón blanquecino se agregan 570 ðl de NaCl 5mM y homogeneizar dos minutos (aquí no se decanta) + 30 ðl de SDS al 10% y homogeneizar diez minutos + 200 ðl de NaCl saturado y homogeneizar 15 minutos. 7. una vez que se haya realizado esta mezcla se centrífuga a 12, 000 r.p.m durante 10minutos a 4°C. se vierta el sobrenadante en el etanol absoluto, una vez que esto se haya hecho mezclar suavemente el tubo que contiene el etanol absoluto y el sobrenadante de lo que se centrífugo y se va a observar la hebra blanquecina de DNA (si aquí no se observa ninguna hebra entonces se perdieron los leucocitos en el primer paso). 8. Después se almacena el tubo que contiene el etanol + el ácido desoxirribonucleico (ADN) 9. Al día siguiente con una pipeta de 1000 ðl se elimina el etanol en el que estuvo el ácido desoxirribonucleico (ADN)agregan otros dos ml de etanol al 70% 10. Después se centrífuga a 9000 r.pm durante 10 minutos a 4 °C. 11. Eliminar el sobrenadante y el tubo Eppendorf con el botón blanco que queda se coloca en un desecador a vacío durante 15 minutos a temperatura ambiente. 12. Finalmente ya que esté perfectamente deshidratado al ácido desoxirribonucleico (ADN)se agregan de 300 a 400 ðl de agua bidestilada desionizada estéri 9 Muestras 8 Muestras sanguíneas. 1 Muestra cervicovaginal. RESULTADOS TERMOCICLADOR Ajuste de parámetros biomate 3 V2.100 DNA(260/280)..................10:41am 29 abril11 Nombre de análisis...........DNA (260/280) [Default] Long de onda 1 ...............260nm Long de onda 2..................280nm Correcc de L.O de Ref......apagado Factor ADN (260nm)......62.90 Factor ADN (280nm).....36.00 Mostrar proteínas: encendido Factor de proteínas (260nm) 1552 Factor de proteínas (280nm) 752.3 Multiplicador de dilución (calculad 1.000) vol. de muestra: 1microlitro Volumen de dilución: 0 micro litros Unidades microgramos/ ml Se muestra el corrimiento en bandas en electroforesis. Este es el marcador. 10 Paciente #1 Abs a 260 nm: 1.298 Relación ADN 1.096 Abs 280nm: 1.184 DNA µg/ml 39.02 Proteína µg/ml 854.6 Resultado negativo en el caso 1. Muestra sanguinea. Paciente #2 Abs a 260nm: 0.031 Relación ADN 1.033 Abs 280nm: 0.030 DNA µg/ml 0.870 Proteína µg/ml 23.08 Resultado negativo en el caso 2. Muestra sanguinea. Paciente #3 Abs a 260nm: 0.021 Relación ADN 1.000 Abs a 280nm:0.021 DNA µg/ml 0.565 Proteína µg/ml 16.69 Resultado negativo en el caso 3. Muestra sanguinea. 11 Paciente #4 Abs a 260nm: 0.042 Relación ADN 1.313 Abs a 280nm: 0.032 DNA µg/ml 1.490 Proteína µg/ml 17.86 Resultado negativo en el caso 4. Muestra sanguinea. Paciente #5 Abs a 260nm:0.097 Relación ADN 1.155 Abs a 280nm: 0.084 DNA µg/ml 3.077 Proteína µg/ml 56.91 Resultado negativo en el caso 5. Muestra sanguinea. Paciente #6 Abs a 260nm: 0.064 Relación ADN 1.164 Abs a 280nm: 0.055 DNA µg/ml 2.046 Proteína µg/ml 36.89 Resultado negativo en el caso 6. Muestra sanguinea. 12 Paciente #7 Abs a 260 nm: 0.091 Relación ADN 1.071 Abs a 280nm: 0.085 DNA µg/ml 2.664 Proteína µg/ml 63.01 Resultado negativo en el caso 7. Muestra sanguinea. Paciente #8 Abs a 260 nm: 0.048 Abs a 280nm: 0.047 Relación ADN 1.021 DNA µg/ml 1.327 Proteína µg/ml 36.59 Resultado negativo en el caso 8. Muestra cervicovaginal. Paciente #9 Abs a 260 nm: 0.098 Abs a 280nm: 0.088 Relación ADN 1.114 DNA µg/ml 2.996 Proteína µg/ml 62.36 Resultado negativo en el caso 9. Muestra cervicovaginal. 13 ANEXOS Extracción de sangre mediante vacutainer a 8 pacientes del sexo masculino. Los pacientes son pertenecientes a la facultad de Bioanálisis, reservándonos en nombre por cuestiones de confidencialidad. Muestras cervicovaginales, obtenidas mediante un citobrush, transportadas y refrigeradas. Una paciente es de la facultad de Bioanálisis y otra pacientes es perteneciente a la facultad de enfermería, reservándonos en nombre por cuestiones de confidencialidad. Las muestras fueron lavadas en repetidas ocasiones, como resultado de ese proceso nos dio un botón limpio. Centrifuga utilizada para realizar dichos lavados. 14 Se muestra la extracción de micro litros de muestra las cuales deben ser añadidas con cierto cuidado y exactitud. En esta imagen observamos la muestra, la cual está lista para ser filtrada. Se muestra la gradilla con las muestras sanguíneas, listas para la electroforesis. Se muestra el agar con muestras de los pacientes 15 Equipo en el cual se realiza la electroforesis. Tubos en los cuales se agregara la muestra cervicovaginal Se muestra cómo se va añadiendo las muestras tanto de sangre como cervicovaginales. Se muestra el corrimiento de las muestras, a los 45 min. De su inicio. 16 En la imagen se muestra el resultado final de la muestras tanto sanguíneas como cervicovaginales. Se muestra del lado izquierdo el control. 17 DISCUSIÓN DE RESULTADOS: Los resultados obtenidos de nuestra investigación, fueron negativos, fueron realizados dentro de una población de alumnos de ciencias de la salud, al no encontrar ningún resultado positivo podríamos pensar en que estudiantes esta libre del Virus del Papiloma Humano, pero la población en que realizamos esta investigación fue muy pequeña a proporción del total de alumnos de ciencias de la salud, así que este resultado nos podría dar un falso negativo. La concientización de los alumnos de ciencias de la salud es algo primordial ya que estos son los que promotores de salud y habría gran incongruencia en alumnos infectado por este virus. CONCLUSIÓN La PCR es una nueva herramienta de investigación y diagnóstico de laboratorio muy potente que abre todo un nuevo mundo de posibilidades. Su aplicación ha de ser limitada a aquellos casos o estudios que lo permitan y en ningún momento su aplicación ha de desmerecer y suplir la técnica oficial de detección y enumeración del VPH. La detección oportuna de este virus es de importancia en lo que respecta a salud pública, tanto para el tratamiento de la población que esta contagiada y la eliminación y propagación como para las diferentes formas de prevención Además la divulgación de esta enfermedad de transmisión sexual y hacer llegar el conocimiento de la detección de este virus por medio de diagnóstico molecular y las ventajas que este tiene a comparación sobre los laboratoriales comunes. 18