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IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH)
EN ESTUDIANTES DE CIENCIAS DE LA SALUD.
INTRODUCCIÓN
El VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO.
El Virus del Papiloma Humano representa una de las infecciones de
transmisión sexual más comunes, aunque todavía poco conocida. La familia de
los VPH cuenta con más de 150 tipos virales que, en relación con su patogenia
oncológica, se clasifican en tipos de alto y de bajo riesgo.
El paradigma de los primeros constituye los Virus del Papiloma Humano
del tipo 16 y 18 y el de los segundos, los Virus del Papiloma Humano de tipo 6
y 11. Las infecciones por tipos de alto riesgo siguen predominantemente un
curso silente, tienden a establecer infecciones persistentes y generan
alteraciones citológicas características englobadas mayoritariamente en grupos
de las neoplasias cervicales. En una proporción menor, las infecciones por
Virus del Papiloma Humano de alto riesgo pueden progresar a lesiones
escamosas intraepiteliales de alto grado y a cáncer de cuello de útero. Algunos
de los tipos virales de alto riesgo también asociados a tumores en otras
localizaciones ano genitales. Los Virus del Papiloma Humano de tipo 6/11 rara
vez se encuentran en lesiones neoplásicas y cursan predominantemente con
infecciones clínicamente visibles, denominadas verrugas genitales o
condilomas acuminados. El Virus del Papiloma Humano infecta las áreas de las
mucosas del cuello del útero, vagina, la vulva, el ano y el pene. La detección de
los tipos del Virus del Papiloma Humano se realiza mediante técnicas de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), no obstante se han detectado
Virus del Papiloma Humano en manos, boca, lengua, cara, etc. En menor
cantidad pero relacionadas al mismo.
Duración de la infección por Virus del Papiloma Humano
Las infecciones por tipos del Virus del Papiloma Humano de alto riesgo
parecen persistir durante más tiempo que las producidas por tipos de bajo
riesgo. Entre los tipos de alto riesgo, existe cierta evidencia de que el Virus del
Papiloma Humano tipo 16 puede persistir durante más tiempo que los otros
tipos.
La infección por el Virus del Papiloma Humano en los hombres también parece
tener una duración corta, y en la mayoría de las infecciones no son detectables,
transcurridos 1 año, aunque se dispone de cierta evidencia de una mayor
persistencia de infecciones masculinas de alto riesgo frente a las de bajo
riesgo.
1
MARCO TEÓRICO
El diagnóstico basado en el estudio del ácido desoxirribonucleico (ADN) ha
experimentado un avance considerable en el último decenio fruto de la
identificación, caracterización y cartografiado de un elevado número de genes
implicados en patologías humanas. En la actualidad, el análisis de numerosas
patologías genéticas puede ser abordado en los laboratorios de genética
molecular humana, tanto con una finalidad clínica como de investigación
básica.
OBJETIVO
Usando las técnicas de la biología molecular vamos a identificar la existencia
del Virus del Papiloma Humano (VPH) en estudiantes de Ciencias de la Salud
en la Universidad Veracruzana.
MATERIALES.
 Muestras sanguíneas
 Muestras de Exudado Vaginal
 Tubos Eppendorf
 Tubos Falcon
 TBE
 Agarosa
 Matraz
 Probeta
 Bromuro de etidio
 EDTA
 Etanol (aldrich)
METODOLOGIA
La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas
en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular
descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría
basta partir de una única copia de ese fragmento. Esta técnica sirve para
amplificar un fragmento de ADN. Tras la amplificación, resulta mucho más fácil
identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causante de una
enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica
sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho
que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente
abaratamiento
del
equipo
necesario
para
llevarla
a
cabo.
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas
para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas
2
entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a
unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Inicialmente la técnica era
lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de
temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto
que las temperaturas del ciclo (94 ºC en algunos momentos) suponen la
inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas
termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas
temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos
microorganismos son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus
furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus termophilus (Tth).
Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con
otras
con
corrección
de
errores
(Pfu,
Vent).
Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato
llamado
termociclador.
TÉCNICA
Para realizar la técnica se necesita:
 Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo
ADN.
 Dos cebadores (primers), oligonucleótidos, que cada uno es
complementario a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias
cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22,
que se usan para iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentados y
a no mucha distancia (no más de 4 kb. Delimitan la zona de ADN a
amplificar.
 Iones de magnesio (Mg 2+), agregado comúnmente como cloruro de
magnesio (MgCl2)
 Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
 ADN polimerasa o mezcla de polimerasas.
 ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar.
 Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria
en cada paso del ciclo.
Ciclo de amplificación
La PCR básica consta de un primer paso de calentamiento hasta 94-95ºC
durante 5-10 minutos, en el cuál se activa la ADN polimerasa, en caso de
necesitarlo. Posteriormente tiene tres pasos que se repiten entre 20 y 40 veces:
 Desnaturalización.
 Unión del cebador.
 Extensión de la cadena.
3
Una vez completados todos los ciclos, se finaliza con dos pasos, uno de
extensión de la cadena a la temperatura óptima de la ADN polimerasa,
normalmente 72ºC, para finalizar enfriando la muestra a 4ºC para su
conservación.
Este ciclo (desnaturalización-hibridación-extensión) se repetirá un número de
veces dependiente de la cantidad de fragmentos amplificados que se desee.
Generalmente son 30 ciclos, ya que un número mucho mayor de ciclos no
implica un mayor rendimiento.
 Desnaturalización
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de
las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes
modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más
habitual. Otros métodos, raramente empleados, serían la adición de
sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.
Unión del cebador
 Unión del cebador.
A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el
cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para
esto es necesario que la temperatura descienda (generalmente, a 55 ºC,
aunque se puede variar según sea el caso entre 45ºC y 65ºC). Estos
cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a
ser amplificada.
 Extensión de la cadena.
Extensión de la cadena. Por último actúa la ADN polimerasa, tomando el
ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del
cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN.
Se aumenta la temperatura hasta 72 ºC, temperatura a la cual la ADN
polimerasa presenta su máximo de actividad, produciéndose una copia
del fragmento que se desea amplificar.
GLOSARIO
DIAGNÓSTICO MOLECULAR: Es la aplicación de una técnica encaminada al
estado de los ácidos nucleicos y proteínas.
BIOLOGÍA MOLECULAR
Es la disciplina científica que tiene como objetivo el estudio de los procesos
que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular.
ELECTROFORESIS
4
Es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga
eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)
Es una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la
información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los
organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su
transmisión hereditaria.
RESUMEN DE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
5
Las bases teóricas de la reacción de la Reacción en cadena de la polimerasa
son simples. En la reacción intervienen tres segmentos del ácido
desoxirribonucleico (ADN): el segmento de doble cadena que queremos
amplificar, y dos pequeños fragmentos de cadena sencilla, los oligonucleótidos
(primer´s u oligos), que tienen la misma secuencia que los extremos
flanqueantes del ácido desoxirribonucleico (ADN) molde. Además, participan
en el reacción el enzima Taq polimerasa (Taq), de oxinucleótidos - trifosfato
(dNTPs), sales, y un tampón.
Los oligos se añaden a la reacción en exceso con respecto al ácido
desoxirribonucleico (ADN) que desea amplificarse. Los oligos hibridarán con
las regiones complementarias del ácido desoxirribonucleico (ADN), quedando
orientados con sus extremos 3´ enfrentados, de modo que la síntesis mediante
la ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerasa (que cataliza el crecimiento de
nuevas cadenas 5´® 3´) se extiende a lo largo del segmento de ácido
desoxirribonucleico (ADN)que queda entre ellas.
El primer ciclo de síntesis producirá nuevas cadenas, de longitud
indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos.
Este tipo de productos se irá acumulando de forma geométrica, con cada ciclo
de síntesis, utilizando como moldes las moléculas de ADN parental de la
reacción.
Durante el segundo ciclo de síntesis, estas cadenas hijas servirán a su vez
como moldes, generándose en este caso fragmentos cuyo tamaño será el del
fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas
hijas servirán de molde a su vez para sucesivos ciclos de síntesis. La cantidad
de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulando de
forma exponencial. El primer paso necesario en este proceso de la síntesis es
la desnaturalización del ácido desoxirribonucleico (ADN). Puesto que el molde
es una molécula de ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena, será
necesaria la separación de estas para que los oligos puedan acceder a sus
secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de
alineamiento ("annealing"). Una vez que los oligos se han unido a las cadenas,
sirven como cebadores para la acción de la ácido desoxirribonucleico (ADN)
polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de ácido
desoxirribonucleico (ADN) complementarias, en el proceso de elongación.
Estos tres pasos consecutivos (desnaturalización, alineamiento y elongación)
constituyen un ciclo de síntesis.
Para las reacciones de PCR de secuenciación se ha diseñado una Taq
polimerasa específica, Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq
polimerasa de Thermus aquaticus y modificada genéticamente de forma que
posee muy baja actividad exonucleasa 5´->3´ con lo que los resultados son
más limpios con menos ruido de fondo y apenas falsas terminaciones. Además
este enzima incorpora los ddNTPs marcados fluorescentemente más
eficientemente, con lo cual son necesarios menos ddNTPs-fluorescentes y
menos ácido desoxirribonucleico (ADN) molde para conseguir la misma señal.
Reactivo
Cantidad
6
DNA
1ml
BUFFER
5ml
dNTPs
10ml
Primers (oligo)
1ml/1ml
Mg Cl2
4ml
Taq DNA
0.3ml
D H2O
3.7ml
Aceite mineral
1gota
Tabla de factores utilizados en el termociclador
tiempo
30 seg.
30 seg.
45 seg.
temperatura
95o C
57o C
70o C
intervalo
2
3
4
PCR CORE KIT
Reagents sufficient for 250 units of taq DNA polymerase
P-2192 PCR buffer (10x) 1vial
P-2317 PCR buffer II 1vial
M-8787 Magnesium Chloride 1vial
W-1754 Water 3 vial
D-7295 Deoxidnucleotide Mix 0.25ml
MB-345 Technical Bulletin
The PCR processing covered by patents
7
Resumen de la preparación del gel de agarosa
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agaragar, pero de composición más homogénea), cuyas disoluciones (típicamente
de 0,5 a 2%) poseen la propiedad de permanecer líquidas por encima de
aprox. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. Este gel está constituido
por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas, embebida en gran
cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas de ácido
nucleico a su través, en mayor medida cuanto más grande sea esta
Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde adecuado, se dejan en él
unos huecos o pocillos para poder introducir luego en ellos la muestra, y que
así ésta se vea obligado a introducirse en el seno del gel cuando apliquemos el
campo eléctrico.
Se preparó el gel al 1.5% en 50ml de TBE al 0.5%
Procedimiento En un matraz se depositó 50ml de TBE al 0.5% y 75gr de polvo
de agarosa y se calentó hasta que la solución quedara transparente sin
partículas de agarosa, después de esto se agregaron 5ml de bromuro de etidio
y se procedió a decantar en la cámara electroforética hasta que enfrié.
El bromuro de etidio es un sólido rojo, un potente mutagénico de efecto
acumulativo, es nocivo por ingestión, tóxico por inhalación e irritante para los
ojos, la piel y las vías respiratorias; debe ser manipulado única y
exclusivamente por personal capacitado
El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante usado comúnmente como
marcador de ácidos nucleicos en laboratorios de biología molecular para
procesos como la electroforesis en gel de agarosa. Compuestos fluorescentes
son formados por intercalación y estos compuestos se pueden ver por
irradiación con luz ultravioleta.
8
TÉCNICA DE EXTRACCIÓN DE DNA DE LEUCOCITOS
1. Extraer 3 ml de sangre periférica y colocarlos en tubo de 13 x 100 con EDTA
al 10%. Posteriormente se transfiere la sangre a tubos de Falcon de 10 ml y se
adicionan 3 ml de TTS (tris-tritón-sacarosa)
2. Se centrífuga a 3000 r.p.m. durante 10 min.
3. Se decanta el sobrenadante a un vaso con color (desechar). Este es un
punto muy importante puesto que en el fondo queda un botón espeso que no
se debe perder al decantar.
4. Agregar al botón 1ml de TTS y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1.5 ml,
homogeneizar fuerte (con la mano o con un vortex con disco agitador para
tubos Eppendorf) hasta disolver el botón y centrifugar a 12 000 r. p. m. Durante
dos minutos a 4°C.
5. decantar el sobrenadante y agregar 1 ml más de TTS y otra vez disolver el
botón y centrifugar otros dos minutos a 4°C . (este paso se tiene que repetir
hasta que se obtenga un botón blanco y también el sobrenadante).
6. Una vez que se haya decantado el sobrenadante blanco y da un botón
blanquecino se agregan 570 ðl de NaCl 5mM y homogeneizar dos minutos
(aquí no se decanta) + 30 ðl de SDS al 10% y homogeneizar diez minutos +
200 ðl de NaCl saturado y homogeneizar 15 minutos.
7. una vez que se haya realizado esta mezcla se centrífuga a 12, 000 r.p.m
durante 10minutos a 4°C. se vierta el sobrenadante en el etanol absoluto, una
vez que esto se haya hecho mezclar suavemente el tubo que contiene el etanol
absoluto y el sobrenadante de lo que se centrífugo y se va a observar la hebra
blanquecina de DNA (si aquí no se observa ninguna hebra entonces se
perdieron los leucocitos en el primer paso).
8. Después se almacena el tubo que contiene el etanol + el ácido
desoxirribonucleico (ADN)
9. Al día siguiente con una pipeta de 1000 ðl se elimina el etanol en el que
estuvo el ácido desoxirribonucleico (ADN)agregan otros dos ml de etanol al
70%
10. Después se centrífuga a 9000 r.pm durante 10 minutos a 4 °C.
11. Eliminar el sobrenadante y el tubo Eppendorf con el botón blanco que
queda se coloca en un desecador a vacío durante 15 minutos a temperatura
ambiente.
12. Finalmente ya que esté perfectamente deshidratado al ácido
desoxirribonucleico (ADN)se agregan de 300 a 400 ðl de agua bidestilada
desionizada estéri
9
Muestras
8 Muestras sanguíneas.
1 Muestra cervicovaginal.
RESULTADOS
TERMOCICLADOR
Ajuste de parámetros
biomate 3 V2.100
DNA(260/280)..................10:41am 29 abril11
Nombre de análisis...........DNA (260/280) [Default]
Long de onda 1 ...............260nm
Long de onda 2..................280nm
Correcc de L.O de Ref......apagado
Factor ADN (260nm)......62.90
Factor ADN (280nm).....36.00
Mostrar proteínas: encendido
Factor de proteínas (260nm) 1552
Factor de proteínas (280nm) 752.3
Multiplicador de dilución (calculad 1.000)
vol. de muestra: 1microlitro
Volumen de dilución: 0 micro litros
Unidades microgramos/ ml
Se muestra el corrimiento en bandas en electroforesis. Este es el marcador.
10
Paciente #1
Abs a 260 nm: 1.298
Relación ADN
1.096
Abs 280nm: 1.184
DNA µg/ml
39.02
Proteína µg/ml
854.6
Resultado negativo en el caso 1. Muestra sanguinea.
Paciente #2
Abs a 260nm: 0.031
Relación ADN
1.033
Abs 280nm: 0.030
DNA µg/ml
0.870
Proteína µg/ml
23.08
Resultado negativo en el caso 2. Muestra sanguinea.
Paciente #3
Abs a 260nm: 0.021
Relación ADN
1.000
Abs a 280nm:0.021
DNA µg/ml
0.565
Proteína µg/ml
16.69
Resultado negativo en el caso 3. Muestra sanguinea.
11
Paciente #4
Abs a 260nm: 0.042
Relación ADN
1.313
Abs a 280nm: 0.032
DNA µg/ml
1.490
Proteína µg/ml
17.86
Resultado negativo en el caso 4. Muestra sanguinea.
Paciente #5
Abs a 260nm:0.097
Relación ADN
1.155
Abs a 280nm: 0.084
DNA µg/ml
3.077
Proteína µg/ml
56.91
Resultado negativo en el caso 5. Muestra sanguinea.
Paciente #6
Abs a 260nm: 0.064
Relación ADN
1.164
Abs a 280nm: 0.055
DNA µg/ml
2.046
Proteína µg/ml
36.89
Resultado negativo en el caso 6. Muestra sanguinea.
12
Paciente #7
Abs a 260 nm: 0.091
Relación ADN
1.071
Abs a 280nm: 0.085
DNA µg/ml
2.664
Proteína µg/ml
63.01
Resultado negativo en el caso 7. Muestra sanguinea.
Paciente #8
Abs a 260 nm: 0.048 Abs a 280nm: 0.047
Relación ADN
1.021
DNA µg/ml
1.327
Proteína µg/ml
36.59
Resultado negativo en el caso 8. Muestra cervicovaginal.
Paciente #9
Abs a 260 nm: 0.098 Abs a 280nm: 0.088
Relación ADN
1.114
DNA µg/ml
2.996
Proteína µg/ml
62.36
Resultado negativo en el caso 9. Muestra cervicovaginal.
13
ANEXOS
Extracción de sangre mediante vacutainer
a 8 pacientes del sexo masculino.
Los pacientes son pertenecientes a la
facultad de Bioanálisis, reservándonos en
nombre por cuestiones de
confidencialidad.
Muestras cervicovaginales, obtenidas
mediante un citobrush, transportadas y
refrigeradas. Una paciente es de la facultad de
Bioanálisis y otra pacientes es perteneciente
a la facultad de enfermería, reservándonos en
nombre por cuestiones de confidencialidad.
Las muestras fueron lavadas en repetidas
ocasiones, como resultado de ese proceso
nos dio un botón limpio.
Centrifuga utilizada para realizar dichos
lavados.
14
Se muestra la extracción de micro litros de
muestra las cuales deben ser añadidas con
cierto cuidado y exactitud.
En esta imagen observamos la muestra, la
cual está lista para ser filtrada.
Se muestra la gradilla con las
muestras sanguíneas, listas para
la electroforesis.
Se muestra el agar con muestras de los
pacientes
15
Equipo en el cual se realiza la
electroforesis.
Tubos en los cuales se agregara la muestra
cervicovaginal
Se muestra cómo se va añadiendo las
muestras tanto de sangre como
cervicovaginales.
Se muestra el corrimiento de las
muestras, a los 45 min. De su inicio.
16
En la imagen se muestra el
resultado final de la muestras
tanto sanguíneas como
cervicovaginales. Se muestra del
lado izquierdo el control.
17
DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
Los resultados obtenidos de nuestra investigación, fueron negativos, fueron
realizados dentro de una población de alumnos de ciencias de la salud, al no
encontrar ningún resultado positivo podríamos pensar en que estudiantes esta
libre del Virus del Papiloma Humano, pero la población en que realizamos esta
investigación fue muy pequeña a proporción del total de alumnos de ciencias
de la salud, así que este resultado nos podría dar un falso negativo.
La concientización de los alumnos de ciencias de la salud es algo primordial ya
que estos son los que promotores de salud y habría gran incongruencia en
alumnos infectado por este virus.
CONCLUSIÓN
La PCR es una nueva herramienta de investigación y diagnóstico de laboratorio
muy potente que abre todo un nuevo mundo de posibilidades. Su aplicación ha
de ser limitada a aquellos casos o estudios que lo permitan y en ningún
momento su aplicación ha de desmerecer y suplir la técnica oficial de detección
y enumeración del VPH.
La detección oportuna de este virus es de importancia en lo que respecta a
salud pública, tanto para el tratamiento de la población que esta contagiada y la
eliminación y propagación como para las diferentes formas de prevención
Además la divulgación de esta enfermedad de transmisión sexual y hacer llegar
el conocimiento de la detección de este virus por medio de diagnóstico
molecular y las ventajas que este tiene a comparación sobre los laboratoriales
comunes.
18