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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
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FACULTAD DE VETERINARIA
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PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA
CURSO 2009-2010
En este Curso Académico se llevaran a cabo las siguientes prácticas de laboratorio:
I. Detección de anticuerpos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky
mediante un ELISA de competición y un ELISA indirecto.
II. Determinación mediante la técnica de aglutinación rápida de grupos
sanguíneos y factor Rh humano.
III. Detección de anticuerpos frente a Listeria sp. y frente a Salmonella sp.
mediante microaglutinación lenta en placa.
IV. Determinación de los anticuerpos calostrales en sueros de terneros.
V. Resolución de supuestos prácticos.
I. MÉTODO ELISA
La técnica inmunoenzimática ELISA (Enzyme-Llinked Immunosorbent Assay) forma
parte de aquellas reacciones serológicas que utilizan conjugados para poder
visualizar la reacción ANTIGENO-ANTICUERPO. El ELISA se basa en el uso de
anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa), de forma que
los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al
estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) insolubilizados sobre la
placa, la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y por tanto, podrá
ser revelada fácilmente mediante la adición del conjugado y del sustrato,
generando un color observable a simple vista y cuantificable mediante un
colorímetro.
En la actualidad el ELISA es uno de los métodos más utilizados para el diagnóstico
serológico de distintas enfermedades infecciosas, y es la técnica más recomendada
para el estudio de poblaciones.
Se han adaptado diferentes tipos de ELISA tanto para la detección de antígenos
como de anticuerpos. En esta práctica utilizaremos dos tipos de ELISA para la
detección de anticuerpos fente al virus de la Enfermedad de Aujeszky (ADV) en
sueros de cerdo.
1
I. 1. PRINCIPIO DEL TEST de la Enfermedad de Aujeszky (ADV)
La glucoproteína E (gE) no se encuentra en las cepas vacunales del virus de la
enfermedad de Aujeszky utilizadas en España. Por lo tanto, la detección de
anticuerpos específicos frente a gE en muestras de sueros de cerdos permite la
diferenciación entre animales vacunados, sanos e infectados por este virus. En estas
prácticas vamos a emplear dos kits comerciales basados en:
-
ELISA de competición (o de bloqueo): detecta sólo Ac frente a gE. Los
pocillos están tapizados con la proteína gE del virus.
-
ELISA indirecto: detecta Ac totales frente a ADV. Los pocillos están tapizados
con antígeno inactivado de ADV completo.
En ambos casos si en la muestra de suero a analizar hay anticuerpos específicos
éstos se fijan sobre el Ag fijado a la placa, por lo que la reacción de ELISA será
positiva. La forma de evidenciar esta unión Ag-Ac es diferente en función de la
metodología empleada:
-
En el ELISA de competición a continuación se incorpora a los pocillos un
anticuerpo monoclonal anti-gE del ADV conjugado con una enzima. En los
casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-gE, este
conjugado no puede unirse a la gE (Figura 1), por lo que se eliminará en los
siguientes lavados.
-
En el ELISA indirecto a continuación se incorpora a los pocillos un
anticuerpo monoclonal anti-Ig de cerdo conjugado con una enzima. En los
casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-ADV, este
conjugado se unirá a los Ac específicos del suero, unidos a su vez al Ag fijado
al pocillo (Figura 2).
En ambos casos el revelado se realiza por la adición de un sustrato cromógeno. La
presencia o ausencia de color indica diferentes resultados en función de la prueba:
-
En el ELISA de competición la ausencia de color indica la presencia de Ac
anti-gE en el suero problema, que será positivo.
-
En el ELISA indirecto el desarrollo de color indica la presencia de Ac antiADV en el suero problema, que será positivo.
La intensidad de color se mide con un lector de ELISA con un filtro de 450nm, y los
sueros a ensayar se comparan con los sueros controles que se incluyen en el kit.
1.2. MUESTRAS Y REACTIVOS
Muestras: Sueros porcinos en refrigeración (máximo 8 días) o congelación.
Reactivos: Las placas tapizadas con el antígeno, los sueros controles, las
soluciones de diluyente de muestras, de los conjugados, del sustrato y frenado se
suministran con cada kit.
La solución de lavado se suministra concentrada (10x), y se debe diluir en agua
destilada antes de su uso.
La solución diluyente de muestras para el ELISA indirecto también se debe diluir
previamente a 1/3 en agua destilada.
2
I. 3. ELISA DE COMPETICIÓN. Procedimiento
Muestras: Se usa una dilución del suero problema al 50% (1/2) en solución diluyente
1.
Estabilizar los reactivos a 18-25ºC antes de empezar la prueba.
2.
Distribución de 50µ
µl de solución diluyente de sueros en cada pocillo a usar.
3.
Distribución de 50µ
µl de sueros controles (negativo, positivo; por duplicado) y
muestra en cada pocillo (por duplicado). Usar una punta de micropipeta por cada
muestra.
4.
Incubación de las muestras durante 1 hora a 37ºC. Tapar las placas o incubar en
cámara húmeda para que no se evaporen los reactivos.
5.
Lavado (lavador de placas o multicanal): Se vacía la placa, se añaden 300µ
µl de
solución de lavado por pocillo, se agita suavemente y se vacía placa. Realizar un
total de 3 lavados.
6.
Distribución del conjugado. Dispensar 100µ
µl de conjugado anti-gE. Incubar 40
minutos a 37ºC.
7.
Realizar 3 lavados como en el caso anterior.
8.
Dispensar 100µ
µl de solución del sustrato. Incubar a temperatura ambiente (1825ºC) y en oscuridad durante 15 minutos.
9.
Frenado de la reacción. Dispensar 100µ
µl de solución de frenado. Agitar
suavemente la microplaca.
10. Lectura inmediata en un lector de ELISA con un filtro de 450nm.
Cerdo vacunado
con ADV gE-
Cerdo infectado o
vacunado con
ADV gE+
Cerdo sano no
vacunado
Figura 1. ELISA de competición
Añadir conjugado anti-gE
marcado con enzima
Añadir sustrato de la enzima
Color
No
Sí
Sí
Proteína gE de ADV
Conjugado anti-gE
Anticuerpo anti-gE
Sustrato
3
Cálculo de resultados: El porcentaje de inhibición de color (% PI) de cada
muestra y del control positivo (DO: densidad óptica)
%PI = (DO media del control negativo – DO de la muestra) x 100
(DO media del control negativo)
La prueba es válida si se cumplen estos dos criterios:
* DO media del control negativo – DO media del control positivo > 0,6
* El suero control positivo tiene un %PI superior a 60
(DO control negativo – DO control positivo) x 100 > 60
(DO media del control negativo)
Interpretación de los resultados:
MUESTRA
SUEROS INDIVIDUALES
Positiva
% PI > 45
Negativa
% PI< 40
Dudosa
40 ≤ %PI ≤ 45
4
I. 4. ELISA INDIRECTO. Procedimiento
Muestras: Se usa una dilución del suero problema a 1/200 en solución diluyente de
muestras.
1. Estabilizar los reactivos a 18-25ºC antes de empezar la prueba.
2. Distribución de 50µ
µl de controles por duplicado y 50µ
µl de las muestras
diluidas 1/200 a los pocillos de la placa (por duplicado). Usar una punta de
micropipeta por cada muestra.
3. Incubación de las muestras durante 1 hora a 37ºC. Tapar las placas con papel
adhesivo o incubar en cámara húmeda para que no se evaporen los reactivos.
4. Lavado (lavador de placas o multicanal): Se vacía la placa, se añaden 300µ
µl de
solución de lavado por pocillo, se agita suavemente y se vacía placa. Realizar
un total de 3 lavados.
5. Distribución del conjugado. Dispensar 50µ
µl de conjugado anti-Ig de cerdo.
Incubar 40 minutos a 37ºC.
6. Realizar 3 lavados como en el caso anterior.
7. Dispensar 50µ
µl de solución del sustrato. Incubar a temperatura ambiente
(18-25ºC) y en oscuridad durante 15 minutos.
8. Frenado de la reacción. Dispensar 50µ
µl de solución de frenado. Agitar
suavemente la microplaca.
9. Lectura inmediata en un lector de ELISA con un filtro de 405 nm.
Cerdo infectado
o vacunado
Figura 2. ELISA indirecto
Cerdo sano no
vacunado
Añadir conjugado anti-Ig
de cerdo marcado con
enzima
Añadir sustrato de la enzima
Color
Sí
No
ADV inactivado
Conjugado anti-Ig de cerdo
Anticuerpo anti-ADV
Sustrato
5
Cálculo de resultados: Es preciso obtener el valor de IRPC (índice relativo x
100) de cada muestra. Para ello hay que aplicar la siguiente relación:
IRPC =
(DO de la muestra - DO media del control negativo)
x 100
(DO media del control positivo – DO media del control negativo)
La prueba es válida si se cumplen estos dos criterios:
* La DO media del control positivo es > 0,6
* La relación
DO media del control positivo
DO media del control negativo
> 7,0
Interpretación de los resultados:
VALOR DE IRPC
INTERPRETACIÓN
> 12,0
Muestra POSITIVA
≤ 12,0
Muestra NEGATIVA
I.5. PRECAUCIONES
- Leer atentamente y seguir las instrucciones del manual.
- Conservar los reactivos en refrigeración (4ºC). Equilibrarlos a temperatura
ambiente (atemperarlos) antes de su uso.
- Manejar los reactivos con cuidado como si fueran potencialmente infecciosos.
Evitar la contaminación de los reactivos y no usarlos fuera de la fecha de
caducidad.
- Guardar las normas de trabajo habituales en un laboratorio, tales como no
pipetear con la boca, rotular el material, etc.
- Utilizar una punta de pipeta por muestra.
- Incluir sistemáticamente los controles positivo y negativo en cada estudio.
- Manejar con especial cuidado la solución de frenado, ya que contiene ácido
sulfúrico y es corrosiva.
6
II. TEST DEL Rh y GRUPOS SANGUÍNEOS
Se trata de una prueba de aglutinación rápida en porta para la detección del
antígeno D Rhesus (Rh D) y los antígenos A y B humanos en eritrocitos.
II.1 Información general
Los antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos reciben el
nombre de antígenos de grupo sanguíneo. En algunas especies animales, como el
gato, existen tres grupos sanguíneos A, B y AB. En el hombre, además de los
antígenos A, B y O, uno de los antígenos eritrocitarios más importantes es el factor
Rh. La expresión e inmunogenicidad del antígeno que determina el grupo de Rh
humano puede variar entre individuos como resultado de diferencias cuantitativas o
cualitativas antigénicas. En general, este antígeno es fuertemente inmunógeno, y
puede suponer un factor de riesgo en transfusiones y en algunos embarazos, donde
no hay compatibilidad entre donante/receptor o madre/feto, pudiendo dar lugar a la
aparición de reacciones de hipersensibilidad de tipo II.
II.2 Reactivos:
Los reactivos utilizados son una mezcla de anticuerpos monoclonales humanos IgM
e IgG (anti-A, anti-B y anti-D (Rh)).
II.3. Procedimiento del test en porta:
1. Colocar una gota de sangre en un porta limpio y templado.
2. Añadir una gota del reactivo correspondiente.
3. Mezclar completamente con movimientos circulares.
4. Observar la aglutinación en un tiempo no mayor de 2 minutos.
II.4. Interpretación:
Una reacción positiva (con aglutinación) indica la presencia del antígeno
correspondiente.
Una reacción negativa (sin aglutinación) indica la ausencia del antígeno analizado.
-
+
7
III. MICROAGLUTINACIÓN EN PLACA (MAT)
La técnica de microaglutinación en placa creada por Martín y Petit, permite detectar
anticuerpos aglutinantes del tipo IgM e IgG, que aparecen en el suero al cabo de
varios días post-infección, requiriendo varias semanas para llegar a su nivel de
microaglutinación más elevado.
La técnica consiste en enfrentar diluciones sucesivas del suero del animal
sospechoso, a un serovar o grupo de serovares seleccionados de la bacteria
inactivada. Las ventajas de esta técnica es que es muy sensible y fiable permitiendo
la determinación cualitativa y cuantitativa de los anticuerpos en el suero. El
único inconveniente es el tiempo requerido para la resolución de la misma (24
horas).
III.1. Fundamento de la técnica MAT aplicada a:
Listeriosis:
La listeriosis es una enfermedad zoonósica grave, que afecta a animales y
personas, que está producida por bacterias del género Listeria. En el hombre,
la listeriosis está causada principalmente por Listeria monocytogenes y está
considerada como la infección de origen alimentario con mayor tasa de
letalidad (20 a 30% de los casos). Aunque L. monocytogenes se ha aislado de
variadas especies de mamíferos, aves, peces y crustáceos, su principal
hábitat es el suelo y la materia vegetal en descomposición, en la cual
sobrevive y crece como saprofito. Si bien parece existir gran diversidad de
serovariedades (16 serovariedades de L. monocytogenes), en los casos de
listeriosis humana sólo hay 3 serovares implicados: 1/2a, 1/2b, 4b.
En esta práctica se va a determinar la presencia de anticuerpos frente a
Listeria monocytogenes en distintos sueros de animales.
Salmonelosis:
La salmonelosis es una enfermedad zoonósica grave, que afecta a animales y
personas, que está producida por bacterias del género Salmonella. En el
hombre, la salmonelosis está causada por numerosos serovares de
Salmonella, siendo los más frecuentes Enteritidis y Typhimurium. Está
considerada como la 2ª infección de origen alimentario con mayor tasa de
prevalencia en la UE, ligeramente por debajo de la campilobacteriosis.
En esta práctica se va a determinar la presencia de anticuerpos frente a dos
serovares diferentes de Salmonella en distintos sueros de animales.
III.2. Procedimiento de la técnica:
Listeriosis
Se dispone de dos tipos de antígenos, correspondientes a los serovares 4c y
4b. Los sueros problema corresponden a estos mismos serovares. Se utilizan
placas de 96 pocillos con fondo en V.
8
Salmonelosis
Se dispone de dos tipos de antígenos, correspondientes a los serovares
Typhimurium y Choleraesuis. Los sueros problema pueden corresponder a
estos mismos serovares o no. Se utilizan placas de 96 pocillos con fondo en V.
PROTOCOLO EN AMBOS CASOS
1. Se añaden 100µl del suero problema diluido al 1/10 en el primer pocillo de
cada fila de la placa.
2. En los pocillos restantes añadimos 50µl de PBS-safranina (Tampón fosfato
salino con colorante, que favorece la visualización de la reacción).
3. A continuación, diluir al doble el suero en los pocillos siguientes de la fila,
excepto en el último pocillo que servirá como testigo del Ag.
4. Añadir a todos los pocillos 50µl de la suspensión de antígeno (bacterias de
L. monocytogenes hervidas y tripsinizadas).
5. Incubar toda la noche a 37ºC y una o dos horas a 4ºC, antes de leer el
resultado.
50µl de PBS-safranina
100µl
Suero
diluido
50µl
1
2
50µl
3
50µl
...
...
Control
11
12
50µl de la suspensión de antígeno
III.3. Interpretación de resultados:
En caso de reacción negativa se apreciará un “botón rojo de sedimentación” en
el centro del pocillo debido a la acumulación de las células bacterianas que no han
reaccionado (sedimentación del Ag). Así, en el pocillo control (donde sólo hay
antígeno), siempre deberá de aparecer botón debido a la ausencia de anticuerpos.
En caso de reacción positiva, se observará una falta de depósito del Ag (ausencia
de botón rojo), ya que se ha producido la aglutinación.
1
2
3
4
........
10
11
12
9
El título sérico del individuo corresponderá a la dilución más alta del suero
problema a la que se produce aglutinación.
•
Una reacción negativa en una sola muestra no descarta una posible infección, y
el resultado puede ser debido a distintas razones:
a) La muestra de suero puede haber sido tomada prematuramente, antes de
cumplirse al menos una semana de evolución desde el inicio de la
enfermedad.
b) Más raramente, el paciente puede estar infectado por un serovar ausente en
el antígeno utilizado y la respuesta inmune no ser suficientemente intensa
todavía como para producir reacciones cruzadas detectables con otros
serovares.
•
En el caso de que en el pocillo control de Ag no hubiese botón de
sedimentación la prueba se invalidaría debido a que indicaría una reacción de
autoaglutinación espontánea del antígeno.
SUEROS
C-
1
2
3
4
5
6
7
8
10
IV. EVALUACIÓN DE LA TRANSFERENCIA PASIVA DE ANTICUERPOS
El animal neonato es dependiente de la madre para proveerse pasivamente de
anticuerpos para su protección durante los primeros meses de vida. La ruta por la
cual el neonato adquiere estos anticuerpos varía según el tipo de placenta de la
especie animal:
Tipo de
placenta
Nº de
capas
Contacto maternofetal
Especies
animales
Transferencia
de Ig
Epiteliocorial
6
Epitelio uterino
intacto- epitelio del
corion fetal
Sindesmocorial
5
Tejido conjuntivo –
epitelio del corion fetal
Cerda
Yegua
Burra
Vaca
Oveja
Cabra
Endoteliocorial
4
Endotelio de vasos
maternos-epitelio del
corion fetal
Perra
Gata
Parcial
(5-10% de IgG)
Hemocorial
3
Sangre maternaepitelio del corion fetal
Mujer
Primates
Roedores
Casi total
(90-100% de
IgG)
No
No
Durante las últimas semanas de gestación en la glándula mamaria hay una
acumulación de secreciones que contienen proteínas trasferidas desde el torrente
sanguíneo. Éstas son ricas en IgG e IgA. La mayor parte de los Ac en el calostro son
de tipo IgG. A medida que pasa el tiempo tras el parto, la secreción mamaria cambia
de calostro a leche. En rumiantes, la IgG (IgG1) es el principal isotipo de Ac en
leche, mientras que en mamíferos no rumiantes lo que predominan es IgA.
La absorción del calostro es un proceso muy importante, principalmente en animales
no primates, ya que en ocasiones, es la única fuente de Ac para el neonato. Los Ac
van a ser absorbidos en las células del intestino delgado mediante pinocitosis,
pasando seguidamente a la sangre. Este fenómeno va a durar sólo un periodo
limitado de tiempo (24-36 horas), tras el cual no se podrán absorber más Ac, pues el
intestino deja de se permeable. Tras el nacimiento el mayor nivel de Ac se halla en
el suero; sin embargo, algunas IgA permanecen en la luz del intestino para proteger
la mucosa directamente.
Los Ac adquiridos de modo pasivo se degradan con el tiempo dependiendo de la
vida media característica del isotipo de Ig. La vida media de la IgG es larga (varias
semanas en la mayoría de las especies), mientras que la IgE sólo dura unos días.
En el animal neonato normal, la producción activa de Ac ocurre antes de la
degradación de los Ac trasferidos por la madre, de forma que hay Ac presentes
continuamente.
11
IV.1. Fundamento de la práctica:
En especies dependientes del calostro, para su protección durante los primeros
meses de vida, pueden existir fallos en la transferencia pasiva de las Ig debido a que
la madre a veces rehúsa al neonato, o a que puede haber una cantidad insuficiente
de Ig en el calostro, o a que el recién nacido es incapaz de mamar. En estos casos,
el nivel sanguíneo de Ac es muy bajo para protegerlo de los patógenos ambientales
con los que entra en contacto habitualmente en las primeras semanas de vida. Estos
animales generalmente desarrollarán procesos diarreicos graves y/o septicemia, que
puede ser fatal. Por tanto, es necesario determinar que el neonato ha recibido el
calostro adecuado que asegure su protección. Si en una muestra de sangre se
detecta una insuficiente cantidad de Ac, y todavía puede haber absorción de Ig vía
intestinal, es posible administrar calostro al recién nacido por vía oral. Si, por el
contrario, ya ha pasado el periodo de absorción de las Ig, los Ac necesarios se
deben administrar vía intravenosa.
Por tanto, es importante que el veterinario disponga de métodos rápidos y eficaces
para la determinación de los niveles de Ig en el neonato. Una de las técnicas más
sencillas, rápidas y baratas es la prueba de la turbidez con sulfato de zinc.
IV. 2. Procedimiento de la técnica:
Se trata de una técnica sencilla basada en la mezcla del suero problema con una
solución de sulfato de zinc. Este compuesto se utiliza para precipitar proteínas, por
lo que hace que las globulinas del suero se vuelvan insolubles, observándose
precipitado cuando hay presencia de Ig.
Se dispone de una serie de muestras de suero de terneros recién nacidos, en las
cuales se pretende determinar el nivel de anticuerpos que han adquirido a través del
calostro.
1. La técnica se lleva a cabo en tubos de vidrio, en cada uno de los cuales se
mezcla: 1ml de agua destilada y 0,1ml del suero problema. Mezclar
vigorosamente.
2. Se añaden 5ml de la solución de sulfato de zinc (ZnSO4, a una concentración
de 250mg/l).
3. Esperar 1 hora a temperatura ambiente y después leer la turbidez del tubo
según la siguiente escala:
12
1500mg/dl
500mg/dl
200mg/dl
100mg/dl
precalostral
IV.3. Interpretación de resultados:
El sulfato de zinc hace que las globulinas se tornen insolubles, por lo que se
observará un precipitado de intensidad variable, en función de la concentración
de Ig en el suero.
En la falta total de transferencia (o en un suero precalostral), la mezcla de reacción
permanece clara. Cuando el suero presenta más de 400 mg/dl de Ig, la mezcla se
torna turbia. Como alternativa a la inspección visual, es posible leer la densidad
óptica de la mezclas en una curva estándar.
Teniendo en cuenta la siguiente tabla, se puede saber si el ternero está
suficientemente protegido por los anticuerpos calostrales. En caso negativo, el
ternero necesitaría un suplemento inmunológico para asegurar su protección.
< 200 mg/dl
Falta de transferencia pasiva
200-400 mg/dl
Falta parcial de transferencia pasiva
400-800 mg/dl
Probables niveles adecuados de Ig
> 800 mg/dl
Niveles adecuados de Ig
13
AUTOEVALUACIÓN
Señala la opción correcta en cada una de las siguientes preguntas y razona la
respuesta:
Microaglutinación
ELISA
En porta
1
2
3
En placa
Evaluación.
transferencia
pasiva Ac
¿Cuál/es de las técnicas desarrolladas emplea
anticuerpos?
¿Cuál/es de las técnicas desarrolladas mide la
inmunidad de base celular?
¿Con cuál/es de las técnicas se puede
determinar el título de un suero?
4
¿Cómo lo determinarías?
5
¿Cuál/es de las técnicas determina la
presencia de anticuerpos específicos?
6
¿Cuál/es de las técnicas es/son primaria/s?
7
¿Cuál/es de las técnicas es/son secundarias?
8
¿En cuál de las técnicas se ve precipitación?
¿En qué técnica/s se emplean Ac
monoclonales?
A tu juicio ¿qué técnica tiene mayor
10
sensibilidad?
A tu juicio ¿qué técnica tiene mayor
11
especificidad?
9
12 ¿Qué técnica emplea controles?
¿Qué técnica se puede emplear para el
diagnóstico de infecciones?
¿Con qué técnica podrías diferenciar animales
14
vacunados de animales infectados?
13
15 ¿Qué técnica es cuantificable?
16
¿Cómo se te ocurre que podrías determinar si
se trata de IgG o de IgM?
14
VI. RESOLUCIÓN DE SUPUESTOS PRÁCTICOS
SUPUESTO PRÁCTICO Nº 1
Para diagnosticar si un animal tiene una inmunodeficiencia secundaria a una infección vírica
se puede determinar el cociente entre el número de linfocitos colaboradores (Th) y
citotóxicos (Tc), ya que es un buen indicio del funcionamiento del sistema inmune tanto
humoral como celular. Estas subpoblaciones de linfocitos se identifican mediante las
distintas moléculas de superficie que expresan (CD). Los CD se pueden analizar mediante
una doble fluorescencia con anticuerpos monoclonales específicos empleando la citometría
de flujo.
PROTOCOLO
Muestras: tres tubos de sangre-EDTA de tres gatos con sospecha de inmunodeficiencia
(infecciones frecuentes, cansancio injustificado, etc.)
Se añade a cada tubo de sangre una solución salina para lisar los hematíes. Tras
centrifugar, el sedimento con los leucocitos se lava con una solución de PBS y se pasa a
otro tubo especial para citometría.
Se añaden a cada tubo de citometría los siguientes anticuerpos monoclonales:
- AntiCD3-APC
- AntiCD4-RD
- AntiCD8-FITC
APC: aloficocianina
RD: rodamina
FITC: isotiocianato de fluoresceína
Se mezcla cuidadosamente, se incuba en oscuridad durante 15 minutos y se analizan las
muestras en el citómetro de flujo, que determina el número y porcentaje de células
marcadas con cada uno de los anticuerpos monoclonales.
RESULTADOS
CD8
CD4
Los datos obtenidos se suelen representar en gráficos de puntos, en los que se representan
en ordenadas y en abscisas la intensidad de la señal para cada uno de los marcadores
empleados. En este caso se analizan dos parámetros para cada célula: CD3+CD4+ ó
CD3+CD8+. Se muestra un ejemplo de los resultados para uno de los tubos de muestra:
B2 y C2: células doblemente positivas
B3 y C3: células doblemente negativas
B1, B4: células positivas para un solo marcador
C1, C4: células positivas para un solo marcador
CD3
CD3
15
El citométro además cuenta el número de células marcadas y determina su
porcentaje en el total de células analizadas.
Los resultados que se obtienen en los tres tubos de sangre son los siguientes:
MUESTRAS
Nº Células (x109/l)
CD3+
CD4+
CD8
TUBO 1
TUBO 2
TUBO 3
1,43
0,77
1,09
0,36
0,23
0,51
0,89
0,44
0,23
+
Cociente
CD4/CD8
PREGUNTAS
1- Explicar resumidamente la citometría de flujo
2- ¿Qué población de linfocitos vamos a identificar empleando estos anticuerpos
monoclonales conjugados con un fluorocromo?
i. CD3+CD4+:
ii. CD3+CD8+:
3- ¿Por qué se emplea el Ac monoclonal anti CD3?
4- Calcula e interpreta el cociente CD4/CD8. Un valor de CD4/CD8 ≤ 1 indica una
cierta alteración del sistema inmune ¿Qué muestra podríamos considerar que
corresponde a una inmunodeficiencia?
5- Explica cuál sería el resultado si la citometría de flujo se hiciera sobre un tubo de:
a)
b)
c)
d)
Sangre entera sin EDTA después de 48 horas de su obtención
Sangre entera desuerada a 4ºC durante una noche:
Plasma sanguíneo obtenido por centrifugación de la sangre entera:
Capa blanca de la sangre separada en un gradiente de Ficoll:
6- Para identificar células NK en una mezcla de linfocitos se emplean como
marcadores anticuerpos monoclonales anti CD3 y anti CD16 (lo expresan todas
las NK aunque aparecen en otros linfocitos), con el resultado que expresa la
gráfica.
¿En qué cuadrante se encuentran las
células NK?
16
SUPUESTO PRÁCTICO Nº 2.La figura de la siguiente hoja representa los resultados obtenidos en ELISA y
Western blot (WB) en el suero de 5 vacas que han sido inoculadas con 5 variantes
de BLV (Virus de la Leucosis Bovina). Todos son inóculos se han realizado con
extractos de células infectadas por BLV.
El ELISA se realizó tapizando los pocillos con extractos de células infectadas por el
virus. En las gráficas de ELISA se aprecian dos curvas de resultados: línea
continua, realizada con los sueros de las vacas tal cual; en la línea discontinua,
los sueros han sido adsorbidos con las células sin infectar. Las líneas verticales de
puntos representan los momentos en los que se ha aplicado una inoculación de
recuerdo a las vacas.
En los 5 WB se han enfrentado los sueros tomados periódicamente (en el sentido de
la flecha horizontal) a tiras en las que se han separado las proteínas del mismo
extracto celular de BLV que el ELISA. La flecha vertical representa el primer suero
tras la inmunización, “c” el control positivo. Los números verticales son los pesos
moleculares (kDa) de las distintas proteínas víricas.
ELISA
1. ¿Para qué crees que se adsorben los sueros antes del ELISA?
2. ¿Qué diferencias ves entre los sueros adsorbidos y los no adsorbidos?
3. Describe qué pasos seguirías en la realización del ELISA presentado en este
experimento.
4. A la vista de los resultados de ELISA, ¿crees que todos los animales han
reaccionado igual?
5. A la vista de los resultados de ELISA, ¿qué inóculo consideras que es el más
inmunógeno?
WESTERN BLOT
6. Describe qué pasos seguirías en la realización del Western Blot presentado en
este experimento.
7. La flecha vertical está colocada en la segunda tira de la izquierda. ¿Qué crees
que hay en la primera tira de la izquierda?
8. A la vista de los resultados de WB, ¿qué proteínas son las más inmunógenas?
9. ¿Qué preparado antigénico crees que es el más inmunógeno?
AMBAS TÉCNICAS
10. ¿Crees que hay una correspondencia entre los resultados de ELISA y los de WB
en cada animal? Si hay diferencias ¿por qué crees que se dan? ¿Cuál es más
sensible? ¿Cuál es más específico?
11. ¿Con cuál de estas técnicas podemos ver la evolución secuencial de diferentes
anticuerpos frente a distintos antígenos de un microorganismo durante el curso
de una infección?
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BLV-1
BLV-2
C
BLV-3
C
BLV-4
C
BLV-5
C
C
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