Download TEORICOS 3 y 4

UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES
CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA
CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA
VIROLOGÍA
TEORICO Nº 3
Temario: Taxonomía viral. Clasificación y nomenclatura de los virus. Breve descripción de los
virus con genoma a DNA: Familias Parvoviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae y
Papovaviridae. Virus con genoma a RNA: Familias Reoviridae, Picornaviridae, Togaviridae,
Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rabdoviridae y Retroviridae. Características más
importantes de cada familia, género y especies. Estrategias de multiplicación.
Taxonomía viral
Existe evidencia suficiente para asegurar que todos los organismos vivos pueden ser
infectados por uno o más virus. El número de virus patógenos o silentes que pueden afectar a los
animales, plantas, invertebrados, protozoarios, hongos y bacterias es muy elevado: han sido
reconocidos más de 4.000 virus diferentes y 30.000 subtipos o cepas de virus diferentes. Las
cepas o los subtipos virales particulares tienen un impacto diferente desde el aspecto de la salud
o el económico. Cientos de virus diferentes son reconocidos por infectar a los humanos y algunos
pocos han sido recuperados de animales individuales (animales de producción, de compañía,
caballos, animales de laboratorios, animales salvajes, aves, reptiles, anfibios y peces).
Debido a que todos los virus (cualquiera sea su hospedador) comparten algunas
propiedades, los virólogos han desarrollado un sistema simple de clasificación y nomenclatura
que abarca a todos los virus. Este sistema ha sido propuesto por el Comité Internacional de
Taxonomía de los Virus (sigla en inglés: ICTV).
Los más recientes esfuerzos por clasificar a los virus se basan en las características
comunes de las propiedades ecológicas, de transmisión, patogénicas y clínicas de los virus. Por
ejemplo: los virus que causan hepatitis: virus de la hepatitis canina (adenovirus), virus de la fiebre
del valle de Rift (bunyavirus) y el virus de la hepatitis B (hepadnavirus) se clasifican dentro de los
“virus de la hepatitis”.
Los sistemas taxonómicos subsecuentes han clasificado a los virus de acuerdo a:

Tamaño: determinado por ultrafiltración y microscopía electrónica.

Morfología del virión: determinada por microscopía electrónica.

Estabilidad del virión: determinada por las variaciones con respecto a su resistencia al
pH, temperatura, exposición a solventes lipídicos, detergentes, etc.

Antigenicidad del virión: determinada por diversos métodos serológicos.
Esta clasificación ha sido muy laboriosa debido a la gran cantidad de virus estudiados y a
las características virales utilizadas para la construcción de este completo sistema taxonómico.
En la mayoría de los casos es necesario medir sólo unas pocas características con el fin de
clasificar un virus “desconocido” en su taxón correspondiente. Por ejemplo: un virus aislado del
tracto respiratorio de un paciente canino, identificado por microscopía electrónica de contraste
negativo como “adenovirus”, es enviado inmediatamente para identificación serológica. Con esta
prueba se lo identifica como perteneciente al género Mastadenovirus de la familia Adenoviridae.
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Además se lo puede clasificar serológicamente como adenovirus canino tipo 1, 2 o inclusive como
un nuevo tipo de adenovirus canino.
Actualmente el criterio principal para delinear la principal taxa viral a la que pertenece un
virus es según:
1) El tipo y características del genoma viral;
2) La estrategia de replicación viral que utiliza el virus;
3) La estructura del virión.
La secuenciación completa o parcial del genoma viral es una herramienta poderosa para
generar información taxonómica y, actualmente, se utiliza como uno de los primeros pasos en los
protocolos utilizados en el proceso de identificación viral. Las secuencias del genoma de
referencia para todas las taxas virales se encuentran disponibles en las bases de datos de acceso
público como GenBank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).
El sistema universal de taxonomía viral consiste en agrupar a los virus en los niveles de:
orden, familia, subfamilia, género y especie.
El nombre del orden viral termina con el sufijo –virales, la familia con el sufijo –viridae, la
subfamilia con el sufijo –virinae y el género con el sufijo –virus. Los niveles de clasificación
taxonómica inferiores, como subespecies, cepas y variantes se han propuesto con fines prácticos
para el diagnóstico o el desarrollo de vacunas, pero no es una forma de clasificación formalmente
aceptada y no existe una definición o nomenclatura universal para estos niveles inferiores de
clasificación.
Actualmente, el sistema universal de taxonomía se compone de:

2 órdenes, los que contienen los virus patógenos para animales y humanos.

54 familias, dentro de ellas sólo 26 familias contienen los virus patógenos para animales y
humanos.

184 géneros.
El orden viral es utilizado comúnmente para agrupar a las familias de virus que exhiben
relaciones filogenéticas distantes, es decir, comparten dominios, secuencias o genes ancestrales.
Debido a que no todos derivan de un ancestro en común, no es posible agrupar a todas las
familias dentro de un orden y generar un solo árbol evolutivo.
El sistema taxonómico universal es completo al nivel de familia y género, es decir, todos
los virus a estudiar desde el punto de vista del interés veterinario han sido asignados a una familia
y género.
La clasificación en subfamilias es utilizada sólo cuando se considera necesario esclarecer
interrelaciones muy complejas entre los virus que integran una familia.
La especie es el taxón más importante en todos los sistemas de clasificación de las formas
vivientes, pero también es el más difícil de definir y aplicar. La mayoría de los virus de interés
veterinario se han clasificado dentro de una especie, pero en pocos casos se ha logrado avanzar
en la clasificación al nivel de subespecie o cepa.
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Familia de virus
Para comprenden el criterio de agrupación en familias de virus, los mismos han sido
agrupados de acuerdo a: 1) el tipo de ácido nucleico (ADN o ARN) y las características de la
cadena (cadena simple o doble); 2) características del genoma (genoma segmentado, genoma de
sentido positivo, negativo o ambisentido) y 3) la estrategia de replicación y transcripción.
FAMILIA DE VIRUS ADN
POXVIRIDAE
 Subfamilia: Chordopoxvirinae

Género: Orthopoxvirus
Especie: virus de la viruela (virus que produce la viruela bovina, de los conejos, camellos, monos y ratones).
Especie: vaccinia virus
(virus relacionado a la viruela humana, utilizado para la realización de vacunas en las
diferentes especies animales).

Género: Parapoxvirus
Especie: Orf virus (virus que en ovejas y cabras produce la enfermedad ectima contagioso)
Especie: virus de la pseudoviruela bovina.
Especie: virus de la dermatitis contagiosa pustular.
Especie: virus de la estomatitis papulosa bovina.

Género: Capripoxvirus
Especie: poxvirus caprino y ovino (virus que afecta produce la viruela ovina y caprina).
Especie: poxvirus bovino
(virus que produce la enfermedad dermatosis nodular “lumpyskin” en el ganado
bovino)

Género: Leporipoxvirus
Especie: mixoma virus (virus que en conejos produce la enfermedad mixomatosis)

Género: Suipoxvirus
Especie: poxvirus porcino (virus que afecta produce la viruela porcina).

Género: Avipoxvirus
Especie: poxvirus aviares (virus que afectan específicamente a las aves)
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Características
Los viriones de los poxvirus (pox, poc o pocc significa pústula) tienen forma rectangular,
similar a un ladrillo (Figura 1) y tienen una estructura muy compleja, midiendo 250 x 200 x 200 nm
(salvo los parapoxvirus que son viriones ovoides más pequeños).
A
B
Figura 1. A. Estructura externa (cobertura lipoproteica) de los viriones de los poxvirus. B.
Estructura interna (corte sagital) de los viriones de los poxvirus.
El genoma consiste en una molécula lineal de ADN doble cadena, con los extremos
covalentemente cerrados y con un tamaño de 170 a 250 kpb. La formación del virión involucra la
incorporación del ADN dentro de partículas proteicas inmaduras con forma de medialuna, las
cuales pasan a su estadio de maduración cuando se agregan alrededor capas externas de
proteínas (líneas verdes en la Figura 2). Este evento ocurre dentro del núcleo de la célula
hospedadora.
Figura 2. Representación esquemática de las estructuras internas de los poxvirus.
La replicación y el ensamblaje viral ocurren en sitios discretos del citoplasma (llamados
viroplasmas o fábrica de viriones) y los viriones son liberados mediante gemación de la
membrana celular (origen de la envoltura viral) o por lisis de la célula (en este caso, los viriones
carecen de envoltura viral).
La transmisión de los virus se produce por contacto directo (incluyendo heridas,
abrasiones, etc), fómites, aerosoles o pueden ser transportados mecánicamente por artrópodos.
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Los virus tienen un amplio rango de hospedadores, salvo excepciones puntuales que incluyen los
vaccinia virus y algunos de los poxvirus aviares.
HERPESVIRIDAE
 Subfamilia: Alphaherpesvirinae

Género: Simplexvirus
Especie: herpesvirus humano simple tipo 1
Especie: herpesvirus bovino tipo 2 (virus de la mamilitis bovina).

Género: Varicellovirus
Especie: herpesvirus humano tipo 3 (virus de la varicela-zoster)
Especie: herpesvirus bovino tipo 1 (virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina- IBR).
Especie: herpesvirus equino tipo 1 (virus del aborto equino)
Especie: herpesvirus equino tipo 4 (virus de la rinoneumonitis equina)
Especie: virus de la Pseudorabia.

Género: Sin nombre
Especie: virus de la enfermedad de Marek de los pollos.
Especie: herpesvirus gallido tipo 1 (virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar).
Especie: herpesvirus equino tipo 3 (virus del exantema coital).
Especie: virus B de la pseudorrabia.
Especie: herpesvirus canino.
Especie: herpesvirus felino (virus de la rinotraqueítis infecciosa felina).
 Subfamilia: Betaherpesvirinae

Género: Cytomegalovirus
Especie: herpesvirus humano tipo 5 o citomegalovirus humano.

Género: Muromegalovirus
Especie: citomegalovirus del ratón.

Género: Roseolovirus
Especie: herpesvirus humano tipo 6.
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 Subfamilia: Gammaherpesvirinae

Género: Lymphocryptovirus
Especie: herpesvirus humano tipo 4

(virus Epstein-Barr)
Género: Rhadinovirus
Especie: herpesvirus equino tipo 2.
Especie: herpesvirus equino tipo 5.
Características
Los viriones de los herpesvirus (herpes: reptar) son envueltos, miden aproximadamente
150 nm de diámetro y contienen una nucleocápside icosaédrica de 100 nm de diámetro (Figura
3).
Nucleocápside
Genoma
Membrana
Complejo de
Glicoproteínas tipo
I y II
Figura 3. Estructura de los viriones de los herpesvirus.
El genoma está formado por una molécula simple lineal de ADN de doble cadena de un
tamaño aproximado de 125 a 235 kpb.
Los virus replican en el núcleo de la célula hospedadora y maduran por gemación a través
de la membrana nuclear, la cual da origen a la envoltura viral.
Una característica común de la infección por herpesvirus es la persistencia que logra el
virus dentro del organismo del animal, normalmente de forma latente. La excreción del virus,
especialmente a través de secreciones genitales o saliva, puede ocurrir de manera continua o
intermitente y con o sin episodios de recurrencia de los signos clínicos.
Algunos virus, miembros de la subfamilia Gammaherpesvirinae, causan tumores debido a
la activación de oncogenes presentes en la célula hospedadora (por ejemplo: virus Epstein-Barr
en humanos, el cual se ha asociado al cáncer nasofaríngeo).
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ADENOVIRIDAE

Género: Mastadenovirus
Especie: adenovirus humano tipo 1 al 49.
Especie: adenovirus equino tipo 1 y 2.
Especie: adenovirus canino tipo 1 (virus de la hepatitis infecciosa canina)
Especie: adenovirus canino tipo 2 (virus que causa epidemias en perros, lobos, zorros, osos, coyotes, etc.
Virus que en perros se asocia al complejo “Tos de las perreras”).
Especie: adenovirus bovino tipo 1, 2, 3 y 10.
Especie: adenovirus ovino tipo 3.

Género: Aviadenovirus
Especie: virus de la enteritis hemorrágica de pollos y pavos.
Especie: virus de la enfermedad del bazo marmóreo en aves.

Género: Atadenovirus
Especie: adenovirus ovino tipo 287.
Especie: adenovirus bovino tipo 4, 5, 6, 7 y 8.
Especie: virus del síndrome de la caída de la puesta en aves.
Características
Los viriones de los adenovirus (adeno: glándula) no poseen envoltura (virus desnudo).
Poseen una nucleocápside hexagonal, con simetría icosaédrica de 80 a 100 nm de diámetro
(Figura 4).
Figura 4. Estructura de los viriones de los adenovirus. 1) Fibra que sobresale de la
nucleocápside, 2) nucleocápside hexagonal de simetría icosaédrica y 3) genoma viral.
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El genoma se compone de una molécula simple lineal de ADN de doble cadena con un
tamaño aproximado de 36 a 44 kpb.
Los virus replican en el núcleo de la célula hospedadora y su replicación es facilitada por
una amplia modulación de la respuesta inmune del animal hospedador.
Los virus poseen un amplio rango de hospedadores. La mayoría de los adenovirus causan
infecciones persistentes y pueden reactivarse por inmunosupresión de la especie hospedadora.
Por ejemplo, los adenovirus equinos causan una enfermedad bastante severa en los caballos
inmunocomprometidos.
Algunos de los adenovirus que causan enfermedades en los humanos, bovinos y pollos
pueden generar tumores cuando se los inoculan en el hámster recién nacido, pero ninguno causa
tumores en sus hospedadores naturales.
PARVOVIRIDAE
 Subfamilia: Parvovirinae

Género: Parvovirus
Especie: virus de la panleucopenia felina.
Especie: parvovirus canino tipo 1, 2a y 2b
(el parvovirus canino tipo 2b se ha asociado a nuevas
epidemias en perros, con cuadros de gastroenteritis hemorrágica muy graves).
Especie: virus de la enteritis del visón.
Especie: parvovirus bovino.
Especie: parvovirus porcino.
Especie: parvovirus de los conejos.
Especie: parvovirus del ratón.

Género: Erythrovirus
Especie: parvovirus humano B19 (causa exantema en los niños).

Género: Dependovirus
Los miembros de este Género son virus defectuosos que requieren de un adenovirus para su replicación; se presentan en perros, aves, bovinos,
caballos y humanos, confundiendo en la interpretación de las pruebas diagnósticas ya que no causan enfermedad en sus hospedadores.
Características
Los viriones de los parvovirus (parvus: pequeño) no poseen envoltura (virus desnudo), son
esféricos con simetría icosaédrica y con un diámetro promedio de 25 nm (Figura 5).
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Estructura esférica
Nucleocápside
Simetría icosaédrica
Figura 5. Estructura de los viriones de los parvovirus.
El genoma se compone de una molécula simple lineal de ADN de cadena sencilla, de tan
sólo 5 kpb. Las nucleocápsides de algunos parvovirus se componen de una hebra de ADN de
sentido negativo (parvovirus del ratón), mientras que otras nucleocápsides se componen por
diferentes porciones de la hebra de ADN (parvovirus bovino).
La replicación del ADN de los parvovirus es un fenómeno complejo. Este proceso involucra
la formación de “horquillas” en la cadena de ADN, la extensión de la misma hasta formar una
molécula intermedia de ADN de doble cadena y la participación de endonucleasas que se
encargan de la ruptura de ésta molécula intermedia para dar origen a la cadena sencilla de ADN
que se encapsida en el virión. La replicación y el ensamblaje de los viriones se producen en el
núcleo de la célula hospedadora. La replicación requiere que las células hospedadoras se
encuentren en la fase S del ciclo de división celular (fase de síntesis activa de ADN). Esto explica
la facilidad de los parvovirus para replicarse en células con rápida división celular como los
enterocitos o las células de la médula ósea presentes en especímenes jóvenes de la especie
canina. Alternativamente, algunos parvovirus requieren de la co-infección con otros virus, tales
como herpesvirus o adenovirus para lograr su replicación.
Estos virus poseen un amplio rango de animales hospedadores y sobreviven durante
mucho tiempo en el ambiente debido a la naturaleza estable de los viriones.
PAPOVAVIRIDAE

Género: Polyomavirus
Especie: virus del polioma del ratón.
Especie: virus SV40.
Ambos virus se utilizan como modelos para el estudio de la oncogenésis viral, debido a su capacidad de persistir integrado dentro del
ADN de la célula hospedadora.

Género: Papillomavirus (virus productores de verrugas)
Especie: papilomavirus humanos
de cuello uterino, ano y farínge).
Especie: papilomavirus bovino.
(Existen más de 70 tipos de virus y algunos están asociados al cáncer
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Especie: papilomavirus del conejo.
Especie: virus de la papilomatosis oral canina.
Características
Los viriones de los papovavirus (siglas pa: papiloma, po: polioma, va: vacuola) no poseen
envoltura (virus desnudo), son esféricos y con simetría icosaédrica. Los viriones poseen un
diámetro promedio de 45 nm (Polyomavirus) a 55 nm (Papillomavirus) (Figura 6).
PROTEÍNAS DE LA CÁPSIDE
ADN VIRAL circular
Figura 6. Estructura de los viriones de los papovavirus.
El genoma se compone de una molécula simple de ADN de doble cadena circular, de tan
sólo 5 kpb (Polyomavirus) a 8 kpb (Papillomavirus). El ADN genómico es infeccioso. La infección
es frecuentemente persistente y el genoma viral puede transportarse de una manera episomal o
integrado en el ADN de la célula hospedadora.
FAMILIA DE VIRUS ARN
RETROVIRIDAE

Género: Alpharetrovirus*
Especie: virus del sarcoma de Rous.
Especie: virus del carcinoma aviar.
Especie: virus del sarcoma aviar
Especie: virus de la leucosis aviar.
Especie: virus de la mieloblastosis aviar
Especie: virus de la necrosis esplénica del pato.
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
Género: Betaretrovirus*
Especie: virus del tumor mamario del ratón.
Especie: virus de la adenomatosis pulmonar ovina (virus Jaagsiekte)
*
Estos géneros virales solían agruparse dentro de la subfamilia Oncovirinae (onco: tumor) que incluyen virus generadores de tumores
(oncogénicos).

Género: Gammaretrovirus
Especie: virus de la leucemia felina (ViLeF).
Especie: virus del sarcoma felino.
Especie: virus porcino tipo C.
Especie: virus de la reticuloendoteliosis aviar.

Género: Deltaretrovirus
Especie: virus de la leucemia bovina.
Especie: virus linfotrófico-T humano tipo 1 y 2.

Género: Epsilonretrovirus
Los miembros de este Género son virus que afectan a peces.

Género: Lentivirus**
Especie: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH o SIDA) tipo 1 y 2.
Especie: virus de la inmunodeficiencia felina (VIF).
Especie: virus de la inmunodeficiencia bovina.
Especie: virus de la anemia infecciosa equina (AIE).
Especie: virus Maedi-Visna del ovino.
Especie: virus de la encefalitis-artritis caprina.
*
Este género viral solían agruparse dentro de la subfamilia Lentivirinae (lenti: lento) que incluyen virus responsables de diversas enfermedades
de curso lento, pero en ocasiones mortales.

Género: Spumavirus
Los miembros de este género son virus espumosos que representan un problema cuando contaminan los cultivos celulares pero
entre ellos no se conoce ninguno que sea patógeno.
Características
Los viriones de los retrovirus (retro: reversa) poseen envoltura, tienen un diámetro de 80 a
100 nm y una cápside de simetría icosaédrica de 60 nm de diámetro (Figura 7).
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Envoltura lipídica
Receptores de unión a proteínas
ARN lineal de sentido +
Proteínas de la Cápside
Figura 7. Estructura de los viriones de los retrovirus.
El genoma viral es diploide, formado por dos moléculas de ARN de cadena sencilla, lineal,
de sentido positivo, organizado como un dímero invertido. Cada monómero tiene un tamaño de 7
a 11 kpb.
La replicación de los retrovirus es un fenómeno único. El ciclo de replicación comprende
varias etapas comunes a todos los retrovirus. En una fase inicial, el virus se une a receptores
específicos (CD4) de la célula T, gracias a sus glicoproteínas de superficie. Las membranas de la
envoltura viral y la celular se fusionan y la cápside viral entra en la célula (Figura 8).
Las enzimas víricas asociadas al ARN genómico forman el complejo nucleoproteico
integrado por la enzima transcriptasa inversa (TI), proteasa (PR) e integrasa (IN), muy
importantes para la replicación del virus.
La síntesis de ADN vírico se produce en el citoplasma a través de la TI. La actividad de la
TI genera una copia de ADN (ADNc) a partir de la hebra de ARN genómico. Casi
simultáneamente emplea este ADNc como molde para sintetizar una segunda hebra de ADN,
convirtiendo el ARN genómico en ADN de doble cadena (ADNdc). La enzima IN realiza cortes en
los extremos de la mólecula de ADNdc y luego, conduce al ADNdc al núcleo celular. Una vez en
el núcleo la enzima IN integra el ADNdc al ADN genómico de la célula hospedadora, para luego
ser utilizado para la transcripción. Esta transcripción genera un ARN genómico de tamaño
completo y varios ARNm (Figura 8). Estos ARNm se traducen a proteínas específicas que son
procesadas por la enzima (PR) para generar las proteínas de la cápside viral. El ensamblaje de
los viriones se produce en el citoplasma de la célula T, conteniendo una copia del ARN genómico
replicado y las enzimas del complejo nucleoproteico. La nucleocápside formada sale de la célula
T mediante gemación de la membrana plasmática, obteniendo de esta manera la envoltura viral.
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Envoltura lipídica
Dos moléculas ARN lineal
Cápside
Receptor en la membrana celular
Célula
Hospedadora
Transcriptasa inversa
ADN transcripto
ARN genómico
ARN mensajeros
Figura 8. Replicación de los viriones de los retrovirus en una célula hospedadora.
REOVIRIDAE

Género: Orthoreovirus
Especie: reovirus humanos tipo 1, 2 y 3.
Especie: reovirus aviares.

Género: Orbivirus
Especie: virus de la lengua azul del ovino (tipo 1 a 25).
Especie: virus de la peste equina africana (tipo 1 a 9).
Especie: virus de la encefalosis equina (tipo 1 y 2).

Género: Rotavirus
Especie: rotavirus del grupo A. (Incluyen virus que generan procesos diarreicos en humanos y animales).
Especie: rotavirus del grupo B. (Incluyen virus de importancia patógena para humanos).
Especie: rotavirus del grupo C y E. (Incluyen virus de importancia patógena para los porcinos).
Especie: rotavirus del grupo D y F. (Incluyen virus de importancia patógena para los aves).

Género: Aquareovirus
Los miembros de este Género son virus que afectan a peces.
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Características
Los viriones de los reovirus (siglas r: respiratorio, e: entérico, o: orphan: huérfano) no
poseen envoltura (desnudos), tienen una apariencia esférica y un diámetro de 60 a 80 nm. Los
viriones tienen dos o tres cápsides proteicas que los recubren, cada una de simetría icosaédrica
(Figura 9). El tipo de cobertura que poseen diferencia a los virus integrantes de cada género.
Orbivirus
Orthoreovirus
Rotavirus
Figura 9. Estructura de los viriones de los reovirus. La cantidad y disposición de las capas
proteicas que conforman la cápside viral diferencia a los diferentes géneros que componen la
familia Reoviridae.
El genoma se compone de ARN lineal de doble cadena dividido en 10 a 12 segmentos. El
tamaño completo del genoma varía entre 16 a 27 kpb.
La replicación y el ensamblaje de los viriones suceden en el citoplasma de las células
hospedadoras. Este proceso se ha relacionado con la presencia de cuerpos de inclusión
intracitoplasmáticos del tipo granular o fibrilar. Los rotavirus y reovirus son transmitidos por
contacto directo (transmisión fecal-oral) e indirectamente a través de fómites, mientras que los
orbivirus son transmitidos por artrópodos (garrapatas, mosquitos, etc.).
ORDEN MONONEGAVIRALES
PARAMYXOVIRIDAE
 Subfamilia: Paramyxovirinae

Género: Respirovirus
Especie: virus de la parainfluenza humana tipo 1 y 3.
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Especie: virus de la parainfluenza bovina tipo 3.
Especie: virus de la parainfluenza del ratón (virus Sendai).

Género: Rubulavirus
Especie: virus de la parainfluenza humana tipo 2, 4a y 4b.
Especie: paramyxovirus aviar tipo 1 (Enfermedad de Newcastle).
Especie: paramyxovirus aviar tipo 2 (virus Yucaipa).
Especie: paramyxovirus aviar tipo 3, 4 y 5 (virus Kunitachi).
Especie: paramyxovirus porcino tipo 6, 7, 8 y 9 (virus La Piedad-Michoacan-
México).

Género: Morbillivirus
Especie: virus del sarampión humano.
Especie: virus distemper canino (Moquillo canino).
Especie: virus rinderpest bovino (Peste bovina).
Especie: virus de la peste de los pequeños rumiantes.
 Subfamilia: Pneumovirinae

Género: Pneumovirus
Especie: virus sincitial respiratorio humano.
Especie: virus sincitial respiratorio bovino.
Especie: virus de la neumonía del ratón.

Género: Metapneumovirus
Especie: virus de la rinotraqueítis del pavo.
Características
Los viriones de los paramyxovirus (para: similar a los orthomyxovirus, myxo: moco) son
pleomórficos (su forma varía entre esférica a filamentosa) de 150 a 300 nm de diámetro. Los
viriones son envueltos, cubiertos de largos peplómeros y con una nucleocápside de simetría
helicoidal similar a las espinas de un pez (Figura 10). La envoltura viral contiene dos
glicoproteínas: hemaglutinina (en la mayoría de las especies también posee actividad
neuraminidasa) y una proteína de fusión (Figura 10).
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Peplómeros (Hemaglutinina)
Proteínas de fusión (ligando)
Proteínas asociadas al
material genético viral
ARN lineal de sentido (-)
Proteínas de la Cápside
Envoltura lipídica
Figura 10. Estructura de los viriones de los paramyxovirus.
El genoma consiste de una cadena simple, lineal de ARN de sentido negativo, de 15-16
kpb.
La replicación viral sucede en el citoplasma de la célula y el ensamblaje se produce por
gemación del virión a través de la membrana celular. La transmisión del virus se produce
principalmente por aerosoles y gotas de las secreciones eliminadas por los animales. Sólo los
Morbillivirus pueden generar infecciones persistentes, algunos de ellos con consecuencias
clínicas al largo plazo (moquillo canino).
ORDEN MONONEGAVIRALES
RHABDOVIRIDAE

Género: Vesiculovirus
Especie: virus de la estomatitis vesicular de New Jersey.
Especie: virus de la estomatitis vesicular de Indiana (VSV-tipo 1).
Especie: virus Cocal (VSV-tipo 2).
Especie: virus Alagoas (VSV-tipo 3).
Especie: virus Maraba (VSV-tipo 4).
Especie: virus Chandipura.
Especie: virus Piry.
Especie: virus Isfahan.

Género: Lyssavirus
Especie: virus de la rabia.
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Especie: virus Mokola.
Especie: virus Duvenhage.
Especie: virus Lagos de los murciélagos.
Especie: virus europeo de los murciélagos tipo 1 y 2.
Especie: lyssavirus de los murciélagos australianos.

Género: Ephemerovirus
Especie: virus de la fiebre efímera bovina.
Especie: virus River Adelaide.
Especie: virus Berrimah.
Características
Los viriones de los rhabdovirus (rhabdos: bacilo) tienen forma de bala, de un tamaño
aproximado de 180 x 75 nm. Poseen una envoltura cubierta de grandes peplómeros. La
nucleocápside subyacente a ésta envoltura tiene forma cilíndrica y posee simetría del tipo
helicoidal (Figura 11).
Envoltura
lipídica
Proteínas de la
Matriz
Peplómeros de la
envoltura.
B
ARN
lineal de
sentido
(-)
Envoltura
lipídica
A
Ribonucleoproteínas
Proteínas
de la
Matriz
Figura 11. A Corte longitudinal del virión de un rhabdovirus. B. Corte transversal del virión de un
rhabdovirus.
El genoma consiste de ARN lineal de cadena sencilla, de sentido negativo con un tamaño
aproximado de 13-16 kpb.
La replicación viral sucede en el citoplasma de la célula hospedadora y el ensamblaje de
los viriones ocurre por gemación de la membrana plasmática (como es el caso de los
vesiculovirus) o de las membranas de organelas intracitoplasmáticas (como es el caso de los
lyssavirus). El virus de la rabia produce cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos muy
prominentes (corpúsculos de Negri) en las células infectadas. Los virus tienen un amplio rango de
hospedadores, en la mayoría el virus replica y son transmitidos por artrópodos. El virus de la rabia
es transmitido principalmente por mordedura del animal o humano rabioso.
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ORTHOMYXOVIRIDAE

Género: Influenzavirus A.
Incluye virus patógenos para el hombre, aves, caballos, cerdos, visón, focas y ballenas.

Género: Influenzavirus B.
Incluye virus sólo patógenos para el hombre, aves.

Género: Influenzavirus C.
Incluye virus que infectan al hombre y al cerdo, pero raramente ocasionan cuadros serios de enfermedad.
Características
Los viriones de los orthomyxovirus (ortho: directo; myxo: moco: aislado directamente
desde el moco) son pleomórficos (esféricos o filamentosos) de 80 a 120 nm de diámetro. Los
viriones poseen una envoltura cubierta de peplómeros con actividad hemaglutinina (H) o
neuraminidasa (N). De éstas proteínas de la envoltura deriva la denominación de las diversas
cepas de estos virus: por ejemplo H1N1. Poseen una nucleocápside de simetría helicoidal (Figura
12).
Peplómeros (Hemaglutinina - H)
Peplómeros (Neuraminidasa – N)
Nucleocápside Helicoidal con proteínas asociadas al
ARN lineal de sentido (-), segmentado.
Envoltura lipídica
Polimerasas
Proteínas de la Matriz (M)
Figura 12. Estructura de los viriones de los orthomyxovirus.
El genoma está formado por 7 (influenzavirus C) u 8 (influenzavirus A y B) moléculas de
ARN lineal, de cadena sencilla, con sentido negativo y de un tamaño total de 10 a 13,6 kpb.
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La replicación viral sucede tanto en el núcleo como en el citoplasma de la célula
hospedadora. El ensamblaje de los viriones sucede por gemación desde la membrana
citoplasmática. Los virus Influenza tipo A que infectan a humanos y otras especies de mamíferos
y aves pueden transmitirse entre las diferentes especies. Esto trae aparejado la posibilidad de
mutaciones y recombinación genética del virus en los diferentes hospedadores, lo que ha
generado la emergencia de nuevas cepas que producen grandes pandemias en la población
humana. La transmisión es muy efectiva a través de gotitas de las secreciones y aerosoles.
PICORNAVIRIDAE

Género: Enterovirus
Especie: poliovirus (tipo 1, 2 y 3) o virus de la poliomelitis.
Especie: coxsackievirus A1 a A22 y A24.
Especie: coxsackievirus B1 a B6.
Especie: echovirus humano.
Especie: enterovirus humano.
Especie: enterovirus porcino (tipo 1a 8).
Especie: enterovirus bovino (tipo 1a 7).
Especie: virus de la enfermedad vesicular porcina.

Género: Rhinovirus
Especie: rinovirus humanos.
Especie: rinovirus bovino.

Género: Hepatovirus
Especie: virus de la hepatitis A humana.

Género: Cardiovirus
Especie: virus de la encefalomiocarditis.

Género: Aphtovirus
Especie: virus de la fiebre aftosa (O, A, C, SAT 1 a 3, Asia 1).
Especie: rinovirus equino.
Características
Los viriones de los picornavirus (pico: micro; rna: sigla en inglés para el material genético
ARN) no poseen envoltura, tienen 27 nm de diámetro y poseen nucleocápsides con simetría
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icosaédrica. La estructura atómica de los virus representantes de todos los géneros ha sido
develada: los viriones están conformados por 60 copias de 4 proteínas que componen el
cápsomero de la cápside y por una sola copia de una proteína asociada al genoma (Figura 13).
PICORNAVIRUS
Polipéptidos que conforman cada uno de los 60
capsómero de la cápside viral. Cada capsómero está
formada por 4 proteínas virales (VP1. VP2, VP3 y VP4)
CÁPSIDE
Proteína
asociada
al
genoma
Cadena simple de
ARN lineal de
sentido (+)
Figura 13. Estructura de los viriones de los picornavirus.
El genoma está formado por una molécula lineal de ARN de cadena sencilla de sentido
positivo, con un tamaño de 7 a 8 kpb.
La replicación y ensamblaje de los viriones sucede en el citoplasma de la célula
hospedadora. El virus es liberado por lisis de la célula, la infección es generalmente aguda y
citolítica, pero pueden ocurrir infecciones persistentes con alguno de los virus de esta familia. La
transmisión es horizontal, principalmente a través de contacto directo, ciclo fecal-oral o mediante
su volatilización en el aire.
TOGAVIRIDAE

Género: Rubivirus
Especie: virus de la rubeola (virus que produce la rubeola humana).

Género: Alphavirus (virus transmitidos por artrópodos).
Especie: virus de la encefalitis equina del oeste (EEO).
Especie: virus de la encefalitis equina del este (EEE).
Especie: virus de la encefalitis equina venezolana (EEV).
Especie: virus Sindbis.
Características
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Los viriones de los togavirus (toga: capa) son envueltos, de forma esférica,
con un tamaño promedio de 70 nm de diámetro y una nucleocápside de simetría icosaédrica (50
nm de diámetro). Los viriones poseen peplómeros muy poco discernibles (Figura 14).
TOGAVIRUS
Glicoproteínas
Nucleocápside icosaédrica
ARN lineal de sentido
(+).
Envoltura lipídica
Figura 14. Estructura de los viriones de los togavirus.
El genoma se compone de una cadena sencilla de ARN lineal de sentido positivo, con un
tamaño de 9 a 12 kpb.
La replicación viral es intracitoplasmática e involucra la síntesis de un ARNm sub-genómico
a partir del cual se sintetizan las proteínas estructurales. El ensamblaje de los viriones sucede por
gemación desde la membrana citoplasmática de la célula hospedadora. Los alphavirus son
transmitidos entre los vertebrados por mosquitos y ciertos artrópodos hematófagos. La infección
celular en los vertebrados es aguda y citolítica, pero la infección en las células de los mosquitos
es persistente y no citolítica.
Antiguamente, el género Pestivirus se agrupaba dentro de la familia Togaviridae.
Recientemente se lo reclasificó en la familia Flaviviridae, junto a otros géneros virales importantes
desde el punto de vista veterinario.
FLAVIVIRIDAE

Género: Flavivirus
Especie: virus de la fiebre amarilla (virus que produce enfermedad en humanos).
Especie: virus del Dengue (virus que produce enfermedad en humanos).
Especie: virus del oeste del Nilo.
Especie: virus de la encefalitis de Saint Louis.
Especie: virus de la encefalitis japonesa.
Especie: virus de la encefalitis del Valle de Murray.
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
Género: Pestivirus
Especie: virus de la diarrea viral bovina (DVB).
Especie: virus del cólera porcino.
Especie: virus de la enfermedad de la frontera de los ovinos.

Género: Hepacivirus
Especie: virus de la hepatitis C.
Especie: virus de la hepatitis G.
Características
Los viriones de los flavivirus (flavus: amarillo) son envueltos, de perfil esférico y de 45 a 60
nm de diámetro. Los viriones poseen peplómeros delgados que no se distribuyen simétricamente.
La cápside viral es esférica y tiene simetría icosaédrica, pero su estructura es desconocida
(Figura 15).
Glicoproteínas
Glicoproteínas
Nucleocápside
icosaédrica
ARN lineal de
sentido (+)
Envoltura viral
Figura 15. Estructura de los viriones de los flavivirus.
El genoma está constituído por una molecula lineal de ARN de cadena sencilla y de sentido
positivo, de 9 a 12,5 kpb.
La replicación sucede en el citoplasma y el ensamblaje involucra las envolturas de las
membranas internas de la célula hospedadora. No se ha demostrado un verdadero proceso de
gemación para estos virus. La infección de las células de los vertebrados es citolítica, pero no
citolítica y persistente en las células de los artrópodos. Los flavivirus son transmitidos entre los
vertebrados por mosquitos y garrapatas; algunos virus tienen un rango limitado de hospedadores
vertebrados mientras que otros tienen una amplia distribución mundial. La infección con pestivirus
afecta a ciertos animales y son transmitidos por contacto directo e indirecto (por ejemplo: alimento
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contaminado con heces, orina o secreciones nasales). Todos los pestivirus son transmitidos
transplacentaria y congénitamente. El virus de la hepatits C humana es transmitido por contacto
estrecho, contacto sexual y por transfusiones de sangre.
BIBLIOGRAFÍA:

Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. (1999). Veterinary Virology. Third
Edition, Elsevier Ed., U.S.A. Traducción realizada por el Dr. Cs. Vet. Diego Grilli (Julio
2013).
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VIROLOGÍA
TEORICO Nº 4
Temario: Mecanismo de acción de los agentes esterilizantes. Efecto de agentes físico-químicos
sobre el virión. Detección e identificación de los virus. Empleo de distintos huéspedes para aislar
y caracterizar virus. Ensayo de virus: a) físico-químico b) infectividad. Cultivos celulares: cultivo
celular primario, cepas diploides y líneas celulares continuas. Infección de los cultivos celulares.
Efecto citopático. Formación de placas. Inhibición metabólica. Hemoadsorción. Hemoaglutinación.
Definiciones importantes adaptadas a virología
Desinfección: hace referencia al método de destrucción de los virus de las superficies
contaminadas mediante agentes químicos (productos desinfectantes) o físicos (calor, luz UV) con
el fin de disminuir al mínimo el número de partículas virales infectantes en el ambiente.
Desinfectantes: productos químicos (hipoclorito de sodio, formaldehído, compuestos de amonio
cuaternario, etc) o físicos (calor seco, calor húmedo, luz UV) utilizados para destruir virus desde
objetos inanimados, no aplicables a tejidos vivos debido a su naturaleza tóxica.
Esterilización: método de eliminación completa de todas las partículas virales contenidos en un
objeto o área específica, de manera de interrumpir completamente el ciclo de transmisión de un
agente viral. La acción esterilizante suele lograrse sólo con temperaturas extremas (100 ºC en
adelante), por lo que su uso se reserva para aquellos materiales termoresistentes.
Antisepsia: método de eliminación parcial o completa de virus, aplicado exclusivamente a tejidos
vivos (piel, principalmente) para reducir la posibilidad de transmisión del agente viral. Los
antisépticos más comunes son: alcohol, iodo, clorhexidina, etc. Su acción sobre los agentes
virales se debe a su acción sobre las proteínas o lípidos de la estructura viral.
Decontaminación: método de eliminación de partículas virales sobre objetos inanimados, previo
al lavado con desinfectantes.
Control de las enfermedades virales a través de la higiene y saneamiento
La cría del ganado en condiciones intensivas conduce a la acumulación local de heces,
orina, pelos, plumas, etc.; los cuales pueden estar contaminados con virus. Para los virus
“termoestables”, la acumulación de tales contaminantes proveen de una fuente activa de virus
para los animales nuevos que se introducen en el sistema productivo. Para evitar esto, los
criadores de ganado porcino, bovino y aves (principales producciones que se manejan bajo
condiciones intensivas); operan con el sistema de manejo “todo adentro, todo afuera”. Este
sistema consiste en vaciar, limpiar y desinfectar las instalaciones donde estaban alojados los
animales enfermos, antes de reponer el plantel de animales.
Las maniobras de higiene y desinfección son las más efectivas en el control de las
infecciones fecales-orales, pero son menos efectivas en la incidencia de las infecciones
respiratorias. En general, los intentos por alcanzar la “limpieza del aire” han fallado y las
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infecciones respiratorias constituyen el grupo más importante de enfermedades que afectan a los
animales en los sistemas intensivos. Las infecciones respiratorias virales son mucho más
comunes en la actualidad debido al incremento de las poblaciones animales en muchos de los
sistemas de producción animal. Por ejemplo, las instalaciones típicas para la cría de pollos
operan como un ecosistema simple, compuesto por miles a decenas de miles de aves, cuyo
equilibrio sanitario puede afectarse drásticamente al introducir el virus de la influenza aviar por el
ingreso de aves silvestres infectadas en dicha instalación.
Infecciones nosocomiales
Las infecciones nosocomiales son menos comunes en los sistemas de producción animal,
debido al tipo de manejo veterinario al que se someten las especies productoras de alimento. Sin
embargo, puede ser algo muy común en la práctica veterinaria de los animales de compañía
(caninos, felinos, etc.). La modalidad de atender pacientes con un acuerdo previo, mediante un
“turno” o cita médica, reduce el riesgo de contagio de las mascotas en las salas de espera. En el
caso de no poder aplicarse este sistema, la indicación que el propietario de la mascota
permanezca con ella en su auto hasta que el veterinario lo pueda atender, reduce el stress de los
animales previo a la consulta médica y disminuye el riesgo de transmisión de enfermedades
infecciosas en la clínica veterinaria. Además, los veterinarios de animales de compañía deberían
exigir que todos sus pacientes estén correctamente inmunizados (vacunados). Las clínicas
veterinarias deberían ser diseñadas para garantizar una fácil limpieza: provistas de paredes
azulejadas, impermeables al agua, que permitan un drenaje adecuado del agua de limpieza y de
mobiliarios de fácil remoción para asegurar la limpieza de “cada rincón” de la clínica. Además,
deberían poseer una eficiente ventilación y aire acondicionado, no sólo para minimizar los olores,
sino también para disminuir la transmisión de virus mediante aerosoles. Es esencial asegurar la
decontaminación y el lavado frecuente de los materiales y equipamientos contaminados
(termómetros, estetoscopios, camillas, etc.).
Agentes físico-químicos y su efecto en los virus
Diversos agentes físicos y químicos pueden actuar sobre los constituyentes del virión
produciendo su inactivación. En general los virus son más sensibles que las bacterias y los
hongos a la acción de los agentes fisicoquímicos.
El conocimiento de la sensibilidad de los virus a las condiciones ambientales es importante
para determinar la viabilidad de muestras clínicas para diagnóstico virológico, para la
conservación de vacunas virales a virus vivo y para estimar la infectividad a temperatura
ambiente. Es fundamental conocer la viabilidad de los virus para poder lograr una inactivación
adecuada de aquellos materiales contaminados que necesitan desinfección o para efectuar el
tratamiento indicado para un correcto abastecimiento de agua potable, etc. Entre los inactivantes
físico-químicos pueden mencionarse la temperatura, la luz UV, el pH, el medio iónico y los
solventes de lípidos.
Temperatura
La mayoría de los virus son lábiles al calor. En general es suficiente una hora a 55-60 ºC
para inactivar a la mayoría de los virus por desnaturalización de las proteínas de la cápside, lo
que impide la adsorción y la decapsidación. Constituyen excepciones el virus de la hepatitis B y
algunos adenovirus, que resisten esa temperatura.
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Como regla general, la vida media de la mayoría de los virus puede ser medida en
segundos a 60ºC, en minutos a 37ºC, en horas a 4ºC, en días a -20ºC, en meses a -70ºC y en
años a -196ºC.
La esterilización por calor seco en estufa o por calor húmedo en autoclave, destruye a
todos los virus, incluyendo a los más resistentes como el de la hepatitis B. por esta razón, la
esterilización en estufa o autoclaves es el procedimiento de elección.
La temperatura ambiente, destruye muchos virus aunque el tiempo requerido para la
inactivación depende de las características de la familia. Por ejemplo el virus de la hepatitis B, los
parvovirus y los poxvirus pueden conservar su infectividad a temperatura ambiente durante
meses. En cambio, otros como los orthomixovirus (influenza) o los paramixovirus (sarampión) se
inactivan en pocas horas.
Por estas razones es fundamental que las muestras clínicas para diagnóstico virológico por
aislamiento sean conservadas a la temperatura adecuada, es decir 4 ºC en hielo granizado y
enviadas al laboratorio en el menor tiempo posible. Es importante evitar la congelación ya que
muchos virus, en especial aquellos con envoltura son muy sensibles a la congelación y
descongelación. Solamente deberán congelarse aquellas muestras que necesiten ser
transportadas largas distancias y que no permitirán el mantenimiento del hielo.
Otro procedimiento para preservar la infectividad es la liofilización, que es un procedimiento
de desecación al vacío, que se utiliza habitualmente para la conservación de vacunas virales.
pH y medio iónico
La mayoría de los virus se conservan mejor en medios isotónicos y a pH fisiológico,
aunque algunos virus pueden soportar un amplio rango de pH y fuerzas iónicas. Por ejemplo, los
enterovirus resisten el pH ácido del estómago y por esa razón pueden penetrar por vía digestiva.
En la preparación de vacunas a virus vivo atenuado es imprescindible la preservación de la
infectividad. Por ello se adicionan ciertas sales, como cloruro de magnesio, que aumentan la
resistencia a la inactivación térmica.
Radiaciones
Las radiaciones UV y las ionizantes (rayos X y Gamma) al producir alteraciones en el
genoma son capaces de inactivar los virus. Para inactivar algunas vacunas se utiliza luz UV, por
ejemplo la vacuna antirrábica de uso humano en Argentina. Las radiaciones ionizantes se utilizan
para esterilizar materiales plásticos de uso médico o de laboratorio. La luz UV se utiliza para
esterilizar áreas de trabajo.
Solventes de lípidos
La presencia o no de envoltura determina la sensibilidad de los virus a los solventes
lipídicos. Todos los virus con envoltura se inactivan fácilmente con solventes de lípidos como éter,
cloroformo, sales biliares o detergentes aniónicos. Por el contrario los virus carentes de envoltura
son resistentes a estos agentes y por ello son infectivos por vía digestiva, ya que no son sensibles
a las sales biliares.
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Desinfección y desinfectantes
Los desinfectantes son agentes químicos formulados para utilizarse sobre superficies
inanimadas, en contraste con los antisépticos, los cuales son agentes químicos formulados para
su uso sobre la piel y/o mucosas. La desinfección de los equipamientos, materiales e incluso
instalaciones juega un rol fundamental en el control de las enfermedades virales que afectan al
ganado.
Los virus de las diferentes familias varían enormemente en su resistencia a los agentes
desinfectantes, siendo los virus envueltos mucho más sensibles a la acción de los agentes
desinfectantes que los virus desnudos. Sin embargo, muchos de los agentes desinfectantes
formulados en los últimos años, inactivan rápidamente a la mayoría de los virus. Su acción
efectiva está influenciada por el acceso del producto a las partículas virales: los virus atrapados
en varias capas de moco o materia fecal no son inactivados tan fácilmente. Los requerimientos
estándares impuestos por la Agencia de Protección Ambiental de los EEUU especifican que al
evaluar la acción desinfectante de un determinado producto, los virus deben ser resuspendidos
en suero al 5% y secados sobre una superficie inanimada antes de evaluar la eficiencia de ese
desinfectante. Se presentan serias dificultades cuando las superficies no pueden ser
rigurosamente higienizadas debido a que poseen grietas o hendiduras que no facilitan la
desinfección de un determinado material o superficie. Por ejemplo, los corrales confeccionados de
madera para el alojamiento de animales de producción.
La Tabla 1 muestra algunos de los desinfectantes más comunes y sus potenciales usos.
Tabla 1. Desinfectantes utilizados para la inactivación de virus.
Desinfectante
Usos
Consideraciones
Hipoclorito de sodio
(Lavandina)
Desinfección de instalaciones y utensilios
e incluso agua de bebida.
Altamente efectivo, pero puede inactivarse
frente a la presencia de grandes cantidades
de proteínas contaminantes (heces, moco,
pelos, células descamadas o exfoliadas). Son
baratos, no tóxicos (utilizados en las
concentraciones adecuadas) y de rápida
acción.
Detergentes
yodóforos (Betadine)
Mismo uso que el hipoclorito de sodio
Su acción se basa en la lenta
iodo
y
en
su
acción
(desnaturalización de proteínas
afecta en menor medida que el
sodio por la alta concentración
Son más caros.
Formaldehído
(Formalina)
Ropa de trabajo, superficie de materiales
utilizados como cama de los corrales y en
la forma de vapor se utiliza para la
esterilización
de
superficie
de
instrumentales, equipamientos, utensilios,
etc.
Posee un bajo poder de penetración, salvo en
su forma de vapor. Útil para realizar
desinfección luego del lavado con otros
desinfectantes. Irritante para mucosas.
Posibilidad de reacciones de hipersensibilidad
por algunos usuarios y animales.
Derivados del fenol
(Dettol)
Se utiliza en una dilución al 2,5% en agua
para la desinfección de manos, caniles,
jaulas,
superficies
de
mobiliarios
utilizados en los hospitales o clínicas
veterinarias.
Su eficacia depende de la temperatura y
concentración a la que se lo utilice. Puede
inactivarse frente a la presencia de grandes
cantidades de proteínas contaminantes.
liberación del
detergente
y lípidos). Se
hipoclorito de
de proteínas.
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Clorhexidina (Fada,
Laclorhex)
Se utiliza para la desinfección de muchos
tipos de materiales, caniles, jaulas,
superficies de mobiliarios utilizados en los
hospitales o clínicas veterinarias.
Su eficacia no se altera frente a la presencia
de fluidos corporales, jabón, compuestos
orgánicos. Son más caros.
Dióxido de etileno
Se utiliza para la desinfección de
accesorios médicos sensibles al calor,
aislantes plásticos, etc.
Es tóxico e inflamable, salvo cuando se lo
combina al 10% con CO2 al 90%, el cual se
encuentra disponible comercialmente como
gas comprimido.
Glutaraldehído (Cidex)
Se utiliza para la esterilización fría de
instrumentos con lentes (microscopios,
equipamiento de oftalmología)
Se utiliza como viricida en solución al 2% con
bicarbonato de sodio. Su acción se desarrolla
en 10 minutos a un pH de 7,5 a 8,5. Son
caros.
Alcoholes (Alcohol
Etílico, Propanol,
Metanol)
Se utiliza para la desinfección de manos y
termómetros.
Tiene acción viricida sólo en altas
concentraciones (70 u 80%). El alcohol etílico
es preferido frente al metanol o el propanol.
No son tóxicos.
Compuestos de
amonio cuaternario
El más utilizado es el Cloruro de
Benzalconio en su presentación como
antiséptico para la higiene de heridas.
No tiene una efectiva acción viricida frente a
la mayoría de los virus. Puede inactivarse
frente a la presencia de grandes cantidades
de proteínas contaminantes.
Los primeros 5 compuestos enumerados en la Tabla 1 pueden utilizarse para la
desinfección de las instalaciones de los animales de producción, aunque algunos suelen ser
demasiado caros para utilizarlos a gran escala. Los últimos 4 compuestos son más utilizados en
el consultorio veterinario, hospitales o laboratorios. La lavandina (Hipoclorito de Sodio al 2%) es
muy económica y se utiliza tradicionalmente como agente desinfectante a gran escala en
establecimientos de producción animal (granjas, tambos, rodeos, haras, etc) para el control del
virus de la Fiebre Aftosa y otras enfermedades virales. El uso de agua caliente y detergente así
como la esterilización por vapor también son agentes utilizados con éxito para la decontaminación
y desinfección de las instalaciones ganaderas.
Detección e identificación de los virus
Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades Virales
Las pruebas de laboratorio destinadas al diagnóstico específico de enfermedades virales
pueden ser de 2 tipos:
(1) Aquellas pruebas directas que evidencian la presencia del virus infeccioso, el antígeno viral o
el ácido nucleico viral.
(2) Aquellas pruebas indirectas que demuestran la presencia de anticuerpos dirigidos contra
antígenos virales en el animal enfermo o con riesgo de infección.
Pruebas directas
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Son aquellos que detectan:
1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral en cultivo celular, huevos embrionados o
animales de laboratorio).
2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanálisis o inmunoensayos enzimáticos (EIA), Test de Aglutinación.
3. La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).
4. El virus como partícula viral (microscopía electrónica).
Mientras que la mayoría de las pruebas de laboratorio tradicionales (cultivo celular,
inoculación en huevos embrionados y/o en animales de laboratorio) siguen siendo ampliamente
utilizadas, muchas de estas pruebas no se ajustan al manejo clínico de las enfermedades virales,
ya que los resultados están disponibles luego de varios días (o incluso semanas). El principal
objetivo para el desarrollo de nuevas pruebas diagnósticas en virología ha sido el diseño de
nuevos métodos de laboratorio que permitan un resultado definitivo en menos de 24 horas o
incluso durante el examen clínico inicial del animal. Los mejores métodos cumplen con al menos
5 pre-requisitos: velocidad, simplicidad, sensibilidad, especificidad y bajo costo. Para el
diagnóstico de laboratorio de la mayoría de las infecciones virales existen: 1) pruebas
diagnósticas estandarizadas y reactivos de buena calidad disponibles en el mercado, 2) ensayos
simplificados y que aseguran un bajo costo de los reactivos, 3) pruebas diagnósticas con
instrumentos que permiten el análisis automatizado de las muestras y 4) análisis computarizado e
impresión de los resultados que facilitan su interpretación, así como también facilitan la
presentación de informes, el mantenimiento de registros y la facturación.
Este avance en el desarrollo de pruebas diagnósticas más rápidas y eficientes ha sido
menos espectacular en medicina veterinaria que en medicina humana (debido al retorno
económico de la inversión y al alcance de las pruebas requeridas para cada especie); sin
embargo, se han desarrollado un gran número de kits diagnósticos, disponibles comercialmente y
de ejecución rápida, segura y económica para utilizarse en la mayoría de las especies animales.
Estas pruebas de laboratorio pueden detectar el antígeno viral, permitiendo el diagnóstico a partir
de una sola muestra recuperada directamente del animal durante la fase aguda de la enfermedad
viral o pueden detectar la presencia de anticuerpos. Los inmunoensayos enzimáticos en fase
sólida (EIA’s) han revolucionado el diagnóstico virológico veterinario debido a su capacidad de
detectar antígenos virales o anticuerpos. Para el diagnóstico de laboratorio de las enfermedades
virales está siendo ampliamente utilizada la Reacción en Cadena de la Polimerasa (siglas en
inglés: PCR), que permite la detección del ácido nucleico viral a partir de muestras clínicas, como
una de las pruebas alternativas de rápida ejecución.
El diagnóstico de una enfermedad viral es un gran desafío. Más de 200 virus individuales,
pertenecientes a 25 familias, causan infecciones virales de importancia veterinaria en las 8
principales especies de animales domésticos (vacas, ovejas, cabras, cerdos, caballos, perros,
gatos y pollos). Si son tenidos en cuenta las cepas, subtipos y variantes de los virus y si el rango
de hospedadores se amplía a pavos, patos, animales de laboratorio y especies silvestres,
entonces el número de virus conocidos se incrementa enormemente. Según el informe de los
centros de referencia y de las colecciones de cultivo existen más de 30.000 variedades de virus.
Por lo tanto, no es sorprendente que ningún laboratorio pueda tener la experiencia y recursos
necesarios para la identificación de todos los virus existentes. Por esta razón, los laboratorios de
diagnóstico veterinario tienden a la especialización, es decir se centran en el diagnóstico de las
enfermedades virales que afectan a los animales de producción o de compañía, a las especies de
laboratorio o las aves o al diagnóstico de enfermedades causas por virus exóticos. Dentro de
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estos laboratorios especializados existe un considerable esfuerzo para el desarrollo de métodos
de diagnóstico rápidos que no involucren necesariamente el aislamiento viral para llegar al
diagnóstico, debido a que este tipo de metodología es cara, demora mucho tiempo y suele no ser
sensible para la mayoría de las enfermedades virales.
Aislamiento viral: prueba directa para el diagnóstico virológico
Cultivo celular
El cultivo de células se desarrolló a comienzos del siglo XX mediante el cultivo de órganos
completos. Luego, se avanzó en el desarrollo de métodos que permitieron el cultivo de células
individuales, ya sea en cultivos celulares primarios (células somáticas obtenidas de un animal
de experimentación o de un paciente, las cuales pueden ser mantenidas en cultivo por un corto
periodo de tiempo) o en líneas celulares inmortalizadas (aquellas que bajo las condiciones
necesarias, continúan creciendo de manera indefinida).
En 1952, Renato Dulbecco, fue el primero en cuantificar virus animales con precisión,
utilizando un ensayo en placa. En esta técnica, se utilizan diluciones del virus para infectar una
monocapa de células cultivadas, que luego se cubren con agar blando para restringir la difusión
del virus, lo que resulta en una muerte celular localizada y genera la aparición de “placas” o
“agujeros” luego de teñir la monocapa (Figura 1).
Diluciones
seriales del virus
Las diluciones son vertidas en
las placas de cultivo que
contienen
las
células
susceptibles.
Luego de la adherencia del virus
a las células, el cultivo se cubre
de un medio semi-sólido el cual
restringe la difusión de las
partículas virales.
La difusión restringida del virus
hacia las células resulta en una
destrucción localizada y visible de
las
células
en
monocapa,
conocida como “placas”.
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Figura 1. Los ensayos en placa se llevan a cabo mediante la aplicación de una dilución adecuada de una
preparación del virus a una monocapa confluente o semi-confluente de células susceptibles. Después de
permitir la fijación del virus y la infección de las células, el medio líquido se sustituye por un medio de
cultivo semisólido que contiene un polímero (agarosa o carboximetilcelulosa), que restringe la difusión de
las partículas virales a las células infectadas. Sólo puede ocurrir la propagación directa célula a célula, lo
que resulta en la destrucción localizada de la monocapa. Después de un período adecuado, el medio se
elimina y por lo general las células son teñidas para poder visualizar los agujeros (“placas”) en la
monocapa celular (véase Figura 4.B, más adelante). Cada placa de cultivo refleja la infección como una
unidad formadora de placa única (ufp).
El recuento del número de “placas” determina directamente el número de partículas virales
infecciosas aplicadas sobre la placa de cultivo.
Tipos de cultivos
Existen tres tipos diferentes de cultivo de los tejidos animales:

cultivo de órganos.

explantes primarios.

cultivos celulares.
En la figura 2 se ilustran los tres tipos de cultivos y sus diferentes modos de cultivo.
A
B
C
A
Figura 2. Tipos de cultivos. A. Cultivo de órganos sobre un disco de filtro o sobre una rejilla de acero
inoxidable en el medio de cultivo. B. Cultivo de explantes en frasco y representación del crecimiento
periférico. C. Desagregación enzimática y mecánica para generar una suspensión celular que formará una
monocapa. Fuente: Freshney y Vunjak-Novakovic, 2006.
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1. Cultivo de órganos: Implica que la arquitectura característica del tejido in vivo se mantenga al
menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al
que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general
esférica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una
buena réplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagación pues el
crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos
celulares embrionarios.
2. Explantes primarios: son fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una
superficie y en la que proliferan solamente las células de la periferia del explante.
3. Cultivo celular: Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos.
La suspensión celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensión en el
medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagación, aumentando notablemente la masa
celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como característica negativa se pierde la
heterogeneidad celular de partida, la población se hace uniforme y homogénea. En la actualidad,
los cultivos celulares son los más empleados fundamentalmente por la posibilidad de
propagación, así como por las ventajas en la cuantificación, caracterización y repetitividad de las
muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotípicas se realizan desde hace
unos años cultivos mixtos con importantes éxitos.
Tipos de cultivos celulares
Las líneas celulares se pueden dividir en dos tipos principales: adherentes (células en
monocapa) y no adherentes (células en suspensión).
Las células adherentes se fijan al material plástico de un frasco o placa y por tanto tienen
que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas. Las células adherentes derivan de
órganos como el músculo, hígado, células nerviosas, riñón, etc.
Las células en suspensión normalmente no se fijan a la superficie del recipiente de
cultivo. Las características de las células en cultivo (in vitro) suelen depender de su procedencia
en el animal (in vivo). Por ejemplo, prácticamente todos los cultivos en suspensión derivan de
células inmunitarias o de precursores de las mismas; in vivo circulan por el torrente sanguíneo y
no tienden a fijarse (como los linfocitos B y T).
Las células que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensión, suelen clasificarse
en primarias, inmortales o transformadas.
Las células primarias son aquellas recientemente aisladas y por lo general tienen una
duración limitada en cultivo.
Las células inmortales y las transformadas (también llamadas líneas celulares
continuas) presentan la propiedad de crecer de forma ilimitada en el cultivo. Las líneas celulares
transformadas son células que derivan de tumores o que han sido manipuladas de algún modo y
presentan un nuevo fenotipo transformado.
Aislamiento viral en cultivos celulares
A pesar de la enorme explosión de nuevas técnicas diagnósticas conocidas como “de
resultados en el mismo día”, que se basan en la demostración del virus, antígeno viral o ácido
nucleico viral a partir de muestras tomadas directamente del animal; el aislamiento viral en
cultivos celulares sigue siendo el método más sensible. Teóricamente, tan sólo un virión viable
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presente en una muestra puede ser recuperado y amplificado en miles de copias en los cultivos
celulares. De esta manera se genera el material viral necesario para ser caracterizado
antigénicamente. Si bien el cultivo celular sigue siendo el método de elección para el aislamiento
viral, existe demasiada expectativa sobre los alcances de esta técnica en el diagnóstico de las
enfermedades virales. Por otra parte, es la única técnica que puede detectar e identificar un virus
totalmente desconocido e incluso permitir el descubrimiento de un nuevo agente viral. En
consecuencia, aquellos laboratorios equipados para el diagnóstico virológico rápido también
inoculan cultivos celulares en el intento de aislar virus. El cultivo es el único método para generar
la suficiente cantidad de virus vivos que permita caracterizar la variabilidad antigénica de los virus
productores de enfermedades en los animales. Además, los cultivos celulares permiten la
producción de una gran cantidad de virus que generan antígenos virales utilizados en las pruebas
diagnósticas o en la producción de anticuerpos monoclonales para su distribución a otros
laboratorios.
Métodos de cultivo celular
La elección de un cultivo celular óptimo que permita el aislamiento primario de un virus de
naturaleza desconocida, a partir de muestras clínicas, es altamente empírica. Las células
primarias, derivadas de los tejidos fetales de la misma especie, proveen el sustrato más
importante de los cultivos celulares para lograr el aislamiento del virus. Las líneas celulares
continuas derivadas de especies homologas son, en la mayoría de los casos, una buena opción
para el aislamiento viral. A menudo, la naturaleza de la enfermedad que padece el animal del que
se obtuvo la muestra sugerirá qué tipo de virus puede ser aislado, y en tales casos, puede ser
elegido el cultivo celular óptimo para ese virus, en paralelo con un segundo tipo de cultivo celular
de amplio espectro. Las líneas celulares ofrecen algunas ventajas y se encuentran disponibles
para la mayoría de los mamíferos domésticos.
El cultivo de tipos especiales de células u órganos es utilizado para algunos virus en
particular. Por ejemplo, los betaherpesvirus y gammaherpesvirus pueden ser recuperados de
cultivos en monocapa propagados directamente desde los tejidos recolectados del animal
enfermo. Algunos coronavirus y rinovirus no crecen bien en cultivos celulares en monocapa y
necesitan ser cultivados en cultivos explantados, es decir, en pequeños cubos de tejido con el
epitelio intacto, tomado de la tráquea o del tracto digestivo. El co-cultivo utilizando tejidos
explantados y células en monocapa puede utilizarse para asegurar el aislamiento de virus que
realizan latencia en sus hospedadores (por ejemplo, los herpesvirus a partir del ganglio del nervio
trigémino). Los cultivos de células de artrópodos son frecuentemente utilizados como un sistema
paralelo para aislar algunos arbovirus.
Inoculación y mantenimiento del cultivo celular
Los cultivos celulares en monocapa se realizan en recipientes plásticos (frascos) con tapa
a rosca (Figura 3).
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Figura 3. Frascos utilizados en el cultivo celular en monocapa.
Las placas multiwell (Figura 4.A) son muy convenientes para las pruebas de neutralización
sérica, donde un gran número de cultivos son requeridos y se necesita economizar en medios,
equipamiento y espacio. Sin embargo, este tipo de placas aumenta el riesgo de contaminaciones
cruzadas cuando se utilizan para el aislamiento viral.
A
B
Figura 4. A. Placas multiwell utilizadas en pruebas de neutralización sérica. B. Placas multiwell utilizadas
para evaluar efecto citopático en placa.
Los cultivos inoculados son incubados comúnmente a 37 ºC, aunque la temperatura
corporal normal de la mayoría de las especies de animales domésticos varía por encima o por
debajo de 37 ºC. En el caso de los virus que afectan al tracto respiratorio superior, tales como el
virus Influenza, rinovirus y coronavirus, se cultivan a 33 ºC (temperatura de la mucosa nasal). Los
cultivos celulares deben ser inspeccionados diariamente para evaluar los efectos citopáticos de
los virus inoculados (Figura 5).
Reconocimiento del desarrollo viral en los cultivos celulares
Efecto citopático: Se denomina efecto citopático a los cambios bioquímicos y moleculares,
morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de
replicación viral y observados sólo en algunos tipos de virus. A lo largo del ciclo viral intracelular,
desde que un virus reconoce a una célula y penetra en su interior hasta la lisis o muerte celular,
prácticamente todos los componentes y organelas celulares sufren alteraciones drásticas a nivel
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molecular, muchas de las cuales tienen una manifestación morfológica. La mayor parte de las
observaciones del efecto citopático se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que
se aprecia:

pérdida de adherencia al sustrato,

inhibición por contacto,

agregación celular,

redondeamiento celular,

formación de sincitios,

cuerpos de inclusión citosólicos,

transformación celular,

lisis celular, etc.
Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran
diversidad de manifestaciones (Figura 5).
A
B
Figura 5. Efecto citopático del virus del sarampión sobre células B95a. A. Cultivo de células no infectadas
con el virus (cultivo control). B. Cultivo de células infectadas con el virus que muestran el efecto citopático.
Algunos virus muestran un efecto citopático detectable en uno o dos días, tales como la
mayoría de los picornavirus y los alphaherpesvirus; mientras que otros virus son muy lentos en
mostrar efecto citopático en los cultivos (1 a 4 semanas) y si lo hacen este efecto puede no ser
demasiado obvio. Al transcurrir tanto tiempo, las células del cultivo celular sin inocular (cultivo
control) comienzan a mostrar una degeneración inespecífica que puede simular un efecto
citopático. En estos casos, las células y el fluido sobrenadante del cultivo celular infectado son
inoculados en un nuevo cultivo celular en monocapa, donde al cabo de un tiempo breve aparece
el efecto citopático.
Cuando los cambios que indican replicación viral son evidentes, se puede continuar con el
diagnóstico siguiendo diferentes alternativas. Si el efecto citopático es lo suficientemente
característico (puede observarse sin la necesidad de teñir las células del cultivo) se puede realizar
un diagnóstico presuntivo de infección viral. Los virus que no poseen un efecto citopático
demasiado evidente, pueden reconocerse debido a sus propiedades “hemoadsorventes”. La
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mayoría de los virus que generan aglutinación de glóbulos rojos pueden someterse a pruebas de
hemoaglutinación que sirven para evidenciar esta propiedad. Por ejemplo, los paramyxovirus son
reconocidos de esta manera. Alternativamente puede recurrirse a la fijación y tinción de las
células en monocapa del cultivo infectado y examinarlas microscópicamente para evaluar el
efecto citopático. Las células teñidas con hematoxilina y eosina pueden mostrar la formación de
cuerpos de inclusión o de células multinucleadas gigantes (sincitios), que si están presentes son
evidencia suficiente para asignar al virus a una familia. Tales cultivos también pueden ser teñidos
con anticuerpos fluorescentes dirigidos específicamente contra un antígeno viral según el tipo de
virus que sospechamos. Además, las células de los cultivos infectados pueden examinarse por
microscopía electrónica.
La clave del éxito en el diagnóstico de laboratorio es aproximarse a un punto en el cual
hemos reunido la suficiente información para confirmar el diagnostico.
Identificación de los aislamientos virales: caracterización antigénica
Un virus puede ser clasificado provisoriamente en una familia en particular y en algunos
casos puede asignarse a un género o especie según los hallazgos clínicos en el animal a partir
del cual se aisló. Además puede clasificarse taxonómicamente según el tipo celular empleado en
el cultivo que permitió su aislamiento y según los resultados observados durante el crecimiento
del virus en dicho cultivo (efecto citopático, hemoadsorción, formación de cuerpos de inclusión,
etc.). Sin embargo, la identificación y clasificación definitiva del virus aislado requiere de la
caracterización antigénica. Utilizando el virus aislado como antígeno se lo evalúa frente a
diferentes anticuerpos, por ejemplo en un inmunoensayo enzimático, para clasificar al virus como
perteneciente a una determinada familia o género (por ejemplo, Adenoviridae). Si se quiere
identificar la especie viral (por ejemplo, virus de la hepatitis infecciosa canina) se utilizan diversos
procedimientos serológicos (los cuales emplean anticuerpos monoclonales), tales como la
neutralización viral o la inhibición de la hemoaglutinación.
Esta aproximación secuencial es aplicable sólo para las familias de virus que comparten un
antígeno familiar común. La elección de la técnica inmunológica varía enormemente. Cada
laboratorio conoce su propio protocolo de caracterización viral basado en la sensibilidad,
especificidad, reproducibilidad, velocidad, conveniencia y costos de las técnicas inmunológicas
utilizadas. Para las enfermedades virales de importancia económica a nivel nacional o
internacional es común que la clasificación e identificación viral se realice según un protocolo de
pruebas de laboratorio especificas para un virus en particular.
Una de las formas más sencillas de identificar un virus recientemente aislado es mediante
la tinción con anticuerpos fluorescentes de las células en monocapa infectadas (Figura 6). Esta
técnica (denominada: inmunofluorescencia directa - IFD), puede resolver de manera definitiva y
en el transcurso de poco más de una hora, la incógnita de clasificación e identificación de un
determinado virus.
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Figura 6. Inmunofluorescencia directa (IFD) Se basa en las propiedades de los fluorocromos. Los
mismos son moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud de onda.
La IFD permite identificar la presencia de partículas virales presentes en las células de la monocapa
infectada mediante el uso de anticuerpos marcados con un fluorocromo como el isotiocianato de
fluoresceína. Se utilizan en el diagnóstico de enfermedades virales como la rabia ciudadana y silvestre,
rinotraqueítis infecciosas bovina, diarrea viral bovina y peste porcina clásica.
La mayoría de las pruebas inmunológicas se aplican a la identificación de viriones y de
antígenos solubles presentes en el sobrenadante de los cultivos celulares. Los inmunoensayos
enzimáticos (o técnicas inmunocitoquímicas) son, actualmente, las técnicas más comúnmente
utilizadas (Figura 7).
SUSTRATO
SUSTRATO
SUSTRATO
ANTICUERPO
PRIMARIO
CONJUGADO
CON UNA
ENZIMA
ANTICUERPO
SECUNDARIO
CONJUGADO
CON UNA ENZIMA
ANTICUERPO
PRIMARIO
ANTICUERPO
anti-ANTIGENO
ELISA directo
1
ELISA indirecto
2
ELISA sandwich
3
Figura 7. Técnicas inmunocitoquímicas (o EIA`s). Son métodos de marcaje para detectar los
anticuerpos unidos específicamente a una molécula viral (antígeno) presente en las células del cultivo
celular. Debido a que el marcador es una enzima la técnica se conoce como enzimoinmunoensayo
(ELISA). 1. ELISA directo: El antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una
enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color. 2. ELISA indirecto: donde existe
un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo
secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de color permite medir
indirectamente la presencia del antígeno en la muestra mediante espectrofotometría. 3. ELISA
“sándwich”: se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después se aplica la muestra
problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer
anticuerpo. Después se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues
cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo
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anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la
amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
Sin embargo, la neutralización viral (Figura 8) continúa siendo la técnica de elección para
definir y distinguir serotipos virales. Para realización de esta prueba se utilizan anticuerpos
monoclonales con una especificidad definida que permite la identificación de diversos virus
(Figura 9). Esto permite reconocer rápidamente el agente viral responsable de la infección,
incluso a nivel de subtipo, cepa y variedad viral (por ejemplo, virus rábico de las diferentes áreas
geográficas). Los anticuerpos monoclonales que identifican familia, genero y tipos de virus
específicos están disponibles para algunos virus de importancia epidemiológica (por ejemplo, el
virus de la Influenza).
D) Cultivo de células sensibles en el fondo
de cada pocillo
A) VIRUS
E) Incubación
F) Observación diaria
C) Dilución de los
B) ANTICUERPOS
en el Microscopio
invertido
anticuerpos en la
placa multiwell
G) Coloración
con Cristal Violeta
para facilitar la
lectura
H) NEUTRALIZACIÓN.
No se observa el efecto
citopático. Existe
neutralización del virus por
los anticuerpos específicos
presentes en las distintas
diluciones del suero.
I) SIN NEUTRALIZACIÓN.
Presencia del efecto
citopático. Los sueros no
poseen anticuerpos que
neutralicen la acción del
virus.
Figura 8. Prueba de neutralización viral. Este método utiliza la habilidad de los anticuerpos de anular la
acción biológica de un virus. El método consiste en (A) la infección de un cultivo celular receptivo con un
virus que causa lesiones visibles en este cultivo. La concentración del virus es conocida, mientras que los
anticuerpos a analizarse (B) se diluyen en los pocillos de la placa multiwell (C). Cada pocillo posee en el
fondo un cultivo de células sensibles para el virus a evaluar (D). En cada pocillo se incuban el virus junto
con los anticuerpos sobre la monocapa de células (E). Diariamente se observa el cultivo celular presente
en cada pocillo bajo el microscopio invertido (F). Pueden teñirse las células con cristal violeta para facilitar
su observación (G). Si los anticuerpos específicos están presentes en la dilución apropiada, estos
neutralizan la infección de las células por el virus en cuestión y con ello la aparición de lesiones en el
cultivo celular (H). Si los anticuerpos no neutralizan al virus, se observa el efecto citopático del virus sobre
las células del cultivo (I).
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Figura 9. Producción de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos o inmunoglobulinas que se usan
en las técnicas inmunocitoquímicas son del tipo G, producidas por unas células del sistema inmunitario
denominados linfocitos B. La producción masiva de anticuerpos se produce en un animal cuando le
inyectamos una molécula que reconoce como extraña, es decir, nuestra molécula problema. Estos
anticuerpos pasan al suero sanguíneo que se extrae del animal inmunizado y a partir del cual se purifican
los anticuerpos producidos, los cuales se usarán posteriormente en la técnica inmunocitoquímica. Las
moléculas complejas como las proteínas tienen en su estructura varios determinantes antigénicos, es
decir, lugares que son capaces de desencadenar una respuesta inmune. Ello implica que cada
determinante antigénico activará un clon, grupo de de linfocitos B, que producirá anticuerpos contra él. Los
anticuerpos de todos los clones de linfocitos B activados por la molécula inyectada irán a parar al suero.
Cuando se emplean sueros purificados de este tipo en inmunocitoquímica se dice que se están empleando
anticuerpos policlonales. Existe una técnica que permite aislar y cultivar en el laboratorio (in vitro) de forma
individualizada a cada uno de los clones activados durante la respuesta inmune. Cada uno de esos
cultivos producirá un tipo de inmunoglobulina G que reconocerá sólo a uno de los determinantes
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antigénicos de la molécula inyectada. A estos anticuerpos se les denomina monoclonales ya que proceden
de linfocitos que producen inmunoglobulinas idénticas.
Identificación de los aislamientos virales: hemoadsorción y hemoaglutinación
Las células infectadas con virus se pueden unir a los glóbulos rojos a través de sus
membranas plasmáticas en los sitios de unión del virión, proceso que se conoce como
hemoadsorción (Figura 10).
Complejo de
Anticuerpos
Tetrámericos
Ac
Célula
Ac
Eritrocito
Ac
Eritrocito
Ac
Eritrocito
Células
infectadas
Figura 10. Hemoadsorción. Es un fenómeno que sucede al aplicar glóbulos rojos a una monocapa de
células de un cultivo previamente infectado con un virus con capacidad hemoaglutinante. La
hemoadsorción se debe a la expresión de hemaglutininas específicas en la membrana plasmática de la
célula infectada, donde se produce la adsorción de los glóbulos rojos. El aislamiento del virus de la peste
porcina africana (PPA) se realiza en cultivos primarios de macrófagos porcinos. El virus de la PPA es
capaz de infectar y replicarse de forma natural en cultivos de leucocitos de sangre periférica de cerdo,
donde además de producir un efecto citopático en los macrófagos infectados, previamente a la lisis celular,
origina un efecto característico de hemoadsorción. La imagen al microscopio se presenta en forma de
mórula o corona (roseta) de eritrocitos alrededor de los leucocitos (fotos a y b).
Esta propiedad de hemoadsorción puede ser utilizada para determinar virus específicos a
través de la Inhibición de la Hemoadsorción, donde se utilizan anticuerpos específicos (Figura
11).
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Virus hemaglutinante
Anticuerpos
Estadío 1
Unión Ag/Ac
Sin unión Ag/Ac
Estadío 1
Eritrocitos
Vista
macroscópica
del fondo de
la placa
POSITIVO
SIN HEMAGLUTINACION
NEGATIVO
HEMAGLUTINACION
Vista
macroscópica
del fondo de
la placa
Figura 11. Inhibición de la Hemoadsorción/ Hemoaglutinación. Las hemoaglutininas presentes en la
superficie del virión pueden ser bloqueadas en su función por la presencia de anticuerpos dirigidos contra
esos determinantes antigénicos específicos responsables de la unión del virus a los glóbulos rojos. Por lo
tanto, el fenómeno de la hemoaglutinación no es evidente y en la policubeta se visualiza la sedimentación
de los glóbulos rojos formando el característico botón rojo, indicando la inhibición de la hemoaglutinación.
Por ejemplo: Los virus Influenza poseen espículas de hemaglutinina, que aglutinan glóbulos rojos de
diferentes especies animales. La unión del anticuerpo específico al sitio antigénico de la hemaglutinina
bloquea la unión de la hemaglutinina viral con los receptores de los eritrocitos. Este bloqueo es específico
y permite distinguir entre variantes antigénicas de un mismo subtipo.
El principio de la inhibición de la hemaglutinación es el mismo que el de la hemoadsorción:
muchos virus pueden unir (y aglutinar) los glóbulos rojos de diferentes especies de mamíferos y
aves, formando “puentes” entre las células y aglutinando los eritrocitos en grandes acúmulos
celulares. Cuando se agregan anticuerpos específicos y el virus, previo a la adición de los
glóbulos rojos, la hemaglutinación es inhibida. Por lo tanto, la especificidad de los anticuerpos
utilizados sirve para identificar el virus aislado en las células del cultivo. La inhibición de la
hemaglutinación es una técnica altamente sensible y específica. Además, es de desarrollo simple,
económica, rápida y ha sido utilizada históricamente como el procedimiento de elección para la
identificación de aquellos virus que poseen efecto hemoaglutinante.
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Aislamiento y caracterización viral en animales de experimentación y en
embriones de animales.
Muchos virus pueden ser satisfactoriamente cultivados en embriones de pollo o en ratones
recién nacidos, pero actualmente, estas técnicas están en desuso debido a que el cultivo celular
constituye una opción más simple.
Animales de experimentación
La inoculación en animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su
aislamiento o propagación, es una técnica poco empleada por las dificultades de mantener un
bioterio, la laboriosidad de la inoculación y el peligro de difusión del virus con las excretas de los
animales. Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros
sistemas –embriones o cultivos celulares– no es posible.
Los animales más utilizados para este fin son los monos, los cobayos y los ratones blancos
lactantes, que se utilizan esporádicamente para el aislamiento de un número limitado de virus y
en general en laboratorios de investigación.
En la actualidad, los ratones blancos pueden ser utilizados para el aislamiento de los
arbovirus (conjunto de virus transmitidos por artrópodos, pertenecientes a diferentes familias) y
para el virus de la rabia. Los ratones lactantes, con menos de 24 hs de nacidos, son inyectados
intracerebral o intraperitonealmente con la muestra sospechosa (Figura 13). Posteriormente y
durante 2 semanas, se observan a los animales por el desarrollo de signos clínicos
patognomónicos de estas enfermedades. Una vez desarrollada la sintomatología se eutanasia al
animal y se procede con la identificación y caracterización del virus mediante pruebas como la
histopatología de los tejidos afectados, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica (para
identificación de antígenos virales en los tejidos) o serología de los animales afectados (para
detectar anticuerpos específicos en los animales infectados).
Figura 12. Inoculación intracerebral de ratones recién nacidos.
Embriones animales
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Los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos
fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días.
Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia
para su realización. De acuerdo al virus de interés, la muestra es inoculada en la cavidad
amniótica, alantoidea, en el saco vitelino o en la membrana corioalantoidea (Figura 13). La
inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de
muestras clínicas.
Membrana
corioalantoidea
Cámara
de aire
Cáscara
Cavidad
Amniótica
Inoculación en la
membrana corioalantoidea
Inoculación amniótica
Saco
Vitelino
Inoculación alantoidea
Membrana de
la cáscara
Albúmina
Cavidad
Alantoidea
Inoculación del
saco vitelino
Figura 13. Vías de inoculación de los huevos embrionados.
Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus Influenza A. En efecto,
existen varios virus patógenos importantes que replican mucho mejor en los huevos que en los
cultivos celulares derivados de los tejidos de los embriones de pollo. Las evidencias del
crecimiento viral pueden observarse en la membrana corioalantoidea (por ejemplo, las típicas
pústulas causadas por los poxvirus), pero también los virus pueden identificarse utilizando otras
técnicas para la detección de virus (hemaglutinación, inmunofluorescencia, etc).
El cultivo celular, la inoculación en embriones de pollo o en ratones son
herramientas disponibles para el aislamiento viral. Algunos de estos sistemas son
utilizados para el diagnóstico. Es decir, en el cultivo celular se puede identificar a los virus
que generan efecto citopático, en los embriones se pueden identificar las lesiones
patognomónicas de los virus sobre los tejidos embrionarios y en los ratones se pueden
observar los signos clínicos de la enfermedad que genera el virus que se ha inoculado.
Para la identificación y caracterización de un virus aislado se utilizan otras herramientas
como la histopatología, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, neutralización y/o
hemaglutinación. Todas estas herramientas pueden combinarse y ser utilizadas
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criteriosamente para permitir un correcto aislamiento y caracterización del agente
productor de la enfermedad viral (Figura 14 y 15).
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4
6
5
Figura 14. Combinación de las diferentes herramientas utilizadas en el diagnóstico de las
enfermedades virales. A partir del animal enfermo puede obtenerse los tejidos afectados, los cuales son
tratados para generar un inóculo con el virus sospechoso (1). Esta muestra se inocula en ratones blancos,
los cuales muestras los signos clínicos de la enfermedad (2) y además pueden permitir la replicación y
multiplicación de las partículas virales (3). Con los tejidos afectados del ratón infectado puede prepararse
un inóculo que se utilizará como muestra para aplicar sobre un cultivo celular (4). En el cultivo celular el
virus puede evidenciar efecto citopático o no (5). Este efecto sería considerado diagnóstico del agente
viral. Si no se evidencia este efecto, las células infectadas de los cultivos pueden someterse a pruebas
inmunohistoquímicas, inmunofluorescentes o histopatología para arribar al diagnóstico y caracterización
viral (6). Si todavía quedan dudas acerca de la identificación viral, las partículas virales amplificadas en los
cultivos celulares pueden utilizase como inóculo antigénico para técnicas como la hemoaglutinación (7) o
neutralización viral.
UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES
CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA
Muestras del animal
enfermo.
1
Inoculación en cultivos celulares
2
6
Partículas virales
3
4
Inoculación en
huevos
embrionados
5
Observación de signos clínicos o
lesiones en los pollitos recién nacidos
Figura 15. Combinación de las diferentes herramientas utilizadas en el diagnóstico de las
enfermedades virales. A partir del animal enfermo puede obtenerse los tejidos afectados, los cuales son
tratados para generar un inóculo con el virus sospechoso (1). Esta muestra se inocula en cultivos celulares
que permiten la replicación y multiplicación de las partículas virales (2). En el cultivo celular el virus puede
evidenciar efecto citopático o no. Este efecto sería considerado diagnóstico del agente viral. Si no se
evidencia este efecto, las partículas virales amplificadas en los cultivos (3) pueden servir como inóculo
para inocular huevos embrionados (4). Sobre los pollitos nacidos de los huevos inoculados pueden
observarse las lesiones o signos clínicos asociados con el virus que se pretende identificar (5). Las
partículas virales obtenidas de los cultivos celulares también pueden ser utilizadas como el antígeno a
identificar en pruebas inmunohistoquímicas (ELISA) para arribar al diagnóstico y caracterización viral (6).
BIBLIOGRAFÍA:

Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. (1999). Veterinary Virology. Third
Edition, Elsevier Ed., U.S.A. Traducción realizada por el Dr. Cs. Vet. Diego Grilli (Agosto
2013).