Download Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Southern blot
Northern blot
Con
hibridación
Western blot
FISH
Microarray
Detección de
ácidos nucleicos
PCR
Con
amplificación
LCR
NASBA, b-DNA
• Métodos de amplificación de la diana
- PCR (y sus variantes)
- NASBA (Nucleic Acid Sequence based
amplification)
• Métodos de amplificación de la sonda
- Reacción en cadena de la ligasa (LCR)
• Métodos de amplificación de la señal
- Branched DNA (b-DNA)
Historia de la PCR
Kary Mullis

Diseñó la técnica de PCR en los años 80

Premio Nobel en Química, 1993
¿Qué es la PCR?
PCR
Técnica molecular específica, rápida,
sensible y versátil
A partir de una molécula de ADN se obtienen
millones de copias de un mismo fragmento
¿Cómo es esto posible? ....
Pensemos en la naturaleza...
¿Cómo hace la célula para replicar su genoma?
DOBLE CADENA DE ADN
SE DESNATURALIZA LA DOBLE
HEBRA
SE UNE
LA
ENZIMA
ADNpol
SE SINTETIZAN 2
COPIAS IDÉNTICAS
A LA DOBLE
CADENA DE ADN
¿Cómo podemos
lograrlo in vitro?
PCR
Molécula de
ADN (molde)
ADN polimerasa
termoestable
Cebador sentido
Cebador Antisentido
dNTPs (A;G;T;C)
Cofactor Mg2+
¿Qué es un primer?
Secuencia de oligonucleótidos complementaria a secuencia de ADN
que se desea amplificar
Fragmento de ADN
PRIMER REV
SECUENCIA QUE DESEO AMPLIFICAR
PRIMER FW
• Permite amplificar un fragmento específico a partir del genoma
Primers
3´
5´
CACGGCCCTGGGAACAATGCAGCTCCGCGTGCGGGCTGAGAGGACCCTGCCCCACCCCAGGTTCCACGCTCA
3´ GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´
5´CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´
3´ GTGCCGGGACCCTTGTTACGTCGAGGCGCACGCCCGACTCTCCTGGGACGGGGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT5´
Cebador sentido (Primer Forward )
5´CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´
Cebador antisentido (Primer reverse)
3´ GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´
Características ideales para un primer
• Longitud: entre 18 y 30 nucleótidos
• Contenido G+C entre 40-75%
• Carecer, en lo posible, de estructuras secundarias y de
complementariedad entre sí
• Ambos primers deben tener temperatura de pegado
similar. Cálculo de la temperatura de annealing:
[2(AxT ) + 4(CxG)] - 5
• Existen programas para diseñar primers y evaluar sus
características
La ADN polimerasa
• Debe ser resistente a altas temperaturas: actúan
~72°C
• Existen varias: la más usada es la Taq obtenida de la
bacteria Thermophilus aquaticus (enzima
termoestable)
• Actividad exonucleasa 5´ 3´
• Enzima se une con alta afinidad al ADN
• Necesita de primer o cebador para empezar la
reacción
• Necesita de cofactores (Mg2+).
Concentración tiene efecto en especificidad y rendimiento de reacción  baja
concentración: bajo rendimiento, exceso: amplificaciones inespecíficas
Los desoxinucleótidos (dNTPs)
GRUPO FOSFATO
• Concentración afecta especificidad y fidelidad
AZÚCAR
BASE NITROGENADA
de reacción
• Concentraciones altas: disminuye fidelidad de polimerasa y puede inhibir su
actividad.
Pasos de la PCR
Desnaturalización
Pegado del primer
Extensión
Repetición de ciclos
Amplificación de
fragmento determinado
Termocicladores
Pasos de la PCR
Tres pasos básicos
Desnaturalización
Primers
complementarios
Apareamiento
Elongación
PCR
• Termociclador
• Reacción comienza a 94ºC: puentes de H
que mantienen unidos a la doble hebra se
rompen  ADN molde se desnaturaliza
(moléculas simple cadena)
• La temperatura es reducida a 50-60ºC:
primers se hibridan en sus posiciones de
pegado (annealing).
• Síntesis de ADN (expansión): a 72ºC
(temperatura óptima para Taq pol)
• Primeros ciclos: grupo de productos largos
se sintetiza a partir de cada cadena de ADN
molde. Estos polinucleótidos tienen
extremos 5´ idénticos pero extremos 3´
distintos.
• Ciclos desnaturalización –
hibridación (annealing) expansión: productos largos
actúan como molde para la
síntesis de ADN dando
productos cortos con extremos
5’ y 3’ determinados por los
sitios de pegado de los
primers.
• Ciclos subsecuentes:
productos cortos se acumulan
(exponencialmente) hasta que
uno de los componentes se
agota.
1. Desnaturalización
Rotura de puentes de H que unen desoxinucleótidos (temperatura
depende de contenido de GC)
95ºC
2. Annealing
Pegado de primers a secuencia target
Temperatura depende de primers: muy alta  poco/nada de
producto, muy baja  productos inespecíficos
ADN Target
forward
5’ 3’
40-60ºC
3’
5’
reverse
3. Extensión
Incorporación de los dNTPs al extremos 3´ libre
72ºC
dNTPs libres
TAQ
Incorpora 100 nt por segundo
Extensión final 5 min: asegura que productos de amplificación estén
completamente terminados
Producto
• Longitud determinada por distancia que separa sitios
de pegado de primers
• Productos largos amplifican con < eficiencia
(existen enzimas más eficientes para estos)
• Productos cortos pueden confundirse con dímeros de
primers en un gel.
PCR
Verificación del producto de PCR
en gel de agarosa
Marcador de tamaño molecular
Productos de PCR
¿Por qué el número de ciclos no
puede ser mayor a 40?
Efecto plateau
• Degradación de reactivos
• Inactivación de la enzima
• Agotamiento de reactivos
Controles de la PCR
La PCR siempre debe contar con un control positivo y uno negativo.
Estos controles son necesarios para:
• Comprobar que no exista contaminación en la mix de reacción
(control negativo)
• Corroborar que si no existe el producto deseado, no es por un
desperfecto en la reacción (control positivo).
 CONTROL NEGATIVO: se utiliza agua como molde
 CONTROL POSITIVO: se utiliza como molde ADN que se sabe
tiene el sitio de pegado de primers.
Falsos positivos y negativos de la PCR
• Causas de falsos positivos
- CONTAMINACIÓN!!
- Amplificación inespecífica
• Causas de falsos negativos
-
Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)
Extracción del ADN defectuosa
Mutación en el sitio de hibridación del cebador
Baja concentración o calidad del templado
Concentración incorrecta de Mg2+ o primers
Variantes de la PCR
•
•
•
•
•
•
•
•
•
RT-PCR
PCR anidada (Nested PCR)
Booster PCR
PCR asimétrica
PCR Multiplex
PCR Reversa
SISPA-PCR
PCR competitiva
PCR en tiempo real (Real Time PCR)
RT-PCR
Técnica usada para amplificar una secuencia de ácido ribonucleico
(ARN).
ADN
TRANSCRIPCIÓN
ARN
RETROTRANSCRIPCIÓN
Pasos de la RT-PCR
- ADN complementario es
producido a partir de ARNm +
dNTPs + enzima ADN polimerasa
(retrotranscriptasa) + primer de
ADN = oligo(dT) (5´TTTTTT3´)
que se hibrida con cola poly(A)
del ARNm generando ADNc.
- Luego que se completa la
reacción de retrotranscripción, se
realiza PCR para generar segunda
cadena de ADN.
ARNm
RT
ARNm (rosa) + ADNc
(azul)
DEGRADACIÓN ARN
Primer cadena de ADN
PCR
Síntesis de segunda
cadena de ADN
PCR anidada (Nested PCR)
 Más sensible y específica.
 Ideal para muestras con poca cantidad de
templado.
Booster PCR
 Dos amplificaciones
sucesivas con idéntico
set de primers.
 Más sensible.
1° PCR
2° PCR con el mismo set de
cebadores
PCR asimétrica
Útil para generar sondas
PCR múltiple (Multiplex)
Amplifica múltiples productos incluidos en el
mismo templado
PCR reversa
 Sólo se conoce una secuencia
de ADN para la hibridación
de los 2 cebadores.
Secuencia
conocida
Corte con enzima de
restricción
Fragmento cortado
PCR con un par de
cebadores
Sequence Independent Single
Primer Amplification
(SISPA) PCR
 Sirve para amplificar fragmentos
de ADN de secuencia
desconocida.
 Utiliza primers adaptadores.