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UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VIROLOGÍA TEORICO Nº 3 Temario: Taxonomía viral. Clasificación y nomenclatura de los virus. Breve descripción de los virus con genoma a DNA: Familias Parvoviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae y Papovaviridae. Virus con genoma a RNA: Familias Reoviridae, Picornaviridae, Togaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rabdoviridae y Retroviridae. Características más importantes de cada familia, género y especies. Estrategias de multiplicación. Taxonomía viral Existe evidencia suficiente para asegurar que todos los organismos vivos pueden ser infectados por uno o más virus. El número de virus patógenos o silentes que pueden afectar a los animales, plantas, invertebrados, protozoarios, hongos y bacterias es muy elevado: han sido reconocidos más de 4.000 virus diferentes y 30.000 subtipos o cepas de virus diferentes. Las cepas o los subtipos virales particulares tienen un impacto diferente desde el aspecto de la salud o el económico. Cientos de virus diferentes son reconocidos por infectar a los humanos y algunos pocos han sido recuperados de animales individuales (animales de producción, de compañía, caballos, animales de laboratorios, animales salvajes, aves, reptiles, anfibios y peces). Debido a que todos los virus (cualquiera sea su hospedador) comparten algunas propiedades, los virólogos han desarrollado un sistema simple de clasificación y nomenclatura que abarca a todos los virus. Este sistema ha sido propuesto por el Comité Internacional de Taxonomía de los Virus (sigla en inglés: ICTV). Los más recientes esfuerzos por clasificar a los virus se basan en las características comunes de las propiedades ecológicas, de transmisión, patogénicas y clínicas de los virus. Por ejemplo: los virus que causan hepatitis: virus de la hepatitis canina (adenovirus), virus de la fiebre del valle de Rift (bunyavirus) y el virus de la hepatitis B (hepadnavirus) se clasifican dentro de los “virus de la hepatitis”. Los sistemas taxonómicos subsecuentes han clasificado a los virus de acuerdo a: Tamaño: determinado por ultrafiltración y microscopía electrónica. Morfología del virión: determinada por microscopía electrónica. Estabilidad del virión: determinada por las variaciones con respecto a su resistencia al pH, temperatura, exposición a solventes lipídicos, detergentes, etc. Antigenicidad del virión: determinada por diversos métodos serológicos. Esta clasificación ha sido muy laboriosa debido a la gran cantidad de virus estudiados y a las características virales utilizadas para la construcción de este completo sistema taxonómico. En la mayoría de los casos es necesario medir sólo unas pocas características con el fin de clasificar un virus “desconocido” en su taxón correspondiente. Por ejemplo: un virus aislado del tracto respiratorio de un paciente canino, identificado por microscopía electrónica de contraste negativo como “adenovirus”, es enviado inmediatamente para identificación serológica. Con esta prueba se lo identifica como perteneciente al género Mastadenovirus de la familia Adenoviridae. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Además se lo puede clasificar serológicamente como adenovirus canino tipo 1, 2 o inclusive como un nuevo tipo de adenovirus canino. Actualmente el criterio principal para delinear la principal taxa viral a la que pertenece un virus es según: 1) El tipo y características del genoma viral; 2) La estrategia de replicación viral que utiliza el virus; 3) La estructura del virión. La secuenciación completa o parcial del genoma viral es una herramienta poderosa para generar información taxonómica y, actualmente, se utiliza como uno de los primeros pasos en los protocolos utilizados en el proceso de identificación viral. Las secuencias del genoma de referencia para todas las taxas virales se encuentran disponibles en las bases de datos de acceso público como GenBank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ). El sistema universal de taxonomía viral consiste en agrupar a los virus en los niveles de: orden, familia, subfamilia, género y especie. El nombre del orden viral termina con el sufijo –virales, la familia con el sufijo –viridae, la subfamilia con el sufijo –virinae y el género con el sufijo –virus. Los niveles de clasificación taxonómica inferiores, como subespecies, cepas y variantes se han propuesto con fines prácticos para el diagnóstico o el desarrollo de vacunas, pero no es una forma de clasificación formalmente aceptada y no existe una definición o nomenclatura universal para estos niveles inferiores de clasificación. Actualmente, el sistema universal de taxonomía se compone de: 2 órdenes, los que contienen los virus patógenos para animales y humanos. 54 familias, dentro de ellas sólo 26 familias contienen los virus patógenos para animales y humanos. 184 géneros. El orden viral es utilizado comúnmente para agrupar a las familias de virus que exhiben relaciones filogenéticas distantes, es decir, comparten dominios, secuencias o genes ancestrales. Debido a que no todos derivan de un ancestro en común, no es posible agrupar a todas las familias dentro de un orden y generar un solo árbol evolutivo. El sistema taxonómico universal es completo al nivel de familia y género, es decir, todos los virus a estudiar desde el punto de vista del interés veterinario han sido asignados a una familia y género. La clasificación en subfamilias es utilizada sólo cuando se considera necesario esclarecer interrelaciones muy complejas entre los virus que integran una familia. La especie es el taxón más importante en todos los sistemas de clasificación de las formas vivientes, pero también es el más difícil de definir y aplicar. La mayoría de los virus de interés veterinario se han clasificado dentro de una especie, pero en pocos casos se ha logrado avanzar en la clasificación al nivel de subespecie o cepa. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Familia de virus Para comprenden el criterio de agrupación en familias de virus, los mismos han sido agrupados de acuerdo a: 1) el tipo de ácido nucleico (ADN o ARN) y las características de la cadena (cadena simple o doble); 2) características del genoma (genoma segmentado, genoma de sentido positivo, negativo o ambisentido) y 3) la estrategia de replicación y transcripción. FAMILIA DE VIRUS ADN POXVIRIDAE Subfamilia: Chordopoxvirinae Género: Orthopoxvirus Especie: virus de la viruela (virus que produce la viruela bovina, de los conejos, camellos, monos y ratones). Especie: vaccinia virus (virus relacionado a la viruela humana, utilizado para la realización de vacunas en las diferentes especies animales). Género: Parapoxvirus Especie: Orf virus (virus que en ovejas y cabras produce la enfermedad ectima contagioso) Especie: virus de la pseudoviruela bovina. Especie: virus de la dermatitis contagiosa pustular. Especie: virus de la estomatitis papulosa bovina. Género: Capripoxvirus Especie: poxvirus caprino y ovino (virus que afecta produce la viruela ovina y caprina). Especie: poxvirus bovino (virus que produce la enfermedad dermatosis nodular “lumpyskin” en el ganado bovino) Género: Leporipoxvirus Especie: mixoma virus (virus que en conejos produce la enfermedad mixomatosis) Género: Suipoxvirus Especie: poxvirus porcino (virus que afecta produce la viruela porcina). Género: Avipoxvirus Especie: poxvirus aviares (virus que afectan específicamente a las aves) UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Características Los viriones de los poxvirus (pox, poc o pocc significa pústula) tienen forma rectangular, similar a un ladrillo (Figura 1) y tienen una estructura muy compleja, midiendo 250 x 200 x 200 nm (salvo los parapoxvirus que son viriones ovoides más pequeños). A B Figura 1. A. Estructura externa (cobertura lipoproteica) de los viriones de los poxvirus. B. Estructura interna (corte sagital) de los viriones de los poxvirus. El genoma consiste en una molécula lineal de ADN doble cadena, con los extremos covalentemente cerrados y con un tamaño de 170 a 250 kpb. La formación del virión involucra la incorporación del ADN dentro de partículas proteicas inmaduras con forma de medialuna, las cuales pasan a su estadio de maduración cuando se agregan alrededor capas externas de proteínas (líneas verdes en la Figura 2). Este evento ocurre dentro del núcleo de la célula hospedadora. Figura 2. Representación esquemática de las estructuras internas de los poxvirus. La replicación y el ensamblaje viral ocurren en sitios discretos del citoplasma (llamados viroplasmas o fábrica de viriones) y los viriones son liberados mediante gemación de la membrana celular (origen de la envoltura viral) o por lisis de la célula (en este caso, los viriones carecen de envoltura viral). La transmisión de los virus se produce por contacto directo (incluyendo heridas, abrasiones, etc), fómites, aerosoles o pueden ser transportados mecánicamente por artrópodos. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Los virus tienen un amplio rango de hospedadores, salvo excepciones puntuales que incluyen los vaccinia virus y algunos de los poxvirus aviares. HERPESVIRIDAE Subfamilia: Alphaherpesvirinae Género: Simplexvirus Especie: herpesvirus humano simple tipo 1 Especie: herpesvirus bovino tipo 2 (virus de la mamilitis bovina). Género: Varicellovirus Especie: herpesvirus humano tipo 3 (virus de la varicela-zoster) Especie: herpesvirus bovino tipo 1 (virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina- IBR). Especie: herpesvirus equino tipo 1 (virus del aborto equino) Especie: herpesvirus equino tipo 4 (virus de la rinoneumonitis equina) Especie: virus de la Pseudorabia. Género: Sin nombre Especie: virus de la enfermedad de Marek de los pollos. Especie: herpesvirus gallido tipo 1 (virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar). Especie: herpesvirus equino tipo 3 (virus del exantema coital). Especie: virus B de la pseudorrabia. Especie: herpesvirus canino. Especie: herpesvirus felino (virus de la rinotraqueítis infecciosa felina). Subfamilia: Betaherpesvirinae Género: Cytomegalovirus Especie: herpesvirus humano tipo 5 o citomegalovirus humano. Género: Muromegalovirus Especie: citomegalovirus del ratón. Género: Roseolovirus Especie: herpesvirus humano tipo 6. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Subfamilia: Gammaherpesvirinae Género: Lymphocryptovirus Especie: herpesvirus humano tipo 4 (virus Epstein-Barr) Género: Rhadinovirus Especie: herpesvirus equino tipo 2. Especie: herpesvirus equino tipo 5. Características Los viriones de los herpesvirus (herpes: reptar) son envueltos, miden aproximadamente 150 nm de diámetro y contienen una nucleocápside icosaédrica de 100 nm de diámetro (Figura 3). Nucleocápside Genoma Membrana Complejo de Glicoproteínas tipo I y II Figura 3. Estructura de los viriones de los herpesvirus. El genoma está formado por una molécula simple lineal de ADN de doble cadena de un tamaño aproximado de 125 a 235 kpb. Los virus replican en el núcleo de la célula hospedadora y maduran por gemación a través de la membrana nuclear, la cual da origen a la envoltura viral. Una característica común de la infección por herpesvirus es la persistencia que logra el virus dentro del organismo del animal, normalmente de forma latente. La excreción del virus, especialmente a través de secreciones genitales o saliva, puede ocurrir de manera continua o intermitente y con o sin episodios de recurrencia de los signos clínicos. Algunos virus, miembros de la subfamilia Gammaherpesvirinae, causan tumores debido a la activación de oncogenes presentes en la célula hospedadora (por ejemplo: virus Epstein-Barr en humanos, el cual se ha asociado al cáncer nasofaríngeo). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA ADENOVIRIDAE Género: Mastadenovirus Especie: adenovirus humano tipo 1 al 49. Especie: adenovirus equino tipo 1 y 2. Especie: adenovirus canino tipo 1 (virus de la hepatitis infecciosa canina) Especie: adenovirus canino tipo 2 (virus que causa epidemias en perros, lobos, zorros, osos, coyotes, etc. Virus que en perros se asocia al complejo “Tos de las perreras”). Especie: adenovirus bovino tipo 1, 2, 3 y 10. Especie: adenovirus ovino tipo 3. Género: Aviadenovirus Especie: virus de la enteritis hemorrágica de pollos y pavos. Especie: virus de la enfermedad del bazo marmóreo en aves. Género: Atadenovirus Especie: adenovirus ovino tipo 287. Especie: adenovirus bovino tipo 4, 5, 6, 7 y 8. Especie: virus del síndrome de la caída de la puesta en aves. Características Los viriones de los adenovirus (adeno: glándula) no poseen envoltura (virus desnudo). Poseen una nucleocápside hexagonal, con simetría icosaédrica de 80 a 100 nm de diámetro (Figura 4). Figura 4. Estructura de los viriones de los adenovirus. 1) Fibra que sobresale de la nucleocápside, 2) nucleocápside hexagonal de simetría icosaédrica y 3) genoma viral. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA El genoma se compone de una molécula simple lineal de ADN de doble cadena con un tamaño aproximado de 36 a 44 kpb. Los virus replican en el núcleo de la célula hospedadora y su replicación es facilitada por una amplia modulación de la respuesta inmune del animal hospedador. Los virus poseen un amplio rango de hospedadores. La mayoría de los adenovirus causan infecciones persistentes y pueden reactivarse por inmunosupresión de la especie hospedadora. Por ejemplo, los adenovirus equinos causan una enfermedad bastante severa en los caballos inmunocomprometidos. Algunos de los adenovirus que causan enfermedades en los humanos, bovinos y pollos pueden generar tumores cuando se los inoculan en el hámster recién nacido, pero ninguno causa tumores en sus hospedadores naturales. PARVOVIRIDAE Subfamilia: Parvovirinae Género: Parvovirus Especie: virus de la panleucopenia felina. Especie: parvovirus canino tipo 1, 2a y 2b (el parvovirus canino tipo 2b se ha asociado a nuevas epidemias en perros, con cuadros de gastroenteritis hemorrágica muy graves). Especie: virus de la enteritis del visón. Especie: parvovirus bovino. Especie: parvovirus porcino. Especie: parvovirus de los conejos. Especie: parvovirus del ratón. Género: Erythrovirus Especie: parvovirus humano B19 (causa exantema en los niños). Género: Dependovirus Los miembros de este Género son virus defectuosos que requieren de un adenovirus para su replicación; se presentan en perros, aves, bovinos, caballos y humanos, confundiendo en la interpretación de las pruebas diagnósticas ya que no causan enfermedad en sus hospedadores. Características Los viriones de los parvovirus (parvus: pequeño) no poseen envoltura (virus desnudo), son esféricos con simetría icosaédrica y con un diámetro promedio de 25 nm (Figura 5). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Estructura esférica Nucleocápside Simetría icosaédrica Figura 5. Estructura de los viriones de los parvovirus. El genoma se compone de una molécula simple lineal de ADN de cadena sencilla, de tan sólo 5 kpb. Las nucleocápsides de algunos parvovirus se componen de una hebra de ADN de sentido negativo (parvovirus del ratón), mientras que otras nucleocápsides se componen por diferentes porciones de la hebra de ADN (parvovirus bovino). La replicación del ADN de los parvovirus es un fenómeno complejo. Este proceso involucra la formación de “horquillas” en la cadena de ADN, la extensión de la misma hasta formar una molécula intermedia de ADN de doble cadena y la participación de endonucleasas que se encargan de la ruptura de ésta molécula intermedia para dar origen a la cadena sencilla de ADN que se encapsida en el virión. La replicación y el ensamblaje de los viriones se producen en el núcleo de la célula hospedadora. La replicación requiere que las células hospedadoras se encuentren en la fase S del ciclo de división celular (fase de síntesis activa de ADN). Esto explica la facilidad de los parvovirus para replicarse en células con rápida división celular como los enterocitos o las células de la médula ósea presentes en especímenes jóvenes de la especie canina. Alternativamente, algunos parvovirus requieren de la co-infección con otros virus, tales como herpesvirus o adenovirus para lograr su replicación. Estos virus poseen un amplio rango de animales hospedadores y sobreviven durante mucho tiempo en el ambiente debido a la naturaleza estable de los viriones. PAPOVAVIRIDAE Género: Polyomavirus Especie: virus del polioma del ratón. Especie: virus SV40. Ambos virus se utilizan como modelos para el estudio de la oncogenésis viral, debido a su capacidad de persistir integrado dentro del ADN de la célula hospedadora. Género: Papillomavirus (virus productores de verrugas) Especie: papilomavirus humanos de cuello uterino, ano y farínge). Especie: papilomavirus bovino. (Existen más de 70 tipos de virus y algunos están asociados al cáncer UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Especie: papilomavirus del conejo. Especie: virus de la papilomatosis oral canina. Características Los viriones de los papovavirus (siglas pa: papiloma, po: polioma, va: vacuola) no poseen envoltura (virus desnudo), son esféricos y con simetría icosaédrica. Los viriones poseen un diámetro promedio de 45 nm (Polyomavirus) a 55 nm (Papillomavirus) (Figura 6). PROTEÍNAS DE LA CÁPSIDE ADN VIRAL circular Figura 6. Estructura de los viriones de los papovavirus. El genoma se compone de una molécula simple de ADN de doble cadena circular, de tan sólo 5 kpb (Polyomavirus) a 8 kpb (Papillomavirus). El ADN genómico es infeccioso. La infección es frecuentemente persistente y el genoma viral puede transportarse de una manera episomal o integrado en el ADN de la célula hospedadora. FAMILIA DE VIRUS ARN RETROVIRIDAE Género: Alpharetrovirus* Especie: virus del sarcoma de Rous. Especie: virus del carcinoma aviar. Especie: virus del sarcoma aviar Especie: virus de la leucosis aviar. Especie: virus de la mieloblastosis aviar Especie: virus de la necrosis esplénica del pato. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Género: Betaretrovirus* Especie: virus del tumor mamario del ratón. Especie: virus de la adenomatosis pulmonar ovina (virus Jaagsiekte) * Estos géneros virales solían agruparse dentro de la subfamilia Oncovirinae (onco: tumor) que incluyen virus generadores de tumores (oncogénicos). Género: Gammaretrovirus Especie: virus de la leucemia felina (ViLeF). Especie: virus del sarcoma felino. Especie: virus porcino tipo C. Especie: virus de la reticuloendoteliosis aviar. Género: Deltaretrovirus Especie: virus de la leucemia bovina. Especie: virus linfotrófico-T humano tipo 1 y 2. Género: Epsilonretrovirus Los miembros de este Género son virus que afectan a peces. Género: Lentivirus** Especie: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH o SIDA) tipo 1 y 2. Especie: virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). Especie: virus de la inmunodeficiencia bovina. Especie: virus de la anemia infecciosa equina (AIE). Especie: virus Maedi-Visna del ovino. Especie: virus de la encefalitis-artritis caprina. * Este género viral solían agruparse dentro de la subfamilia Lentivirinae (lenti: lento) que incluyen virus responsables de diversas enfermedades de curso lento, pero en ocasiones mortales. Género: Spumavirus Los miembros de este género son virus espumosos que representan un problema cuando contaminan los cultivos celulares pero entre ellos no se conoce ninguno que sea patógeno. Características Los viriones de los retrovirus (retro: reversa) poseen envoltura, tienen un diámetro de 80 a 100 nm y una cápside de simetría icosaédrica de 60 nm de diámetro (Figura 7). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Envoltura lipídica Receptores de unión a proteínas ARN lineal de sentido + Proteínas de la Cápside Figura 7. Estructura de los viriones de los retrovirus. El genoma viral es diploide, formado por dos moléculas de ARN de cadena sencilla, lineal, de sentido positivo, organizado como un dímero invertido. Cada monómero tiene un tamaño de 7 a 11 kpb. La replicación de los retrovirus es un fenómeno único. El ciclo de replicación comprende varias etapas comunes a todos los retrovirus. En una fase inicial, el virus se une a receptores específicos (CD4) de la célula T, gracias a sus glicoproteínas de superficie. Las membranas de la envoltura viral y la celular se fusionan y la cápside viral entra en la célula (Figura 8). Las enzimas víricas asociadas al ARN genómico forman el complejo nucleoproteico integrado por la enzima transcriptasa inversa (TI), proteasa (PR) e integrasa (IN), muy importantes para la replicación del virus. La síntesis de ADN vírico se produce en el citoplasma a través de la TI. La actividad de la TI genera una copia de ADN (ADNc) a partir de la hebra de ARN genómico. Casi simultáneamente emplea este ADNc como molde para sintetizar una segunda hebra de ADN, convirtiendo el ARN genómico en ADN de doble cadena (ADNdc). La enzima IN realiza cortes en los extremos de la mólecula de ADNdc y luego, conduce al ADNdc al núcleo celular. Una vez en el núcleo la enzima IN integra el ADNdc al ADN genómico de la célula hospedadora, para luego ser utilizado para la transcripción. Esta transcripción genera un ARN genómico de tamaño completo y varios ARNm (Figura 8). Estos ARNm se traducen a proteínas específicas que son procesadas por la enzima (PR) para generar las proteínas de la cápside viral. El ensamblaje de los viriones se produce en el citoplasma de la célula T, conteniendo una copia del ARN genómico replicado y las enzimas del complejo nucleoproteico. La nucleocápside formada sale de la célula T mediante gemación de la membrana plasmática, obteniendo de esta manera la envoltura viral. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Envoltura lipídica Dos moléculas ARN lineal Cápside Receptor en la membrana celular Célula Hospedadora Transcriptasa inversa ADN transcripto ARN genómico ARN mensajeros Figura 8. Replicación de los viriones de los retrovirus en una célula hospedadora. REOVIRIDAE Género: Orthoreovirus Especie: reovirus humanos tipo 1, 2 y 3. Especie: reovirus aviares. Género: Orbivirus Especie: virus de la lengua azul del ovino (tipo 1 a 25). Especie: virus de la peste equina africana (tipo 1 a 9). Especie: virus de la encefalosis equina (tipo 1 y 2). Género: Rotavirus Especie: rotavirus del grupo A. (Incluyen virus que generan procesos diarreicos en humanos y animales). Especie: rotavirus del grupo B. (Incluyen virus de importancia patógena para humanos). Especie: rotavirus del grupo C y E. (Incluyen virus de importancia patógena para los porcinos). Especie: rotavirus del grupo D y F. (Incluyen virus de importancia patógena para los aves). Género: Aquareovirus Los miembros de este Género son virus que afectan a peces. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Características Los viriones de los reovirus (siglas r: respiratorio, e: entérico, o: orphan: huérfano) no poseen envoltura (desnudos), tienen una apariencia esférica y un diámetro de 60 a 80 nm. Los viriones tienen dos o tres cápsides proteicas que los recubren, cada una de simetría icosaédrica (Figura 9). El tipo de cobertura que poseen diferencia a los virus integrantes de cada género. Orbivirus Orthoreovirus Rotavirus Figura 9. Estructura de los viriones de los reovirus. La cantidad y disposición de las capas proteicas que conforman la cápside viral diferencia a los diferentes géneros que componen la familia Reoviridae. El genoma se compone de ARN lineal de doble cadena dividido en 10 a 12 segmentos. El tamaño completo del genoma varía entre 16 a 27 kpb. La replicación y el ensamblaje de los viriones suceden en el citoplasma de las células hospedadoras. Este proceso se ha relacionado con la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos del tipo granular o fibrilar. Los rotavirus y reovirus son transmitidos por contacto directo (transmisión fecal-oral) e indirectamente a través de fómites, mientras que los orbivirus son transmitidos por artrópodos (garrapatas, mosquitos, etc.). ORDEN MONONEGAVIRALES PARAMYXOVIRIDAE Subfamilia: Paramyxovirinae Género: Respirovirus Especie: virus de la parainfluenza humana tipo 1 y 3. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Especie: virus de la parainfluenza bovina tipo 3. Especie: virus de la parainfluenza del ratón (virus Sendai). Género: Rubulavirus Especie: virus de la parainfluenza humana tipo 2, 4a y 4b. Especie: paramyxovirus aviar tipo 1 (Enfermedad de Newcastle). Especie: paramyxovirus aviar tipo 2 (virus Yucaipa). Especie: paramyxovirus aviar tipo 3, 4 y 5 (virus Kunitachi). Especie: paramyxovirus porcino tipo 6, 7, 8 y 9 (virus La Piedad-Michoacan- México). Género: Morbillivirus Especie: virus del sarampión humano. Especie: virus distemper canino (Moquillo canino). Especie: virus rinderpest bovino (Peste bovina). Especie: virus de la peste de los pequeños rumiantes. Subfamilia: Pneumovirinae Género: Pneumovirus Especie: virus sincitial respiratorio humano. Especie: virus sincitial respiratorio bovino. Especie: virus de la neumonía del ratón. Género: Metapneumovirus Especie: virus de la rinotraqueítis del pavo. Características Los viriones de los paramyxovirus (para: similar a los orthomyxovirus, myxo: moco) son pleomórficos (su forma varía entre esférica a filamentosa) de 150 a 300 nm de diámetro. Los viriones son envueltos, cubiertos de largos peplómeros y con una nucleocápside de simetría helicoidal similar a las espinas de un pez (Figura 10). La envoltura viral contiene dos glicoproteínas: hemaglutinina (en la mayoría de las especies también posee actividad neuraminidasa) y una proteína de fusión (Figura 10). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Peplómeros (Hemaglutinina) Proteínas de fusión (ligando) Proteínas asociadas al material genético viral ARN lineal de sentido (-) Proteínas de la Cápside Envoltura lipídica Figura 10. Estructura de los viriones de los paramyxovirus. El genoma consiste de una cadena simple, lineal de ARN de sentido negativo, de 15-16 kpb. La replicación viral sucede en el citoplasma de la célula y el ensamblaje se produce por gemación del virión a través de la membrana celular. La transmisión del virus se produce principalmente por aerosoles y gotas de las secreciones eliminadas por los animales. Sólo los Morbillivirus pueden generar infecciones persistentes, algunos de ellos con consecuencias clínicas al largo plazo (moquillo canino). ORDEN MONONEGAVIRALES RHABDOVIRIDAE Género: Vesiculovirus Especie: virus de la estomatitis vesicular de New Jersey. Especie: virus de la estomatitis vesicular de Indiana (VSV-tipo 1). Especie: virus Cocal (VSV-tipo 2). Especie: virus Alagoas (VSV-tipo 3). Especie: virus Maraba (VSV-tipo 4). Especie: virus Chandipura. Especie: virus Piry. Especie: virus Isfahan. Género: Lyssavirus Especie: virus de la rabia. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Especie: virus Mokola. Especie: virus Duvenhage. Especie: virus Lagos de los murciélagos. Especie: virus europeo de los murciélagos tipo 1 y 2. Especie: lyssavirus de los murciélagos australianos. Género: Ephemerovirus Especie: virus de la fiebre efímera bovina. Especie: virus River Adelaide. Especie: virus Berrimah. Características Los viriones de los rhabdovirus (rhabdos: bacilo) tienen forma de bala, de un tamaño aproximado de 180 x 75 nm. Poseen una envoltura cubierta de grandes peplómeros. La nucleocápside subyacente a ésta envoltura tiene forma cilíndrica y posee simetría del tipo helicoidal (Figura 11). Envoltura lipídica Proteínas de la Matriz Peplómeros de la envoltura. B ARN lineal de sentido (-) Envoltura lipídica A Ribonucleoproteínas Proteínas de la Matriz Figura 11. A Corte longitudinal del virión de un rhabdovirus. B. Corte transversal del virión de un rhabdovirus. El genoma consiste de ARN lineal de cadena sencilla, de sentido negativo con un tamaño aproximado de 13-16 kpb. La replicación viral sucede en el citoplasma de la célula hospedadora y el ensamblaje de los viriones ocurre por gemación de la membrana plasmática (como es el caso de los vesiculovirus) o de las membranas de organelas intracitoplasmáticas (como es el caso de los lyssavirus). El virus de la rabia produce cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos muy prominentes (corpúsculos de Negri) en las células infectadas. Los virus tienen un amplio rango de hospedadores, en la mayoría el virus replica y son transmitidos por artrópodos. El virus de la rabia es transmitido principalmente por mordedura del animal o humano rabioso. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA ORTHOMYXOVIRIDAE Género: Influenzavirus A. Incluye virus patógenos para el hombre, aves, caballos, cerdos, visón, focas y ballenas. Género: Influenzavirus B. Incluye virus sólo patógenos para el hombre, aves. Género: Influenzavirus C. Incluye virus que infectan al hombre y al cerdo, pero raramente ocasionan cuadros serios de enfermedad. Características Los viriones de los orthomyxovirus (ortho: directo; myxo: moco: aislado directamente desde el moco) son pleomórficos (esféricos o filamentosos) de 80 a 120 nm de diámetro. Los viriones poseen una envoltura cubierta de peplómeros con actividad hemaglutinina (H) o neuraminidasa (N). De éstas proteínas de la envoltura deriva la denominación de las diversas cepas de estos virus: por ejemplo H1N1. Poseen una nucleocápside de simetría helicoidal (Figura 12). Peplómeros (Hemaglutinina - H) Peplómeros (Neuraminidasa – N) Nucleocápside Helicoidal con proteínas asociadas al ARN lineal de sentido (-), segmentado. Envoltura lipídica Polimerasas Proteínas de la Matriz (M) Figura 12. Estructura de los viriones de los orthomyxovirus. El genoma está formado por 7 (influenzavirus C) u 8 (influenzavirus A y B) moléculas de ARN lineal, de cadena sencilla, con sentido negativo y de un tamaño total de 10 a 13,6 kpb. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA La replicación viral sucede tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula hospedadora. El ensamblaje de los viriones sucede por gemación desde la membrana citoplasmática. Los virus Influenza tipo A que infectan a humanos y otras especies de mamíferos y aves pueden transmitirse entre las diferentes especies. Esto trae aparejado la posibilidad de mutaciones y recombinación genética del virus en los diferentes hospedadores, lo que ha generado la emergencia de nuevas cepas que producen grandes pandemias en la población humana. La transmisión es muy efectiva a través de gotitas de las secreciones y aerosoles. PICORNAVIRIDAE Género: Enterovirus Especie: poliovirus (tipo 1, 2 y 3) o virus de la poliomelitis. Especie: coxsackievirus A1 a A22 y A24. Especie: coxsackievirus B1 a B6. Especie: echovirus humano. Especie: enterovirus humano. Especie: enterovirus porcino (tipo 1a 8). Especie: enterovirus bovino (tipo 1a 7). Especie: virus de la enfermedad vesicular porcina. Género: Rhinovirus Especie: rinovirus humanos. Especie: rinovirus bovino. Género: Hepatovirus Especie: virus de la hepatitis A humana. Género: Cardiovirus Especie: virus de la encefalomiocarditis. Género: Aphtovirus Especie: virus de la fiebre aftosa (O, A, C, SAT 1 a 3, Asia 1). Especie: rinovirus equino. Características Los viriones de los picornavirus (pico: micro; rna: sigla en inglés para el material genético ARN) no poseen envoltura, tienen 27 nm de diámetro y poseen nucleocápsides con simetría UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA icosaédrica. La estructura atómica de los virus representantes de todos los géneros ha sido develada: los viriones están conformados por 60 copias de 4 proteínas que componen el cápsomero de la cápside y por una sola copia de una proteína asociada al genoma (Figura 13). PICORNAVIRUS Polipéptidos que conforman cada uno de los 60 capsómero de la cápside viral. Cada capsómero está formada por 4 proteínas virales (VP1. VP2, VP3 y VP4) CÁPSIDE Proteína asociada al genoma Cadena simple de ARN lineal de sentido (+) Figura 13. Estructura de los viriones de los picornavirus. El genoma está formado por una molécula lineal de ARN de cadena sencilla de sentido positivo, con un tamaño de 7 a 8 kpb. La replicación y ensamblaje de los viriones sucede en el citoplasma de la célula hospedadora. El virus es liberado por lisis de la célula, la infección es generalmente aguda y citolítica, pero pueden ocurrir infecciones persistentes con alguno de los virus de esta familia. La transmisión es horizontal, principalmente a través de contacto directo, ciclo fecal-oral o mediante su volatilización en el aire. TOGAVIRIDAE Género: Rubivirus Especie: virus de la rubeola (virus que produce la rubeola humana). Género: Alphavirus (virus transmitidos por artrópodos). Especie: virus de la encefalitis equina del oeste (EEO). Especie: virus de la encefalitis equina del este (EEE). Especie: virus de la encefalitis equina venezolana (EEV). Especie: virus Sindbis. Características UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Los viriones de los togavirus (toga: capa) son envueltos, de forma esférica, con un tamaño promedio de 70 nm de diámetro y una nucleocápside de simetría icosaédrica (50 nm de diámetro). Los viriones poseen peplómeros muy poco discernibles (Figura 14). TOGAVIRUS Glicoproteínas Nucleocápside icosaédrica ARN lineal de sentido (+). Envoltura lipídica Figura 14. Estructura de los viriones de los togavirus. El genoma se compone de una cadena sencilla de ARN lineal de sentido positivo, con un tamaño de 9 a 12 kpb. La replicación viral es intracitoplasmática e involucra la síntesis de un ARNm sub-genómico a partir del cual se sintetizan las proteínas estructurales. El ensamblaje de los viriones sucede por gemación desde la membrana citoplasmática de la célula hospedadora. Los alphavirus son transmitidos entre los vertebrados por mosquitos y ciertos artrópodos hematófagos. La infección celular en los vertebrados es aguda y citolítica, pero la infección en las células de los mosquitos es persistente y no citolítica. Antiguamente, el género Pestivirus se agrupaba dentro de la familia Togaviridae. Recientemente se lo reclasificó en la familia Flaviviridae, junto a otros géneros virales importantes desde el punto de vista veterinario. FLAVIVIRIDAE Género: Flavivirus Especie: virus de la fiebre amarilla (virus que produce enfermedad en humanos). Especie: virus del Dengue (virus que produce enfermedad en humanos). Especie: virus del oeste del Nilo. Especie: virus de la encefalitis de Saint Louis. Especie: virus de la encefalitis japonesa. Especie: virus de la encefalitis del Valle de Murray. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Género: Pestivirus Especie: virus de la diarrea viral bovina (DVB). Especie: virus del cólera porcino. Especie: virus de la enfermedad de la frontera de los ovinos. Género: Hepacivirus Especie: virus de la hepatitis C. Especie: virus de la hepatitis G. Características Los viriones de los flavivirus (flavus: amarillo) son envueltos, de perfil esférico y de 45 a 60 nm de diámetro. Los viriones poseen peplómeros delgados que no se distribuyen simétricamente. La cápside viral es esférica y tiene simetría icosaédrica, pero su estructura es desconocida (Figura 15). Glicoproteínas Glicoproteínas Nucleocápside icosaédrica ARN lineal de sentido (+) Envoltura viral Figura 15. Estructura de los viriones de los flavivirus. El genoma está constituído por una molecula lineal de ARN de cadena sencilla y de sentido positivo, de 9 a 12,5 kpb. La replicación sucede en el citoplasma y el ensamblaje involucra las envolturas de las membranas internas de la célula hospedadora. No se ha demostrado un verdadero proceso de gemación para estos virus. La infección de las células de los vertebrados es citolítica, pero no citolítica y persistente en las células de los artrópodos. Los flavivirus son transmitidos entre los vertebrados por mosquitos y garrapatas; algunos virus tienen un rango limitado de hospedadores vertebrados mientras que otros tienen una amplia distribución mundial. La infección con pestivirus afecta a ciertos animales y son transmitidos por contacto directo e indirecto (por ejemplo: alimento UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA contaminado con heces, orina o secreciones nasales). Todos los pestivirus son transmitidos transplacentaria y congénitamente. El virus de la hepatits C humana es transmitido por contacto estrecho, contacto sexual y por transfusiones de sangre. BIBLIOGRAFÍA: Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. (1999). Veterinary Virology. Third Edition, Elsevier Ed., U.S.A. Traducción realizada por el Dr. Cs. Vet. Diego Grilli (Julio 2013). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VIROLOGÍA TEORICO Nº 4 Temario: Mecanismo de acción de los agentes esterilizantes. Efecto de agentes físico-químicos sobre el virión. Detección e identificación de los virus. Empleo de distintos huéspedes para aislar y caracterizar virus. Ensayo de virus: a) físico-químico b) infectividad. Cultivos celulares: cultivo celular primario, cepas diploides y líneas celulares continuas. Infección de los cultivos celulares. Efecto citopático. Formación de placas. Inhibición metabólica. Hemoadsorción. Hemoaglutinación. Definiciones importantes adaptadas a virología Desinfección: hace referencia al método de destrucción de los virus de las superficies contaminadas mediante agentes químicos (productos desinfectantes) o físicos (calor, luz UV) con el fin de disminuir al mínimo el número de partículas virales infectantes en el ambiente. Desinfectantes: productos químicos (hipoclorito de sodio, formaldehído, compuestos de amonio cuaternario, etc) o físicos (calor seco, calor húmedo, luz UV) utilizados para destruir virus desde objetos inanimados, no aplicables a tejidos vivos debido a su naturaleza tóxica. Esterilización: método de eliminación completa de todas las partículas virales contenidos en un objeto o área específica, de manera de interrumpir completamente el ciclo de transmisión de un agente viral. La acción esterilizante suele lograrse sólo con temperaturas extremas (100 ºC en adelante), por lo que su uso se reserva para aquellos materiales termoresistentes. Antisepsia: método de eliminación parcial o completa de virus, aplicado exclusivamente a tejidos vivos (piel, principalmente) para reducir la posibilidad de transmisión del agente viral. Los antisépticos más comunes son: alcohol, iodo, clorhexidina, etc. Su acción sobre los agentes virales se debe a su acción sobre las proteínas o lípidos de la estructura viral. Decontaminación: método de eliminación de partículas virales sobre objetos inanimados, previo al lavado con desinfectantes. Control de las enfermedades virales a través de la higiene y saneamiento La cría del ganado en condiciones intensivas conduce a la acumulación local de heces, orina, pelos, plumas, etc.; los cuales pueden estar contaminados con virus. Para los virus “termoestables”, la acumulación de tales contaminantes proveen de una fuente activa de virus para los animales nuevos que se introducen en el sistema productivo. Para evitar esto, los criadores de ganado porcino, bovino y aves (principales producciones que se manejan bajo condiciones intensivas); operan con el sistema de manejo “todo adentro, todo afuera”. Este sistema consiste en vaciar, limpiar y desinfectar las instalaciones donde estaban alojados los animales enfermos, antes de reponer el plantel de animales. Las maniobras de higiene y desinfección son las más efectivas en el control de las infecciones fecales-orales, pero son menos efectivas en la incidencia de las infecciones respiratorias. En general, los intentos por alcanzar la “limpieza del aire” han fallado y las UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA infecciones respiratorias constituyen el grupo más importante de enfermedades que afectan a los animales en los sistemas intensivos. Las infecciones respiratorias virales son mucho más comunes en la actualidad debido al incremento de las poblaciones animales en muchos de los sistemas de producción animal. Por ejemplo, las instalaciones típicas para la cría de pollos operan como un ecosistema simple, compuesto por miles a decenas de miles de aves, cuyo equilibrio sanitario puede afectarse drásticamente al introducir el virus de la influenza aviar por el ingreso de aves silvestres infectadas en dicha instalación. Infecciones nosocomiales Las infecciones nosocomiales son menos comunes en los sistemas de producción animal, debido al tipo de manejo veterinario al que se someten las especies productoras de alimento. Sin embargo, puede ser algo muy común en la práctica veterinaria de los animales de compañía (caninos, felinos, etc.). La modalidad de atender pacientes con un acuerdo previo, mediante un “turno” o cita médica, reduce el riesgo de contagio de las mascotas en las salas de espera. En el caso de no poder aplicarse este sistema, la indicación que el propietario de la mascota permanezca con ella en su auto hasta que el veterinario lo pueda atender, reduce el stress de los animales previo a la consulta médica y disminuye el riesgo de transmisión de enfermedades infecciosas en la clínica veterinaria. Además, los veterinarios de animales de compañía deberían exigir que todos sus pacientes estén correctamente inmunizados (vacunados). Las clínicas veterinarias deberían ser diseñadas para garantizar una fácil limpieza: provistas de paredes azulejadas, impermeables al agua, que permitan un drenaje adecuado del agua de limpieza y de mobiliarios de fácil remoción para asegurar la limpieza de “cada rincón” de la clínica. Además, deberían poseer una eficiente ventilación y aire acondicionado, no sólo para minimizar los olores, sino también para disminuir la transmisión de virus mediante aerosoles. Es esencial asegurar la decontaminación y el lavado frecuente de los materiales y equipamientos contaminados (termómetros, estetoscopios, camillas, etc.). Agentes físico-químicos y su efecto en los virus Diversos agentes físicos y químicos pueden actuar sobre los constituyentes del virión produciendo su inactivación. En general los virus son más sensibles que las bacterias y los hongos a la acción de los agentes fisicoquímicos. El conocimiento de la sensibilidad de los virus a las condiciones ambientales es importante para determinar la viabilidad de muestras clínicas para diagnóstico virológico, para la conservación de vacunas virales a virus vivo y para estimar la infectividad a temperatura ambiente. Es fundamental conocer la viabilidad de los virus para poder lograr una inactivación adecuada de aquellos materiales contaminados que necesitan desinfección o para efectuar el tratamiento indicado para un correcto abastecimiento de agua potable, etc. Entre los inactivantes físico-químicos pueden mencionarse la temperatura, la luz UV, el pH, el medio iónico y los solventes de lípidos. Temperatura La mayoría de los virus son lábiles al calor. En general es suficiente una hora a 55-60 ºC para inactivar a la mayoría de los virus por desnaturalización de las proteínas de la cápside, lo que impide la adsorción y la decapsidación. Constituyen excepciones el virus de la hepatitis B y algunos adenovirus, que resisten esa temperatura. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Como regla general, la vida media de la mayoría de los virus puede ser medida en segundos a 60ºC, en minutos a 37ºC, en horas a 4ºC, en días a -20ºC, en meses a -70ºC y en años a -196ºC. La esterilización por calor seco en estufa o por calor húmedo en autoclave, destruye a todos los virus, incluyendo a los más resistentes como el de la hepatitis B. por esta razón, la esterilización en estufa o autoclaves es el procedimiento de elección. La temperatura ambiente, destruye muchos virus aunque el tiempo requerido para la inactivación depende de las características de la familia. Por ejemplo el virus de la hepatitis B, los parvovirus y los poxvirus pueden conservar su infectividad a temperatura ambiente durante meses. En cambio, otros como los orthomixovirus (influenza) o los paramixovirus (sarampión) se inactivan en pocas horas. Por estas razones es fundamental que las muestras clínicas para diagnóstico virológico por aislamiento sean conservadas a la temperatura adecuada, es decir 4 ºC en hielo granizado y enviadas al laboratorio en el menor tiempo posible. Es importante evitar la congelación ya que muchos virus, en especial aquellos con envoltura son muy sensibles a la congelación y descongelación. Solamente deberán congelarse aquellas muestras que necesiten ser transportadas largas distancias y que no permitirán el mantenimiento del hielo. Otro procedimiento para preservar la infectividad es la liofilización, que es un procedimiento de desecación al vacío, que se utiliza habitualmente para la conservación de vacunas virales. pH y medio iónico La mayoría de los virus se conservan mejor en medios isotónicos y a pH fisiológico, aunque algunos virus pueden soportar un amplio rango de pH y fuerzas iónicas. Por ejemplo, los enterovirus resisten el pH ácido del estómago y por esa razón pueden penetrar por vía digestiva. En la preparación de vacunas a virus vivo atenuado es imprescindible la preservación de la infectividad. Por ello se adicionan ciertas sales, como cloruro de magnesio, que aumentan la resistencia a la inactivación térmica. Radiaciones Las radiaciones UV y las ionizantes (rayos X y Gamma) al producir alteraciones en el genoma son capaces de inactivar los virus. Para inactivar algunas vacunas se utiliza luz UV, por ejemplo la vacuna antirrábica de uso humano en Argentina. Las radiaciones ionizantes se utilizan para esterilizar materiales plásticos de uso médico o de laboratorio. La luz UV se utiliza para esterilizar áreas de trabajo. Solventes de lípidos La presencia o no de envoltura determina la sensibilidad de los virus a los solventes lipídicos. Todos los virus con envoltura se inactivan fácilmente con solventes de lípidos como éter, cloroformo, sales biliares o detergentes aniónicos. Por el contrario los virus carentes de envoltura son resistentes a estos agentes y por ello son infectivos por vía digestiva, ya que no son sensibles a las sales biliares. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Desinfección y desinfectantes Los desinfectantes son agentes químicos formulados para utilizarse sobre superficies inanimadas, en contraste con los antisépticos, los cuales son agentes químicos formulados para su uso sobre la piel y/o mucosas. La desinfección de los equipamientos, materiales e incluso instalaciones juega un rol fundamental en el control de las enfermedades virales que afectan al ganado. Los virus de las diferentes familias varían enormemente en su resistencia a los agentes desinfectantes, siendo los virus envueltos mucho más sensibles a la acción de los agentes desinfectantes que los virus desnudos. Sin embargo, muchos de los agentes desinfectantes formulados en los últimos años, inactivan rápidamente a la mayoría de los virus. Su acción efectiva está influenciada por el acceso del producto a las partículas virales: los virus atrapados en varias capas de moco o materia fecal no son inactivados tan fácilmente. Los requerimientos estándares impuestos por la Agencia de Protección Ambiental de los EEUU especifican que al evaluar la acción desinfectante de un determinado producto, los virus deben ser resuspendidos en suero al 5% y secados sobre una superficie inanimada antes de evaluar la eficiencia de ese desinfectante. Se presentan serias dificultades cuando las superficies no pueden ser rigurosamente higienizadas debido a que poseen grietas o hendiduras que no facilitan la desinfección de un determinado material o superficie. Por ejemplo, los corrales confeccionados de madera para el alojamiento de animales de producción. La Tabla 1 muestra algunos de los desinfectantes más comunes y sus potenciales usos. Tabla 1. Desinfectantes utilizados para la inactivación de virus. Desinfectante Usos Consideraciones Hipoclorito de sodio (Lavandina) Desinfección de instalaciones y utensilios e incluso agua de bebida. Altamente efectivo, pero puede inactivarse frente a la presencia de grandes cantidades de proteínas contaminantes (heces, moco, pelos, células descamadas o exfoliadas). Son baratos, no tóxicos (utilizados en las concentraciones adecuadas) y de rápida acción. Detergentes yodóforos (Betadine) Mismo uso que el hipoclorito de sodio Su acción se basa en la lenta iodo y en su acción (desnaturalización de proteínas afecta en menor medida que el sodio por la alta concentración Son más caros. Formaldehído (Formalina) Ropa de trabajo, superficie de materiales utilizados como cama de los corrales y en la forma de vapor se utiliza para la esterilización de superficie de instrumentales, equipamientos, utensilios, etc. Posee un bajo poder de penetración, salvo en su forma de vapor. Útil para realizar desinfección luego del lavado con otros desinfectantes. Irritante para mucosas. Posibilidad de reacciones de hipersensibilidad por algunos usuarios y animales. Derivados del fenol (Dettol) Se utiliza en una dilución al 2,5% en agua para la desinfección de manos, caniles, jaulas, superficies de mobiliarios utilizados en los hospitales o clínicas veterinarias. Su eficacia depende de la temperatura y concentración a la que se lo utilice. Puede inactivarse frente a la presencia de grandes cantidades de proteínas contaminantes. liberación del detergente y lípidos). Se hipoclorito de de proteínas. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Clorhexidina (Fada, Laclorhex) Se utiliza para la desinfección de muchos tipos de materiales, caniles, jaulas, superficies de mobiliarios utilizados en los hospitales o clínicas veterinarias. Su eficacia no se altera frente a la presencia de fluidos corporales, jabón, compuestos orgánicos. Son más caros. Dióxido de etileno Se utiliza para la desinfección de accesorios médicos sensibles al calor, aislantes plásticos, etc. Es tóxico e inflamable, salvo cuando se lo combina al 10% con CO2 al 90%, el cual se encuentra disponible comercialmente como gas comprimido. Glutaraldehído (Cidex) Se utiliza para la esterilización fría de instrumentos con lentes (microscopios, equipamiento de oftalmología) Se utiliza como viricida en solución al 2% con bicarbonato de sodio. Su acción se desarrolla en 10 minutos a un pH de 7,5 a 8,5. Son caros. Alcoholes (Alcohol Etílico, Propanol, Metanol) Se utiliza para la desinfección de manos y termómetros. Tiene acción viricida sólo en altas concentraciones (70 u 80%). El alcohol etílico es preferido frente al metanol o el propanol. No son tóxicos. Compuestos de amonio cuaternario El más utilizado es el Cloruro de Benzalconio en su presentación como antiséptico para la higiene de heridas. No tiene una efectiva acción viricida frente a la mayoría de los virus. Puede inactivarse frente a la presencia de grandes cantidades de proteínas contaminantes. Los primeros 5 compuestos enumerados en la Tabla 1 pueden utilizarse para la desinfección de las instalaciones de los animales de producción, aunque algunos suelen ser demasiado caros para utilizarlos a gran escala. Los últimos 4 compuestos son más utilizados en el consultorio veterinario, hospitales o laboratorios. La lavandina (Hipoclorito de Sodio al 2%) es muy económica y se utiliza tradicionalmente como agente desinfectante a gran escala en establecimientos de producción animal (granjas, tambos, rodeos, haras, etc) para el control del virus de la Fiebre Aftosa y otras enfermedades virales. El uso de agua caliente y detergente así como la esterilización por vapor también son agentes utilizados con éxito para la decontaminación y desinfección de las instalaciones ganaderas. Detección e identificación de los virus Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades Virales Las pruebas de laboratorio destinadas al diagnóstico específico de enfermedades virales pueden ser de 2 tipos: (1) Aquellas pruebas directas que evidencian la presencia del virus infeccioso, el antígeno viral o el ácido nucleico viral. (2) Aquellas pruebas indirectas que demuestran la presencia de anticuerpos dirigidos contra antígenos virales en el animal enfermo o con riesgo de infección. Pruebas directas UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Son aquellos que detectan: 1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral en cultivo celular, huevos embrionados o animales de laboratorio). 2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanálisis o inmunoensayos enzimáticos (EIA), Test de Aglutinación. 3. La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.). 4. El virus como partícula viral (microscopía electrónica). Mientras que la mayoría de las pruebas de laboratorio tradicionales (cultivo celular, inoculación en huevos embrionados y/o en animales de laboratorio) siguen siendo ampliamente utilizadas, muchas de estas pruebas no se ajustan al manejo clínico de las enfermedades virales, ya que los resultados están disponibles luego de varios días (o incluso semanas). El principal objetivo para el desarrollo de nuevas pruebas diagnósticas en virología ha sido el diseño de nuevos métodos de laboratorio que permitan un resultado definitivo en menos de 24 horas o incluso durante el examen clínico inicial del animal. Los mejores métodos cumplen con al menos 5 pre-requisitos: velocidad, simplicidad, sensibilidad, especificidad y bajo costo. Para el diagnóstico de laboratorio de la mayoría de las infecciones virales existen: 1) pruebas diagnósticas estandarizadas y reactivos de buena calidad disponibles en el mercado, 2) ensayos simplificados y que aseguran un bajo costo de los reactivos, 3) pruebas diagnósticas con instrumentos que permiten el análisis automatizado de las muestras y 4) análisis computarizado e impresión de los resultados que facilitan su interpretación, así como también facilitan la presentación de informes, el mantenimiento de registros y la facturación. Este avance en el desarrollo de pruebas diagnósticas más rápidas y eficientes ha sido menos espectacular en medicina veterinaria que en medicina humana (debido al retorno económico de la inversión y al alcance de las pruebas requeridas para cada especie); sin embargo, se han desarrollado un gran número de kits diagnósticos, disponibles comercialmente y de ejecución rápida, segura y económica para utilizarse en la mayoría de las especies animales. Estas pruebas de laboratorio pueden detectar el antígeno viral, permitiendo el diagnóstico a partir de una sola muestra recuperada directamente del animal durante la fase aguda de la enfermedad viral o pueden detectar la presencia de anticuerpos. Los inmunoensayos enzimáticos en fase sólida (EIA’s) han revolucionado el diagnóstico virológico veterinario debido a su capacidad de detectar antígenos virales o anticuerpos. Para el diagnóstico de laboratorio de las enfermedades virales está siendo ampliamente utilizada la Reacción en Cadena de la Polimerasa (siglas en inglés: PCR), que permite la detección del ácido nucleico viral a partir de muestras clínicas, como una de las pruebas alternativas de rápida ejecución. El diagnóstico de una enfermedad viral es un gran desafío. Más de 200 virus individuales, pertenecientes a 25 familias, causan infecciones virales de importancia veterinaria en las 8 principales especies de animales domésticos (vacas, ovejas, cabras, cerdos, caballos, perros, gatos y pollos). Si son tenidos en cuenta las cepas, subtipos y variantes de los virus y si el rango de hospedadores se amplía a pavos, patos, animales de laboratorio y especies silvestres, entonces el número de virus conocidos se incrementa enormemente. Según el informe de los centros de referencia y de las colecciones de cultivo existen más de 30.000 variedades de virus. Por lo tanto, no es sorprendente que ningún laboratorio pueda tener la experiencia y recursos necesarios para la identificación de todos los virus existentes. Por esta razón, los laboratorios de diagnóstico veterinario tienden a la especialización, es decir se centran en el diagnóstico de las enfermedades virales que afectan a los animales de producción o de compañía, a las especies de laboratorio o las aves o al diagnóstico de enfermedades causas por virus exóticos. Dentro de UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA estos laboratorios especializados existe un considerable esfuerzo para el desarrollo de métodos de diagnóstico rápidos que no involucren necesariamente el aislamiento viral para llegar al diagnóstico, debido a que este tipo de metodología es cara, demora mucho tiempo y suele no ser sensible para la mayoría de las enfermedades virales. Aislamiento viral: prueba directa para el diagnóstico virológico Cultivo celular El cultivo de células se desarrolló a comienzos del siglo XX mediante el cultivo de órganos completos. Luego, se avanzó en el desarrollo de métodos que permitieron el cultivo de células individuales, ya sea en cultivos celulares primarios (células somáticas obtenidas de un animal de experimentación o de un paciente, las cuales pueden ser mantenidas en cultivo por un corto periodo de tiempo) o en líneas celulares inmortalizadas (aquellas que bajo las condiciones necesarias, continúan creciendo de manera indefinida). En 1952, Renato Dulbecco, fue el primero en cuantificar virus animales con precisión, utilizando un ensayo en placa. En esta técnica, se utilizan diluciones del virus para infectar una monocapa de células cultivadas, que luego se cubren con agar blando para restringir la difusión del virus, lo que resulta en una muerte celular localizada y genera la aparición de “placas” o “agujeros” luego de teñir la monocapa (Figura 1). Diluciones seriales del virus Las diluciones son vertidas en las placas de cultivo que contienen las células susceptibles. Luego de la adherencia del virus a las células, el cultivo se cubre de un medio semi-sólido el cual restringe la difusión de las partículas virales. La difusión restringida del virus hacia las células resulta en una destrucción localizada y visible de las células en monocapa, conocida como “placas”. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Figura 1. Los ensayos en placa se llevan a cabo mediante la aplicación de una dilución adecuada de una preparación del virus a una monocapa confluente o semi-confluente de células susceptibles. Después de permitir la fijación del virus y la infección de las células, el medio líquido se sustituye por un medio de cultivo semisólido que contiene un polímero (agarosa o carboximetilcelulosa), que restringe la difusión de las partículas virales a las células infectadas. Sólo puede ocurrir la propagación directa célula a célula, lo que resulta en la destrucción localizada de la monocapa. Después de un período adecuado, el medio se elimina y por lo general las células son teñidas para poder visualizar los agujeros (“placas”) en la monocapa celular (véase Figura 4.B, más adelante). Cada placa de cultivo refleja la infección como una unidad formadora de placa única (ufp). El recuento del número de “placas” determina directamente el número de partículas virales infecciosas aplicadas sobre la placa de cultivo. Tipos de cultivos Existen tres tipos diferentes de cultivo de los tejidos animales: cultivo de órganos. explantes primarios. cultivos celulares. En la figura 2 se ilustran los tres tipos de cultivos y sus diferentes modos de cultivo. A B C A Figura 2. Tipos de cultivos. A. Cultivo de órganos sobre un disco de filtro o sobre una rejilla de acero inoxidable en el medio de cultivo. B. Cultivo de explantes en frasco y representación del crecimiento periférico. C. Desagregación enzimática y mecánica para generar una suspensión celular que formará una monocapa. Fuente: Freshney y Vunjak-Novakovic, 2006. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA 1. Cultivo de órganos: Implica que la arquitectura característica del tejido in vivo se mantenga al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. 2. Explantes primarios: son fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan solamente las células de la periferia del explante. 3. Cultivo celular: Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos. La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea. En la actualidad, los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagación, así como por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetitividad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace unos años cultivos mixtos con importantes éxitos. Tipos de cultivos celulares Las líneas celulares se pueden dividir en dos tipos principales: adherentes (células en monocapa) y no adherentes (células en suspensión). Las células adherentes se fijan al material plástico de un frasco o placa y por tanto tienen que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas. Las células adherentes derivan de órganos como el músculo, hígado, células nerviosas, riñón, etc. Las células en suspensión normalmente no se fijan a la superficie del recipiente de cultivo. Las características de las células en cultivo (in vitro) suelen depender de su procedencia en el animal (in vivo). Por ejemplo, prácticamente todos los cultivos en suspensión derivan de células inmunitarias o de precursores de las mismas; in vivo circulan por el torrente sanguíneo y no tienden a fijarse (como los linfocitos B y T). Las células que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensión, suelen clasificarse en primarias, inmortales o transformadas. Las células primarias son aquellas recientemente aisladas y por lo general tienen una duración limitada en cultivo. Las células inmortales y las transformadas (también llamadas líneas celulares continuas) presentan la propiedad de crecer de forma ilimitada en el cultivo. Las líneas celulares transformadas son células que derivan de tumores o que han sido manipuladas de algún modo y presentan un nuevo fenotipo transformado. Aislamiento viral en cultivos celulares A pesar de la enorme explosión de nuevas técnicas diagnósticas conocidas como “de resultados en el mismo día”, que se basan en la demostración del virus, antígeno viral o ácido nucleico viral a partir de muestras tomadas directamente del animal; el aislamiento viral en cultivos celulares sigue siendo el método más sensible. Teóricamente, tan sólo un virión viable UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA presente en una muestra puede ser recuperado y amplificado en miles de copias en los cultivos celulares. De esta manera se genera el material viral necesario para ser caracterizado antigénicamente. Si bien el cultivo celular sigue siendo el método de elección para el aislamiento viral, existe demasiada expectativa sobre los alcances de esta técnica en el diagnóstico de las enfermedades virales. Por otra parte, es la única técnica que puede detectar e identificar un virus totalmente desconocido e incluso permitir el descubrimiento de un nuevo agente viral. En consecuencia, aquellos laboratorios equipados para el diagnóstico virológico rápido también inoculan cultivos celulares en el intento de aislar virus. El cultivo es el único método para generar la suficiente cantidad de virus vivos que permita caracterizar la variabilidad antigénica de los virus productores de enfermedades en los animales. Además, los cultivos celulares permiten la producción de una gran cantidad de virus que generan antígenos virales utilizados en las pruebas diagnósticas o en la producción de anticuerpos monoclonales para su distribución a otros laboratorios. Métodos de cultivo celular La elección de un cultivo celular óptimo que permita el aislamiento primario de un virus de naturaleza desconocida, a partir de muestras clínicas, es altamente empírica. Las células primarias, derivadas de los tejidos fetales de la misma especie, proveen el sustrato más importante de los cultivos celulares para lograr el aislamiento del virus. Las líneas celulares continuas derivadas de especies homologas son, en la mayoría de los casos, una buena opción para el aislamiento viral. A menudo, la naturaleza de la enfermedad que padece el animal del que se obtuvo la muestra sugerirá qué tipo de virus puede ser aislado, y en tales casos, puede ser elegido el cultivo celular óptimo para ese virus, en paralelo con un segundo tipo de cultivo celular de amplio espectro. Las líneas celulares ofrecen algunas ventajas y se encuentran disponibles para la mayoría de los mamíferos domésticos. El cultivo de tipos especiales de células u órganos es utilizado para algunos virus en particular. Por ejemplo, los betaherpesvirus y gammaherpesvirus pueden ser recuperados de cultivos en monocapa propagados directamente desde los tejidos recolectados del animal enfermo. Algunos coronavirus y rinovirus no crecen bien en cultivos celulares en monocapa y necesitan ser cultivados en cultivos explantados, es decir, en pequeños cubos de tejido con el epitelio intacto, tomado de la tráquea o del tracto digestivo. El co-cultivo utilizando tejidos explantados y células en monocapa puede utilizarse para asegurar el aislamiento de virus que realizan latencia en sus hospedadores (por ejemplo, los herpesvirus a partir del ganglio del nervio trigémino). Los cultivos de células de artrópodos son frecuentemente utilizados como un sistema paralelo para aislar algunos arbovirus. Inoculación y mantenimiento del cultivo celular Los cultivos celulares en monocapa se realizan en recipientes plásticos (frascos) con tapa a rosca (Figura 3). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Figura 3. Frascos utilizados en el cultivo celular en monocapa. Las placas multiwell (Figura 4.A) son muy convenientes para las pruebas de neutralización sérica, donde un gran número de cultivos son requeridos y se necesita economizar en medios, equipamiento y espacio. Sin embargo, este tipo de placas aumenta el riesgo de contaminaciones cruzadas cuando se utilizan para el aislamiento viral. A B Figura 4. A. Placas multiwell utilizadas en pruebas de neutralización sérica. B. Placas multiwell utilizadas para evaluar efecto citopático en placa. Los cultivos inoculados son incubados comúnmente a 37 ºC, aunque la temperatura corporal normal de la mayoría de las especies de animales domésticos varía por encima o por debajo de 37 ºC. En el caso de los virus que afectan al tracto respiratorio superior, tales como el virus Influenza, rinovirus y coronavirus, se cultivan a 33 ºC (temperatura de la mucosa nasal). Los cultivos celulares deben ser inspeccionados diariamente para evaluar los efectos citopáticos de los virus inoculados (Figura 5). Reconocimiento del desarrollo viral en los cultivos celulares Efecto citopático: Se denomina efecto citopático a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral y observados sólo en algunos tipos de virus. A lo largo del ciclo viral intracelular, desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular, prácticamente todos los componentes y organelas celulares sufren alteraciones drásticas a nivel UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA molecular, muchas de las cuales tienen una manifestación morfológica. La mayor parte de las observaciones del efecto citopático se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, agregación celular, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis celular, etc. Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones (Figura 5). A B Figura 5. Efecto citopático del virus del sarampión sobre células B95a. A. Cultivo de células no infectadas con el virus (cultivo control). B. Cultivo de células infectadas con el virus que muestran el efecto citopático. Algunos virus muestran un efecto citopático detectable en uno o dos días, tales como la mayoría de los picornavirus y los alphaherpesvirus; mientras que otros virus son muy lentos en mostrar efecto citopático en los cultivos (1 a 4 semanas) y si lo hacen este efecto puede no ser demasiado obvio. Al transcurrir tanto tiempo, las células del cultivo celular sin inocular (cultivo control) comienzan a mostrar una degeneración inespecífica que puede simular un efecto citopático. En estos casos, las células y el fluido sobrenadante del cultivo celular infectado son inoculados en un nuevo cultivo celular en monocapa, donde al cabo de un tiempo breve aparece el efecto citopático. Cuando los cambios que indican replicación viral son evidentes, se puede continuar con el diagnóstico siguiendo diferentes alternativas. Si el efecto citopático es lo suficientemente característico (puede observarse sin la necesidad de teñir las células del cultivo) se puede realizar un diagnóstico presuntivo de infección viral. Los virus que no poseen un efecto citopático demasiado evidente, pueden reconocerse debido a sus propiedades “hemoadsorventes”. La UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA mayoría de los virus que generan aglutinación de glóbulos rojos pueden someterse a pruebas de hemoaglutinación que sirven para evidenciar esta propiedad. Por ejemplo, los paramyxovirus son reconocidos de esta manera. Alternativamente puede recurrirse a la fijación y tinción de las células en monocapa del cultivo infectado y examinarlas microscópicamente para evaluar el efecto citopático. Las células teñidas con hematoxilina y eosina pueden mostrar la formación de cuerpos de inclusión o de células multinucleadas gigantes (sincitios), que si están presentes son evidencia suficiente para asignar al virus a una familia. Tales cultivos también pueden ser teñidos con anticuerpos fluorescentes dirigidos específicamente contra un antígeno viral según el tipo de virus que sospechamos. Además, las células de los cultivos infectados pueden examinarse por microscopía electrónica. La clave del éxito en el diagnóstico de laboratorio es aproximarse a un punto en el cual hemos reunido la suficiente información para confirmar el diagnostico. Identificación de los aislamientos virales: caracterización antigénica Un virus puede ser clasificado provisoriamente en una familia en particular y en algunos casos puede asignarse a un género o especie según los hallazgos clínicos en el animal a partir del cual se aisló. Además puede clasificarse taxonómicamente según el tipo celular empleado en el cultivo que permitió su aislamiento y según los resultados observados durante el crecimiento del virus en dicho cultivo (efecto citopático, hemoadsorción, formación de cuerpos de inclusión, etc.). Sin embargo, la identificación y clasificación definitiva del virus aislado requiere de la caracterización antigénica. Utilizando el virus aislado como antígeno se lo evalúa frente a diferentes anticuerpos, por ejemplo en un inmunoensayo enzimático, para clasificar al virus como perteneciente a una determinada familia o género (por ejemplo, Adenoviridae). Si se quiere identificar la especie viral (por ejemplo, virus de la hepatitis infecciosa canina) se utilizan diversos procedimientos serológicos (los cuales emplean anticuerpos monoclonales), tales como la neutralización viral o la inhibición de la hemoaglutinación. Esta aproximación secuencial es aplicable sólo para las familias de virus que comparten un antígeno familiar común. La elección de la técnica inmunológica varía enormemente. Cada laboratorio conoce su propio protocolo de caracterización viral basado en la sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, velocidad, conveniencia y costos de las técnicas inmunológicas utilizadas. Para las enfermedades virales de importancia económica a nivel nacional o internacional es común que la clasificación e identificación viral se realice según un protocolo de pruebas de laboratorio especificas para un virus en particular. Una de las formas más sencillas de identificar un virus recientemente aislado es mediante la tinción con anticuerpos fluorescentes de las células en monocapa infectadas (Figura 6). Esta técnica (denominada: inmunofluorescencia directa - IFD), puede resolver de manera definitiva y en el transcurso de poco más de una hora, la incógnita de clasificación e identificación de un determinado virus. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Figura 6. Inmunofluorescencia directa (IFD) Se basa en las propiedades de los fluorocromos. Los mismos son moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda. La IFD permite identificar la presencia de partículas virales presentes en las células de la monocapa infectada mediante el uso de anticuerpos marcados con un fluorocromo como el isotiocianato de fluoresceína. Se utilizan en el diagnóstico de enfermedades virales como la rabia ciudadana y silvestre, rinotraqueítis infecciosas bovina, diarrea viral bovina y peste porcina clásica. La mayoría de las pruebas inmunológicas se aplican a la identificación de viriones y de antígenos solubles presentes en el sobrenadante de los cultivos celulares. Los inmunoensayos enzimáticos (o técnicas inmunocitoquímicas) son, actualmente, las técnicas más comúnmente utilizadas (Figura 7). SUSTRATO SUSTRATO SUSTRATO ANTICUERPO PRIMARIO CONJUGADO CON UNA ENZIMA ANTICUERPO SECUNDARIO CONJUGADO CON UNA ENZIMA ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO anti-ANTIGENO ELISA directo 1 ELISA indirecto 2 ELISA sandwich 3 Figura 7. Técnicas inmunocitoquímicas (o EIA`s). Son métodos de marcaje para detectar los anticuerpos unidos específicamente a una molécula viral (antígeno) presente en las células del cultivo celular. Debido a que el marcador es una enzima la técnica se conoce como enzimoinmunoensayo (ELISA). 1. ELISA directo: El antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color. 2. ELISA indirecto: donde existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de color permite medir indirectamente la presencia del antígeno en la muestra mediante espectrofotometría. 3. ELISA “sándwich”: se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. Sin embargo, la neutralización viral (Figura 8) continúa siendo la técnica de elección para definir y distinguir serotipos virales. Para realización de esta prueba se utilizan anticuerpos monoclonales con una especificidad definida que permite la identificación de diversos virus (Figura 9). Esto permite reconocer rápidamente el agente viral responsable de la infección, incluso a nivel de subtipo, cepa y variedad viral (por ejemplo, virus rábico de las diferentes áreas geográficas). Los anticuerpos monoclonales que identifican familia, genero y tipos de virus específicos están disponibles para algunos virus de importancia epidemiológica (por ejemplo, el virus de la Influenza). D) Cultivo de células sensibles en el fondo de cada pocillo A) VIRUS E) Incubación F) Observación diaria C) Dilución de los B) ANTICUERPOS en el Microscopio invertido anticuerpos en la placa multiwell G) Coloración con Cristal Violeta para facilitar la lectura H) NEUTRALIZACIÓN. No se observa el efecto citopático. Existe neutralización del virus por los anticuerpos específicos presentes en las distintas diluciones del suero. I) SIN NEUTRALIZACIÓN. Presencia del efecto citopático. Los sueros no poseen anticuerpos que neutralicen la acción del virus. Figura 8. Prueba de neutralización viral. Este método utiliza la habilidad de los anticuerpos de anular la acción biológica de un virus. El método consiste en (A) la infección de un cultivo celular receptivo con un virus que causa lesiones visibles en este cultivo. La concentración del virus es conocida, mientras que los anticuerpos a analizarse (B) se diluyen en los pocillos de la placa multiwell (C). Cada pocillo posee en el fondo un cultivo de células sensibles para el virus a evaluar (D). En cada pocillo se incuban el virus junto con los anticuerpos sobre la monocapa de células (E). Diariamente se observa el cultivo celular presente en cada pocillo bajo el microscopio invertido (F). Pueden teñirse las células con cristal violeta para facilitar su observación (G). Si los anticuerpos específicos están presentes en la dilución apropiada, estos neutralizan la infección de las células por el virus en cuestión y con ello la aparición de lesiones en el cultivo celular (H). Si los anticuerpos no neutralizan al virus, se observa el efecto citopático del virus sobre las células del cultivo (I). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Figura 9. Producción de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G, producidas por unas células del sistema inmunitario denominados linfocitos B. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le inyectamos una molécula que reconoce como extraña, es decir, nuestra molécula problema. Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican los anticuerpos producidos, los cuales se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica. Las moléculas complejas como las proteínas tienen en su estructura varios determinantes antigénicos, es decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada determinante antigénico activará un clon, grupo de de linfocitos B, que producirá anticuerpos contra él. Los anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molécula inyectada irán a parar al suero. Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando anticuerpos policlonales. Existe una técnica que permite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma individualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos cultivos producirá un tipo de inmunoglobulina G que reconocerá sólo a uno de los determinantes UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA antigénicos de la molécula inyectada. A estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas. Identificación de los aislamientos virales: hemoadsorción y hemoaglutinación Las células infectadas con virus se pueden unir a los glóbulos rojos a través de sus membranas plasmáticas en los sitios de unión del virión, proceso que se conoce como hemoadsorción (Figura 10). Complejo de Anticuerpos Tetrámericos Ac Célula Ac Eritrocito Ac Eritrocito Ac Eritrocito Células infectadas Figura 10. Hemoadsorción. Es un fenómeno que sucede al aplicar glóbulos rojos a una monocapa de células de un cultivo previamente infectado con un virus con capacidad hemoaglutinante. La hemoadsorción se debe a la expresión de hemaglutininas específicas en la membrana plasmática de la célula infectada, donde se produce la adsorción de los glóbulos rojos. El aislamiento del virus de la peste porcina africana (PPA) se realiza en cultivos primarios de macrófagos porcinos. El virus de la PPA es capaz de infectar y replicarse de forma natural en cultivos de leucocitos de sangre periférica de cerdo, donde además de producir un efecto citopático en los macrófagos infectados, previamente a la lisis celular, origina un efecto característico de hemoadsorción. La imagen al microscopio se presenta en forma de mórula o corona (roseta) de eritrocitos alrededor de los leucocitos (fotos a y b). Esta propiedad de hemoadsorción puede ser utilizada para determinar virus específicos a través de la Inhibición de la Hemoadsorción, donde se utilizan anticuerpos específicos (Figura 11). UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Virus hemaglutinante Anticuerpos Estadío 1 Unión Ag/Ac Sin unión Ag/Ac Estadío 1 Eritrocitos Vista macroscópica del fondo de la placa POSITIVO SIN HEMAGLUTINACION NEGATIVO HEMAGLUTINACION Vista macroscópica del fondo de la placa Figura 11. Inhibición de la Hemoadsorción/ Hemoaglutinación. Las hemoaglutininas presentes en la superficie del virión pueden ser bloqueadas en su función por la presencia de anticuerpos dirigidos contra esos determinantes antigénicos específicos responsables de la unión del virus a los glóbulos rojos. Por lo tanto, el fenómeno de la hemoaglutinación no es evidente y en la policubeta se visualiza la sedimentación de los glóbulos rojos formando el característico botón rojo, indicando la inhibición de la hemoaglutinación. Por ejemplo: Los virus Influenza poseen espículas de hemaglutinina, que aglutinan glóbulos rojos de diferentes especies animales. La unión del anticuerpo específico al sitio antigénico de la hemaglutinina bloquea la unión de la hemaglutinina viral con los receptores de los eritrocitos. Este bloqueo es específico y permite distinguir entre variantes antigénicas de un mismo subtipo. El principio de la inhibición de la hemaglutinación es el mismo que el de la hemoadsorción: muchos virus pueden unir (y aglutinar) los glóbulos rojos de diferentes especies de mamíferos y aves, formando “puentes” entre las células y aglutinando los eritrocitos en grandes acúmulos celulares. Cuando se agregan anticuerpos específicos y el virus, previo a la adición de los glóbulos rojos, la hemaglutinación es inhibida. Por lo tanto, la especificidad de los anticuerpos utilizados sirve para identificar el virus aislado en las células del cultivo. La inhibición de la hemaglutinación es una técnica altamente sensible y específica. Además, es de desarrollo simple, económica, rápida y ha sido utilizada históricamente como el procedimiento de elección para la identificación de aquellos virus que poseen efecto hemoaglutinante. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Aislamiento y caracterización viral en animales de experimentación y en embriones de animales. Muchos virus pueden ser satisfactoriamente cultivados en embriones de pollo o en ratones recién nacidos, pero actualmente, estas técnicas están en desuso debido a que el cultivo celular constituye una opción más simple. Animales de experimentación La inoculación en animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su aislamiento o propagación, es una técnica poco empleada por las dificultades de mantener un bioterio, la laboriosidad de la inoculación y el peligro de difusión del virus con las excretas de los animales. Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros sistemas –embriones o cultivos celulares– no es posible. Los animales más utilizados para este fin son los monos, los cobayos y los ratones blancos lactantes, que se utilizan esporádicamente para el aislamiento de un número limitado de virus y en general en laboratorios de investigación. En la actualidad, los ratones blancos pueden ser utilizados para el aislamiento de los arbovirus (conjunto de virus transmitidos por artrópodos, pertenecientes a diferentes familias) y para el virus de la rabia. Los ratones lactantes, con menos de 24 hs de nacidos, son inyectados intracerebral o intraperitonealmente con la muestra sospechosa (Figura 13). Posteriormente y durante 2 semanas, se observan a los animales por el desarrollo de signos clínicos patognomónicos de estas enfermedades. Una vez desarrollada la sintomatología se eutanasia al animal y se procede con la identificación y caracterización del virus mediante pruebas como la histopatología de los tejidos afectados, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica (para identificación de antígenos virales en los tejidos) o serología de los animales afectados (para detectar anticuerpos específicos en los animales infectados). Figura 12. Inoculación intracerebral de ratones recién nacidos. Embriones animales UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia para su realización. De acuerdo al virus de interés, la muestra es inoculada en la cavidad amniótica, alantoidea, en el saco vitelino o en la membrana corioalantoidea (Figura 13). La inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Membrana corioalantoidea Cámara de aire Cáscara Cavidad Amniótica Inoculación en la membrana corioalantoidea Inoculación amniótica Saco Vitelino Inoculación alantoidea Membrana de la cáscara Albúmina Cavidad Alantoidea Inoculación del saco vitelino Figura 13. Vías de inoculación de los huevos embrionados. Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus Influenza A. En efecto, existen varios virus patógenos importantes que replican mucho mejor en los huevos que en los cultivos celulares derivados de los tejidos de los embriones de pollo. Las evidencias del crecimiento viral pueden observarse en la membrana corioalantoidea (por ejemplo, las típicas pústulas causadas por los poxvirus), pero también los virus pueden identificarse utilizando otras técnicas para la detección de virus (hemaglutinación, inmunofluorescencia, etc). El cultivo celular, la inoculación en embriones de pollo o en ratones son herramientas disponibles para el aislamiento viral. Algunos de estos sistemas son utilizados para el diagnóstico. Es decir, en el cultivo celular se puede identificar a los virus que generan efecto citopático, en los embriones se pueden identificar las lesiones patognomónicas de los virus sobre los tejidos embrionarios y en los ratones se pueden observar los signos clínicos de la enfermedad que genera el virus que se ha inoculado. Para la identificación y caracterización de un virus aislado se utilizan otras herramientas como la histopatología, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, neutralización y/o hemaglutinación. Todas estas herramientas pueden combinarse y ser utilizadas UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA criteriosamente para permitir un correcto aislamiento y caracterización del agente productor de la enfermedad viral (Figura 14 y 15). 7 2 1 3 4 6 5 Figura 14. Combinación de las diferentes herramientas utilizadas en el diagnóstico de las enfermedades virales. A partir del animal enfermo puede obtenerse los tejidos afectados, los cuales son tratados para generar un inóculo con el virus sospechoso (1). Esta muestra se inocula en ratones blancos, los cuales muestras los signos clínicos de la enfermedad (2) y además pueden permitir la replicación y multiplicación de las partículas virales (3). Con los tejidos afectados del ratón infectado puede prepararse un inóculo que se utilizará como muestra para aplicar sobre un cultivo celular (4). En el cultivo celular el virus puede evidenciar efecto citopático o no (5). Este efecto sería considerado diagnóstico del agente viral. Si no se evidencia este efecto, las células infectadas de los cultivos pueden someterse a pruebas inmunohistoquímicas, inmunofluorescentes o histopatología para arribar al diagnóstico y caracterización viral (6). Si todavía quedan dudas acerca de la identificación viral, las partículas virales amplificadas en los cultivos celulares pueden utilizase como inóculo antigénico para técnicas como la hemoaglutinación (7) o neutralización viral. UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA Muestras del animal enfermo. 1 Inoculación en cultivos celulares 2 6 Partículas virales 3 4 Inoculación en huevos embrionados 5 Observación de signos clínicos o lesiones en los pollitos recién nacidos Figura 15. Combinación de las diferentes herramientas utilizadas en el diagnóstico de las enfermedades virales. A partir del animal enfermo puede obtenerse los tejidos afectados, los cuales son tratados para generar un inóculo con el virus sospechoso (1). Esta muestra se inocula en cultivos celulares que permiten la replicación y multiplicación de las partículas virales (2). En el cultivo celular el virus puede evidenciar efecto citopático o no. Este efecto sería considerado diagnóstico del agente viral. Si no se evidencia este efecto, las partículas virales amplificadas en los cultivos (3) pueden servir como inóculo para inocular huevos embrionados (4). Sobre los pollitos nacidos de los huevos inoculados pueden observarse las lesiones o signos clínicos asociados con el virus que se pretende identificar (5). Las partículas virales obtenidas de los cultivos celulares también pueden ser utilizadas como el antígeno a identificar en pruebas inmunohistoquímicas (ELISA) para arribar al diagnóstico y caracterización viral (6). BIBLIOGRAFÍA: Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. (1999). Veterinary Virology. Third Edition, Elsevier Ed., U.S.A. Traducción realizada por el Dr. Cs. Vet. Diego Grilli (Agosto 2013).