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Posible efecto de dos presiones parciales de
oxígeno en la vascularización del saco
vitelino y la alantoides de embriones de
pollo (Gallus domesticus) y en la expresión
de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Edwin Acosta Virgüez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Bogotá D.C., Colombia
2011
Posible efecto de dos presiones parciales de
oxígeno en la vascularización del saco
vitelino y la alantoides de embriones de
pollo (Gallus domesticus) y en la expresión
de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Edwin Acosta Virgüez
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Doctor en Ciencias: Salud Animal
Director:
Doctor Aureliano Hernández Vásquez
Línea de Investigación:
Morfofisiología de la implantación embrionaria
Grupo de Investigación:
Fisiopatología de la adaptación de los animales al trópico
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Bogotá D.C., Colombia
2011
Dedicatoria
A Dios “si existe”, por darme esperanza.
A mis padres (Álvaro y Alicia), por su incansable apoyo.
A mis hermanos, por su soporte.
A mi esposa Teresita, por su amor y compañía.
y…
A mi preciosa hija Marianita, por alegrarme la vida, y ser mi razón de existir.
Agradecimientos
Al Dr. Aureliano Hernández, por su ejemplo, amistad e infalibles consejos; y
especialmente por su longanimidad e invaluable ayuda.
Al Dr. Hernán Niño, por su gran colaboración durante la fase experimental, y por
compartir su experiencia.
A la Dra. Paola Maradei, por proporcionarnos los embriones necesarios para los ensayos
durante la fase de estandarización.
Al Ing. Eduardo Roa por brindarme su apoyo durante la toma de muestras.
Al Dr. Eduardo Caminos, por permitir hacer uso del laboratorio de bioquímica de la
Facultad de Medicina.
A las Dras. Elena Casey, Doreen Cunningham, y Crystal Rogers del Departamento de
Biología de la Universidad de Georgetown (USA), por sus enseñanzas y amistad durante
la pasantía internacional.
A Rafael, Arlen, e Isa, amigos de siempre.
Este trabajo fue financiado por la división de investigación de la sede Bogotá (DIB), la
vicerrectoría de investigación (UNal) y por el programa de créditos condonables de
COLCIENCIAS.
Resumen y Abstract
IX
Resumen
Con el objetivo de establecer el posible efecto de dos diferentes alturas en el peso
embrionario y en la vascularización de las membranas extraembrionarias, se incubaron
embriones de pollo a 355 y 1378msnm, y el día 3 y 4 de incubación, lo mismo que en el
día 6 y 7 de incubación: se midió el peso del embrión y de las membranas
extraembrionarias (día 3 y 4: saco vitelino - día 6 y 7 corioalantoides); se estimó el área
vascular media, el porcentaje capilar y el área capilar media del saco vitelino y de la
corioalantoides; se describió y cuantificó la inmunoexpresión del HIF-2α, del VEGF-A y
de su receptor FLK-1 en las células del saco vitelino y en la corioalantoides; y se realizó
la cuantificación relativa de la expresión del mRNA de las anteriores proteínas en el saco
vitelino y en la corioalantoides mediante q-PCR. Los resultados de esta investigación
mostraron que ni el peso del embrión ni del saco vitelino presentan diferencia
estadísticamente significativa el día 3 y el día 4 en los embriones incubados en las dos
diferentes alturas; no obstante que si hubo diferencia estadísticamente significativa en el
área vascular media (p:< 0.05), el porcentaje capilar (p:< 0.05), el día 3 y el día 4; del
porcentaje de células positivas a la expresión de VEGF-A (p: 0.05) y FLK-1 (p:< 0.05) el
día 3, y del porcentaje de células positivas a la expresión de HIF-2α (p: 0.05) y FLK-1 (p:
0.05) el día 4; y de la expresión relativa del mRNA del HIF-2α, VEGF-A y de su receptor
FLK-1 el día 3 y el día 4 (p:< 0.001 para la expresión relativa del mRNA de todos los tres
genes el día 3; y p: 0.01; < 0.01; < 0.001 para la expresión relativa del mRNA de los
respectivos genes el día 4) en los embriones incubados a 1378msnm. Además mediante
tinción inmunohistoquímica se encontraron células positivas a HIF-2α y VEGF-A en el
endodermo, endotelio y ectodermo; y células positivas a FLK-1 únicamente en el
endotelio. Además, los resultados de la presente investigación también mostraron que ni
el peso del embrión ni el de la corioalantoides presentan diferencia estadísticamente
significativa el día 6 y el día 7 en los embriones incubados en las dos diferentes alturas; a
pesar de que se presentó diferencia estadísticamente significativa en el área vascular
media (p:< 0.05), el porcentaje capilar (p: 0.05) y el área capilar media (p:< 0.05); del
X
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del saco
vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la expresión
de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
porcentaje de células positivas a la expresión de HIF-2α (p:< 0.05) y FLK-1 (p:< 0.05); y
de la expresión relativa del mRNA del HIF-2α (p:< 0.05) y del FLK-1 (p:< 0.01), el día 6
de incubación, en los embriones incubados a 1378msnm. Además mediante tinción
inmunohistoquímica se encontraron células positivas a HIF-2α y VEGF-A en el
endodermo, mesodermo, endotelio y ectodermo; y células positivas a FLK-1 en el
mesodermo y en el endotelio de la corioalantoides. De los resultados se concluyó que el
nivel de hipoxia (dada por la altura: 1378msnm) a la cual fueron sometidos los embriones
en esta investigación si afecta la expresión tanto del HIF-2α, como del VEGF-A y de su
receptor FLK-1 en el saco vitelino, el día 3 y 4 de incubación; pero únicamente la
expresión del HIF-2α y el FLK-1 en la CAM el día 6 de incubación. Además, que dichos
cambios en la expresión se reflejan en un aumento en la vascularización del saco vitelino
y la corioalantoides. Y que la hipoxia a la cual fueron sometidos los embriones (dada por
la altura: 1378msnm) no afecta el peso del embrión ni tampoco el del saco vitelino (el día
3 y 4) ni la corioalantoides (el día 6 y 7), bien sea porque dicho nivel de hipoxia no fue lo
bastante severo para producir hipometabolismo, o bien, porque el aumento en la
vascularización fue suficiente para contrarrestar la hipoxia. Finalmente, los resultados
muestran que el día 7 de incubación del embrión del pollo, es un tiempo de transición
muy importante durante el desarrollo de la corioalantoides, y como una falla en el
crecimiento vascular de dicha membrana en respuesta a la hipoxia podría conducir a
hipometabolismo con la concomitante reducción en el peso del embrión observada en los
diferentes estudios en los que se han sometido embriones de pollo a hipoxia, y en los
que se ha medido el peso del embrión después del día 7 de incubación.
Palabras
clave:
hipoxia
hipobárica,
embrión
del
pollo,
saco
vitelino,
corioalantoides, vascularización, HIF-2α, VEGF-A, FLK-1
Abstract
To evaluate the posible effect of two different altitudes on the embryonic weight and in the
extraembryonic vascularization, chicken embryos were incubated at 355 and 1378masl,
and on day three and four, and on day six and seven: the embryonic and extraembryonic
weight were measured (day three and four: yolk sac – day six and seven: chorioallantois);
Contenido
XI
the vascular media area, capillary percentage and capillary media area in the yolk sac
and chorioallantois were estimated; the immunoexpression of HIF-2α, VEGF-A and its
FLK-1 receptor were described and quantified in the yolk sac and chorioallantoic
membrane; the quantification of relative mRNA expression of the above proteins in the
yolk sac and chorioallantois was made using q-PCR. The results showed that neither
embryonic weight nor yolk sac weight had statistical significant difference on day three
and four on the embryos incubated at two different altitudes; nevertheless that there was
statistical significant difference in the vascular media area (p:< 0.05), capillary percentage
(p:< 0.05), on day three and four; of the positive cells percentage immunoreactives to
VEGF-A (p: 0.05) and FLK-1 (p:<0.05) on day three, and the positive cells percentage
immunoreactives to HIF-2α (p: 0.05) and FLK-1 (p: 0.05) on day four; and the relative
mRNA expression of HIF-2α, VEGF-A and its FLK-1 receptor on day three and four (p:<
0.001 for the relative mRNA expression of the above genes on day three; and p: 0.01; <
0.01; < 0.001 for relative mRNA expression of the respective genes on day four) on the
embryos incubated at 1378masl. Additionally, by immunohistochemistry staining, positive
cells immunoreactives to HIF-2α and VEGF-A were found in the endoderm, endothelium
and ectoderm; and positive cells immunoreactives to FLK-1 were found only in the
endothelium. Furthermore, the results showed that neither embryonic weight nor
chorioallantoic weight had statistical significant difference on day six and seven in the
embryos incubated at two different altitudes; nevertheless that there was statistical
significant difference in the vascular media area (p:< 0.05), capillary percentage (p: 0.05)
and capillary media area (p:< 0.05); of the positive cells percentage immunoreactives to
HIF-2α (p:< 0.05) and FLK-1 (p:< 0.05); and the relative mRNA expression of HIF-2α (p:<
0.05) and FLK-1 (p:< 0.01) on day six but not on day seven, on the embryos incubated at
1378masl. Moreover, by immunohistochemistry staining, positive cells immunoreactives
to HIF-2α and VEGF-A were found in the endoderm, mesoderm, endothelium and
ectoderm; and positive cells immunoreactives to FLK-1 were found in the chorioallantoic
mesoderm and endothelium. On the basis of present results, it was concluded that the
level of hypobaric hypoxia affects the expression of HIF-2α, VEGF-A and its FLK-1
receptor in the yolk sac, on day three and four of incubation; and the expression of HIF2α, and FLK-1 in the chorioallantoic membrane, on day six of incubation. The absence of
effects seen on the the embryonic and extraembrionic weight on the embryos submitted
to hypoxia, might be due to the hypoxia level was not severe enough to produce
hypometabolism, or because the increase in the vascularization in the extraembryonic
XII
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del saco
vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la expresión
de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
membranes was enough to diminish the hypoxia effects; although it is expected that from
the end of first week of incubation, there should be a delay on embryonic growth, which
will conduce to low birth weight as it was observed on the present work.
Keywords: hypobaric hypoxia, chicken embryo, yolk sac, chorioallantois,
vascularization, HIF-2α, VEGF-A, FLK-1
Contenido
XIII
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................ XVI
Lista de tablas ........................................................................................................... XVIII
Abreviaturas ................................................................................................................ XIX
Introducción..................................................................................................................... 1
Objetivos .......................................................................................................................... 6
1. Desarrollo embrionario, extraembrionario y vascular ........................................... 7
1.1
Desarrollo embrionario aviar ............................................................................ 7
1.1.1
Fertilización ........................................................................................... 7
1.1.2
Clivaje ................................................................................................... 7
1.1.3
Mórula ................................................................................................... 8
1.1.4
Blastulación........................................................................................... 8
1.1.5
Gastrulación .......................................................................................... 9
1.1.6
Diferenciación del mesodermo ............................................................ 10
1.1.7
Estructuras mesodérmicas .................................................................. 10
1.1.8
Estados del desarrollo Hamburger y Hamilton del día 2 al 7 ............... 11
1.2
Desarrollo extraembrionario ........................................................................... 12
1.2.1
Saco vitelino........................................................................................ 13
1.2.2
Amnios ................................................................................................ 15
1.2.3
Córion ................................................................................................. 16
1.2.4
Alantoides ........................................................................................... 17
1.2.5
Corioalantoides ................................................................................... 18
1.3
Vasculogénesis y angiogénesis ..................................................................... 20
1.3.1
Vasculogénesis ................................................................................... 21
1.3.2
Vasculogénesis extra e intraembrionaria ............................................. 30
1.3.3
Angiogénesis ...................................................................................... 32
1.4
Desarrollo vascular extra e intraembrionario .................................................. 33
1.4.1
Vascularización extraembrionaria ....................................................... 33
1.4.2
Desarrollo vascular embrionario .......................................................... 36
1.5
Respiración embrionaria ................................................................................ 37
1.5.1
Periodos de la respiración embrionaria aviar ....................................... 38
1.5.2
Transporte del oxígeno en el embrión aviar ........................................ 41
1.5.3
Regulación del oxígeno ....................................................................... 43
1.5.4
Desarrollo embrionario en condiciones hipóxicas ................................ 45
1.5.5
Hipoxia y vascularización extraembrionaria ......................................... 49
XIV
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2. Peso embrionario y desarrollo vascular e inmunoexpresión y expresión relativa
del HIF-2α, VEGF-A y FLK-1 en el saco vitelino de pollos incubados a 355 y
1378msnm el día 3 y 4 de incubación ...........................................................................51
2.1
Resumen ........................................................................................................51
Abstract ....................................................................................................................52
2.2
Introducción....................................................................................................53
Objetivos............................................................................................................56
2.3
Materiales y métodos .....................................................................................56
2.3.1
Incubación ...........................................................................................56
2.3.2
Extracción y exposición .......................................................................57
2.3.3
Fotografías ..........................................................................................57
2.3.4
Pesaje .................................................................................................57
2.3.5
Fijación y congelación..........................................................................57
2.3.6
Tinción .................................................................................................58
2.3.7
Descripción ..........................................................................................58
2.3.8
Evaluación morfométrica .....................................................................59
2.3.9
Cuantificación de la inmunoexpresión ..................................................66
2.3.10 Cuantificación de la expresión del mRNA ............................................66
2.3.11 Análisis estadístico ..............................................................................68
2.4
Resultados .....................................................................................................69
2.4.1
Condiciones de incubación ..................................................................69
2.4.2
Peso del SV y del embrión ...................................................................71
2.4.3
Evaluación morfométrica .....................................................................72
2.4.4
Descripción ..........................................................................................75
2.4.5
Cuantificación de la inmunoexpresión ..................................................81
2.4.6
Cuantificación de la expresión del mRNA (qPCR) ...............................83
2.5
Discusión........................................................................................................90
2.5.1
Condiciones de incubación ..................................................................90
2.5.2
Peso del SV y del embrión ...................................................................90
2.5.3
Área capilar, área vascular media, y porcentaje capilar .......................92
2.5.4
Inmunoexpresión del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1 .................93
2.5.5
Expresión relativa del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1 ................96
3. Peso embrionario y desarrollo vascular e inmunoexpresión y expresión relativa
del HIF-2α, VEGF-A y FLK-1 en la alantoides de pollos incubados a 355 y
1378msnm el día 6 y 7 de incubación ...........................................................................97
3.1
Resumen ........................................................................................................97
Abstract ....................................................................................................................98
3.2
Introducción....................................................................................................99
Objetivos: .........................................................................................................103
3.3
Materiales y métodos ...................................................................................104
3.3.1
Incubación .........................................................................................104
3.3.2
Extracción y exposición .....................................................................104
3.3.3
Fotografías ........................................................................................105
3.3.4
Pesaje ...............................................................................................105
3.3.5
Fijación y congelación........................................................................105
3.3.6
Tinción ...............................................................................................105
3.3.7
Descripción ........................................................................................106
3.3.8
Evaluación morfométrica ...................................................................106
3.3.9
Análisis estadístico ............................................................................115
Contenido
3.4
XV
Resultados................................................................................................... 116
3.4.1
Condiciones de incubación ............................................................... 116
3.4.2
Peso de la CAM y del embrión .......................................................... 119
3.4.3
Descripción. ...................................................................................... 123
3.4.4
Cuantificación de la inmunoexpresión ............................................... 129
3.4.5
Cuantificación de la expresión del mRNA (qPCR) ............................. 131
3.5
Discusión ..................................................................................................... 138
3.5.1
Condiciones de incubación ............................................................... 138
3.5.2
Peso de la CAM y del embrión .......................................................... 138
3.5.3
Área capilar, área vascular media, y porcentaje capilar..................... 140
3.5.4
Inmunoexpresión del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1 .............. 141
3.5.5
Expresión relativa del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1 ............. 143
4. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 145
4.1
Discusión general y conclusiones ................................................................ 145
4.1.1
Modelo de expresión del HIF-2α, VEGF-A y FLK-1 en el SV ............. 145
4.1.2
Modelo de expresión del HIF-2α, VEGF-A y FLK-1 en la CAM.......... 148
4.2
Recomendaciones ....................................................................................... 158
Bibliografía .................................................................................................................. 159
Contenido
XVI
Lista de figuras
Pág.
Figura 1-1: Membranas extraembrionarias del pollo (SV)............................................... 15
Figura 1-2: Membranas extraembrionarias del pollo (CAM). .......................................... 17
Figura 2-1: Foto embrión y SV día 3 (355msnm). ........................................................... 60
Figura 2-2: Foto embrión y SV día 3 (1378msnm). ......................................................... 60
Figura 2-3: AVMSV dia 3 (355msnm). ............................................................................. 61
Figura 2-4: AVMSV dia 3 (1378msnm). ........................................................................... 61
Figura 2-5: Foto embrión y SV día 4 (355msnm). ........................................................... 62
Figura 2-6: Foto embrión y SV día 4 (355msnm). ........................................................... 62
Figura 2-7: AVMSV dia 4 (355msnm). ............................................................................. 63
Figura 2-8: AVMSV dia 4 (1378msnm). ........................................................................... 63
Figura 2-9: Microfotografía SV. ...................................................................................... 64
Figura 2-10: Electroforesis de la RT-PCR mRNA genes de interés. ............................... 67
Figura 2-11: Condiciones de incubación del día 3 al 4 de embriones incubados a 355 y
1378msnm. ..................................................................................................................... 70
Figura 2-12: Peso del SV y del embrión los días 3 y 4 de embriones incubados a 355 y
1378msnm. ..................................................................................................................... 72
Figura 2-13: Evaluación morfométrica del SV los días 3 y 4 de embriones incubados a
355 y 1378msnm. ........................................................................................................... 74
Figura 2-14: Descripción histológica del SV. .................................................................. 76
Figura 2-15: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti HIF-2α en el SV. ....... 78
Figura 2-16: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti VEGF-A en el SV. .... 79
Figura 2-17: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti FLK-1 en el SV. ........ 80
Figura 2-18: % de células que expresan HIF-2α, VEGF-A y, FLK-1 en el SV de
embriones incubados a 355 y 1378msnm. ...................................................................... 82
Figura 2-19: Expresión relativa del HIF-2α en el SV el día 3 y 4 de incubación. ............. 85
Figura 2-20: Expresión relativa del VEGF-A en el SV el día 3 y 4 de incubación. .......... 86
Figura 2-21: Expresión relativa del FLK-1 en el SV el día 3 y 4 de incubación. .............. 87
Figura 3-1: Foto embrión y CAM día 6 (355msnm)....................................................... 107
Figura 3-2: Foto embrión y CAM día 6 (1378msnm). .................................................... 107
Figura 3-3: AVMCAM dia 6 (355msnm). ......................................................................... 108
Figura 3-4: AVMCAM dia 6 (1378msnm). ....................................................................... 108
Figura 3-5: Foto embrión y CAM día 7 (355msnm)....................................................... 109
Contenido
XVII
Figura 3-6: Foto embrión y CAM día 7 (1378msnm). ....................................................109
Figura 3-7: AVMCAM dia 7 (355msnm). ..........................................................................110
Figura 3-8: AVMCAM dia 7 (1378msnm). ........................................................................110
Figura 3-9: Microfotografía CAM...................................................................................111
Figura 3-10: Electroforesis de la RT-PCR mRNA genes de interés. ............................. 114
Figura 3-11: Condiciones de incubación del día 6 al 7 de embriones incubados a 355 y
1378msnm. ...................................................................................................................118
Figura 3-12: Peso de la CAM y del embrión los días 6 y 7 de embriones incubados a 355
y 1378msnm. .................................................................................................................120
Figura 3-13: Evaluación morfométrica de la CAM los días 6 y 7 de embriones incubados
a 355 y 1378msnm. .......................................................................................................122
Figura 3-14: Descripción histológica del CAM. ............................................................. 124
Figura 3-15: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti HIF-2α en la CAM. ..126
Figura 3-16: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti VEGF-A en la CAM. 127
Figura 3-17: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti FLK-1 en la CAM. ...128
Figura 3-18: % de células expresando HIF-2α, VEGF-A y, FLK-1 en la CAM de
embriones incubados a 355 y 1378msnm .....................................................................130
Figura 3-19: Expresión relativa del HIF-2α en la CAM el día 6 y 7 de incubación. ........133
Figura 3-20: Expresión relativa del VEGF-A en la CAM el día 6 y 7 de incubación. ......134
Figura 3-21: Expresión relativa del FLK-1 en la CAM el día 6 y 7 de incubación. .........135
Figura 4-1: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αSV - ∆CTVEGF-ASV ..........................................152
Figura 4-2: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αSV - ∆CTFLK-1SV ..............................................153
Figura 4-3: Regresión lineal: ∆CTVEGF-ASV - ∆CTFLK-1SV............................................154
Figura 4-4: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αCAM - ∆CTVEGF-ACAM ......................................155
Figura 4-5: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αCAM - ∆CTFLK-1CAM ..........................................156
Figura 4-6: Regresión lineal: ∆CTVEGF-ACAM - ∆CTFLK-1CAM........................................157
Contenido
XVIII
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2-1: Secuencias iniciadores q-PCR. ..................................................................... 68
Tabla 2-2: Análisis de varianza (ANOVA). ...................................................................... 88
Tabla 3-1: Secuencias iniciadores q-PCR. ................................................................... 115
Tabla 3-2: Analisis de Varianza (ANOVA). ................................................................... 136
Contenido
XIX
Abreviaturas
Abreviatura
Término
SV
Saco vitelino
PesoE
Peso embrionario
PesoSV
Peso del saco vitelino
ÁreaSV
Área del saco vitelino
AVMSV
Área vascular media del saco vitelino
ACMSV
Área capilar media del saco vitelino
%CapilarSV
Porcentaje capilar del saco vitelino
%Cel.HIF-2αSV
Porcentaje de células positivas a HIF-2α en el saco vitelino
%Cel.VEGF-ASV
Porcentaje de células positivas a VEGF-A en el saco vitelino
%Cel.FLK-1SV
Porcentaje de células positivas a FLK-1 en el saco vitelino
∆CTHIF-2αSV
∆CT del HIF-2α en el saco vitelino
∆CTVEGF-ΑSV
∆CT del VEGF-A en el saco vitelino
∆CTFLK-1SV
∆CT del FLK-1 en el saco vitelino
CAM
Corioalantoides
PesoCAM
Peso de la corioalantoides
ÁreaCAM
Área de la corioalantoides
AVMCAM
Área vascular media de la corioalantoides
ACMCAM
Área capilar media de la corioalantoides
%CapilarCAM
Porcentaje capilar de la corioalantoides
%Cel.HIF-2αCAM
Porcentaje de células positivas a HIF-2α en la corioalantoides
%Cel.VEGF-ACAM
Porcentaje de células positivas a VEGF-A en la corioalantoides
%Cel.FLK-1CAM
Porcentaje de células positivas a FLK-1 en la corioalantoides
∆CTHIF-2αCAM
∆CT del HIF-2α en la corioalantoides
∆CTVEGF-ΑCAM
∆CT del VEGF-A en la corioalantoides
∆CTFLK-1CAM
∆CT del FLK-1 en la corioalantoides
Introducción
El Oxígeno (O2) es esencial para el desarrollo de la vida de los organismos aerobios, y
por lo tanto es importante un suministro adecuado de O2 para todos los organismos
superiores puesto que este sirve como el aceptor final de electrones en la fosforilación
oxidativa mitocondrial, y debido a que diversos procesos enzimáticos requieren del O2
molecular como un sustrato (Wenger, 2000). Tanto las aves como los mamíferos ocupan
similares hábitats, aunque las primeras, logran alcanzar más grandes altitudes que los
segundos (Bouverot, 1978). Paul Bert (1878) fue el primero en demostrar que el principal
desafío fisiológico en la altitud es la disminución en la presión barométrica - PB (la
presión del aire atmosférico): La PB cae exponencialmente con la distancia arriba a la
superficie de la tierra (West, 1991). El efecto fisiológico fundamental de la disminución de
la PB (hipobaria) en la altitud se debe a la concomitante disminución en la presión
parcial de O2 (PO2) – que es la presión del O2 sin tener en cuenta los demás
componentes gaseosos del aire atmosférico (Dejours y Dejours, 1992). Los experimentos
de Paul Bert acerca de los efectos de la PB, condujeron a la conclusión de que la
disminución en la PB afecta las proporciones del O2 en la sangre (Bert, 1878). Entonces,
la disminución en la PO2 atmosférica conduce a una disminución en la PO2 en la sangre
(West, 1991).
Los estudios de la disminución en la PB han demostrado que la hipobaria genera de por
si efectos fisiológicos (como por ejemplo cambios en la ventilación) aunque estos son
menos robustos que la respuesta a la hipoxia per se (Loeppky y col., 1997).
Además de la disminución en la PO2, la altitud presenta otros desafíos para las especies
que allí se desarrollan, como el frío y la resequedad (Visschedijk, 1980). Existen varias
maneras de calcular el enfriamiento con el aumento de altitud, pero en general se estima
que la temperatura disminuye alrededor de 6°C por cada mil metros más de altitud
(Bouverot, 1985), y en las aves, se ha visto que una sostenida disminución en la
2
Introducción
temperatura, provoca una disminución en el crecimiento embrionario (Mortola, 2006). El
problema con la resequedad en la altitud, es que los animales homeotermos incrementan
las proporciones de agua evaporada durante la exhalación (Paganelli y col., 1975). Si
aumenta la proporción de agua en el aire, disminuyen las demás proporciones de gases
en el mismo (incluido el O2), decreciendo aún más la PO2 en dichos ambientes (Luft,
1965). Además, se ha visto que los embriones incubados en ambientes húmedos tienen
una capacidad de transporte del O2 disminuida (Mortola, 2006).
Se han realizado distintos estudios para ver en qué radica la adaptación de las especies
que viven en la altitud. Lo primero que hay que saber, es que en general las aves toleran
mejor la altitud que los mamíferos. Uno de los rasgos distintivos de dicha clase animal,
que la hace mejor adaptada a la altitud, es su sistema respiratorio (Brown y col., 1997):
tienen sacos aéreos para la ventilación (Magnussen y col., 1976), parabronquios para el
intercambio gaseoso (Scheid y Piiper, 1986), un arreglo bronquial en paralelo y en serie,
y un flujo de aire unidireccional que les confiere un intercambio gaseoso más eficiente.
Igualmente, se ha encontrado que las aves tienen mayor capacidad de tolerar la alcalosis
respiratoria, permitiéndoles hiperventilar más de lo que lo hacen los mamíferos,
conservando así más O2 (Powell, 2004).
A pesar de que las aves están mejor adaptadas a la altitud, en aquellas no residentes, o
domesticadas en tierras bajas como por ejemplo el pollo doméstico (Gallus domesticus)
cuando son llevadas a ambientes hipóxicos, pueden, si son susceptibles, desarrollar
hipertensión arterial pulmonar (Julian, 1993).
Así como la disponibilidad de O2 es de gran importancia para las aves y mamíferos, esta
molécula también es un determinante crítico para el normal desarrollo embrionario y fetal
(Liu y col., 2009). Aunque los mecanismos exactos por medio de los cuales el embrión o
feto son sensibles a los cambios en el O2 ambiental no se han dilucidado completamente,
se sabe que éste responde a cambios en la oxigenación en los cuales el O2 es limitante.
Puesto que el interés de la presente investigación se centra en el desarrollo embrionario
bajo condiciones de hipoxia hipobárica es importante mencionar algunas de las
adaptaciones fisiológicas del embrión o feto a la hipoxia, descritas hasta ahora:
Introducción
3
Durante la hipoxia, el gasto ventricular se redirige hacia órganos clave, como por ejemplo
el cerebro (Cohn y col., 1974; Mulder y col., 1998). En dichos periodos de hipoxia, la
mencionada redistribución ventricular se acompaña también de redistribución del flujo
sanguíneo umbilical: en los momentos de hipoxemia (baja PO2 en la sangre) se aumenta
el flujo a través del ducto venoso en el hígado, entrando a la vena cava caudal, de donde
es enviada luego de ser devuelta al corazón por el agujero oval a la región anterior del
cuerpo supliendo al cerebro (Mulder y col., 2000; Kiserud y col., 2001; Mulder y col.,
2002). También se ha mostrado que existe una disminución del flujo sanguíneo de la
membrana corioalantoidea en respuesta a la hipoxia (Ar y col., 1991). Dicha
redistribución se logra por medio del control regional del tono de la microvasculatura en
respuesta a la concentración del O2. Sin embargo, algunos investigadores sugieren que
aún si la hipoxia modifica la perfusión en la CAM, dicho efecto debe no alterar el
transporte del O2 (Wagner-Amos y Seymor, 2003; León-Velarde y Monge, 2004).
Además, se ha encontrado que el sistema cardiovascular del feto es capaz de responder
a la hipoxemia disminuyendo la frecuencia cardiaca, para favorecer el consumo de O2
por parte del músculo cardiaco (Cohn y col., 1974). Dicha bradicardia ha sido bien
documentada en los embriones de pollo expuestos a hipoxia (Tazawa, 1981; Crossley y
col., 2003); sin embargo, si la hipoxemia continúa, la disminución inicial en la frecuencia
cardiaca poco a poco va desapareciendo. Se debe decir, que tal respuesta inicial en la
disminución en la frecuencia cardiaca, es ausente en los estadios tempranos de
desarrollo, posiblemente por la inmadurez de los mecanismos neuronales (Stein y col.,
1999). Y en general, puede decirse, que la mayoría de respuestas efectivas a la hipoxia
sostenida (decrecimiento en la termogénesis, vasoconstricción periférica, incremento en
la ventilación pulmonar, gasto cardiaco, y del hematocrito) presentes en el adulto, son
mínimamente funcionales en las fases tempranas de desarrollo embrionario (Azzam y
Mortola, 2007). En términos generales, se dice que durante la mayoría del periodo de la
incubación, las respuestas a la hipoxia afectan principalmente el funcionamiento del
corazón, ya que el control neural de la función vascular comienza tan solo en la última
semana de incubación (Crossley y Altamiras, 2000).
En el embrión (o feto) durante periodos de exposición a la hipoxia, se presenta un
aumento en la elaboración de las catecolaminas, las cuales posiblemente desempeñan
su papel frente a la hipoxemia mediante el aumento del tono vascular (Schuijers y col.,
4
Introducción
1986), que a su vez contrarresta la disminución de la frecuencia cardiaca en los casos de
hipoxia crónica (Jones y col., 1988). Al final, en los episodios de hipoxia crónica, la
abolición de la disminución de la frecuencia cardiaca, y la vasoconstricción periférica por
las catecolaminas favorece la irrigación sanguínea, y con ella la oxigenación de los
lechos capilares de órganos importantes. En el caso del embrión aviar, se ha encontrado
un incremento en las catecolaminas plasmáticas en condiciones de hipoxia. Dichos
embriones expuestos a hipoxia cuando fueron tratados con agentes adrenérgicos
incrementaron la PO2 y la saturación sanguínea de O2 (Wittmann y Prechtl, 1991). Así
mismo, los embriones de pollo expuestos a moderada hipoxia crónica, desarrollaron hiper
inervación simpática, del sistema arterial (Ruijtenbeek y col., 2000). Hallazgo importante,
puesto que al parecer, una vez que se establece la hiper inervación simpática del sistema
cardiovascular, ésta persiste a través de toda la vida de dicho individuo.
Se ha encontrado además respuesta a la hipoxia por parte de otros moduladores
vasculares tales como el Óxido Nítrico (NO) y las Endotelinas. En el caso del NO se ha
visto que este juega un papel importante en el feto, manteniendo el flujo sanguíneo a la
corteza cerebral durante la hipoxia (Hunter y col., 2003). Las Endotelinas por otro lado
ejercen efectos vasodilatadores o vasoconstrictores en respuesta a la hipoxia
dependiendo del lecho vascular y de la proporción de receptores para Endotelina-A (vaso
constricción) o, Endotelina-B (vasodilatación) (Chatfield y col., 1991).
Un importante tipo de respuesta a la hipoxia es la metabólica. En el feto, el metabolismo
está dirigido a aumentar el tamaño de los órganos y su complejidad. Durante los
episodios de hipoxia, los fetos intrínsecamente son capaces de reducir la demanda de O2
de los tejidos (Mortola, 2001). En las aves domésticas, se ha visto que una disminución
en la actividad metabólica del embrión en estados tardíos del desarrollo, acoplada a una
tasa más lenta de desarrollo embrionario, es un factor importante en la adaptación a la
hipoxia hipobárica (Beattie y Smith, 1975; Ar y col., 1991; Tazawa y col., 1992). Al
parecer, dichas respuestas hipometabólicas a la hipoxia son reflejos centrales en los
centros termorreguladores hipotalámicos (Mortola, 2009).
Además, muchas aves criadas en la altitud ponen huevos con cáscaras que tienen
reducida conductancia al vapor de agua; y se cree que ésta puede darse por
aclimatación y probablemente ser estimulada por la hipoxia (Packard y col, 1977; Rahn y
Introducción
5
col., 1977; Carey y col., 1983; Hempleman y col., 1993). En contraposición, algunos
investigadores han encontrado un incremento en la conductancia de la cáscara, en
huevos puestos por aves de vida silvestre por encima de los 3000 metros de altitud sobre
el nivel del mar - msnm (Carey y col., 1982) de tal manera, que se cree que la prioridad
del diseño de la cáscara cambia a altitudes por encima de los 3000 metros, para mejorar
la disponibilidad del O2 a expensas de mayores pérdidas de vapor de agua (Carey,
1986).
Los trabajos de León-Velarde y colaboradores (1991), en los que reportan que los pollos
de las grandes altitudes del Perú han evolucionado una hemoglobina (Hb) con una alta
afinidad por el O2, sugieren que podría existir una adaptación genética como respuesta a
la hipoxia. En otro estudio más reciente, con pollos de regiones altas, quienes habían
vivido en la altitud por al menos seis generaciones, se encontró que dicha residencia en
la altitud les confería protección contra los efectos deletéreos de la hipoxia. Sin embargo,
no se sabe, si existe la posibilidad de que la hipoxia hipobárica, pueda conferirle, a las
aves, protección a través de mecanismos epigenéticos (que son las alteraciones en la
regulación genética que ocurre sin un cambio en la secuencia de DNA) (Giussani y col.,
2007). Puesto que desde hace tiempo se ha visto que la adaptación genética a la altitud
podría ser adquirida (Rahn y col., 1982), y ya que algunos marcadores epigenéticos son
heredables, como la metilación CpG, se abre la posibilidad de que las adaptaciones a la
hipoxia hipobárica puedan transferise de una generación a otra, en tiempos
comparativamente más cortos (Spicer y Burggren, 2003).
Dado que el huevo aviar contiene todos los materiales necesarios para el desarrollo
embrionario excepto el O2, el cual difunde hacia adentro desde el ambiente exterior a
través de los poros de la cáscara, y luego a las membranas extraembrionarias, a decir:
saco vitelino (SV) y corioalantoides (CAM), que son los órganos respiratorios del
embrión, investidos en gran proporción por vasos sanguíneos; se ha propuesto que un
incremento en el número de dichos vasos sanguíneos en tales membranas, podría
compensar la hipoxia hipobárica (Reizis y col., 2005), no obstante, los resultados han
sido controvertidos (Wangensteen y Rahn, 1970/1971; Rahn y Paganelli, 1974; Tullet y
Deeming, 1982; Adair y col., 1987; Strick y col., 1991; Richards y col., 1991/1992; Burton
y Palmer, 1992; Hoper y Jahn, 1995).
6
Introducción
Objetivos
General
Establecer si existían diferencias en el peso embrionario (PesoE) y en la vascularización
de las membranas extraembrionarias (SV, CAM), de pollos incubados en dos diferentes
condiciones de altitud (PO2).
Específicos
• Determinar el PesoE y del SV (PesoSV), de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 3 y 4 de incubación.
• Cuantificar el área vascular media (AVM), el porcentaje Capilar (%Capilar), y el área
capilar media (ACM) del SV, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm,
los días 3 y 4 de incubación.
• Describir y cuantificar la inmunoexpresión del factor inducible por la hipoxia (HIF-2α),
del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) y su receptor FLK-1 en el SV, de
embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm, los días 3 y 4 de incubación.
• Realizar la cuantificación relativa de la expresión del mRNA del HIF-2α, del VEGF-A y
su receptor FLK-1 en el SV, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm,
los días 3 y 4 de incubación.
• Determinar el PesoE y PesoCAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 6 y 7 de incubación.
• Cuantificar el área vascular media (AVM), el porcentaje Capilar (%Capilar), y el área
capilar media (ACM) de la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 6 y 7 de incubación.
• Describir y cuantificar la inmunoexpresión del HIF-2α, del VEGF-A y su receptor FLK-1
en la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm, los días 6 y 7 de
incubación.
• Realizar la cuantificación relativa de la expresión del mRNA del HIF-2α, del VEGF-A y
su receptor FLK-1 en la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 6 y 7 de incubación.
1. Desarrollo
vascular
embrionario,
extraembrionario
y
1.1 Desarrollo embrionario aviar
Los estadios más tempranos del desarrollo en el embrión aviar, desde la fertilización
hasta la formación del blastodermo, ocurren antes de la oviposición (Patten, 1964).
1.1.1 Fertilización
El óvulo aviar está formado por una singular célula de unos 3 cm de diámetro, en el que
la mayoría del contenido es vitelo rodeado por la membrana plasmática. El núcleo del
huevo y el citoplasma asociado se localiza periféricamente en una región llamada la
vesícula germinal. El vitelo debajo de ésta estructura es claro y menos denso que el
remanente vitelo amarillo, haciendo que la vesícula germinal se ubique en la región más
alta del oocito. Células foliculares rodean al oocito y bombean vitelo de la sangre, que
previamente fue sintetizado en el hígado materno. La ruptura del folículo libera al oocito
(que previamente pasó por la primera división reduccional) para ser fertilizado en el
oviducto. Cuando el espermatozoide penetra la membrana vitelina derivada del folículo
ocurre la segunda división reduccional. La resultante célula después de la fertilización es
llamada blastodisco (el cigoto). Movimientos peristálticos llevan el huevo fuera del
oviducto (Bellairs y Osmond, 1998).
1.1.2 Clivaje
Inmediatamente después de la fertilización el huevo entra en una serie de divisiones
mitóticas que se conoce como el proceso de clivaje. En las aves el clivaje toma lugar
antes de que el huevo sea puesto, es decir, durante el tiempo de su travesía por el
oviducto. Se debe tener en cuenta que aunque el vitelo (que es el material almacenado
para la nutrición del embrión) no se divide, este sí afecta a las divisiones celulares del
8
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
―huevo propiamente dicho‖ (representado por un área circular de unos 3 mm, dentro del
gran vitelo que comúnmente se conoce como yema). La cantidad de vitelo en las aves
hace que las divisiones sean del tipo meroblástico; es decir, en forma parcial, ya que las
células que contactan con el vitelo se dividen solo en un extremo, dividiéndose
totalmente a medida que se pierde el contacto con el vitelo (Olsen, 1942; Anne y Gilbert,
1997). Las primeras dos divisiones de clivaje ocurren dentro de unas pocas horas
después de la fertilización. El tercer clivaje coincide con la aplicación de las membranas
de la cáscara. El cuarto clivaje divide al blastodisco bilateralmente y ocurre justamente
cuando se está formando la cáscara (Bellairs y Osmond, 2008).
1.1.3 Mórula
Al final del periodo de clivaje el huevo se convierte en un disco más o menos denso de
varias capas celulares (el blastodermo) que descansan sobre el vitelo (Duval, 1884);
estado que corresponde a la mórula observada al final del clivaje en el mamífero (Gilbert,
1997). Subsecuentemente el blastodermo comienza a expandirse sobre el vitelo, y la
región marginal de células más externas recibe el nombre de área opaca, y llega a
hacerse especializada en engolfar el vitelo adyacente. La región más central, recibe el
nombre de área pelúcida. Esta área comprende una capa superficial de células
conocidas como epiblasto, del cual se derivan los tejidos embrionarios. La capa profunda
de grandes células del área pelúcida comprende el hipoblasto, el cual conformará el
endodermo extraembrionario. A este estado el huevo es puesto, y de acuerdo con
Hamburger y Hamilton (1951), corresponde al estado 1 (HH1) con cerca de 60000
células.
1.1.4 Blastulación
El estado de mórula dura poco tiempo. Casi tan pronto como ésta se establece, se forma
una fisura entre el epiblasto y el hipoblasto. Dicha fisura o cavidad es equivalente al
blastocele en los mamíferos (Larsen, 2003).
Capítulo 1
9
1.1.5 Gastrulación
(Estados HH2-HH4). El proceso de gastrulación comienza poco después de la
blastulación, y es esencialmente un empaquetamiento de la blástula donde se forma una
nueva cavidad recubierta por una doble capa celular (antes el blastocele estaba tapizado
únicamente por una capa celular) (Anne y Gilbert, 1997). Esta nueva cavidad de doble
capa se denomina gastrocele o arquenteron (Holtfreter, 1943; Gilbert, 2003). Los
cambios en la blástula los cuales presagian el comienzo de la gastrulación ocurren unas
pocas horas después de que se ha puesto el huevo. Luego de que éste se incuba entre 3
y 4 horas, un extremo de la masa celular que recubre la cavidad del blastocele y que por
tanto no contacta el vitelo (el área pelúcida), se engrosa. Este engrosamiento es lo que
marca el futuro extremo caudal del embrión. Dos o tres horas después de que esta área
se ha engrosado empieza a presentarse una elongación caudal-cefálica del mismo, que
se dirige vía de la línea central del disco embrionario. Cerca de las 7 a 9 horas de
incubación, dicha elongación es aún más definitiva, y alrededor de la mitad del primer día
esta área engrosada asume la forma de un surco (el surco primitivo), que más o menos a
las 16 horas de incubación va a ser la característica más llamativa del embrión (Hunt,
1937). Luego en el extremo craneal de este surco, se forma una depresión más profunda
que recibe el nombre de la fosita primitiva. Poco tiempo después las células próximas al
surco primitivo comienzan a proliferar y a desprenderse a lo largo del surco emigrando
hacia abajo por el espacio existente entre dos capas de líneas celulares. Durante este
proceso, algunas de las células que emigran por el surco primitivo, invaden la capa de
células que cubría al blastocele y la sustituyen por completo. Así, la cavidad queda
recubierta por un nuevo tipo celular (el endodermo). Además, algunas de las células que
emigran vía del surco primitivo, se ubican en el espacio existente entre la capa de células
más superficial (el ectodermo) y el endodermo. De esta manera se establecen las tres
capas germinativas: el ectodermo (la más superficial), el endodermo (la que contacta la
cavidad), y entre las dos el mesodermo (Jacobson, 1938a, b). En este estadio, el extremo
anterior del surco primitivo se amplía para formar el nodo de Hensen, una estructura que
sería más o menos el equivalente al organizador en el anfibio Xenopus y al escudo
embrionario en el pez Cebra. Al terminar este estadio (HH4) estará finalizando el primer
día del desarrollo aviar (Hamburger y Hamilton, 1951).
10
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
1.1.6 Diferenciación del mesodermo
El mesodermo el cual se origina a partir del surco primitivo, se extiende rápidamente
lateralmente, y al mismo tiempo dichas extensiones se dirigen también en dirección
craneal; de esta manera, se puede intuir, que la porción anterior del blastodermo estará
―libre de mesodermo‖. Cuando se observan cortes que pasan a través del surco primitivo,
de embriones cerca de las 18 horas de incubación, se ven masas agregadas de
mesodermo que se extienden longitudinalmente entre el ectodermo y el endodermo.
Inmediatamente adyacente al surco primitivo el mesodermo es entonces marcadamente
más grueso que sus extensiones laterales. Estas zonas de mesodermo engrosado en la
línea media son denominadas mesodermo dorsal. El mesodermo que se extiende
lateralmente, y que es menos denso, se divide en dos regiones bien delimitadas a saber:
el mesodermo intermedio, y el mesodermo lateral (Patten, 1964).
1.1.7 Estructuras mesodérmicas
El mesodermo dorsal se organiza en somitas. Estos se originan por división del
mesodermo que se segmenta en ―bloques de masas‖. En este tiempo (24 horas) se
observa un embrión de 3 a 4 somitas (HH8); y dicho número aumenta a medida que
incrementa la edad del embrión. Además de la aparición de los somitas, el mesodermo
intermedio se hace visible más claramente, aunque todavía está poco diferenciado. Por
último, el mesodermo lateral se divide a su vez en dos hojas colaterales: una cercana al
ectodermo denominada mesodermo somático, y otra hoja cercana al endodermo
denominada mesodermo esplácnico. Y se establece una cavidad entre estas dos hojas
colaterales, denominada el celoma extraembrionario. A la nueva capa resultante de la
unión del mesodermo somático con el ectodermo se le refiere como la somatopleura, y a
la resultante de la unión del mesodermo esplácnico con el endodermo se le refiere como
la esplacnopleura (Gilbert, 2000). Es importante mencionar, que en este momento (HH8),
en la región anterior (craneal) de la cavidad celómica se comienza a observar una
dilatación local, que constituye lo que se conoce como la región cardiaca (el primordio del
corazón). Igualmente cabe mencionar que en este estado se empieza a presentar una
marcada diferenciación de la porción más próxima del área opaca (parte del blastodermo
Capítulo 1
11
que contacta con el vitelo) al área pelúcida. Esta región proximal se observa mucho más
oscura y de apariencia algo moteada. La mayor densidad de esta región se debe a su
invasión por mesodermo que la hace más gruesa y más opaca. A esta región proximal
más densa del área opaca se le llama área opaca vasculosa, y a la zona distal menos
densa área opaca vitelina. Del mesodermo del área opaca vasculosa se originan los
vasos sanguíneos del SV. La apariencia moteada de esta zona se debe a las
agrupaciones celulares conocidas como islotes sanguíneos (Patterson, 1909). Más o
menos a las 33 horas de incubación (HH9-HH10) comienza la fusión de los dos
primordios cardiacos, y las pulsasiones del corazón se presentan mientras el par de
primordios todavía se está fusionando: inicialmente el miocardio de los dos primordios se
unen para formar un tubo único, aunque los dos endocardios estarán dentro de este tubo
común por un breve tiempo, y poco tiempo después también se fusionaran. Las
porciones posteriores sin fusionar del endocardio llagarán a ser las aperturas de las
venas vitelinas hacia el corazón (Gilbert, 2003).
Hacia las 48 horas de incubación (HH12) se pueden observar unos 16 somitas en el
embrión, y el corazón desplazado hacia el lado izquierdo y en forma de S (Hamburger y
Hamilton, 1951).
1.1.8 Estados del desarrollo Hamburger y Hamilton del día 2 al 7
• Durante el segundo día del desarrollo (HH13-HH19), la cabeza comienza a rotar hacia
la izquierda, y las vesículas ópticas y óticas empiezan a pronunciarse. Se vislumbran
para este momento pequeñas proyecciones del tronco, las cuales son los esbozos de las
extremidades. El amnios se extiende sobre el embrión y se empieza a cerrar. Durante las
siguientes 48 horas, se establecen la mayoría de los sistemas de órganos (etapa
embrionaria), de tal manera que entre el sexto día hasta la eclosión, la mayoría del
desarrollo está dirigido al incremento en tamaño de los órganos existentes (etapa fetal).
Al final del estadio HH19 (72 horas), se puede observar la alantoides, con un tamaño
alrededor de 1mm de diámetro. En este estado el embrión posee alrededor de 40
somitas, y el corazón es un tubo de dos cámaras, con una aurícula y un ventrículo
(Gilbert, 2003).
12
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
• En el tercer día del desarrollo (HH20-HH23) los esbozos de las extremidades
posteriores empiezan a ser más grandes que los esbozos anteriores (alares). Al final de
este periodo, ambos tipos de esbozos poseen una longitud aproximada al ancho; y el
número de somitas se extiende hasta la punta de la cola. La alantoides se hace vesicular
y al terminar este tiempo (3½ - 4 día – HH23), ésta se prolonga hasta la cabeza. En el SV
se observan claramente los vasos vitelinos principales.
• Para el cuarto día del desarrollo (HH24-26) las extremidades son más largas que
anchas y con el tiempo empiezan a ser notables las articulaciones del codo y la rodilla, lo
mismo que la demarcación digital. El área vascularizada del SV cubre la totalidad
superior del vitelo cuando este es extraído y se pone sobre una superficie plana.
• Día quinto del desarrollo (HH27-28): se observan 3 dígitos en las extremidades alares y
4 dedos en las extremidades posteriores. Se empieza a observar el presuntivo pico
cuando el embrión es visto de perfil.
• En el sexto día del desarrollo (HH29-HH30) comienza a ser visible un rudimento del
quinto dedo en la extremidad posterior; y además, se demarcan los tres principales
segmentos articulares a lo largo de las extremidades anteriores y posteriores. La
alantoides cubre totalmente al embrión, con un diámetro alrededor de 4 cm.
• Para el séptimo día del desarrollo (HH31-33) todos los dígitos y 4 de los dedos de la
extremidad posterior continúan alargándose; sin embargo, el rudimento del quinto dedo
de la pata desaparece. La alantoides cubre al embrión, y la mayor parte de la membrana
del SV.
1.2 Desarrollo extraembrionario
En 1931 el embriólogo de Cambridge Joseph Needham acuñó el término cleidoico para
describir las características especiales del huevo aviar. Él señaló que el huevo aviar
estaba encerrado esencialmente debido a que todos los materiales necesarios para el
desarrollo del embrión se hallaban dentro del cascarón: suficiente agua, nutrientes y
energía (en este caso grasas) para el crecimiento y mantenimiento tisular. Únicamente el
O2 (y el calor) se requieren del ambiente.
Capítulo 1
13
Puede decirse entonces, que los huevos de las aves contienen todos los materiales
necesarios para el desarrollo embrionario menos el O2, el cual difunde desde el ambiente
a través de poros en la cáscara del huevo. Existen dos membranas fibrosas adheridas a
la superficie interna de la cáscara del huevo, las cuales separan la cáscara en si misma
del contenido del huevo (Romanoff y Romanoff, 1949).
Como ya se mencionó antes, un resultado del proceso de gastrulación, es la
conformación de tres distintas capas celulares (tejidos primarios), a menudo referidas
como capas germinales. Estas capas son el ectodermo, mesodermo y endodermo. En
términos generales, el ectodermo da origen a la piel y a los tejidos neurales; el
endodermo forma el hígado, los pulmones, el páncreas y el epitelio de recubrimiento
intestinal (Vokes y Krieg, 2002a, b). En cuanto al mesodermo, como aparece más arriba,
al comienzo de la gastrulación, las células del epiblasto en la región del embrión que
define la parte posterior del mismo, sufren una transición epitelial a mesenquimal y
forman una estructura transitoria conocida como el surco primitivo, del cual emergen las
células mesodérmicas. El mesodermo recientemente formado migra lejos del surco
primitivo, moviéndose lateralmente, así como anteriormente (Fehling y col., 2003), para
luego diferenciarse en un gran número de tejidos, dentro de las que se incluyen las
membranas extraembrionarias (Cleaver y col., 1997; Cleaver y Krieg, 1998; McGrath y
col., 2003).
Las membranas extraembrionarias, a decir: SV, CAM y amnios; son características
comunes para los amniotas (que son las especies que durante el desarrollo embrionario
se encuentran rodeados por membranas para su nutrición, respiración y eliminación de
desechos).
Aunque
los
procesos
y
estructuras
que
establecen
los órganos
extraembrionarios parecen ser casi idénticos entre las aves; se encuentra una
considerable diversidad en relación al tiempo de ocurrencia, patrones de desarrollo, y
arreglo estructural de dichas membranas (Luckett, 1977).
1.2.1 Saco vitelino
Ésta es la primera de las membranas extraembrionarias en desarrollarse. Inicialmente se
reconoce como el área vitelina, que es el área más externa del blastodermo, consistente
14
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
de tres capas germinales, las cuales son una continuación de las capas celulares del
disco embrionario: una capa ectodérmica adyacente a las membranas vitelinas, una capa
endodérmica adyacente al vitelo, y entre las dos una capa de células mesodérmicas. Las
dos capas de mesodermo están separadas por el celoma extraembrionario; y es así,
como la lámina de mesodermo próxima al endodermo y esta última forman la pared
definitiva del SV (Ackerman y Rahn, 1980). Por otro lado las membranas vitelinas
rodearan al SV hasta el día 4 de incubación; a este tiempo, el contacto del tejido
embrionario con las membranas vitelinas altera su estructura (Jensen, 1969), de manera
que se facilita la ruptura de ésta, cuando se incrementa el volumen del SV. Esto hace
que el vitelo pierda su forma esférica y la estructura embrión-vitelo adopte la forma del
huevo. La parte superior de esta estructura es delimitada entonces por la membrana del
SV, y la parte inferior por la membrana vitelina (Figura 1-1), la cual se desliza bajo el polo
opuesto del SV del embrión. Es así como la separación del SV de la albúmina (el así
llamado ombligo del SV) se mantiene, y este polo vegetal del SV permanece incompleto
hasta el día 17 (Romanoff y Romanoff, 1933). La membrana del SV cruza el ecuador de
la membrana vitelina en los días 5-7 y alcanza su máxima área alrededor del día 10-11,
rodeando finalmente al vitelo el día 14-15. Desde el día 12 la membrana del SV se
convierte en una masa flácida trilobulada. Después del día 10-11 el área del SV decrece,
aunque la membrana esté aún incrementando en masa y alcance su pico de peso
alrededor del día 15. La razón para el hecho anterior es el decrecimiento en el tamaño
del SV a medida que el vitelo es absorbido (Patten, 1971).
La función de absorción de la membrana del SV provee un problema interesante: el
epitelio de absorción de esta no forma vellos, como lo hace, por ejemplo la mucosa del
epitelio del intestino. Por lo tanto la absorción de los nutrientes está restringida al área
superficial del vitelo y los septos vascularizados. Es así como la función de absorción del
SV depende en gran medida de la densidad capilar y de la distancia de difusión a través
de dicha membrana. Para mejorar la absorción a través del SV, los vasos de ésta
membrana corren en septos del epitelio interno del SV, los cuales logran alcanzar el
interior del vitelo (Raginosa, 1961). La profundidad de los septos parece incrementar con
la edad del embrión, pero no hay datos detallados disponibles.
Capítulo 1
15
Figura 1-1: Membranas extraembrionarias del pollo (SV).
Modificada de: MacGeady y col., (2006). Veterinary Embriology. Foetal membranes. Blackwell
Publishers. p. 68.
1.2.2 Amnios
El amnios está conformado por una capa de ectodermo y adyacentemente una capa
avascular de mesodermo que se localiza junto al embrión. Estas dos capas de tejido se
extienden hasta formar pliegues sobre la cabeza y la cola del embrión en desarrollo y
para el día 4 de incubación los pliegues se fusionan juntos sobre el embrión,
encerrándolo y formando así el saco amniótico (Figura 2); de esta manera, la capa más
interna del amnios es ectodermo, y la más externa es el mesodermo avascular. Dentro
de este mesodermo aparecen células musculares, de tal forma que el amnios se hace
contráctil para el día 5, para impedir que el embrión se adhiera a las membranas (Wu y
col., 2001). Los vasos sanguíneos del amnios se originan de la subsecuente fusión del
mesodermo avascular del amnios con el mesodermo vascular de la alantoides.
Cerca del día 12 se desarrolla un ducto entre el saco albuminal y el saco amniótico; esta
conexión sero-amniótica es el punto donde los pliegues de la cabeza y la cola del amnios
se encuentran al día 4 de incubación. Este ducto permite el movimiento de proteínas del
16
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
albumen dentro del fluido amniótico (Adamstone, 1948). Cerca de los últimos 3 días de
incubación, el embrión ingiere la restante porción de la albúmina y el remanente líquido
amniótico (Mortola, 2009).
1.2.3 Córion
El córion se desarrolla de tejidos contiguos con el amnios y lejanos al embrión. Está
comprendido de una capa externa de ectodermo adyacente a la membrana interna de la
cáscara y un mesodermo avascular, la cual delinea el celoma extraembrionario.
Eventualmente este mesodermo se fusiona con el mesodermo vascular de la alantoides,
supliendo de esta manera los vasos sanguíneos y formando la corioalantoides o
alantocórion (Burton y Palmer, 1989). Para el día 11 la alantoides ha delineado
completamente al córion y la CAM cubre el 98% del área de las membranas de la
cáscara del huevo, actuando por lo tanto como la superficie respiratoria primaria del
embrión a partir del final del primer tercio de incubación (Figura 1-2).
Capítulo 1
17
Figura 1-2: Membranas extraembrionarias del pollo (CAM).
Modificada de: MacGeady y col., (2006). Veterinary Embriology. Foetal membranes. Blackwell
Publishers. p. 70.
1.2.4 Alantoides
En el día 2 la alantoides es tan solo un pequeño brote de células endodérmicas, y para el
día 4 ésta es visible como un pequeño saco libre creciendo fuera del intestino primitivo
posterior del embrión. Su lado más interno es endodérmico y la superficie externa es
mesodermo vascular. La alantoides se expande dentro del celoma extraembrionario, y lo
llena casi en su totalidad, de tal manera que para el día 6 su mesodermo vascular está
fusionado tanto con el córion, formando la corioalantoides (Fancsi y Feher, 1979;
DeFouw y col., 1989); como con el mesodermo avascular del amnios (Figura 1). Por lo
tanto, la alantoides suple el sistema sanguíneo para la CAM y para el amnios. Es
necesario decir también, que la alantoides se llenará de fluidos provenientes de las
excreciones renales que aparecen por primera vez para el día 5, y que entran vía del
ducto alantoideo desde la región cloacal del intestino posterior (Romanoff, 1967).
Además es importante mencionar algunos estudios realizados en el ratón, en los que la
alantoides ha sido subdividida en regiones: proximal, medial y distal, argumentado en el
hecho de que al parecer, la diferenciación del mesodermo alantoideo en angioblastos (las
18
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
células endoteliales primordiales) se da en una secuencia distal-proximal (Downs y col.,
2004). No se sabe si en las aves ocurre de manera parecida.
1.2.5 Corioalantoides
Esta es una parte de los tejidos extraembrionarios que comienza a desarrollarse
alrededor del día 6-7 de incubación a partir de la fusión del corion con el amnios
(Romanoff, 1960; Fancsi y Feher, 1979). Estructuralmente, la capa epitelial más externa
del córion se deriva del trofoblasto, la cual se opone a la alantoides. Esta estructura
forma una matriz de soporte para la extensa red vascular que cursa a través de la CAM,
con un grosor de 20-100µm (Ogden y col., 1997). La CAM del pollito maduro (desde el
día 12 de incubación) puede dividirse dentro de tres capas anatómicas: el estrato
primario (Leeson y Leeson, 1963; Narbaitz, 1972; Packard y Packard, 1984), el plexo
capilar o seno sanguíneo, y un estrato delgado compuesto primariamente de células
epiteliales coriónicas especializadas que han migrado presumiblemente sobre el plexo
capilar/seno sanguíneo y están involucradas en el intercambio gaseoso y en la absorción
de calcio (Ribatti y col., 2001). Contiguamente y adherida a la capa delgada de la CAM
se encuentra la membrana interna del huevo (Wong y col., 1984; Burton y Palmer, 1989).
El embrión en desarrollo está encerrado por el estrato primario, que es la parte más
gruesa de la CAM (aproximadamente 10-20 µm de grosor). Los vasos más grandes de la
CAM (hasta de 1 mm de diámetro) corren inmediatamente por debajo y están anclados a
esta capa a través de delgadas vainas perivasculares. Los vasos más pequeños (< 200
µm de diámetro) están embebidos dentro de la capa principal (Fuchs y Lindenbaum,
1988 Shumko y col., 1988). Externamente a la capa primaria de la CAM se encuentra el
plexo capilar o seno sanguíneo, y sobre este seno se encuentra un estrato delgado
(aproximadamente 1 µm) que está compuesto por 4 subcapas que derivan originalmente
del córion (membrana basal, capa celular epitelial, matriz extracelular de peptidoglicano,
y la lámina basal). La membrana basal se extiende en directo contacto con el seno
sanguíneo. Durante el desarrollo, el citoplasma de las células de la capa celular epitelial
se pierde de manera progresiva, dando a estas células una apariencia delgada y
vacuolada. El plexo capilar permanece separado del ectodermo por la lámina basal, y
Capítulo 1
19
directamente sobre la lámina basal de la capa delgada se extiende la membrana interna
de la cáscara, una membrana de grosor de 20 µm, acelular y rica en calcio, que además
contiene peptidoglicanos y colágenos tipo I, V y X (Wong y col., 1984; Arias y col., 1997)
y que consta de dos tipos celulares principalmente: las células de la cavidad vellosa, las
cuales son aparentemente secretorias y quizás involucradas en la solubilización de la
cáscara (Narbaitz y col., 1981; Narbaitz, 1987), y células que cubren los capilares que
conforman la mayoría de la superficie de la CAM (Coleman y Terepka, 1972a, b, c). La
lámina basal de la capa delgada contiene extensos microvellos que penetran dentro de la
membrana interna de la cáscara (Fancsi y Feher, 1979) y transportadores de calcio que
transfieren este mineral almacenado en la membrana interna de la cáscara al embrión en
desarrollo por medio de las membranas extraembrionarias (Tuan y col., 1986; Akins y
Tuan, 1993a, b). Puede decirse entonces, que las células epiteliales del ectodermo de la
CAM movilizan y transportan calcio de la cáscara del huevo dentro de la vasculatura
embrionaria a partir del día 10, y alcanzan su nivel más alto en dicho transporte alrededor
del día 17 de incubación (Johnston y Comar, 1955; Terepka y col., 1969; Garrison y
Terepka, 1972a, b).
El desarrollo y organización estructural de tejidos durante la formación de la CAM parece
ser invariante entre las aves. Sin embargo algunos aspectos funcionales de estos tejidos,
por ejemplo, el tamaño del la superficie de intercambio y el grosor de la barrera de
difusión de la CAM, si difiere.
Fietze-Gschwind (1973) estudió el desarrollo estructural y el desarrollo funcional del la
CAM del pollo doméstico. Un importante aspecto funcional a mencionar es que la CAM
sufre una considerable reorganización alrededor del día 10 de incubación. Durante esta
reorganización, los capilares sanguíneos se mueven de su posición debajo del epitelio
coriónico, a una posición entre o incluso arriba de las células epiteliales del córion, más
cerca la membrana de la cáscara, lo que resulta en un considerable reducción del la
barrera de difusión de la CAM. Datos morfométricos disponibles de Fitze-Gschwind
muestran que el grosor de la barrera de difusión disminuye de un promedio de 4,3 µm al
día 8, a 0.8 µm al día 12, y 0.5 µm al día 14. Debido a que la difusión no depende
únicamente del área de superficie sino también de la barrera a la difusión, este proceso
puede ser entendido como un mecanismo para optimizar el intercambio gaseoso cuando
el área de la CAM alcanza su máximo tamaño y no es posible un incremento adicional.
20
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
En términos generales, durante los primeros 4 días el embrión puede satisfacer su
intercambio gaseoso y necesidades energéticas a través del área vascularizada del SV
(Reeves, 1984), y a medida que las demandas incrementan con el crecimiento del
embrión, la CAM se establece como un órgano de respiración embrionaria, y después de
cerca de 10 días cuando la CAM alcanza el máximo de su área y cubre la entera
superficie interna del huevo, la reducción de la barrera de difusión de la CAM
adicionalmente mejora el intercambio gaseoso hasta el día 14. Después de ese día la
capacidad funcional de la CAM parece ser maximizada y no es posible un mejoramiento
adicional, aunque las demandas embrionarias continúan su incremento hasta la eclosión.
Después de que los cambios estructurales mencionados no permiten más mejoras en el
intercambio gaseoso, un adicional incremento se produce gracias al aumento en la
afinidad por el O2 que se da durante todo el proceso de incubación y que comienza
alrededor del día 6 y 7de incubación (Reeves, 1984). El modelo difusión-limitada de Rahn
y colaboradores (1974), el cual se basó en los parámetros fisiológicos de la tensión
gaseosa de la cámara de aire, el metabolismo, y el tiempo de incubación, se ha
perfeccionado por aspectos del desarrollo de la CAM y una visión más orientada hacia el
embrión y a las capacidades limitantes de los tejidos y órganos en sí mismos.
1.3 Vasculogénesis y angiogénesis
Durante muchos años ha sido el interés de los investigadores conocer cómo son las
interacciones locales que llevan a la formación de los vasos sanguíneos primarios, y
cómo las células endoteliales migran y se ensamblan dentro de redes vasculares en
lugares precisos en los diferentes tejidos del embrión. En 1672, Marcello Malpighi
describió por primera vez que la sangre era transportada por específicos tubos en el
embrión del pollo (Gilbert, 2003). Posteriormente los embriólogos estuvieron interesados
en conocer cómo se desarrollaban estos vasos. Desde que se produjo el interés en el
desarrollo vascular, el embrión aviar ha jugado un papel importante en las
investigaciones. Sabin (1917,1920) describió el modelo de desarrollo vascular en este
embrión. Después se manipularon los embriones aviares por medio de injertos de
codorniz, puesto que era fácil diferenciar las células de éste último por su morfología
Capítulo 1
21
nuclear. Posteriormente un avance importante fue hecho cuando se empezó a utilizar
anticuerpos antiQH1, que reconocían específicamente a las células endoteliales y
progenitores de la codorniz, pero no reconocían a las células endoteliales del pollo
(Pardanaud y col., 1987).
Entonces, los primeros estudios acerca de la formación de los vasos sanguíneos fueron
del tipo descriptivo. Estos estudios en su totalidad condujeron a la descripción de que
plexos vasculares primitivos se formaban en el sitio del futuro vaso o lecho capilar, y
remodelados para formar estructuras vasculares más finas y complejas (Sabin, 1917,
1920).
Noden en 1989, determinó que la mayoría de tejidos mesodérmicos, con la
excepción de la placa precordal, contenían células con potencial angiogénico que podían
migrar grandes distancias para formar los vasos del embrión. Los estudios de Noden
demostraron que angioblastos que normalmente participan en la formación de un tejido,
eran capaces de participar en la formación de otros tejidos. Estas observaciones y la de
otros autores (Poole y Coffin, 1989) sustentan el hecho de que son factores locales en
los tejidos, y no factores intrínsecos de las células endoteliales lo que determina el patrón
de desarrollo de los vasos sanguíneos (Drake y col., 1998).
En la actualidad se han desarrollado metodologías que permiten realizar análisis
dinámicos por imagen del desarrollo de los vasos sanguíneos en el embrión aviar (Rupp
y col., 2003). Y otros estudios hoy en día, han sido dirigidos a investigar la implicación de
ciertas moléculas en el patrón de desarrollo de los vasos sanguíneos (Ferrara y col.,
2003).
1.3.1 Vasculogénesis
Como se mencionó más arriba el sistema vascular se ensambla y llega a ser funcional
antes de que se desarrollen los demás órganos. Inicialmente, los precursores
endoteliales llamados angioblastos emergen como células dispersas en el mesodermo y
luego se agregan para formar cordones. Éstos agregados de cordones endoteliales
primitivos se organizan para formar vasos sanguíneos primitivos los cuales luego
transportan a las células sanguíneas. Este proceso, mediante el cual a partir de células
endoteliales primitivas (angioblastos) se forman vasos sanguíneos es denominado como
22
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
vasculogénesis. Por lo tanto la vasculogénesis se define como la formación de novo de
los vasos sanguíneos (Risau y col., 1988).
Los capilares formados por el proceso de vasculogénesis son llamados entonces plexos
vasculares primordiales (Risau y Flamme, 1995). La vasculogénesis es por lo tanto
responsable de la formación de los primordios de los principales vasos, y de la red capilar
primaria (Poole y Coffin, 1989). En resumen, por el proceso de vasculogénesis se
forman: los islotes sanguíneos, la aorta dorsal, el endocardio, y los vasos vitelinos (Coffin
y Poole, 1988). Existen dos tipos de vasculogénesis de acuerdo con Poole y Coffin
(1991): en la tipo I, los angioblastos se asocian en el sitio de su origen para formar vasos
(v.g., la aorta dorsal); y en el tipo II, los angioblastos migran cierta distancia para formar
en el nuevo sitio vasos sanguíneos (v.g., el endocardio). Posteriormente esta red inicial
de vasos primordiales es moldeada y extendida por medio del proceso denominado
angiogénesis, que es el brote o crecimiento de nuevos vasos a partir de los vasos
anteriormente formados por el proceso de vasculogénesis (Risau, 1997). Aunque en
términos generales la vasculatura de la mayoría de órganos se forma por angiogénesis,
la vasculatura de ciertos órganos endodérmicos: el hígado, pulmones, páncreas,
estomago e intestino, y el bazo; se forma por vasculogénesis (Pardanaud y col., 1989).
Inicialmente se pensó que los procesos patológicos y de neovascularización en el adulto
ocurrían únicamente a través de angiogénesis; sin embargo, estudios recientes han
mostrado que células endoteliales circulantes, provenientes de la médula ósea, también
participan en dichos procesos, demostrando que tanto la vasculogénesis como la
angiogénesis ocurren en el adulto (Asahara y col., 1997).
1.3.1.1 Los islotes sanguíneos.
La estructura vascular visible de manera más
temprana en el pollo son los islotes sanguíneos, los cuales, como se mencionó antes, se
originan en el SV (Romanoff, 1960). Estos islotes sanguíneos darían origen al teórico
hemangioblasto (His, 1900) que es hipotéticamente el progenitor común tanto para
células endoteliales como hematopoyéticas.
Capítulo 1
23
1.3.1.2 El hemangioblasto. Los progenitores hematopoyéticos y endoteliales dentro
de los islotes sanguíneos, comparten la expresión de un número de genes entre los que
se incluyen principalmente: los receptores del factor endotelial vascular (VEGF), FLK-1 y
FLT-1, el receptor para las angiopoyetínas TIE, y el gen SCL/TAL-1 - el gen ―Stem Cell
Leucemia‖ (Fong y col., 1995, 1996, 1999). La estrecha asociación entre las células
hematopoyéticas primitivas y el endotelio en desarrollo en el SV, junto con la expresión
de marcadores comunes por parte de sus progenitores celulares, ha sugerido la
existencia de un precursor común llamado el hemangioblasto (His, 1900; Murray, 1932;
Choi, 1998). Dicho hemangioblasto sería de origen mesodérmico y emergería durante la
gastrulación, cuando células reclutadas por el epiblasto (ectodermo primitivo), migran a
través del surco primitivo – una estructura posterior a la mitad de la línea media – y
establecen el mesodermo del embrión y de las regiones extraembrionarias (Palis y col.,
1995).
Por experimentos realizados con quimeras de pollo-codorniz, en los que explantes del
embrión de la codorniz eran injertados en el área extraembrionaria del pollo, se encontró
que los progenitores hematopoyéticos del SV no eran auto renovables, y que pronto eran
reemplazados por progenitores hematopoyéticos de origen intraembrionario (DieterlenLièvre y col., 1976). En los estudios con embriones anfibios se han encontrado resultados
muy similares (Turpen y col., 1981); aunque otros estudios sugieren que las células del
SV, sí tienen la capacidad de células stem (SE), y pueden ser utilizadas in vivo para la
hematopoyesis definitiva (Palis y col., 1999). Incluso algunas evidencias experimentales
sugieren que las dos clases de células en cada tipo de hematopoyesis, podrían
potencialmente compartir un progenitor común (Palis y Koniski, 2005).
Algunos investigadores han tratado de encontrar respuestas a esta cuestión del
hipotético hemangioblasto yendo un poco más atrás en la evolución: cuando se estudia la
hematopoyesis en los invertebrados, se ve que las células hematopoyéticas y vasculares
siguen claramente distintas vías de desarrollo (Nishikawa, 2001); la principal diferencia
entre los vertebrados e invertebrados es la presencia de un verdadero endotelio en los
primeros (Muñoz-Chápuli y col., 2005). Además se especula que el establecimiento de
una vía común para la generación de células endoteliales y hematopoyéticas en los
vertebrados pudo deberse a la emergencia de un sistema circulatorio cerrado en estos
últimos, en contraposición a lo que ocurre en los invertebrados, quienes poseen un
24
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
sistema abierto al espacio intersticial, lo que permite la entrada a la circulación, en
cualquier momento de células hematopoyéticas (Nishikawa, 2001). En los invertebrados
el transporte de O2, nutrientes y desechos metabólicos se lleva a cabo por dos tipos de
sistemas de cavidades: el sistema celómico y el hemal. Las cavidades celómicas están
delineadas por un mesotelio (epitelio mesodermal), mientras las cavidades hemales
están delineadas por la membrana basal de diferentes tipos de epitelio, esto es, una capa
más o menos gruesa de matriz extracelular. Las cavidades hemales pueden ser
encontradas entre el epitelio endodérmico y el mesotelio, entre dos mesotelios, o
rodeado por una singular capa de células mioepiteliales o mesoteliales. Es importante
subrayar que hay células circulantes libres en los espacios celómicos de los
invertebrados, llamados celomocitos, también como dentro del tejido conectivo. En
muchos casos los celomocitos y los hemocitos son indistinguibles, y ellos reciben su
nombre de acuerdo con la cavidad donde ellos se encuentran. El origen embrionario de
los celomocitos y los hemocitos en los invertebrados no es bien conocido. Sin embargo,
la mayoría de la investigación descriptiva y experimental apunta al endotelio celómico
como el tejido progenitor más probable de estos tipos de células circulantes. En algunos
invertebrados, los progenitores de hemocitos (hemoblastos) forman nódulos de células
proliferantes rodeados por hemocitos diferenciados. Interesantemente también ha sido
reportada la diferenciación de hemoblastos de células musculares lisas. Un tipo especial
de hemocito, algunas veces llamado amebocito, es capaz de adherirse a la membrana
basal que delimita las cavidades hemales. En algunos casos, los amebocitos adherentes
son tan abundantes que ellos adquieren la apariencia de un endotelio. Todos los
anteriores hallazgos, señalan al epitelio celómico, como el origen evolutivo de los
elementos del sistema circulatorio de los vertebrados (Shigei y col., 2001). Igualmente,
en la mosca se ha identificado el ortólogo del VEGF, denominado DmVEGF-1 y su
receptor DmVEGFR; receptor que se expresa en los hemocitos embrionarios (Heino y
col., 2001).
Posiblemente la mejor evidencia para la existencia del hemangioblasto viene de estudios
con embriones aviares. Durante el desarrollo del embrión aviar, las células endoteliales
que conforman la aorta dorsal se originan de dos tipos diferentes de poblaciones de
células mesodérmicas. Los angioblastos que derivan del mesodermo esplacnopleural
Capítulo 1
25
forman el piso del la arteria aorta dorsal, mientras que los angioblastos del mesodermo
somático forman las paredes y el techo de la aorta. Y por estudios de linaje se encontró
que las células endoteliales del piso de la aorta tienen el potencial de originar células
hematopoyéticas (Jaffredo y col., 1998).
Finalmente, gran cantidad de estudios a cerca de la existencia del hemangioblasto
provienen de estudios en el ratón, en los que al producirse la deleción de linajes celulares
que poseían el receptor FLK-1, fallaban en formar la vascularización extraembrionaria y
células sanguíneas (Shalaby y col., 1995). Estos estudios han demostrado que el
receptor FLK-1 se pierde rápidamente en los progenitores diferenciados hacia la vía
hematopoyéica (Eichmann y col., 1993), y que mantienen la expresión de SCL/TAL-1
(Porcher y col., 1996).
1.3.1.3 Los cuerpos embrioides. En cuanto a las vías de señalización implicadas en
el desarrollo vascular, los diferentes estudios han tratado de seguir a las células
mesodérmicas desde antes de su diferenciación, pasando por el momento de su
diferenciación hasta verlas completamente diferenciadas desarrollando el patrón
vascular. La mayor desventaja de dichos estudios radica en que han sido in vitro (Palis y
col., 2000). Dichos estudios han consistido de la utilización de células SE derivadas de la
masa celular interna del blastocisto (totipotentes), y que pueden diferenciarse tanto en
tejidos intra como extraembrionarios (Orkin y Zon, 2002). Cuando dichas células se
ponen en una placa, se agregan para formar lo que se ha denominado, cuerpos
embrioides - CE (Keller y col., 1993). Este término proviene de estudios de Doetschman
y colaboradores (1985) quienes observaron que las células SE de ratón podían generar
sangre in vitro. Estos investigadores lograron hacer diferenciar células SE en cultivos en
suspensión, y notaron que formaban estructuras quísticas ovoides similares a embriones,
a las que llamaron cuerpos embrioides. En tales estudios encontraron que dichos CEs
desarrollaban pseudo islotes sanguíneos hemoglobinizados (Keller y col., 2005). En las
aves ocurre lo mismo, sin embargo, cuando las células SE de ave son disociadas antes
de cultivarse, se forman los CEs pero no es posible observar la formación de los islotes
sanguíneos (Flamme y Risau, 1992). Pero, cuando es adicionado el factor de crecimiento
fibroblástico (FGF) a dichos cultivos disociados, se restaura la capacidad de estos para
formar los islotes sanguíneos (Flamme y Risau, 1992). La formación los cordones
vasculares (plexos capilares) no ocurre en los CEs, a menos que sean implantados en el
26
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
peritoneo del ratón o en la CAM del pollo; lo que sugiere que la fusión de los islotes
sanguíneos en los plexos capilares requiere de adicionales factores presentes en el
embrión, además del VEGF (Risau, 1991). Además de establecerse que la formación de
los plexos capilares (vasculares) requiere de factores del embrión, ha quedado
demostrado que la diferenciación de las células endoteliales a partir del endotelio es
independiente de la gastrulación (Christ y col., 1991). Es importante anotar, que la
diferenciación de las células endoteliales ocurre principalmente en el mesodermo que
está en contacto con endodermo adyacente (Wilt, 1965; Pardanaud y col., 1989; Palis y
col., 1995). Es por esto, que órganos como el cerebro y el riñón deben ser vascularizados
por angiogénesis (Pardanaud y Dieterlen-Lièvre, 1993).
Se ha demostrado que miembros de la familia del FGF, desempeñan un importante papel
en la inducción de las células mesodérmicas hacia la línea endotelial. Por ejemplo, en
estudios in vitro, usando cultivos de células epiblásticas, se ha visto que el FGF induce la
expresión del FLK-1 (el receptor del VEGF), que es el marcador más temprano del linaje
endotelial (Eichmann y col., 1993). Y al parecer, los FGFs no son funcionales durante los
subsecuentes procesos de desarrollo vascular.
1.3.1.4 Las colonias blásticas.
Los CEs contienen poblaciones celulares en
desarrollo que se derivan de las tres capas germinativas, que incluyen células
hematopoyéticas, endoteliales cardiacas, musculares, esqueléticas y adiposas (Keller,
1995). Los CEs primero dan origen a precursores transitorios de una población de células
formadoras de colonias blásticas CFC-Bl (Choi y col., 1998), que producen colonias de
células blásticas no diferenciadas. Estas colonias pueden ser identificadas en cultivo
únicamente durante un breve lapso. Las colonias blásticas típicamente expresan genes
para la línea celular hematopoyética y endotelial (Robb y Elefanty, 1998) entre tales
genes se incluye el SCL/TAL-1 (Weiss, 1994). Además, los estudios in vitro con CEs han
demostrado que las colonias blásticas tienen el potencial de dar origen a células
endoteliales adherentes y a células hematopoyéticas no adherentes (Choi y col., 1998).
Este potencial para generar ambos tipos celulares, ha sugerido que las CFC-Bls podrían
representar el equivalente in vitro del hemangioblasto (Choi, 2002). Por otro lado, los
análisis de progenie de los cultivos de células SE en busca de marcadores endoteliales y
Capítulo 1
27
hematopoyéticos, revelan que la población de células FLK-1+, pueden ser clasificadas en
subpoblaciones VE-Cadherina+ y VE-Cadherina-. En estudios adicionales se ha
demostrado que el grupo de células FlK-1+ VE-Cadherina+ CD45-, dan origen tanto a las
células hematopoyéticas como endoteliales (Nishikawa y col., 1998). A medida que
avanza la diferenciación hacia la línea celular hematopoyética, las células progenitoras
ganan expresión de CD45, y pierden la expresión de FLK-1. Por otro lado, el angioblasto
mantiene la expresión de FLK-1 y gana la expresión de VE-Cadherina. Éste último
marcador es estrictamente específico de las células endoteliales según Nishikawa y
colaboradores (1998).
1.3.1.5 El angioblasto.
Históricamente, en un principio se postuló que los vasos
sanguíneos extraembrionarios podrían ser la fuente de las células endoteliales que
poblaban el propio embrión (His, 1868, 1900). No obstante, esto fue refutado por Hahn
(1909); y los estudios definitivos fueron llevados a cabo por Reagan (1915), quién
demostró que a los embriones de pollo a los que se les retiraban los pliegues del SV
antes de que la invasión extraembrionaria de células vasculares desde este lugar pudiera
ocurrir, aún formaban vasos sanguíneos al interior del embrión. Los angioblastos se
originan exclusivamente dentro de los tejidos mesodérmicos. La vascularización de
tejidos y órganos de origen no mesodérmico (v.g., el cerebro y los órganos viscerales)
procede vía invasión de estos tejidos con vasos sanguíneos
originados en las
estructuras mesodérmicas adyacentes, por angiogénesis (Poole y col., 2001). Sin
embargo, es importante subrayar que no todos los tejidos mesodérmicos tienen el
potencial de angioblastos. La vasculogénesis está predominantemente limitada al
mesodermo ventrolateral y no ocurre en el mesodermo dorsoanterior, probablemente
debido a un efecto inhibitorio del ectodermo (Augustine, 1970; Pardanaud y DieterlenLièvre, 1999). En el pollo se han encontrado dos fuentes principales de angioblastos: la
primera fuente, es el mesodermo paraxial. El mesodermo paraxial cefálico provee
angioblastos para los vasos sanguíneos de la cabeza (Couly y col., 1995); mientras que
los somitas del tronco contienen angioblastos que migran para formar los vasos de la
pared del cuerpo, los miembros, los riñones, y las porciones dorsales de la aorta – las
arterias intersomitas (intersegmentarias dorsales) son los primeros vasos que se forman
por angiogénesis, por brotes de la arteria aorta dorsal (Poole y col., 2001). La segunda
fuente de angioblastos es el ya mencionado mesodermo esplacnopleural; mesodermo
que daría origen al hipotético hemangioblasto (Pardanaud y col., 1996).
28
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Al presente es incierto, si las diferencias en los orígenes de las células endoteliales
observadas entre
la
vasculatura
intra
y extraembrionaria,
reflejan
diferencias
fundamentales en el proceso del desarrollo celular vascular entre estos dos sistemas, o si
la vasculogénesis intra y extraembrionaria ocurre en un modo molecular idéntico (Vokes
y Kreig, 2002a, b).
1.3.1.6 Proliferación endotelial. Después de que las células endoteliales se han
diferenciado, comienzan a multiplicarse y a migrar antes de ensamblarse en los vasos
sanguíneos. Se sabe que el VEGF es el más potente mitógeno de las células
endoteliales (Ferrara y Henzel, 1989; Flamme y col., 1995a; Wilting y col., 1996). En los
estudios de adición de VEGF en el embrión del pollo, se ha encontrado, por ejemplo, que
cuando éste es aplicado a la CAM, se incrementa la proliferación de células endoteliales
en dicha membrana (Wilting y col., 1996).
1.3.1.7 El factor de crecimiento endotelial vascular. A finales del siglo 20 se
encontró una proteína capaz de inducir la división de células endoteliales in vivo, y por lo
tanto fue llamado el factor de crecimiento endotelial vascular – VEGF (Leung y col.,
1989). Posteriormente se encontró que el VEGF era mitógeno para las células
endoteliales, y quemotáctico (Yoshida y col., 1996). Igualmente se encontró que dicha
molécula tenía un efecto en la permeabilidad vascular, por lo que se le denominó el factor
de la permeabilidad vascular – VPF (Connolly y col., 1989). Posteriormente se encontró
que la secuencia de este factor estaba relacionada con la del gen del factor de
crecimiento derivado de las plaquetas – PDFG (Houck y col., 1991). Subsecuentemente,
se identificaron otros cuatro factores homólogos. La familia del VEGF incluye
actualmente al clásico VEGF, ahora denomidado VEGF-A (que fue la molécula de interés
de este estudio), y también el VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (los homólogos
virales), y el factor de crecimiento placentario (PlGF). Los estudios de mapeo genómico
han mostrado que los diferentes miembros de la familia de VEGF se encuentran
dispersos por todo el genoma, y que no existen dos miembros localizados en el mismo
cromosoma (Vicenti y col., 1996).
Capítulo 1
29
Existen varias isoformas de este factor que corresponden a variaciones en los sitios de
splicing de un único mRNA que incluye diferentes exones (Ferrara, 2000). Todas las
isoformas son angiogénicas in vivo (Schmidt y Flamme, 1998). El isotipo VEGF-A
consiste de 8 exones y 7 intrones, los que generan las isoformas 121, 145, 165, 189, y
206 aminoácidos (Ferrara y col., 2003). Todos los miembros de la familia VEGF parecen
funcionar como dímeros (Muller y col., 1997). La isoforma VEGF121 se encuentra en los
tejidos de forma libre (Ferrara y col., 2003). La variante VEGF145, está presente en
mayor cantidad en procesos tumorales (Poltorak y col., 1997). El VEGF165 es la
isoforma que predomina normalmente (Ferrara y col., 2003), y comparada con las demás
isoformas, el VEGF165 es la más potente, y se cree que dicha potencia está dada por el
tipo de correceptor Neuropilina al que se une (Veikkola y Alitalo, 1999); en cuanto a su
disponibilidad: una fracción se secreta y otra parte permanece unida a la superficie
celular o unidad a la matriz extracelular. La isoforma VEGF189 suele acompañar la
expresión de las otras isoformas (Houck y col., 1991). En contraste, el VEGF206 es la
forma de presentación más rara. Éstas dos últimas variantes son casi completamente
secuestradas en la matriz extracelular (Ferrara y col., 2003). En cuando a la isoforma
VEGF145, tiene una afinidad parecida a la isoforma VEGF165 (Poltorak y col., 1997).
La
diferenciación
angioblástica
(hemangioblástica)
del
mesodermo
durante
la
vasculogénesis requiere de la actividad del VEGF y de su receptor FLK-1. El VEGF actúa
de manera paracrina con relación al FLK-1, con la expresión del VEGF restringida
generalmente al endodermo y al ectodermo, y la expresión del FLK-1 a las células
endoteliales y sus precursores en el mesodermo (Flamme y col., 1995b). Además, el
VEGF-A es secretado por una variedad de células, como las células musculares lisas
(Klagsbrun y D‘Amore, 1996). La actividad angiogénica del VEGF ha sido estudiada en la
CAM del pollo (Wilting y col., 1992; 1993). También se ha encontrado que el VEGF se
expresa en células del SV (Nützel, 2005).
Además del FLK-1, los VEGFs se unen con alta afinidad a otros cuatro receptores: res
VEGFR-1 (FLT-1), VEGFR-3 (FLT-4), y a los correceptores Neuropilina-1 (NRP-1), y
Neuropilina-2 (NRP-2) (Nimmagadda y col., 2007).
1.3.1.8 El receptor del VEGF.
Los receptores VEGFR (FLT-1, FLK-1 y FLT-4),
forman una subfamilia dentro de la familia de los receptores del PDGF (factor de
30
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
crecimiento derivado de las plaquetas). Estos receptores son del tipo tirosina quinasa
(Flamme y col., 1995a). Durante el desarrollo embrionario, los VEGFRs se expresan en
las células endoteliales desde el estado de los islotes sanguíneos. En el adulto, el FLT-1
y FLK-2 se localizan en las células endoteliales, mientras que el FLT-4 se expresa
principalmente en el endotelio linfático. El ligando de cada receptor es diferente: FLT-1 es
el receptor para VEGF-A, VEGF-B y PlGF. FLK-1 se une a VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, y
el VEGF-E; mientras que FLT-4 es el ligando de VEGF-C y VEGF-D (Klagsbrun y
D‘Amore, 1996). Se ha confirmado la expresión de estos receptores en el mesodermo y
las células endoteliales tanto del SV como de la CAM en el embrión del pollo (Eichmann
and Christ, 1997; Nützel, 2005).
1.3.2 Vasculogénesis extra e intraembrionaria
El proceso de vasculogénesis fue descrito por los clásicos embriólogos quienes usaron
métodos histológicos para establecer que los angioblastos se originan del mesodermo y
coalescen para formar cordones endoteliales que subsiguientemente se convierten en
vasos sanguíneos patentes (His, 1868, 1900; Sabin, 1917, 1920). Dichos estudios
demostraron que en los amniotas la vasculogénesis ocurre fuera del embrión en el SV, lo
mismo que al interior. En los peces y anfibios solo se lleva a cabo la vasculogénesis
intraembrionaria (Stockard, 1915). La principal diferencia entre los angioblastos intra y
extraembrionarios
subyace
en
que
los
segundos
forman
islotes
sanguíneos,
caracterizados por una capa externa células endoteliales y una capa interna de células
hematopoyéticas (Drake y col., 1998). El mesodermo extraembrionario que da origen a
los islotes sanguíneos ha sido localizado en la parte posterior del surco primitivo, que es
el tipo más temprano de mesodermo depositado durante la gastrulación (Kinder y col.,
1999). En el caso de los precursores endoteliales intraembrionarios, estos se observan
como angioblastos solitarios (Risau and Flamme, 1995), y únicamente en raras
ocasiones, ellos están estrechamente asociados con células sanguíneas. De hecho la
independencia de estas dos líneas celulares ha sido demostrada en los anfibios, donde la
entera región formadora de sangre de las salamandras puede ser quirúrgicamente
removida de la red endotelial (Goss, 1928). El origen conjunto de los angioblastos y de
Capítulo 1
31
los precursores hematopoyéticos en los islotes sanguíneos hizo pensar a los primeros
investigadores que los dos tipos celulares se originaban de un precursor común. Y
Murray en 1932 acuñó el término hemangioblasto para dicho hipotético precursor común.
Aunque continúa siendo hipotética la existencia de tal precursor común, los estudios
moleculares lo soportan cada vez más, puesto que las células endoteliales y las
hematopoyéticas comparten muchos marcadores entre ellas (Pardanaud y col., 1987).
Además, como se describió más arriba, en los estudios moleculares in vitro se ha llegado
a observar que es posible producir la diferenciación de células SE a células
hematopoyéticas y endoteliales (Choi y col., 1998).
El desarrollo temprano de los vasos sanguíneos es muy rápido y la red de vasos para la
circulación está lista antes de que el corazón empiece a latir. Este suceso es de gran
importancia puesto que esto implica que el desarrollo inicial de los vasos sanguíneos es
independiente de la perfusión y de las demandas metabólicas, que son de gran
importancia para la inducción de nuevos vasos, posteriormente en el desarrollo (Risau y
Flamme, 1995).
Luego del inicio del latido cardiaco y por lo tanto de la circulación, comienza un rápido
crecimiento de las redes vasculares. En el SV la estructura de las redes vasculares
semeja un panal de abejas (Evans, 1909). Luego de que dichas redes se establecen y
que se forman los grandes vasos, se recluta la armazón de sostén de dichos vasos: los
pericitos y las células musculares lisas, de tal manera que empieza a ocurrir la
diferenciación de vasos arteriales y venosos (Murphy y Carlson, 1978). A partir de este
momento, la perfusión es de gran importancia, puesto que los vasos con mayor perfusión
aumentan su estructura (Noden, 1989). Aunque se ha demostrado desde hace mucho,
que el crecimiento inicial de los vasos en el SV son independientes del desarrollo
embrionario; posteriormente dichos vasos dependen en gran manera para la
conformación de su compleja estructura de fuerzas mecánicas proveídas por la
contracción del corazón (Chapman, 1918).
Entonces, es importante saber que las
células endoteliales tienen la facultad de responder al ambiente, a la inducción de las
fuerzas hemodinámicas, y también a las demandas metabólicas. Es así, que factores de
crecimiento, como el VEGF junto con su receptor, y otros factores como el factor
inducible por la hipoxia (HIF) pueden hacer que se modifique el lecho vascular (Fong y
col., 1995).
32
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
1.3.3 Angiogénesis
Los cordones y capilares que resultan de la vasculogénesis, se expanden y remodelan, a
través del proceso conocido como angiogénesis (Daniel y Abrahamson, 2000). Para que
ocurra la angiogénesis, parece ser necesaria la presencia de dos señales: la
combinación de la Angiopoyetina-2 y VEGF. Estos factores hacen que las células de
soporte sean más laxas, permitiendo que las células endoteliales recientemente
expuestas, se multipliquen. La Angiopoyetina-2 actúa al parecer por medio del receptor
TIE-2 (receptor tirosina quinasa) (Sato y col., 1995). El efecto de la Angiopoyetina-2
sobre el TIE-2 parece ser antagónico al efecto de la Angiopoyetina-1 (bloqueador de la
remodelación vascular). El receptor TIE-2 se expresa normalmente después de la
expresión de FLK-1, que es consistente con la observación de que las angiopoyetinas
tienen una función posterior en la angiogénesis, que es distinta a la del VEGF (Hoying,
2003). Se ha propuesto que las angiopoyetinas actúan estabilizando los vasos inducidos
por la acción del VEGF (Suri y col., 1996), en un proceso que involucra el reclutamiento
de miocitos y pericitos (Folkman y D‘Amore, 1996); por ejemplo, en los estudios de
sobreexpresión de Angiopoyetina-1, se observó hipervascularización, con producción de
muchos vasos compactos (Suri y col., 1998), en contraste con lo encontrado con la
sobreexpresión de VEGF, en la cual también ocurre hipervascularización, pero con la
formación de vasos grande débiles - simples tubos endoteliales sin células de soporte
(Drake y Litlle, 1995). En corolario, puede decirse, que el papel de las angiopoyetinas en
la vasculogénesis está relacionada con los aspectos de maduración celular endotelial,
después de los estados iniciales de proliferación y formación de túbulos sanguíneos (Suri
y col., 1996). De acuerdo con esto, puede decirse, que el desarrollo de la vasculatura
comienza cuando el VEGF se une a su primer receptor, el FLK-1, haciendo que las
células mesodérmicas se diferencien en células endoteliales, favoreciendo a la vez su
multiplicación. La formación de túbulos capilares ocurriría cuando el VEGF se une a su
segundo receptor, el FLT-1. El siguiente paso involucraría la interacción de los vasos
sanguíneos con las células mesodérmicas que lo soportan, y en este caso las
angiopoyetinas se unirían a su receptor TIE-2, permitiendo que los vasos sanguíneos
Capítulo 1
33
recluten las células periendoteliales, que se convierten en pericitos y tejido muscular liso;
la estructura que estabiliza los vasos sanguíneos (Sato y col., 1995).
Se han descrito varios mecanismos mediante los cuales se modela los plexos vasculares
primitivos que se han establecido a través del proceso de vasculogénesis descrito más
arriba:
• El primero de esos tipos de procesos angiogénicos involucra el brote de capilares a
partir de los vasos preexistentes. En este caso, la degradación de la matriz extracelular
se acopla a la proliferación de los brotes de células endoteliales, lo que permite la
extensión de los vasos primarios (Wagner, 1980). En el SV se produce extensión de los
vasos a través del proceso descrito anteriormente (Stewart y Wiley, 1981).
• El siguiente mecanismo de angiogénesis se llama intususcepción, que involucra la
división de vasos preexistentes (Patan y col, 1996). Ésta ocurre por la proliferación de las
células endoteliales al interior de los vasos. Los dos mecanismos mencionados hasta
ahora pueden desarrollarse concomitantemente. La angiogénesis por intususcepción
ocurre en el SV y en la CAM (Flamme y col., 1997).
• Un tercer tipo de angiogénesis se denomina intercalante, que se produce por la
proliferación de las células endoteliales en los vasos sanguíneos, lo que conduce a un
aumento en su diámetro (Wilting y col., 1997).
1.4 Desarrollo vascular extra e intraembrionario
1.4.1 Vascularización extraembrionaria
Al tratar el tema de la circulación del embrión del pollo, se debe tener en cuenta la
existencia de tres arcos circulatorios, en los que el corazón es el centro común: un primer
arco se establece dentro del embrión; un segundo arco se localiza en la membrana que
rodea al SV; y posteriormente durante el desarrollo se origina un tercer arco que
involucra otra serie de vasos extraembrionarios en la CAM (Anne y Gilbert, 1997). Para el
caso del primer arco circulatorio, la formación de los vasos sanguíneos a partir de los
34
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
islotes sanguíneos en el área vasculosa del SV se inicia primero en la parte periférica de
la misma y desde allí se extiende hacia el cuerpo del embrión. Al finalizarse el primer día
de incubación los plexos vasculares extraembrionarios se han extendido en dirección del
embrión, y han hecho conexión con las venas onfalomesentéricas, las cuales originadas
dentro del embrión se extienden fuera del mismo, y se establece de esta manera la
circulación aferente desde el vitelo. Los nutrientes del vitelo se conducen hacia el
embrión por absorción directa, mientras que se forman los vasos vitelinos eferentes
(Anne y Gilbert, 1997). En cuanto al corazón, aunque la prospectiva de un tejido cardiaco
pueda ser reconocida muy temprano en el desarrollo, la primera indicación estructural
definitiva de la formación del corazón aparece en el embrión de 24 horas de incubación, y
las primeras contracciones pueden ser vistas en el estado de 9 somitas (cerca de las 33
horas de incubación) (Bremer, 1928). Concurrentemente con el establecimiento del
corazón, los vasos sanguíneos han estado originándose dentro del cuerpo del embrión.
Los grandes vasos que conectan con el corazón, son los primeros vasos
intraembrionarios en establecerse. Unas pocas ramas se originan de la aorta a este
estado, y a medida que avanza su desarrollo, las ramas se extienden a las varias partes
del embrión, y la aorta llega a ser el principal vaso conductor eferente de la circulación
embrionaria, de la cual se origina la arteria vitelina (Evans, 1909).
1.4.1.1 Vascularización del saco vitelino. La formación del sistema vascular del
SV y su conexión con la circulación embrionaria es crucial para la supervivencia del
embrión. Como ya se dijo, los primeros vasos sanguíneos del embrión y del SV se
establecen por el proceso de vasculogénesis (la diferenciación in situ del las células
endoteliales del mesodermo y su coalescencia para formar vasos primarios) (Risau,
1997). La vasculogénesis conduce a la formación del principal vaso sanguíneo
intraembrionario, la aorta, y a la formación del plexo vascular primario en el SV.
Entonces, al final del periodo de vasculogénesis y antes del comienzo de la perfusión, los
vasos del SV están presentes en la forma de un plexo capilar. Pronto después del
comienzo de la perfusión, un polo arterial posterior y un polo venoso anterior están
presentes en el SV; es decir, que las arterias y las venas en este estado están presentes
en una configuración bidimensional – la circulación primaria. Esta configuración es
transitoria y remodelada en un periodo de 24 horas, en una estructura tridimensional con
Capítulo 1
35
arterias y venas emparejadas – la circulación secundaria (le Noble y col., 2004). El
sistema sanguíneo primario del SV, el área vasculosa, es evidente para el día 2-3 de
incubación cuando las arterias vitelinas que llevan sangre desde el corazón a la periferia
del blastodermo se hacen claramente visibles. Al mismo tiempo una vena se desarrolla
en el margen del blastodermo, el seno terminal. La sangre de los vasos capilares
periféricos se vacían dentro de esta vena, la cual lleva la sangre anteriormente a la vena
vitelina anterior, que transporta la sangre al corazón. Un sistema sanguíneo secundario
de nuevas venas comienza a aparecer mientras el sistema sanguíneo primario está aún
en desarrollo. El área vascularizada del SV es circular, extendiéndose radialmente sobre
la superficie del vitelo desde el embrión. El área vasculosa está delimitada por el seno
terminal que colecta la sangre de los capilares distales (Baumann y Meuer, 1992). En el
día 5, las venas vitelinas laterales han crecido paralelas a las arterias vitelinas, y en los
capilares periféricos del seno terminal, el flujo se revierte, y la sangre ahora se transporta
desde la periferia del blastodermo al corazón a través de las venas vitelinas laterales, en
una ruta más directa. Para el día 6 el seno terminal comienza a regresar (Romanoff y
Romanoff, 1949). El patrón de ramificación de las arterias y las venas es dicótomo,
dando la apariencia de una topología de árbol, mientras que los capilares,
particularmente cerca del seno terminal, forman una malla (Baumann y Meuer, 1992).
1.4.1.2 Vascularización de la corioalantoides. La extensa red vascular de la CAM
comienza su desarrollo al día 4 de incubación (Fietze-Gschwind, 1973). Inicialmente se
observan vasos sanguíneos pobremente diferenciados, dispersos por todo el
mesodermo. Los vasos recién formados se han desarrollado por brotes de los
preexistentes (Schlatter y col., 1997). Al día 5 dicha red capilar laxa se encuentra ausente
en algunas regiones de la CAM. Para el día 6 la red capilar se distribuye uniformemente,
y ya en el día 7, el análisis morfométrico muestra una red capilar más estrecha (Schlatter
y col., 1997). Luego esta red capilar continúa creciendo rápidamente hasta el día 8
(Burton y Palmer, 1989), y a partir de este día se observa muy poca angiogénesis por
brote; desapareciendo completamente del día 9 en adelante (Schlatter y col., 1997). Para
el día 10 comienza la interdigitación con el ectodermo (Ausprunk y col., 1974) y
rápidamente prosigue la proliferación capilar hasta el día 11 cuando está completamente
formada (Romanoff, 1960; Rol‘nik, 1970; Spanel-Borowski, 1989), y de ahí en adelante el
índice mitótico endotelial declina rápidamente. La angiogénesis intususceptiva es el
mecanismo utilizado durante la segunda fase de desarrollo vascular en la CAM (día 8-12)
36
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
es (Schlatter, 1997). A medida que los plexos capilares crecen, los espacios dentro de
los plexos se subdividen. Inicialmente hasta el día 7, como se anotó más arriba, el
principal mecanismo para esta subdivisión es por brote de los vasos preexistentes; sin
embargo, después del día 7, la angiogénesis intususceptiva se convierte en el proceso
más importante de subdivisión de los plexos (Burton y Palmer, 1992; Schlatter y col.,
1997; Djonov y col., 2000).
En un estudio se encontró que el área vascular total incrementa continuamente hasta el
día 14, mientras que al parecer la longitud total solo aumenta hasta el día 12,
presentando una leve reducción después (Nikiforidis y col., 1999). Al día 14, el plexo
capilar se localiza en la superficie del ectodermo, adyacente a la membrana de la
cáscara del huevo (Duncker, 1978), y puede decirse en términos generales que la
arquitectura de la CAM ha alcanzado su morfología madura (Schlatter, 1997). El sistema
vascular alcanza su arreglo final para el día 18, justo antes de la eclosión (Ausprunk y
col., 1974).
Muchos de los estudios de la vascularización de la CAM se han realizado en la
membrana corioalantoidea madura (Folkman, 1974; Senger y col., 1983; Connolly y col.,
1989; Leung y col., 1989; Wilting y col., 1991, 1992, 1993). El desarrollo del sistema
vascular de la CAM es un proceso complejo altamente regulado, que depende de
factores genéticos y epigenéticos expresados por células endoteliales y no endoteliales;
razón por la cual, la CAM ha servido como un modelo in vivo para la evaluación de
moléculas angiogénicas y anti-angiogénicas (Ribatti y col., 1996, 1997b; Ribatti y Vacca,
1999; Ribatti y col., 2001).
1.4.2 Desarrollo vascular embrionario
El sistema cardiovascular de los vertebrados se origina a partir de la capa mesodérmica
del embrión primitivo. Los angioblastos dan origen a las células endoteliales, y los
hematoblastos se diferencian en las células sanguíneas (González-Crussi, 1971). Los
angioblastos que se van desarrollando se ensamblan dentro de cordones vasculares
Capítulo 1
37
primitivos. Estos cordones primordiales fueron por primera vez observados en la codorniz
(Peault y col., 1983). Los primeros angioblastos crecen en la periferia del mesodermo
extraembrionario, y un poco después al interior del embrión (Pardanaud y col., 1987). En
las cercanías del intestino anterior estos angioblastos al interior del embrión establecen el
primordio del corazón, y a lo largo de los somitas se extienden formando vasos, los
cuales se interconectan con los vasos extraembrionarios ya en el estado de dos somitas
(His, 1900). En esta etapa del desarrollo el corazón es una estructura tubular ubicada en
la línea media ventral; y dicha región se encuentra dilatada notablemente. En su parte
anterior el corazón se continúa con un gran vaso medial, la aorta ventral; y en su parte
posterior se continúa con el par de venas onfalomesentéricas. Por otro lado, fuera del
embrión en el SV, ha estado ocurriendo un rápido crecimiento del área vasculosa, y en el
límite periférico de esta área, como se describió arriba, se forma el seno marginal (una
marcada banda oscura) (Patten, 1964), y la circulación aferente desde el SV se establece
en las siguientes horas de incubación cuando el plexo de vasos que se desarrollan en la
superficie del vitelo entran en comunicación con las venas onfalomesentéricas que se
están desarrollando dentro del embrión, y que se extienden lateralmente. Así mismo, la
circulación eferente hacia el vitelo se produce algo después, cuando las arterias
onfalomesentéricas que se originan de la aorta del embrión llegan a conectarse con el
plexo vascular del SV (Patten, 1971), mientras tanto, el corazón se ha estado formando
como una bomba efectiva. Durante este tiempo se han desarrollado las células
sanguíneas en los islotes del SV; y al mismo tiempo los vasos que van desde el área
vasculosa hacia el embrión, de tal manera, que todo es encuentra listo para el
establecimiento del completo arco circulatorio desde el corazón al SV y viceversa (Patten
y Kramer, 1933; Patten, 1971).
1.5 Respiración embrionaria
Durante la vida embrionaria los pollos consumen cerca de 6 litros de O2 y liberan
aproximadamente 4.5 litros de CO2 (Burton y Tullet, 1985). La permeabilidad de O2 de la
cáscara del huevo y sus membranas inicialmente es baja, pero luego incrementa
después de la primera semana de incubación. Este aumento se asocia con la
disminución del contenido de agua de las membranas de la cáscara, ya que un alto
contenido de agua se correlaciona con una baja permeabilidad de O2 y viceversa. Existe
38
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
la hipótesis, de que la remoción de agua de las membranas de la cáscara por el
incremento de la presión coloidosmótica, aumenta el número de canales llenos de gas en
las membranas, facilitando la permeabilidad al O2. El grado final de hidratación de las
membranas alcanzado durante la incubación es independiente de la humedad ambiental,
es decir, que es controlado por las condiciones propias del huevo (Lomholt, 1976). Se
debe decir también, que la cámara de aire va incrementando su tamaño a medida que el
tiempo de incubación avanza.
1.5.1 Periodos de la respiración embrionaria aviar
Desde el punto de vista de los mecanismos de respiración, la vida embrionaria del pollo
puede ser dividida en 4 periodos:
1.5.1.1 Difusión. Este se caracteriza por la circulación sanguínea primaria, que se
presenta aproximadamente desde las 36 horas de incubación, cuando la sangre
comienza a fluir por los vasos recientemente formados hasta las 65-72 horas (Romanoff,
1960). Durante este periodo no hay un verdadero transporte de O2 por la Hb. Prueba de
esto son los mismos niveles de oxigenación de la sangre arterial y venosa. Se ha
demostrado que embriones en estadios tempranos, a los cuales se les ha saturado la Hb
con CO2 evitando el transporte de O2, sobreviven por largo tiempo, lo cual sugiere que
durante las primeras horas del desarrollo embrionario, la difusión es el principal
mecanismo de abastecimiento de O2 hacia los tejidos (Cirotto y Arangi, 1989b; Burggren
y col., 2000). En este caso, la conductancia de la cáscara es el factor principal en la
barrera de difusión del O2; y dicha conductancia está determinada básicamente por el
área funcional de los poros y la PB (Mortola, 2009).
Es importante saber que mientras la circulación primaria perdura, la del SV no funciona
como un órgano respiratorio. Esto probablemente sea debido a la ausencia de una
estructura capilar adecuada en la cual pueda ocurrir el intercambio de gases. Sin
embargo, en este estadio, el O2 que se difunde es suficiente para mantener el
metabolismo tisular del embrión. Es probable que la sangre permita y facilite la difusión
Capítulo 1
39
del O2 del área vascular al cuerpo del embrión (Cirotto y Arangi, 1989a, b). A medida que
va creciendo el embrión, hay un incremento en el nivel de oxigenación de la Hb, el cual
se puede deber al incremento de la superficie vascular y a su progresivo enriquecimiento
dentro de los vasos sanguíneos.
1.5.1.2 Circulación vitelina. El segundo periodo se caracteriza por la circulación
secundaria que va desde las 65-72 horas hasta los 6 días de incubación. El área vascular
del SV comienza a funcionar como un órgano respiratorio. Sin embargo, los diferentes
niveles de oxigenación de la hemoglobina de las venas onfalomesentéricas muestran que
la sangre se oxigena parcialmente en el área vascular. Por lo tanto, no se puede
considerar como un órgano respiratorio eficiente ya que la sangre que llega al área
vascular contiene aproximadamente un 40% de oxihemoglobina, mientras que la que
sale contiene solamente entre el 60 y 70 % de oxihemoglobina (Baumann y Meuer,
1992). La cáscara, sus membranas y la albúmina que rodean al SV, dificultan la difusión
de O2, aunque su conductancia a los gases permanece constante durante la incubación
(Mortola, 2009). Otra razón para la ineficiente unión de la Hb con el O2, es quizá, la
ausencia de sinusoides en el área vascular donde pueda tomar lugar una unión eficiente
(Ciroto y Arangi, 1989a, b). Durante este periodo, los estudios con espectrofotometría,
indican que el mayor consumo de O2 por parte del embrión proviene del área opaca del
SV (Adair y col., 1987).
1.5.1.3 Circulación alandoidea. En el tercer periodo, el intercambio de gases se da
por medio de la CAM y va del día 6 al 19 de incubación (Rahn y Paganelli, 1974). El
paso del O2 desde la atmósfera hasta los tejidos del embrión se ve limitado por varios
factores: el embrión no tiene control sobre la resistencia externa inerte, que está
compuesta por la cáscara y su membrana externa. Sin embargo, la resistencia interna
puede ser controlada en cierto grado ya que esta incluye la membrana interna de la
cáscara, el epitelio coriónico, la pared de los capilares sanguíneos en la CAM, el plasma
sanguíneo, el volumen de sangre capilar y la velocidad de reacción del O2 con la Hb
dentro de las células rojas (Wangensteen y Weibel, 1982); y de hecho, de acuerdo con
las mediciones de la saturación de O2 de la Hb, se ha encontrado que existe una
diferencia marcada entre la saturación arterial y venosa, con un 50% de diferencia
(Cirotto y Arangi, 1989b). Durante este periodo la conductancia a los gases entre el
40
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
ambiente y la sangre incrementa notablemente, primero, debido al crecimiento de la CAM
con su vascularidad, y la proximidad de la CAM a la membrana interna de la cáscara;
además, el volumen sanguíneo, el hematocrito y la afinidad por el O2 de los glóbulos
rojos también incrementa (Tazawa, 1971).
Durante este periodo, el consumo de O2 de la propia CAM, es una gran fracción del total
en todos los tejidos del huevo, disminuyendo a la quinta parte después del día 12 de
incubación (Pearson y col., 1991). Lo que quiere decir, que durante la primera semana de
incubación, un gran porcentaje del consumo de O2 proviene de la CAM en desarrollo. De
manera parecida, durante la segunda mitad de incubación, cerca de la mitad del gasto
cardiaco va dirigido a la CAM, y un 15% al SV; y en la tercera semana de incubación
dicha fracción del gasto cardiaco hacia CAM permanece igual, no obstante, el gasto
cardiaco que se dirige al SV disminuye a favor de los órganos embrionarios (Mortola,
2009).
1.5.1.4 Ventilación pulmonar. El cuarto periodo, en el que comienza la respiración
pulmonar va desde el momento en que el embrión perfora la membrana interna en el día
19, hasta la eclosión – el día 21 (Burton y Tullet, 1985). Durante este periodo el
intercambio de gases se da por dos mecanismos: difusión (CAM) y convección
(pulmones) (Ar y col., 1980). Teniendo en cuenta que la porosidad de la cáscara es
inalterable una vez ha sido puesto el huevo, y que a medida que el embrión se desarrolla
incrementa la demanda metabólica, las condiciones dentro del huevo llegan a ser por sí
mismas, hipóxicas e hipercápnicas hacia el final de la incubación (Wangensteen y Rahn,
1970/1971).
Wittmann y Weissenbeck (1980), encontraron que el incremento de la
relación CO2/O2 dentro de la cámara de aire del huevo, estimula el inicio de la eclosión.
La hipoxia alcanza su máximo alrededor del día 19 de incubación. En este momento es
cuando el embrión pica dentro de la cámara de aire y se inicia la ventilación pulmonar
(Tazawa, 1980; Ar y col., 1987). Esta hipoxia fisiológica estaría involucrada en el
incremento de las catecolaminas plasmáticas que se da también hacia el día 19. La
adrenalina y la noradrenalina causan un incremento de la Hb y una redistribución del flujo
sanguíneo para favorecer el intercambio gaseoso entre el embrión y el ambiente (Dragon
y col., 1999).
Capítulo 1
41
En el embrión del pollo, los cambios para controlar la tensión de O2 en la sangre y por
ende la afinidad de la Hb por el O2, se realizan modulando las concentraciones del ATP y
del 2,3 difosfoglicerol (2,3DFG) en los glóbulos rojos. La hipoxia, que es una condición
normal en el desarrollo tardío del embrión, hace que disminuya la concentración de ATP
de las células rojas (incrementa la afinidad de O2 de éstas) y promueve la síntesis de
2,3DFG (Baumann y col., 1986; Dragon y col., 1999).
Antes de la eclosión, la CAM es el único órgano respiratorio; y la circulación de dicha
membrana y la circulación sistémica del embrión funcionan en paralelo: la arteria
alantoidea suple a la región posterior del embrión y a la CAM (con relativamente pobre
concentración de O2). La sangre baja en O2 que retorna de la región anterior del embrión
y del SV diluye la sangre oxigenada de la vena alantoidea proveniente de la CAM. Esta
ingresa al área umbilical y llega al atrio derecho vía del ducto venoso y de la vena cava
caudal, para ser luego desviada en su mayoría a través del agujero oval (Mortola, 2009);
y puesto que los pulmones en este estadio no están completamente desarrollados, un
gran porcentaje de la sangre que proviene del ventrículo derecho evita el paso de los
pulmones por medio del ducto arterioso. En resumen se dice entonces que en ambas, la
vena y arteria alantoidea, hay sangre oxigenada y mixta respectivamente. Después de la
perforación interna de la cáscara, el ducto arterioso comienza a cerrarse y los pulmones
se vuelven funcionales. Es así como al iniciarse la ventilación pulmonar durante la
eclosión, la arteria alantoidea lleva sangre oxigenada desde los pulmones. Por
consiguiente, se espera que la presión de O2 aumente ya que hay dos sistemas de
intercambio de gases funcionando: el corioalantoideo y el pulmonar (Burton y col., 1989).
1.5.2 Transporte del oxígeno en el embrión aviar
Durante el desarrollo temprano aviar, la difusión del ambiente exterior al interior del
huevo es muy importante. Después de que el huevo es puesto, este se ve enfrentado a la
PO2 en el ambiente atmosférico en el que se encuentra. En los estados tempranos de
desarrollo cuando el intercambio gaseoso se lleva a cabo por medio de los vasos
sanguíneos de la membrana del SV, la barrera de difusión está dada por la cáscara del
huevo (los poros presentes en ella) y las membranas externas e internas de la cáscara
42
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
(Paganelli, 1980). Por diferentes estudios, se sabe que en realidad la cáscara del huevo y
su membrana externa exhiben una baja resistencia a la difusión de los gases. En cuanto
a la membrana interna, esta, al inicio de la incubación es relativamente húmeda, de tal
manera, que la difusión de los gases a través de ésta es como a través de un líquido. Sin
embargo, la humedad de dicha membrana comienza a disminuir a partir del segundo día,
reduciéndose la difusión de los gases a través de la misma (Kutchai y Steen, 1971).
Después del segundo día de incubación el área vasculosa del SV se extiende a lo largo
de la superficie del SV. Durante los primeros 4 a 5 días de desarrollo, del total del O2
tomado, la mayor parte es utilizado por las estructuras extraembrionarias, mientras que
menos del 10% es utilizado por el propio embrión (Meuer, 1987). Teniendo en cuenta que
en términos generales se dice que en los estadios más tempranos de desarrollo el
gradiente de difusión del O2 entre el medio ambiente y la cámara de aire varia muy poco
(Mortola, 2009), y de acuerdo con las mediciones de la presión parcial media de O2 en la
circulación del SV (que es la diferencia entre la PO2 en la arteria y vena vitelina) se
estima que la capacidad de difusión del O2 a la circulación del vaso vitelino es alrededor
de 0,01nl∙s-1∙Torr-1 (Baumann, 1990). En la segunda mitad de incubación (la fase de
mayor crecimiento embrionario) empieza a haber un marcado decrecimiento en la PO2 en
la cámara de aire, que favorece la difusión del O2 a través de la cáscara (Tazawa y col.,
1980; Burggren y col., 2000).
Como ocurre en otras especies, las aves producen una serie diferente de Hbs
embrionarias con respecto al adulto. Al principio, estas Hbs se sintetizan en las células
sanguíneas primitivas que se originan en el SV (Dieterlen-Lièvre, 1988). Dichas células
pueden verse en el embrión a partir del segundo día de incubación en los islotes
sanguíneos. Después de que se establece el sistema circulatorio entre el embrión y el SV
alrededor del tercer día de incubación, comienza el transporte convectivo de O2 desde
dicha membrana. La parte vascularizada del SV recibe el nombre de área vasculosa, que
es el principal órgano de intercambio gaseoso durante los primeros días de desarrollo
hasta el final de la primera semana (Patten, 1971). En cuanto a los tipos de Hb
embrionaria en las aves, los diferentes estudios sugieren que estos son iguales entre las
diferentes especies aviares (Cirotto y col., 1980). En el embrión del pollo, las células rojas
primitivas son la principal población de células más o menos hasta el día 6 de incubación,
Capítulo 1
43
cuando una segunda serie de células sanguíneas (definitivas) entra en circulación. Estas
células son incapaces de sintetizar la Hb embrionaria, y en cambio sintetizan las Hbs
adultas A y D. En los estadios temprano de desarrollo en el embrión aviar se produce un
exceso de hemoglobina D, contrario a lo que sucede posteriormente donde se produce
mayormente tipo A (Cirotto y col., 1980). El SV es el responsable de la producción de
todas las células rojas primitivas, lo mismo que de la primera población definitiva.
Posteriormente dicha eritropoyesis es de origen intraembrionario (Dieterlen-Lièvre, 1975).
A diferencia de lo que ocurre en los animales adultos (exceptuando los estados
patológicos), en los que las células sanguíneas siempre ingresan al torrente sanguíneo
como células postmitóticas, las células sanguíneas primitivas entran a la circulación
como células sanguíneas inmaduras, y terminan su diferenciación dentro de la
circulación. De esta manera, las células sanguíneas primitivas pueden proliferar
rápidamente y al mismo tiempo transportar el O2 en estos estadios tempranos de
desarrollo (Cirotto y Geraci, 1977). Mientras la población de glóbulos rojos definitivos
(que es la mayoría de la población el día 8) se expande rápidamente hasta el día 17, la
mayor
proporción
de
células
circulantes
se
encuentra
en
el
estado
policromático/ortocromático (Dragon y Baumann, 2003).
1.5.3 Regulación del oxígeno
En las condiciones de baja concentración de O2, la respuesta primaria en los eucariotes
para mantener las demandas energéticas, es prender la vía de la fosforilación oxidativa,
para generar ATP para la glicólisis (proceso conocido
como el efecto Pasteur); sin
embargo, parece que en los embriones la caída metabólica en respuesta a la hipoxia,
con la concomitante disminución en el consumo de O2, no es compensado por fuentes
energéticas anaerobias (Mortola y Besterman, 2007).
Para incrementar la captación del O2 por parte del organismo, la hipoxia promueve un
incremento en la producción de glóbulos rojos, la formación de nuevos vasos
sanguíneos, y la vasodilatación, entre otros. Dentro de todas las vías metabólicas y
genes inducidos por la hipoxia, uno de los reguladores clave tanto de los cambios
sistémicos como celulares, es el factor inducible por la hipoxia – HIF (Mack y Simon,
2004).
44
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
1.5.3.1 El factor inducible por la hipoxia. El HIF es un heterodímero de la familia
de proteínas bHLH-PAS; y consiste de una subunidad inestable alfa, y una subunidad
estable beta (llamada ARNT) que se une al DNA en lugares específicos, llamados los
elementos de respuesta a la hipoxia – HRES (Hu y col., 1998). El HIFα se dimeriza con
miembros de la familia HIFβ y se trasloca al núcleo, activando transcripcionalmente 100 a
200 genes involucrados en el metabolismo, la vasculogénesis, angiogénesis, incluyendo
a la eritropoyetina, la transferrina y su receptor, lo mismo que el VEGF y su receptor FLK1 (Kulshreshtha y col., 2007). Además el HIF regula la expresión de genes necesarios
para la proliferación y supervivencia celular (Mack y Simon, 2004). De las tres proteínas
HIFα existentes en los metazoarios superiores, la HIF-1α y HIF-2α han sido las más
estudiadas. (Hu y col., 2007). El HIF-2α parece tener menor actividad en aquellas células
que expresan también el HIF-1α (Hu y col., 2006), pero en los casos en que el HIF-2α es
sobreexpresado, la transcripción de los genes blanco es mayor. Otras investigaciones
también sugieren que las distintas isoformas de HIF, producen distintas respuestas a la
hipoxia (Sánchez y col., 2007). En los vertebrados, el HIF parece estar implicado además
en vías normales del desarrollo (Lyer y col., 1998); por ejemplo, se ha encontrado que en
los embriones de ratón hay regiones que son hipóxicas, y donde hay una mayor
expresión del HIF (Lee y col., 2001). En el embrión aviar, también se han encontrado
áreas hipóxicas en algunos órganos en condiciones de normoxia (Nanka y col., 2006). En
dichos órganos se detecta expresión de HIF.
1.5.3.2 Los radicales libres de oxígeno. Antes que nada, es importante saber que
todas las proteínas que se unen al O2 molecular contienen hierro; y por eso, no es de
sorprender que Goldberg y colaboradores (1988) sugirieran por primera vez, que el
sensor del O2 en los animales era el grupo prostético Heme de la Hb. En los estudios
para evaluar la relación del O2 con dicho grupo prostético, se ha encontrado que al usar
metales catiónicos que no se unen al O2, no se producen cambios adicionales en la
inducción de la eritropoyetina (hormona encargada de estimular la formación de
eritrocitos) en los individuos previamente tratados con dichos cationes y luego expuestos
a hipoxia, indicando que el hierro del grupo heme es reemplazado por dichos cationes.
Posteriormente, estudios en los que se usaron quelantes confirmaron estos hallazgos,
Capítulo 1
45
puesto que al usar dichos quelantes se daban efectos parecidos a los producidos por la
hipoxia (Ho y Bunn, 1996). En la actualidad se sabe que el grupo heme no es el único
mecanismo sensor a la hipoxia, y que se usan diferentes vías de transducción en la
célula. De todas estas vías de transducción, durante mucho tiempo se ha sabido, que los
Radicales Libres de O2 (RLO), son transductores en diferentes organismos y sistemas
(Suzuki y col., 1997). Y puesto que el O2 es el principal componente de los RLO, es claro,
que estos se ven afectados por las concentraciones en el O2 ambiental. La reducción no
enzimática del peróxido de hidrógeno produce el anión hidroxilo y el altamente reactivo,
radical hidroxilo, por la oxidación del ión ferroso. Así, en este modelo, las
concentraciones del radical hidroxilo en normoxia inactivaría el HIFα, el cual sería
liberado por la disminución de las concentraciones del radical hidroxilo en las condiciones
de hipoxia (Duranteau y col., 1998). Entonces, bajo condiciones de buena oxigenación el
HIFα se hidroxila a uno o ambos lados de los residuos prolil (Kaelin, 2005), haciendo que
dicho residuo prolil hidroxilado genere un sitio de unión para la proteína supresora
tumoral von Hippel-Lindau – pVHL (Maxwell y col., 1999), la cual es un componente de
un complejo ubiquitina ligasa; de tal manera que el HIFα es poliubiquitinado y sujeto a
degradación proteosomal cuando el O2 se encuentra disponible (Kaelin, 2005). Así, en
condiciones de hipoxia, el HIFα deja de estar hidroxilado, acumulándose.
Aunque existen muchos modelos para explicar cómo las células pueden sentir los
cambios en las concentraciones de O2, un mecanismo exacto es aún desconocido (Mack
y Simon, 2004).
1.5.4 Desarrollo embrionario en condiciones hipóxicas
Aunque la hipoxia tiene poco efecto en el desarrollo temprano debido a la pequeña
demanda absoluta de O2 por parte del embrión; a medida que este crece, la hipoxia
progresivamente representa una perturbación más severa (Tazawa y col., 1992; van
Golde y col., 1997), sobre todo si se tiene en cuenta que en este periodo el intercambio
de gases se da principalmente a través de la CAM (Ar y col., 1980). En algunos estudios
investigando lo contrario (el efecto de la hiperoxia) se ha encontrado lo inverso: al
incrementar la concentración de O2 dentro de la incubadora de 21% a 60% durante los
días 16 a 18, el peso del embrión aumentó (McCutcheon y Metcalfe, 1984; Stock y
46
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Metcalfe, 1987). Por el contrario, la tasa de crecimiento declina si la concentración de O2
se reduce al 15% durante este periodo crítico (Asson-Batres y col., 1989). Estos estudios
sugieren que el crecimiento y el metabolismo del embrión de pollo están limitados
fisiológicamente por la disponibilidad de O2 durante el último tercio de la incubación.
Como se mencionó antes, varios autores han reportado el efecto negativo de la hipoxia
en el crecimiento de embriones incubados a gran altitud (Wangensteen y col., 1974; entre
otros). No obstante, otros investigadores (Villamor y col., 2004) han reportado que la
hipoxia no tiene efecto en el peso embrionario; o incluso, que la hipoxia acelera el
desarrollo embrionario (Blanker y col., 2004).
Aggazzotti (1914) citado por Rahn (1988) evaluó la tensión de gases dentro de la cámara
de aire de embriones de pollo incubados a nivel del mar y a 3000msnm, y describió los
cambios en la PO2 y de la PCO2 durante el desarrollo embrionario. Hacia el final de la
incubación, la PO2 mostró una disminución aproximada del 28% en los huevos incubados
a gran altitud respecto a los del nivel del mar. Se encontraron resultados similares para la
PCO2. Posteriormente estos resultados fueron confirmados por Wangensteen y
colaboradores (1974), de lo cual se concluyó que la hipoxia hipobárica conduce a una
menor tasa metabólica del embrión reflejada en la disminución de la PCO2, lo cual está
directamente relacionado con la prolongación del tiempo de eclosión a gran altitud
reportado por Smith y colaboradores (1969). Recientemente también se ha reportado la
ocurrencia del hipometabolismo en embriones de pollo incubados en condiciones de
hipoxia, siendo en estos casos, mayor en las etapas más tempranas del desarrollo
(Mortola y Besterman, 2007). Una interpretación, es que en los embriones jóvenes, el
incompleto desarrollo de la CAM, limita la disponibilidad del O2, agravando la hipoxia
tisular (Mortola y Cooney, 2008). Aunque los mecanismos exactos que permiten la
regulación del crecimiento embrionario en respuesta a la hipoxia son aún desconocidos
(Mortola, 2009).
Visschedijk (1968a) observó que el tiempo de picado puede ser acelerado inhibiendo el
intercambio gaseoso a través de la cáscara de la cámara de aire durante los últimos días
de incubación. El picado de la cáscara se retardó por punción de la cáscara que cubre la
Capítulo 1
47
cámara de aire, con el subsiguiente incremento del intercambio gaseoso. Además, se
encontró que el estímulo para picar la membrana interna se presentaba más rápido,
cuando se incrementaba la concentración de CO2 y se retrasaba, al aumentar la
concentración de O2 dentro de la cámara de aire (Visschedijk, 1968b, c). Sin embargo,
actualmente algunos autores han reportado que la hipoxia tiene menores efectos en el
tiempo de incubación (Azzam y col., 2007).
Tengerdy y colaboradores (1970), lo mismo que Visschedijk y colaboradores (1985)
encontraron que al exponer embriones de pollo a condiciones de hipoxia por cortos
periodos de tiempo (24-48 horas), se reducía la incubabilidad. Similares resultados
obtuvieron otros investigadores en el caso del pavo (Moreng, 1983; Christensen y
Beagley, 1984). En términos generales, se sugiere que una disponibilidad del O2 por
debajo del 15% sin importar en que periodo del desarrollo es aplicada, altera la
supervivencia embrionaria, y por lo tanto la incubabilidad del mismo (Carter y Freeman,
1969 citado por Mortola, 2009; Zhang y col., 2008).
Smith y colaboradores (1969), observaron las variaciones en el desarrollo de embriones
de pollo incubados en tres diferentes altitudes (nivel del mar, 3100 y 3800msnm). Estas y
posteriores investigaciones mostraron, que la hipoxia, produce un retraso en el
crecimiento, principalmente en los estadios tempranos (<10 días) y tardíos (>16 días) de
la incubación (Taylor y col, 1971). Posteriormente también, otros autores encontraron una
disminución en el crecimiento corporal de embriones de pollo expuestos a hipoxia
(Tazawa y col., 1971; Wangesteen y col., 1974; Metcalfe y col., 1981; McCutcheon y col.,
1982; Xu y Mortola, 1989; Miller y col., 2002; Chan y Burggren, 2005; Giussani y col.,
2007).
Atherton y Timiras (1970), evaluaron el desarrollo somático y eritropoyético en embriones
de pollo a gran altitud y encontraron que la Hb embrionaria persistía aproximadamente 24
horas más que en los embriones a nivel del mar; y que el periodo en el cual cambiaba la
Hb embrionaria a adulta, era hacia el día 7 de incubación (normalmente se presenta al
día 6). Estos hallazgos, puede ser el resultado de una adaptación fisiológica en los
estados tempranos del desarrollo embrionario, ya que se ha demostrado que la Hb adulta
tiene menor afinidad por el O2 que la embrionaria. Además, se encontró un aumento en
el número de eritroblastos en el día 7 y 9 de incubación a gran altitud, lo que sugiere una
48
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
policitemia inminente. Aunque estos resultados son controversiales con los de otros
estudios (Tazawa y col., 1971; Xu y Mortola, 1989; Dzialowski y col., 2002), en los que el
incremento fue muy pequeño o ninguno.
Los embriones incubados a gran altitud disminuyen la concentración de ATP de las
células rojas e incrementan la concentración de 2,3 DFG y la actividad de anhidrasa
carbónica más rápido que los embriones incubados a menor altitud (Baumann y col.,
1986; Dragon y col., 1999). Toda la investigación a cerca de las vías de regulación de la
función de los glóbulos rojos en el transporte de O2, han mostrado que la hipoxia produce
los mismos efectos en el embrión temprano como tardío; esto es, un incremento en la
afinidad del O2 causada por el reemplazo del nucleótido ATP por 2,3 DFG, y la activación
de la síntesis de la anhidrasa carbónica que mejora el transporte del CO2 para
contrarrestar el efecto de la hipercapnia en la afinidad por el O2 de la Hb (Dragon y col.,
2003).
Además, se ha encontrado que los embriones de pollo expuestos a hipoxia desarrollan
enfermedad cardiaca (Rowet y col., 2002). Y aunque el VEGF ha mostrado ser
importante en la respuesta angiogénica debido a la hipoxia; se cree que el aumento de
su expresión en el corazón durante la hipoxia, produce efectos deletéreos en el mismo
(Tintu y col., 2009). De gran interés es el hecho de que los pollos adultos de embriones
expuestos a hipoxia crónica durante el desarrollo mostraron corazones severamente
dilatados (Tintu y col., 2009).
En teoría, los efectos de la hipoxia hipobárica pueden ser normalizados si el intercambio
gaseoso es restaurado a valores del nivel del mar (Yildirim y Mehmet, 2010).
En conclusión, puede decirse que la hipoxia altera el normal desarrollo del control
metabólico (durante toda la incubación), y cardiaco (a partir del segundo tercio de
incubación) pulmonar (al final de la incubación), a través de diferentes mecanismos. Si
estos efectos son irreversibles o eventualmente se recobran durante la vida postnatal es
aún incierto (Mortola, 2009), aunque como se mencionó en la introducción, los efectos
Capítulo 1
49
neuronales del sistema cardiovascular, parecen ser permanentes (Ruijtenbeek y col.,
2000; Tintu y col., 2009).
1.5.5 Hipoxia y vascularización extraembrionaria
Algunos investigadores han seguido la densidad vascular de la CAM con el tiempo,
desde el día 7, encontrando un incremento en el índice de densidad vascular de la CAM
del 36% en el día 10 y del 68% en el día 14 (Dusseau y Hutchins, 1988). En estos
estudios además, se encontró un incremento del índice de densidad vascular en estos
mismos días en embriones expuestos a ambientes de hipoxia relativa (15% de O2). Otros
investigadores, quienes incubaron huevos de pollo en concentraciones de O2 del 12, 16,
21, 45 y del 70% de O2 desde el día 7 al 14, demostraron que el grado de exposición al
O2 produce un cambio concentración-dependiente en el índice de densidad vascular (la
hipoxia lo incrementa) (Strick y col., 1991). Corona y Warburton (2000) cubrieron ± 25%
de la cáscara del huevo con cera antes de ponerlos en la incubadora y midieron en el día
12 de incubación el índice de densidad vascular en la región hipóxica formada en la
CAM, pero no encontraron diferencias en dichos índices entre las regiones hipóxicas y
las control en estos estados tempranos; en controversia a estos resultados,
posteriormente Wagner-Amos y Seymor (2003) demostraron que al cubrir la mitad de la
cáscara con cera al comienzo de la incubación, se reduce la densidad de los vasos de la
CAM bajo el área cubierta comparado con los huevos sin cubrir. En un estudio reciente
(Azzam y Mortola, 2007), se encontró un aumento en el peso de la CAM en los
embriones expuestos a la hipoxia, como previamente reportado por otros autores (Strick
y col., 1991; Burton y Palmer, 1992; Wagner-Amos y Seymor, 2003; Chan y Burggren,
2005). Indicando que la hipoxia tiene un efecto positivo en la masa de la CAM,
permitiendo un mejor aprovechamiento del O2 presente; algo parecido a lo que ocurre
con la placenta de los mamíferos durante la gestación hipóxica (Azzam y Mortola, 2007).
No obstante, no hay certeza aún si los huevos incubados en mayores altitudes poseen
CAM más grandes (Mortola, 2009).
50
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2. Peso embrionario
inmunoexpresión y
2α, VEGF-A y FLK-1
incubados a 355 y
incubación
y desarrollo vascular e
expresión relativa del HIFen el saco vitelino de pollos
1378msnm el día 3 y 4 de
2.1 Resumen
Con el objetivo de establecer el posible efecto de dos diferentes alturas en el peso
embrionario y en la vascularización de la membrana del saco vitelino, se incubaron
embriones de pollo a 355 y 1378msnm, y el día 3 y 4 de incubación: se midió el peso del
embrión y del saco vitelino; se estimó el área vascular media, el porcentaje capilar y el
área capilar media del saco vitelino; se describió y cuantificó la inmunoexpresión del HIF2α, del VEGF-A y de su receptor FLK-1 en las células del saco vitelino; y se realizó la
cuantificación relativa de la expresión del mRNA de las anteriores proteínas en el saco
vitelino mediante q-PCR. Los resultados de la presente investigación mostraron que ni el
peso del embrión ni del saco vitelino presentan diferencia estadísticamente significativa el
día 3 y el día 4 en los embriones incubados en las dos diferentes alturas; no obstante que
si hubo diferencia estadísticamente significativa en el área vascular media (p:< 0.05), el
porcentaje capilar (p:< 0.05), el día 3 y el día 4; del porcentaje de células positivas a la
expresión de VEGF-A (p: 0.05) y FLK-1 (p:< 0.05) el día 3, y del porcentaje de células
positivas a la expresión de HIF-2α (p: 0.05) y FLK-1 (p: 0.05) el día 4; y de la expresión
relativa del mRNA del HIF-2α, VEGF-A y de su receptor FLK-1 el día 3 y el día 4 (p:<
0.001 para la expresión relativa del mRNA de todos los tres genes el día 3; y p: 0.01; <
0.01; < 0.001 para la expresión relativa del mRNA de los respectivos genes el día 4) en
los embriones incubados a 1378msnm. Además mediante tinción inmunohistoquímica se
encontraron células positivas a HIF-2α y VEGF-A en el endodermo, endotelio y
ectodermo; y células positivas a FLK-1 únicamente en el endotelio. De los resultados se
52
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
concluyó que el nivel de hipoxia (dada por la altura: 1378msnm) a la cual fueron
sometidos los embriones en esta investigación si afecta la expresión tanto del HIF-2α,
como del VEGF-A y de su receptor FLK-1 en el saco vitelino, el día 3 y 4 de incubación.
Además, que dicho cambio en la expresión se refleja en un aumento en la
vascularización del saco vitelino; y que la hipoxia a la cual fueron sometidos los
embriones, no afecta el peso del embrión ni del saco vitelino, bien sea porque dicho nivel
de hipoxia no fue lo bastante severo para producir hipometabolismo, o bien, porque el
aumento en la vascularización fue suficiente para contrarrestar la hipoxia.
Palabras
clave:
hipoxia
hipobárica,
embrión
del
pollo,
saco
vitelino,
vascularización, HIF-2α, VEGF-A, FLK-1
Abstract
To evaluate the posible effect of two different altitudes on the embryonic weight and in the
yolk sac vascularization, chicken embryos were incubated at 355 and 1378masl, and on
day three and four: the embryonic and yolk sac weight were measured; the vascular
media area, capillary percentage and capillary media area were estimated; the
immunoexpression of HIF-2α, VEGF-A and its FLK-1 receptor were described and
quantified in the yolk sac; the quantification of relative mRNA expression of the above
proteins in the yolk sac was made using q-PCR. The results showed that neither
embryonic weight nor yolk sac weight had statistical significant difference on day three
and four in the embryos incubated at two different altitudes; nevertheless that there was
statistical significant difference in the vascular media area (p:< 0.05), capillary percentage
(p:< 0.05), on day three and four; of the positive cells percentage immunoreactives to
VEGF-A (p: 0.05) and FLK-1 (p:<0.05) on day three, and the positive cells percentage
immunoreactives to HIF-2α (p: 0.05) and FLK-1 (p: 0.05) on day four; and the relative
mRNA expression of HIF-2α, VEGF-A and its FLK-1 receptor on day three and four (p:<
0.001 for the relative mRNA expression of the above genes on day three; and p: 0.01; <
0.01; < 0.001 for relative mRNA expression of the respective genes on day four) on the
embryos incubated at 1378masl. Moreover, by immunohistochemistry staining, positive
Capítulo 2
53
cells immunoreactives to HIF-2α and VEGF-A were found in the endoderm, endothelium
and ectoderm; and positive cells immunoreactives to FLK-1 were found only in the
endothelium. On the basis of present results, it was concluded that the hypoxia level at
which the embryos were submitted on this research, affects the expression of HIF-2α,
VEGF-A and its FLK-1 receptor in the yolk sac, on day three and four of incubation.
Furthermore, that those changes on the gene expression produce an increase in the
vascularization of the yolk sac; and that the hypoxia at which the embryos were exposed
does not affect neither the embryonic nor yolk sac weight, maybe due the hypoxia level
was not severe enough to produce hypometabolism, or because the increase in the
vascularization was enough to diminish the hypoxia effects.
Key words: hypobaric hypoxia, chicken embryo, yolk sac, vascularization, HIF-2α,
VEGF-A, FLK-1
2.2 Introducción
La respiración involucra múltiples y bien establecidos pasos en el transporte del O2. En el
caso del embrión aviar lo primero que ocurre (que sería el equivalente a la ventilación en
el adulto) es la difusión del O2 desde el ambiente al interior del huevo, seguida por la
difusión de éste a los capilares del SV, y finalmente de los capilares al sistema de
respiración mitocondrial. Durante cada paso de la respiración descrito anteriormente,
ocurre una caída en la PO2 y un incremento en la PCO2. En condiciones de altura, la PO2
disminuye, y con ésta también se reduce la diferencia en las presiones de O2 disponibles
para el transporte gaseoso hasta la mitocondria. De tal manera, que dicha disminución en
la PO2 debe ser compensada de alguna forma, bien sea regulando el metabolismo o a
través de modificaciones en los pasos descritos inicialmente (León-Velarde y Monge,
2004). Por la ecuación de Fick (Monge y col., 2000) se sabe que el Flujo de O2 (la
velocidad de transferencia de éste) es proporcional al área superficial de la cáscara (área
de los poros), al coeficiente de difusión de dicho gas y a la diferencia de PO2, y por
último, inversamente proporcional al grosor de la cáscara (Billat, 2001). Por lo tanto la
fórmula se escribe:
Flujo O2 = A * D * (P1 - P2)
T
54
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Donde A es la superficie de la cáscara del huevo (área de los poros), T el grosor de la
cáscara, D el coeficiente de difusión y (P1 - P2) la diferencia de presión parcial entre
ambos lados de la cáscara. Puesto que D es inversamente proporcional a la PB, y dado
que el grosor de la cáscara no varía con dicha altura, la mayoría de la variación en la
conductancia se debe al área total de los poros, dado por el número de los mismos
(Carey, 1986). Se sabe además, que la conductancia de la cáscara del huevo permanece
constante a través de todo el tiempo de incubación (Carey y col., 1983). Se estima que la
diferencia en la presión parcial en el huevo es alrededor de 42 Torr. Y a pesar de que
existe un incremento de D en la altura, la baja en la PO2 fuera del huevo, reduce la PO2
al interior por debajo del valor correspondiente a nivel del mar (Wangensteen y col.,
1974). Adicionalmente, el incremento en la masa del embrión resulta en una disminución
en la concentración del O2 al interior del huevo (Rahn y col., 1974). El continuo aumento
en el consumo de O2 (VO2) produce una reducción en la PO2 al interior del huevo, que
acentúa la diferencia en la PO2 entre el ambiente y el interior del huevo, mejorando de
esta manera la difusión. En el embrión del pollo se han establecido dos periodos de
respiración durante los primeros 5 días del desarrollo. Un primer periodo que se presenta
desde el inicio de la incubación hasta un poco antes del tercer día; periodo en el cual no
hay un verdadero transporte de O2 por la Hb. (Romanoff, 1960), de tal manera, que
durante éstas primeras horas del desarrollo embrionario, la difusión es el principal
mecanismo de abastecimiento de O2 hacia los tejidos (Cirotto y Arangi, 1989b; Burggren
y col., 2000); y en este caso, la conductancia de la cáscara es el factor principal en la
barrera de difusión del O2; y como se mencionó más arriba, dicha conductancia está
determinada básicamente por el área funcional de los poros y la PB (Mortola, 2009).
Durante este primer periodo de respiración embrionaria aviar se forma y crece el SV, el
cual no funciona como un órgano respiratorio sino hasta pasadas unas 65 horas, y esto
probablemente debido a la ausencia de una estructura capilar adecuada en la cual pueda
ocurrir el intercambio de gases, y es probable que la sangre solo actúe facilitando la
difusión del O2 del área vascular al cuerpo del embrión (Cirotto y Arangi, 1989a, b). El
segundo periodo va desde las 65-72 horas hasta los 6 días de incubación, cuando el
área vascular del SV comienza a funcionar como un órgano respiratorio. Sin embargo,
los diferentes niveles de oxigenación de la Hb de las venas onfalomesentéricas muestran
que la sangre se oxigena parcialmente en el área vascular. Por lo tanto, no se puede
Capítulo 2
55
considerar como un órgano respiratorio eficiente ya que la sangre que llega al área
vascular contiene aproximadamente un 40 % de oxihemoglobina, mientras que la que
sale posee solamente entre el 60 y 70 % de oxihemoglobina (Baumann y Meuer, 1992).
Durante este periodo, los estudios con espectrofotometría, indican que el mayor consumo
de O2 por parte del embrión proviene del área opaca del SV (Adair y col., 1987). Se ha
encontrado que la vascularización de las membranas extraembrionarias reacciona a las
condiciones de oxigenación del ambiente. La mayoría de estudios acerca de la
vascularización de las membranas embrionarias del pollo se han realizado en la CAM, y
aún son controversiales; por ejemplo: Wagner-Amos y Seymor (2003) encontraron que
hay una reacción de crecimiento vascular negativa en respuesta a las condiciones de
hipoxia ambiental; más sin embargo otros autores como Dusseau y Hutchins (1988)
encontraron que hay una reacción positiva por parte de los lechos vasculares en
respuesta a la hipoxia. Contrastando incluso con otros autores como Burton y Palmer
(1992) quienes no observaron cambios en la vascularización en respuesta a la hipoxia.
Lo que si se reconoce, es que los embriones sometidos a hipoxia, resultan en retardado
desarrollo y pobre incubabilidad (Zhang y col., 2008). En los experimentos de la presente
investigación, se evaluó el efecto de la hipoxia hipobárica en el crecimiento del SV y su
desarrollo vascular, en la expresión de algunos genes (el HIF-2α, el VEGF-A, y su
receptor FLK-1), y en la mortalidad embrionaria.
Es importante mencionar algunas de las características morfológicas del SV entre el día
3 y 4 de incubación: cuando se observa la superficie del vitelo (yema) se manifiestan tres
áreas a simple vista, que corresponden a distintas regiones morfológicas: una zona
central que rodea al embrión, el área pelúcida, y otra externamente a ésta, el área opaca.
Entre las dos, se forma una región bien vascularizada denominada el área vasculosa. El
embrión del pollo se halla en el área pelúcida (central), la cual no contacta directamente
con el vitelo (debajo de ésta), y por lo tanto aparece algo transparente. El área opaca se
desarrolla propiamente dentro del SV extraembrionario (Risau y Flamme, 1995).
Inicialmente, el desarrollo vascular en el SV precede al desarrollo vascular
intraembrionario. Los primeros vasos en el SV son visibles como una agregación de
células mesenquimales en el mesodermo esplácnico adyacente al endodermo
extraembrionario en el medio del área opaca; esta vascularización rápidamente se
extiende a través de dicha área, con excepción de la región anterior a la cabeza y una
pequeña zona en la cola embrionaria (Lanzer y Topol, 2002).
56
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Objetivos
General
Establecer si existían diferencias en el peso embrionario (PesoE), y en la vascularización
del SV, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm, los días 3 y 4 de
incubación.
Específicos
• Determinar el PesoE y del SV (PesoSV), de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 3 y 4 de incubación.
• Cuantificar el área vascular media (AVM), el porcentaje Capilar (%Capilar), y el área
capilar media (ACM) del SV, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm,
los días 3 y 4 de incubación.
• Describir y cuantificar la inmunoexpresión HIF-2α, del VEGF-A y su receptor FLK-1 en
el SV, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm, los días 3 y 4 de
incubación.
• Realizar la cuantificación relativa de la expresión del mRNA del HIF-2α, del VEGF-A y
su receptor FLK-1 en el SV, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm,
los días 3 y 4 de incubación.
2.3 Materiales y métodos
2.3.1 Incubación
Se obtuvieron 14580 huevos fértiles de la estirpe Cobb de la Granja Santa Inés en
Colombia. Los huevos fueron almacenados durante 5 días, y se incubaron en máquinas
comerciales Chick Master® bajo las condiciones estándar de la industria: Temperatura
37.5ºC; Humedad relativa 50%; y los huevos fueron volteados automáticamente cada
hora. La mitad se incubó a 355msnm (Ricaurte, Cundinamarca, Colombia: PB:
730mmHg, PO2: 153mmHg, Disponibilidad de O2: 20%); y la otra mitad a 1378msnm
Capítulo 2
57
(Garagoa, Boyacá, Colombia: PB: 650mmHg, PO2: 136mmHg, Disponibilidad de O2:
17.7%). Se tomó como día 1, después de transcurridas 24 horas de incubación.
2.3.2 Extracción y exposición
Del total de huevos incubados en cada altura, se colectó una muestra de 15 huevos con
embriones viables, el día 4 y el día 5 de incubación. Los embriones junto con sus SVs
fueron extraídos de la cáscara y puestos sobre una bandeja, para tomar fotos de los
mismos.
2.3.3 Fotografías
Cada membrana del SV y embrión sobre la bandeja fueron fotografiados a una distancia
de 15cm de la lente de la cámara fotográfica. Se utilizó una cámara fotográfica Canon
PowerShot S5IS® con SuperMacro, y se obtuvo una imagen de la vascularización que
abarcó el área total de dicha membrana junto con su embrión, conservando así las
medidas de las diferentes estructuras.
2.3.4 Pesaje
Los embriones fueron sacrificados por decapitación (todos los procedimientos fueron
aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad Nacional de Colombia, Facultad
de Medicina Veterinaria y de Zootecnia), y se midió la masa húmeda (Peso E) de los
embriones - libre de vitelo; y del SV (Peso SV) - libre de vitelo, con una balanza analítica.
2.3.5 Fijación y congelación
Se tomaron muestras del SV de cada embrión, que fueron fijadas mediante inmersión en
formalina de pH 7.4 al 4%, por espacio de 24 horas. Igualmente, se tomaron muestras
del SV que fueron almacenadas en crio tubos y congeladas inmediatamente
sumergiéndolas en nitrógeno líquido.
58
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2.3.6 Tinción
Los tejidos fijados en formalina fueron embebidos en parafina, y usados para cortes
(5µm), para ser teñidos después con hematoxilina-eosina. Las láminas para tinción con
anticuerpos fueron desparafinadas incubándolas a 60ºC y luego pasándolas por xilol.
Posteriormente los cortes fueron hidratados pasándolos por etanol en concentraciones
descendentes. Luego las láminas fueron lavadas con agua destilada. Se adicionó
peróxido de hidrógeno al 3% en metanol y se enjuagaron con agua destilada. Se agregó
la solución de recuperación de antígeno (buffer citrato pH 6), y luego de enfriar y lavar las
láminas con agua destilada se sumergieron en buffer Tris (pH 7). Después se adicionó la
solución universal Blocking Reagent (Biogenex HK 0.85.5k). Se preparó la dilución del
Anticuerpo anti FLIP en dilución 1/50, el cual fue añadido a las láminas. Se lavaron las
láminas tres veces con buffer Tris, y posteriormente se agregó el reactivo estabilizante
Super Enhancer (Biogenex HK518-YAK), y se volvieron a lavar las láminas con buffer
Tris. Luego se adicionó el complejo de polímero marcado con peroxidasa S.S Label
PolymerHRP (Biogenex HK519-YAK), y se enjuagaron las láminas de nuevo con buffer
Tris. Además, se añadió la solución cromógeno DAB (Biogenex HK520-YAK), y se
observó al microscopio la aparición del color café, y se detuvo la reacción DAB. Para
terminar se contrastaron los cortes con hematoxilina de Harris, realizando el azulamiento
con agua amoniacal; se deshidrataron los tejidos con etanol en concentraciones
ascendentes, y se aclararon las láminas por medio de pases en xilol.
Para los controles positivos se utilizó: cortes de adenocarcinoma de colon.
Para los controles negativos se empleó: cortes del SV sin el anticuerpo primario.
2.3.7 Descripción
Se realizó la descripción histológica de los cortes del SV teñidos con hematoxilinaeosina, lo mismo que la descripción de la expresión inmunohistoquímica de las laminas
marcadas con anticuerpos, mediante microscopio de luz y objetivo 40X.
Capítulo 2
59
2.3.8 Evaluación morfométrica
La estimación del Área Vascular Media (AVMSV) se hizo mediante la determinación del
área ocupada por los vasos sanguíneos en las fotografías tomadas a las membranas del
SV (Figura 2-1 a Figura 2-8). El área se cuantificó usando el programa comercial Adobe
Photoshop® CS4 Extended mediante el empleo de la herramienta Measurement Image
Panel (Abrams y col., 2009). Previamente los vasos fueron completamente delineados
con ayuda del programa comercial CorelDRAW® Graphics Suite X4. Adicionalmente se
cuantificó el área total del SV (ÁreaSV) con el uso de la misma herramienta de Adobe
Photoshop® CS4 Extended.
60
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-1: Foto embrión y SV día 3 (355msnm).
Fotografía del embrión y su SV el día 3 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 2-2: Foto embrión y SV día 3 (1378msnm).
Fotografía del embrión y su SV el día 3 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
Capítulo 2
Figura 2-3: AVMSV dia 3 (355msnm).
Área vascular media (AVM) del SV el día 3 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 2-4: AVMSV dia 3 (1378msnm).
Área vascular media (AVM) del SV el día 3 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
61
62
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-5: Foto embrión y SV día 4 (355msnm).
Fotografía del embrión y su SV el día 4 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 2-6: Foto embrión y SV día 4 (1378msnm).
Fotografía del embrión y su SV el día 4 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
Capítulo 2
Figura 2-7: AVMSV dia 4 (355msnm).
Área vascular media (AVM) del SV el día 4 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 2-8: AVMSV dia 4 (1378msnm).
Área vascular media (AVM) del SV el día 4 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
63
64
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
El Porcentaje Capilar (%CapilarSV) se estimó en las láminas teñidas con hematoxilinaeosina. Para tal fin, se uso la metodología empleada por Seidlitz y colaboradores (2004)
(Figura 2-9); en la cual únicamente se tuvieron en cuenta los plexos capilares dentro de
los campos ópticos seleccionados azar. En total se estimó el %CapilarSV de 5 campos por
lámina, es decir por muestra. Dicho procedimiento se realizó mediante el microscopio de
luz y objetivo 40X.
Figura 2-9: Microfotografía SV.
A.
B.
Microfotografía de corte del SV teñida con HyE. A. Objetivo 10X. B. Objetivo 20X.
Capítulo 2
65
Figura 2-9: (Continuación).
C.
D.
Microfotografía del SV. HyE. Objetivo 40X. C. Serie de líneas negras que representan la longitud
de cada vaso. D. Línea negra continua que representa la superficie total del SV en la fotografía.
El Área Capilar Media (ACMSV) se cuantificó restándole al Área SV el AVMSV, y
multiplicándolo por el %CapilarSV.
66
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2.3.9 Cuantificación de la inmunoexpresión
Mediante el microscopio de luz y objetivo 40x, se estimó el número de células que
expresaban determinado marcador (HIF-2α, VEGF.A, FLK-1) como un porcentaje del
total de células observadas por campo (%Cel.HIF-2αSV, %Cel.VEGF-ASV, %Cel.FLK-1SV),
en 5 campos ópticos escogidos al azar por lámina (por muestra).
2.3.10
Cuantificación de la expresión del mRNA
2.3.10.1 Extracción del RNA. El RNA total del SV fue extraído con la técnica de
Trizol Reagent (Invitrogen®), de acuerdo con las instrucciones de la casa comercial. La
extracción de mRNA se realizó con el kit Dynabeads® mRNA Direct™. La concentración
de mRNA de cada una de las muestras fue cuantificada en un espectrofotómetro de luz
ultravioleta a una absorbancia de 260/280 nm (Spectronic BioMate 3 UV-Vis
Spectrophotometer®).
2.3.10.2 RT-PCR. La síntesis de cDNA se realizó a partir de 1 μg de mRNA utilizando
200 U MMLV-reverse transcriptase, 20 U ribonuclease inhibitor RNase-Out y 1 nM
Random Hexamer Primers (Invitrogen®) en un volumen total de 30 μl. Las reacciones de
RT fueron incubadas a 37°C por 45 minutos y 42°C por 15 minutos, y terminadas por
calentamiento a 92°C por 2 minutos. Para verificar la especificidad de los productos
amplificados, se realizaron controles negativos con reacciones de RT sin adición de la
enzima transcriptasa reversa (Figura 2-10).
2.3.10.3 q-PCR. A partir del cDNA obtenido por RT, se determinó la expresión del
mRNA de HIF2-α, VEGF-A, FLK-1, y de la subunidad ribosomal 18S; con la técnica PCR
en tiempo real usando el termociclador Light Cycler de Roche® y la metodología de
detección de SYBR green PCR core reagents (Roche®). Los anteriores procedimientos
se realizaron de acuerdo con reportes previos (Gómez, 2008) en los que se validó esta
técnica y siguiendo las instrucciones de la casa comercial. La prueba de PCR se realizó
usando iniciadores específicos para cada gen de interés, los cuales fueron diseñados con
el programa Primer3 disponible en la red, a partir de las secuencias de los genes de
Capítulo 2
67
Gallus gallus reportadas en GenBank. El número de acceso, los iniciadores y el tamaño
del producto se muestran en la Tabla 2-1. El volumen final de reacción fue de 20 μl.
Todas las reacciones se llevaron a cabo con las siguientes condiciones: 95°C por 3
minutos, 40 ciclos de 95°C por 5 segundos, 64°C por 15 segundos y 72°C por 15
segundos. En cada una de las muestras, los niveles de mRNA fueron estandarizados con
los niveles de expresión de S18 (previo cálculo de la eficiencia). Adicionalmente se
realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 %, teñido con bromuro de etidio
para su visualización, con el objetivo de asegurar el tamaño (pares de bases) de los
productos obtenidos (Figura 2-10). Igualmente se verificaron los amplificados mediante
secuenciación.
Figura 2-10: Electroforesis de la RT-PCR mRNA genes de interés.
M
S18
RT-
HIF-2α
RT-
VEGF-A
RT-
FLK-1
RT-
Imagen representativa del mRNA de los genes de interés en muestras de SV de pollos incubados
a 1378msnm. Subunidad ribosomal S18 (265 pb), HIF-2α (180 pb), VEGF-A (80 pb), y FLK-1 (89
pb). En el experimento se empleó un marcador de peso molecular (M) de 500 pb (línea más
brillante 125 pb. Las demás líneas cada 25 pb). Los productos de PCR se separaron en un gel de
agarosa al 1.5%, teñido con bromuro de etidio, analizado con luz ultravioleta y visualizado con el
Gel Doc System (Bio-Rad®, Hercules, CA). En la figura también se observan los controles
negativos de la transcripción reversa (RT-), en los cuales no se evidencian bandas después de la
amplificación.
68
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Tabla 2-1: Secuencias iniciadores q-PCR.
Iniciadores
Producto
(5' - 3')
(pb)
Gen
18S
No. GenBank
CTC AAC ACG GGA AAC CTC AC
265
M59389
180
AF129813
80
AB011078
89
AB066660
CGG ACA TCT AAG GGC ATC AC
HIF-2α
ATC AAG TTC CCC CTC AGG AC
TGT TGC AAT GCT TGC TCT TC
VEGF-A
AGA ATG TGT CCC TGT GGA TGT G
GCG CTA TGT GCT GAC TCT GAT G
FLK-1
GGA GTT TCC CAG AGA CCG AC
CAA TCC CAA AGG CAT CAG C
En la tabla se incluyen el par de iniciadores utilizados para la amplificación de cada gen de
interés. Adicionalmente se incluyen los tamaños esperados de los productos del cDNA generado,
expresados en pares de bases (pb), así como el número de identificación de cada gen (disponible
en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
2.3.11
Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de las variables cuantitativas (Peso E, PesoSV, ÁreaSV,
AVMSV, ACMSV, %CapilarSV, %Cel.HIF-2αSV, %Cel.VEGF-ASV, %Cel.FLK-1SV,), calculando
medidas de tendencia central y de dispersión. En el caso de las variables de la expresión
del mRNA de los diferentes genes, estas primero fueron estandarizadas mediante el
método comparativo ∆CT (∆CTHIF-2αSV, ∆CTVEGF-ΑSV, y ∆CTFLK-1SV) (Schmittgen y
Livak, 2008) antes de calcularse las medidas de tendencia central y de dispersión. Para
todas las variables se efectuó una prueba D'Agostino & Pearson ómnibus para evaluar la
normalidad en la distribución de dichas variables. Después cada variable en las dos
altitudes fueron comparadas entre sí por medio de la prueba t de Student. Para el caso
de las variables ∆CTs, fueron comparadas entre sí mediante la prueba Pfaffl (Pfaffl,
2001), y dichos resultados fueron contrastados con el modelo 2-∆∆CT (Livak y
Capítulo 2
69
Schmittgen, 2001) y una prueba t de Student de los ∆CTs. En todo caso, la significancia
en la diferencia estadística es señalada en las gráficas mediante el uso de asteriscos:
Diferencia estadística con p:≤ 0.05 *
Diferencia estadística con p:≤ 0.01 **
Diferencia estadística con p:≤ 0.001 ***
Diferencia estadística con p:≤ 0.0001 ****
Adicionalmente se analizó la variación y el efecto conjunto de la altitud de incubación y el
tiempo de incubación sobre las diferentes variables mediante análisis de varianza
(ANOVA). Asimismo, se realizó el análisis de correlación de Pearson de las diferentes
variables, y la regresión lineal para las variables con mayor correlación lineal.
Los resultados son expresados como la media, junto con el intervalo de confianza del
95% (IC) (du Prel y col., 2009). En el caso de las pruebas de diferencia se declara el
valor p, seguido del IC de dicha diferencia.
Los datos fueron recolectados en formatos diseñados en Excel.
El análisis de los datos se realizó con el programa GraphPad® Prism 5 (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA), y el programa de análisis de expresión relativa REST®
2009 (Pfaffl y col., 2009).
2.4 Resultados
2.4.1 Condiciones de incubación
En la Figura 2-11 se muestra que las condiciones de incubación en la incubadora en las
dos diferentes alturas (355msnm y 1378msnm) fueron las mismas: Tº bulbo seco (p:
0.9993. IC: -0.127 ; 0.127); y Humedad relativa (p: 0.5263. IC: -1.835 ; 0.965) (Figura 211A). De igual manera, las condiciones de incubación en el embrión: Tº embrionaria (p:
0.3194. IC: -0.184 ; 0.550); y Humedad embrionaria, medida como la pérdida de peso: (p:
0.9908. IC: -1.273 ; 1.289) también fueron las mismas (Figura 2-11B).
Figura 2-11: Condiciones de incubación del día 3 al 4 de embriones incubados a 355 y 1378msnm.
B.
Condiciones del embrión
Tº incubadora (p: 0.9993)
Humedad relativa (p: 0.5263)
Diámetro del punto = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Valores de condiciones de incubación (media ± IC) de incubadora (A), y embrión (B); expresados como % de humedad relativa y temperatura en
°C (A), y como % de pérdida de peso embrionario y temperatura embrionaria en °C (B).
2.4.2 Peso del SV y del embrión
El PesoSV el día 3 fue, a 355msnm: 0.133 gramos (0.116 ; 0.149), y a 1378msnm: 0.148
gramos (0.128 ; 0.168); y para el día 4 fue, a 355msnm: 0.377 gramos (0.342 ; 0.413), y a
1378msnm: 0.411 gramos (0.377 ; 0.444) (Figura 2-12A).
El PesoE el día 3 fue, a 355msnm: 0.025 gramos (0.022 ; 0.028), y a 1378msnm: 0.028
gramos (0.025 ; 0.030); y para el día 4 fue, a 355msnm: 0.098 gramos (0.091 ; 0.104), y a
1378msnm: 0.107 gramos (0.096 ; 0.118) (Figura 2-12B). No se encontró diferencia tanto
en el PesoSV: el día 3 (p: 0.2238. IC: -0.010 ; 0.040), o el día 4 (p: 0.1566. IC: -0.013 ;
0.080); como en el PesoE: el día 3 (p: 0.1362. IC: -0.001 ; 0.007), o el día 4 (p: 0.1207.
IC: -0.003 ; 0.022), a 355msnm y 1378msnm (Figura 2-12). Y tanto el PesoSV (p: 0.4853.
IC: -0.034 ; 0.070), como el PesoE (p: 0.3147. IC: -0.006 ; 0.018) aumentaron de igual
forma del día 3 al día 4 en las dos diferentes alturas (p:< 0.0001). El análisis de varianza
mostró que el PesoSV y el PesoE están aparentemente afectados principalmente por el
tiempo de incubación en un 86.60 % (p:< 0.0001) en el primer caso, y en un 90.78 % en
el segundo; y no por la altitud de incubación, con un r2: 0.0078 (p: 0.0667) en el primer
caso, y un r2: 0.0060 (p: 0.0513) en el segundo (Tabla 2-2).
72
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-12: Peso del SV y del embrión los días 3 y 4 de embriones incubados a
355 y 1378msnm.
A.
B.
PesoSV
gram os
0.540
0.494
PesoE
gram os
0.146
355m snm
1378m snm
0.133
mm2
6200
355m snm
1378m snm
5620
0.448
0.120
5040
0.402
0.107
4460
0.356
0.094
3880
0.310
0.081
3300
0.264
0.068
2720
0.218
0.055
2140
0.172
0.042
1560
0.126
0.029
980
0.080
0.016
Día 3
(p: 0.2238)
355m
1378
400
Día 4
(p: 0.1566)
Día 3
(p: 0.1362)
Día 4
(p: 0.1207)
D
(p: 0
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ínim o
Barras de error = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Barras de err
gram os
Valores
del peso del saco vitelino (SV) - PesoSV (A), y del peso del embrión - PesoE (B) (media ±
1.980
355m snm
IC) expresados
en
1378m
snmgramos, de pollos incubados a 355msnm y 1378msnm, el día 3 y 4 de
1.798
incubación.
1.616
gram os
1.40
1.434
1.28
1.252
1.16
1.070
1.04
0.888
0.92
2.4.3 Evaluación morfométrica
355m snm
1378m snm
El 0.706
ACMSV el día 3 fue, a 355msnm: 1323.7230.80
mm2 (1144.091 ; 1503.355), y a 1378msnm:
0.524
0.68el día 4 fue, a 355msnm: 2957.071 mm2
1620.446
mm2 (1354.909 ; 1885.983); y para
0.56
(2724.549 ; 3189.592), y a 1378msnm: 3315.282
mm2 (3001.844 ; 3628.72) (Figura 20.342
0.160
13A).
Día 6
(p: 0.1868)
Día 7
(p: 0.1804)
0.44
0.32
2
El AVMValor
día 3 fue, a 355msnm: 34.371 mm
(28.164 ; 40.577), y a 1378msnm: 43.368
SV el
m ínim o, m edia y m áxim o representados.
0.20
Barras de error = 95% IC
Día 6
Día 7
(p: 0.4733)
(p: 0.1363) ; 116.022),
mm2 (36.031 ; 50.705); y para el día 4 fue, a 355msnm:
101.517 mm2 (87.012
Valor
m ínim o, m2-13B).
edia y m áxim o representados.
y a 1378msnm: 122.249 mm2 (106.665 ; 137.832).
(Figura
Barras de error = 95% IC
Capítulo 2
73
El %CapilarSV el día 3 fue, a 355msnm: 84.687 % (83.235 ; 86.139), y a 1378msnm:
86.900 % (85.744 ; 88.056); y para el día 4 fue, a 355msnm: 86.692 % (85.560 ; 87.824),
y a 1378msnm: 88.448 % (87.238 ; 89.658). (Figura 2-13C).
Los valores del ACMSV: el día 3 (p: 0.0584. IC: -9.460 ; 602.906), o el día 4 (p: 0.0598 IC:
-14.520 ; 730.942); y del AVMSV: el día 3 (p: 0.0446. IC: -0.181 ; 18.175), o el día 4 (p:
0.0450. IC: 0.399 ; 41.064); así como del %CapilarSV, el día 3 (p: 0.0165. IC: 0.441 ;
3.986), o el día 4 (p: 0.0309 IC: 0.174 ; 3.338), fueron más altos a 1378msnm que a
355msnm (Figura 2-13). Y tanto el ACMSV (p: 0.7961. IC: -423.480 ; 546.450), y el AVMSV
(p: 0.2908. IC: -10.611 ; 34.079), como el %Capilar SV (p: 0.6966. IC: -2.836 ; 1.922),
aumentaron de igual forma del día 3 al día 4 en las dos alturas (p:< 0.0001 a 0.0571).
Adicionalmente el análisis de varianza mostró que el ACMSV y el AVMSV están afectados
por el tiempo de incubación, en un 75.80 % (p:< 0.0001) en el primer caso, y en un 73.56
% (p:< 0.0001) en el segundo; y en menor medida por la altitud de incubación con un r2:
0.0294 (p: 0.0074) en el primer caso, y un r2: 0.0305 (p: 0.0085) en el segundo. El
ANOVA mostró además, que el %CapilarSV se ve afectado similarmente por la altitud y el
tiempo de incubación, con un r2: 0.1516 (p: 0.0012), y un r2: 0.1215 (p: 0.0034)
respectivamente (Tabla 2-2).
74
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-13: Evaluación morfométrica del SV los días 3 y 4 de embriones
incubados a 355 y 1378msnm.
Valores del área capilar media - ACMSV (A), y del área vascular media - AVMSV (B) del SV (media
± IC) expresados en mm2, de pollos incubados a 355msnm y 1378msnm, el día 3 y 4 de
incubación. *p:< 0.05 (Si hubo diferencia estadística).
Capítulo 2
75
Figura 2-13: (Continuación).
C.
%CapilarSV
100
97
94
355m snm
1378m snm
*
*
91
88
85
82
79
76
73
70
Día 3
(p: 0.0165)
Día 4
(p: 0.0309)
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Barras de error = 95% IC
Valores del % capilar - %CapilarSV (C) del SV (media ± IC), de pollos incubados a 355msnm y
1378msnm, el día 3 y 4 de incubación. *p:< 0.05.
2.4.4 Descripción
2.4.4.1 Histológica. En los cortes coloreados con hematoxilina-eosina (Figura 2-14)
se observa el SV compuesto por el endodermo (en) con grandes vacuolas, mesodermo
(me) en el que se hallan los vasos sanguíneos (vs), y el ectodermo (ec) superficialmente.
76
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-14: Descripción histológica del SV.
B.
A.
vs
ap
ao
Objetivo 10X. SV. Área pelucida (ap). Área opaca (ao)
Objetivo 20X. SV. Vaso sanguíneo (vs)
C.
ap
ec
vs
en
ao
Objetivo 40X. SV. Endodermo (en). Ectodermo (ec).
2.4.4.2 Inmunohistoquímica. La tinción IHC con el anticuerpo anti HIF-2α (Figura 215) se observó en el núcleo (n) y citoplasma (c) del: endodermo (en), el endotelio (e) y el
ectodermo (ec). La tinción IHC con el anticuerpo anti VEGF-A (Figura 2-16) se observó
en la membrana nuclear (mn), citoplasma (c) y la membrana plasmática (mp) del:
endodermo (en), endotelio (e) y ectodermo (ec). La tinción IHC con el anticuerpo anti
Capítulo 2
77
FLK-1 (Figura 2-17) se observó en la membrana de las células endoteliales y en el
mesodermo vascular (mv).
Figura 2-15: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti HIF-2α en el SV.
A.
B.
en
vs
ec
e
C.
n (ec)
n (en)
n (e)
Inmunohistoquímica del SV con el anticuerpo anti HIF-2α (A), Control positivo: adenocarcinoma de colon (B), y Control negativo: SV sin
anticuerpo primario (C). en: endodermo. vs: vaso sanguíneo. e: endotelio. ec: ectodermo. n(en): núcleo de célula endodermal. n(e): núcleo de
célula endotelial. n(ec): núcleo de célula ectodermal.
Capítulo 2
79
Figura 2-16: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti VEGF-A en el SV.
A.
B.
en
vs
c (e)
C.
vs
c (ec)
c (en)
Inmunohistoquímica del SV con el anticuerpo anti VEGF-A (A), Control positivo: adenocarcinoma de colon (B), y Control negativo: SV sin
anticuerpo primario (C). en: endodermo. vs: vaso sanguíneo. c(en): citoplasma de célula endodermal. c(e): citoplasma de célula endotelial. c(ec):
citoplasma de célula ectodermal.
80
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-17: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti FLK-1 en el SV.
A.
B.
vs
mv
e
mv
ec
C.
en
en
Inmunohistoquímica del SV con el anticuerpo anti FLK-1 (A), Control positivo: adenocarcinoma de colon (B), y Control negativo: SV sin anticuerpo
primario (C). en: endodermo. mv: mesodermo vascular. e: endotelio. ec: ectodermo.
Capítulo 2
81
2.4.5 Cuantificación de la inmunoexpresión
El %Cel.HIF-2αSV el día 3 fue, a 355msnm: 86.768 % (82.491 ; 91.045), y a 1378msnm:
92.480 % (87.906 ; 97.054); y para el día 4 fue, a 355msnm: 87.953 % (83.953 ; 91.954),
y a 1378msnm: 93.121 % (89.536 ; 96.706) (Figura 2-18A).
El %Cel.VEGF-ASV el día 3 fue, a 355msnm: 89.747 % (84.539 ; 94.954), y a 1378msnm:
95.539 % (92.627 ; 98.450); y para el día 4 fue, a 355msnm: 91.769 % (86.517 ; 97.021),
y a 1378msnm: 96.968 % (95.621 ; 98.315) (Figura 2-18B).
El %Cel.FLK-1SV el día 3 fue, a 355msnm: 86.155 % (82.733 ; 89.577), y a 1378msnm:
90.547 % (87.91 ; 93.184); y para el día 4 fue, a 355msnm: 88.345 % (84.611 ; 92.08), y a
1378msnm: 93.941 % (89.48 ; 98.403) (Figura 2-18C).
Los valores del %Cel.HIF-2αSV: el día 3 (p: 0.0605. IC: -0.269 ; 11.693), o el día 4 (p:
0.0486 IC: 0.037 ; 10.299); y del %Cel.VEGF-ASV: el día 3 (p: 0.0492. IC: 0.094 ; 11.490), o
el día 4 (p: 0.0566. IC: 0.020 ; 10.377), así como del % Cel.FLK-1SV: el día 3 (p: 0.0384. IC:
0.266 ; 8.518), o el día 4 (p: 0.0488. IC: 0.039 ; 11.153), fueron más altos a 1378msnm
que a 355msnm (Figura 2-18). Y dichos valores no difirieron del día 3 al día 4 en ninguna
de las dos diferentes alturas (Figura 2-18): el %Cel.HIF-2αS V: a 355msnm (p: 0.6676. IC: 4.408 ; 6.779), o a 1378msnm (p: 0.8147. IC: -4.909 ; 6.191); el %Cel.VEGF-ASV: a
355msnm (p: 0.5622. IC: -5.041 ; 9.086), o a 1378msnm (p: 0.3508. IC: -1.635 ; 4.493); y
el %Cel.FLK-1SV: a 355msnm (p: 0.3616. IC: -2.647 ; 7.028), o a 1378msnm (p: 0.1736. IC:
-1.555 ; 8.344).
Además, el análisis de varianza mostró que el % Cel.HIF-2αSV, el %Cel.VEGF-ASV, y el
%Cel.FLK-1SV, están aparentemente afectados de manera similar por la altitud de
incubación en un 12.45 % (p:< 0.0065), 13.07 % (p:< 0.0050), y 12.93 % (p:< 0.0096)
respectivamente; y no por el tiempo de incubación: r2: 0.0035 (p: 0.6367), r2: 0.0129 (p:
0.3624), r2: 0.0404 (p: 0.1039) (Tabla 2-2).
82
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-18: % de células que expresan HIF-2α, VEGF-A y, FLK-1 en el SV de
embriones incubados a 355 y 1378msnm.
A.
B.
%Cel.HIF-2αSV
%Cel.VEGF-ASV
*
100
100
*
100
97
97
97
94
94
94
91
91
91
88
88
88
85
85
85
82
82
82
79
79
79
76
76
76
73
73
73
70
70
70
Día 3
(p: 0.0605)
355m snm
Día 4
(p: 0.0486)
1378m snm
Día 3
(p: 0.0492)
355m snm
Día 4
(p: 0.0566)
1378m snm
(
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ín
Barras de error = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Barras de
Capítulo 2
83
C.
%Cel.FLK-1SV
*
100
*
97
94
91
88
85
82
79
76
73
70
Día 3
(p: 0.0384)
355m snm
Día 4
(p: 0.0488)
1378m snm
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Barras de error = 95% IC
Valores del % de células HIF-2α positivas - %Cel.HIF-2αSV (A), del % de células VEGF-A positivas %Cel.VEGF-ASV (B), y del % de células FLK-1 positivas - %Cel.FLK-1SV (C) en el SV (media ± IC), de
pollos incubados a 355msnm y 1378msnm, el día 3 y 4 de incubación. *p:≤ 0.05.
2.4.6 Cuantificación de la expresión del mRNA (qPCR)
La expresión relativa del HIF-2α el día 3 fue, a 1378msnm: 5.033 veces (p: 0.0004. IC:
2.238 ; 11.318) su expresión a 355msnm (Figura 2-19A); y para el día 4 fue, a 1378msnm:
4.090 veces (p: 0.0127. IC: 1.391 ; 12.021) su expresión a 355msnm (Figura 2-19C).
La expresión relativa del VEGF-A el día 3 fue, a 1378msnm: 5.487 veces (p: 0.0003. IC:
2.398 ; 12.553) su expresión a 355msnm (Figura 2-20A); y para el día 4 fue, a 1378msnm:
3.608 veces (p: 0.0025. IC: 1.639 ; 7.946) su expresión a 355msnm (Figura 2-20C).
La expresión relativa del FLK-1 el día 3 fue, a 1378msnm: 11.466 veces (p:< 0.0001. IC:
4.903 ; 26.818) su expresión a 355msnm (Figura 23A); y para el día 4 fue, a 1378msnm:
5.146 veces (p: 0.0002. IC: 2.345 ; 11.29) su expresión a 355msnm (Figura 2-21C).
84
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
La expresión relativa del HIF-2α a 355msnm fue, el día 4: 2.426 veces (p: 0.0578. IC:
0.969 ; 6.075) su expresión al día 3 Figura 2-19B); y a 1378msnm fue, para el día 4: 1.972
veces (p: 0.1735. IC 0.734 ; 5.297) su expresión al día 3 (Figura 2-19D).
La expresión relativa del VEGF-A a 355msnm fue, el día 4: 2.588 (p: 0.0263. IC: 1.132 ;
5.916) su expresión al día 3 (Figura 2-20B); y a 1378msnm fue, para el día 4: 1.702 veces
(p: 0.1795. IC: 0.772 ; 3.752) su expresión al día 3 (Figura 2-20D).
La expresión relativa del FLK-1 a 355msnm fue, el día 4: 3.246 veces (p: 0.0103. IC:
(1.358 ; 7.761) su expresión al día 3 (Figura 2-21B); y a 1378msnm fue, para el día 4:
1.457 veces (p: 0.3204. IC: 0.680 ; 3.119) su expresión al día 3 (Figura 2-21D).
Adicionalmente el análisis de varianza mostró que la expresión relativa de HIF-2α, de
VEGF-A, y del FLK-1 está afectada en buena medida, y de manera similar, por la altitud
de incubación: r2: 0.2547 (p:< 0.0001), r2: 0.3100 (p:< 0.0001), r2: 0.4428 (p:< 0.0001)
respectivamente; y menos, pero de manera similar, con el tiempo de incubación: r2:
0.0682 (p: 0.0209), r2: 0.0765 (p: 0.0103), r2: 0.0643 (p: 0.0080) (Tabla 2-2).
Figura 2-19: Expresión relativa del HIF-2α en el SV el día 3 y 4 de incubación.
A.
C.
Expresión relativa
HIF-2
(Día 3)
Expresión relativa
HIF-2
(Día 4)
27
27
24
24
21
21
18
18
15
15
E.
12
9
6
12
Expresión relativa
HIF-2
(Día 3 y Día 4)
***
9
6
**
3
**
3
0
0
(p: 0.0004)
(p: 0.0127)
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
***
B.
D.
Expresión relativa
HIF-2
(355msnm)
Expresión relativa
HIF-2
(1378msnm)
27
27
24
24
21
Día 3
(p: 0.0004)
355m snm (p: 0.0578)
18
Día 4
(p: 0.0127)
1378m snm (p: 0.1735)
21
18
15
15
12
12
9
9
6
6
3
3
0
0
(p: 0.0578)
Día 3
Día 4
Líneas = 95% IC
(p: 0.1735)
Día 3
Día 4
Líneas = 95% IC
Valores del la expresión relativa del HIF-2α en el SV (media ± IC), de embriones incubados a
1378msnm con respecto a embriones incubados a 355msnm, el día 3 (A) y el día 4 (B); y de
embriones incubados el día 4 con respecto a embriones incubados el día 3, a 355msnm (C) y
1378msnm (D). Figura (E) expresión relativa tanto del día 3 como del día 4 a 355msnm y
1378msnm. **p: 0.01 ***p:< 0.001.
86
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 2-20: Expresión relativa del VEGF-A en el SV el día 3 y 4 de incubación.
A.
C.
Expresión relativa
VEGF-A
(Día 3)
Expresión relativa
VEGF-A
(Día 4)
27
27
24
24
21
21
18
18
15
15
E.
12
12
9
6
Expresión relativa
VEGF-A
(Día 3 y Día 4)
***
3
9
6
**
**
3
0
0
(p: 0.0003)
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
(p: 0.0025)
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
*
***
B.
D.
Expresión relativa
VEGF-A
(355msnm)
Expresión relativa
VEGF-A
(1378msnm)
27
27
24
24
21
21
Día 3
(p: 0.0003)
355m snm (p: 0.0263)
18
Día 4
(p: 0.0025)
1378m snm (p: 0.1795)
18
15
15
12
12
9
9
6
3
6
*
0
3
0
(p: 0.0263)
Día 3
Día 4
Líneas = 95% IC
(p: 0.1795)
Día 3
Día 4
Líneas = 95% IC
Valores expresión relativa del VEGF-A en el SV (media ± IC), de embriones incubados a
1378msnm con respecto a embriones incubados a 355msnm, el día 3 (A) y el día 4 (B); y de
embriones incubados el día 4 con respecto a embriones incubados el día 3, a 355msnm (C) y
1378msnm (D). Figura (E) expresión relativa tanto del día 3 como del día 4 a 355msnm y
1378msnm. *p:< 0.05 **p:< 0.01 ***p:< 0.001.
Capítulo 2
87
Figura 2-21: Expresión relativa del FLK-1 en el SV el día 3 y 4 de incubación.
A.
C.
Expresión relativa
FLK-1
(Día 3)
Expresión relativa
FLK-1
(Día 4)
27
27
24
24
21
21
18
18
15
12
15
E.
****
12
Expresión relativa
FLK-1
(Día 3 - Día 4)
9
6
9
6
***
3
***
3
0
0
**
(p:< 0.0001)
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
(p: 0.0002)
****
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
B.
D.
Expresión relativa
FLK-1
(355msnm)
Expresión relativa
FLK-1
(1378msnm)
27
27
24
24
21
Día 3
(p:< 0.0001)
355m snm (p: 0.0103)
18
Día 4
(p: 0.0002)
1378m snm (p: 0.3204)
21
18
15
15
12
12
9
9
6
6
**
3
3
0
0
(p: 0.0103)
Día 3
Día 4
Líneas = 95% IC
(p: 0.3204)
Día 3
Día 4
Líneas = 95% IC
Valores expresión relativa del FLK-1 en el SV (media ± IC), de embriones incubados a 1378msnm
con respecto a embriones incubados a 355msnm, el día 3 (A) y el día 4 (B); y de embriones
incubados el día 4 con respecto a embriones incubados el día 3, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
Figura (E) expresión relativa tanto del día 3 como del día 4 a 355msnm y 1378msnm. **p: 0.01
***p:< 0.001 ****p:< 0.0001.
88
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Tabla 2-2: Análisis de varianza (ANOVA).
gl
SC
CM
F
p
r2
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
0,01
0,97
0,00
0,14
1,12
0,01
0,97
0,00
0,00
3,4980
387,8000
0,4914
0,0667
< 0.0001
0,4862
0,0078
0,8660
0,0011
PesoE
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
0,00
0,09
0,00
0,01
0,10
0,00
0,09
0,00
0,00
3,9650
601,7000
1,1820
0,0513
< 0.0001
0,2816
0,0060
0,9078
0,0018
ACMSV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
1609000,00
41540000,00
14180,00
11640000,00
54803180,00
1609000,00
41540000,00
14180,00
207900,00
7,7350
199,8000
0,0682
0,0074
< 0.0001
0,7949
0,0294
0,7580
0,0003
AVMSV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
3314,00
79960,00
516,30
24910,00
108700,30
3314,00
79960,00
516,30
444,80
7,4520
179,8000
1,1610
0,0085
< 0.0001
0,2859
0,0305
0,7356
0,0047
%CapilarSV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
59,08
47,35
0,78
282,50
389,71
59,08
47,35
0,78
5,04
11,7100
9,3860
0,1555
0,0012
0,0034
0,6948
0,1516
0,1215
0,0020
Fuente de variación
PesoSV
Análisis de varianza (ANOVA) del efecto conjunto de la altitud de incubación y el tiempo de
incubación sobre las diferentes variables.
Capítulo 2
89
Tabla 2-2: (Continuación).
2
Fuente de variación
gl
SC
CM
F
p
%Cel.HIF-2αSV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
443,90
12,51
1,11
3108,00
3565,52
443,90
12,51
1,11
55,49
7,9990
0,2255
0,0200
0,0065
0,6367
0,8880
0,1245
0,0035
0,0003
%Cel.VEGF-ASV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
453,00
44,69
1,32
2967,00
3466,01
453,00
44,69
1,32
52,98
8,5500
0,8434
0,0249
0,0050
0,3624
0,8751
0,1307
0,0129
0,0004
%Cel.FLK-1SV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
374,10
117,00
5,44
2397,00
2893,54
374,10
117,00
5,44
42,81
8,7390
2,7330
0,1270
0,0046
0,1039
0,7229
0,1293
0,0404
0,0019
∆CTHIF-2αSV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
71,40
19,12
0,34
189,50
280,36
71,40
19,12
0,34
3,38
21,1000
5,6500
0,0993
< 0.0001
0,0209
0,7539
0,2547
0,0682
0,0012
∆CTVEGF-ASV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
69,57
17,16
1,37
136,30
224,40
69,57
17,16
1,37
2,43
28,5900
7,0530
0,5634
< 0.0001
0,0103
0,4560
0,3100
0,0765
0,0061
∆CTFLK-1SV
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
129,80
18,84
5,01
139,50
293,15
129,80
18,84
5,01
2,49
52,0900
7,5620
2,0120
< 0.0001
0,0080
0,1617
0,4428
0,0643
0,0171
r
Análisis de varianza (ANOVA) del efecto conjunto de la altitud de incubación y el tiempo de
incubación sobre las diferentes variables.
90
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2.5 Discusión
2.5.1 Condiciones de incubación
El intercambio de gases (O2, CO2) y vapor de agua en el huevo del pollo está
determinado por la conductancia (porosidad) de la cáscara y el gradiente de presiones
parciales a través la misma (Paganelli, 1980), y dicho intercambio se da exclusivamente
por difusión. De tal manera que la conductancia de la cáscara afecta la pérdida de agua
del interior del huevo, y el intercambio gaseoso del O2 y del CO2; sin embargo, al parecer
la selección natural en las aves a llevado a que éstas le den mayor importancia a
mantener niveles adecuados de pérdidas de agua por difusión por encima de las
necesidades de difusión de los demás gases (Carey, 1983). En términos generales, la
mayoría de huevos pierde cerca del 10-12% de agua durante la incubación (Ar y Rahn,
1980), y se sabe que se presenta una menor incubabilidad cuando hay una variación de
dicha pérdida de agua. Aunque se ha encontrado una aclimatación de pollos
provenientes de tierras bajas y luego criados, y posteriormente sus huevos incubados en
la altitud. León-Velarde y colaboradores (1997) observaron que dicha aclimatación (con
reducción en la conductancia de la cáscara) se efectúa únicamente por selección a largo
plazo. Para el caso particular de esta investigación se esperaba entonces que todos los
huevos incubados (provenientes del mismo lote de reproductoras) tuvieran la misma
conductancia de la cáscara. Presupuesto que confirman los resultados de la medición de
la pérdida de peso (una medida indirecta de la pérdida de agua) en la cual no se
encontró diferencia estadísticamente significativa en dicha estimación en ambas alturas.
Además, como señalaron Christensen y McCorkle (1982) la pérdida de peso del huevo
también depende de las condiciones de incubación (temperatura y humedad); y es así
como la no diferencia estadística en la pérdida de peso, constata que las condiciones de
incubación fueron similares, variando únicamente la PB debido a la altitud.
2.5.2 Peso del SV y del embrión
El PesoSV en cualquier periodo de incubación después de los primeros seis días, se ha
encontrado, que varía directamente con el peso del huevo (Byerly, 1930b), razón por la
Capítulo 2
91
cual en esta investigación no se tuvieron en cuenta los pesos de los huevos. El mismo
autor reportó que el crecimiento del SV depende solo parcialmente de la presencia de un
embrión: Byerly encontró que el SV puede mantenerse vivo y crecer varios días aún
después de que haya muerto el embrión (Byerly, 1930a), es así como para esta
investigación se tuvieron en cuenta los SV que presentaban embriones viables. No
obstante, los resultados de esta investigación muestran que existe una correlación entre
el PesoE y el PesoSV, aunque los estudios de Byerly (1926), mostraron que los SV de
embriones de pollo incubados los primeros días presentaban tamaños aproximadamente
iguales sin importar el tamaño o aún la existencia de un embrión viable. En cuanto al
PesoE y el PesoSV, de los huevos incubados en condiciones de altitud Wangensteen y
colaboradores (1974) demostraron que una de las mayores adaptaciones en respuesta a
la incubación en la altitud es la reducción en el metabolismo embrionario, lo que conlleva
a un retraso en el crecimiento. En esta investigación no se encontró diferencia
estadísticamente significativa que apoye una disminución en el crecimiento embrionario,
reflejado en el peso embrionario en las condiciones de la altitud de este estudio; sin
embargo se debe tener en cuenta que la hipoxia a la cual fueron expuestos los
embriones en esta investigación no fue tan baja (disponibilidad del O2 del 17.7%) si se
tiene en cuenta, que de acuerdo a lo reportado por Asson-Batres y colaboradores (1989)
la tasa de crecimiento declina si la concentración de O2 se reduce al 15% o menos.
Además, durante este periodo (primera semana de incubación), los estudios con
espectrofotometría, indican que el mayor consumo de O2 por parte del embrión proviene
del área opaca del SV (Adair y col., 1987); pero a pesar de ello, tampoco se encontró
diferencia estadísticamente significativa en el Peso SV, lo que podría significar, que este
porcentaje de disponibilidad de O2 del 17.7%, tampoco parece tener un efecto en el
PesoSV. Podría entonces declararse que la hipoxia a la cual fueron sometidos los
embriones en este estudio tiene poco efecto en el desarrollo temprano debido a la
pequeña demanda absoluta de O2 por parte, tanto del embrión, como del SV, semejante
a lo declarado por otros autores, aún en condiciones de mayor hipoxia (Tazawa y col.,
1992; van Golde y col., 1997; Chan y Burggren, 2005).
92
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2.5.3 Área capilar, área vascular media, y porcentaje capilar
La porción vascular del SV es el principal órgano de intercambio gaseoso durante el
desarrollo temprano (Baumann y Meuer, 1992), y este periodo de respiración vitelina va
desde las 65-72 horas cuando el área vascular del SV comienza a funcionar como un
órgano respiratorio, hasta el 5-6 día de incubación cuando la CAM empieza a
establecerse como el principal órgano respiratorio (Wangensteen y Rahn 1970/1971),
reemplazando al SV. La PO2 es un determinante crítico para el apropiado desarrollo
embrionario. Cuando las demandas de los tejidos exceden su abastecimiento se
establece una condición hipóxica, como en el caso de la disminución en la PO2 dada por
la altitud. Dicha condición hipóxica, se sabe que produce retraso en el desarrollo
embrionario, disfunción cardiovascular y alteración en la angiogénesis, entre otras
(Sharma y col., 2006). Casi la totalidad de los estudios referentes a cambios en
vascularización de las membranas extraembrionarias del pollo incubados en condiciones
de hipoxia se han concentrado en la CAM, y al final sus resultados no han producido las
mismas conclusiones (Dusseau y Hutchins, 1988; Burton y Palmer, 1992; Wagner-Amos
y Seymor, 2003; Zhang y col., 2008), partiendo de la misma premisa: ―Que un incremento
en el número de los vasos sanguíneos en dicha membrana, podría compensar la hipoxia
hipobárica‖ (Reizis y col., 2005). En este caso, la hipoxia hipobárica a la cual fueron
expuestos los embriones incubados en la altitud (disponibilidad de O2 del 17.7%) no se
asoció con un aumento del ACMSV, pero si con un aumento del AVMSV, e igualmente del
%CapilarSV, tanto el día 3 como el 4 de incubación. Lo que parece indicar que la hipoxia
dada por la hipobaria en dicha altitud en la cual fueron incubados los embriones, estimula
la ramificación de los vasos (angiogénesis por brote o por intususcepción) (Stewart y
Wiley, 1981; Flamme y col., 1997), y no la elongación de los mismos (angiogénesis
intercalante) (Wilting y col., 1997), puesto que el Área SV no tuvo diferencia
estadísticamente significativa (Día 3 p: 0.08; Día 4 p: 0.09), mostrando que el diámetro
del SV no aumentó en las condiciones de altitud, y por lo tanto la extensión de los vasos
dentro de la misma tampoco. Entonces puede decirse, que la hipoxia a la cual fueron
sometidos los embriones en este estudio (disponibilidad de O2 del 17.7%), aunque
produce un incremento en el número de vasos principales (AVMSV), y en el porcentaje de
capilar (%CapilarSV), al final no conduce un aumento total del área vascular efectiva para
el intercambio gaseoso (el lecho capilar: ACMSV); sin embargo, debe tenerse en cuenta
Capítulo 2
93
que la medición del área capilar media en este estudio fue una estimación indirecta,
tomando para su cálculo la medición del área vascular media y del porcentaje capilar.
Como se mencionó más arriba, son pocos los estudios que evalúen el efecto de la
hipoxia en el desarrollo vascular del SV; por ejemplo, el estudio de Hoper y Jahn (1995)
en el cual se evaluó el efecto de la hipoxia (disponibilidad de O2 del 10%) en la
vascularización del SV el día 4 de incubación, mostró un incremento en la densidad
vascular, medida como el área ocupada por los vasos sanguíneos en el SV; algo
semejante a lo que se encontró en este estudio con el AVMSV. Este hallazgo sugiere, que
puesto que la mayor demanda de O2 por parte del embrión en este periodo proviene del
SV (Adair y col., 1987), dicha demanda crea un ambiente hipóxico en dicha membrana,
que conduce a un aumento en el número de vasos principales y capilares, pero no a una
extensión de los mismos, reflejado en la no diferencia en el Área SV.
2.5.4 Inmunoexpresión del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1
La vasculogénesis y la angiogénesis son los dos mecanismos utilizados para la
formación de la red vascular en el embrión. La vasculogénesis hace referencia a la
diferenciación in situ de vasos sanguíneos a partir de los hemangioblastos derivados de
las células mesodérmicas; y la angiogénesis comprende el brote o división y elongación
de nuevos vasos sanguíneos de los preexistentemente originados por vasculogénesis.
La regulación de ambos mecanismos está dada por potentes reguladores positivos,
particularmente el VEGF-A y su receptor el FLK-1 (Patan, 2004). Estudios recientes de la
angiogénesis en el embrión del pollo se llevan a cabo principalmente en el propio
embrión y en la CAM. No obstante, la angiogénesis en el SV, el primer órgano
respiratorio del embrión del pollo es utilizado actualmente muy poco (Flamme, 1989; le
Noble y col., 2004; Wang y col., 2007). Existe desde hace mucho tiempo evidencia de
que la incrementada demanda metabólica resultante de la hipoxia conduce a la expresión
de factores angiogénicos (Folkman, 1971). Además se sabe que las células expuestas a
ambientes hipóxicos expresan ciertos factores, como HIF. Este factor a su vez regula la
expresión de factores angiogénicos, tal como el VEGF y sus receptores (Nanka y col.,
2006). En este estudio se decidió observar el efecto de la hipoxia hipobárica en la
expresión del HIF-2α, el cual se ha reportado se expresa principalmente los tejidos de
94
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
origen extraembrionario (Favier y col., 1999); y así mismo, observar la expresión de uno
de los factores regulados por este, el VEGF-A y su receptor el FLK-1, en las células del
SV.
2.5.4.1 Inmunoexpresión del HIF-2α. La expresión del HIF-2α en el SV observada
mediante la técnica de IHC con el anticuerpo anti HIF-2α se vio en el endodermo, el
endotelio y el ectodermo. Dicho patrón de expresión ha sido previamente reportado por
otros autores (Elvert y col., 1999; Favier y col., 1999). En el caso de la expresión del
HIF-2α por parte de las células del ectodermo (Ota y col., 2007), se ha visto que éstas
células también expresan el VEGF-A (Flamme y col., 1995a, b), lo que abre la posibilidad
de que el HIF-2α pueda estar involucrado en el proceso normal de la angiogénesis
(Semenza y col., 2001). Esto es verificado en esta investigación, puesto que la expresión
del HIF-2α se observó en células del SV tanto de embriones incubados en condiciones
normales (baja altitud) como en células de embriones incubados en condiciones de
hipoxia hipobárica (altitud). No obstante, la expresión (medida como el número de células
que expresaban este factor) fue mayor en los embriones incubados en condiciones de
hipoxia el día 4 de incubación, algo similar a lo encontrado por Nanka y colaboradores
(2001); estudio en el cual la intensidad de la expresión fue mayor en las áreas hipóxicas.
Para confirmar los hallazgos de este estudio, se decidió cuantificar la expresión del
mRNA de dicho factor.
Es de resaltar, como se mencionó más arriba, que la expresión de dicho factor también
se observó en el endodermo y las células endoteliales; lo cual sugiere que el endodermo
es parte vital en la respuesta a la hipoxia, y también, que el endotelio podría auto regular
su proliferación en respuesta a la misma (Semenza y col., 2005).
2.5.4.2 Inmunoexpresión del VEGF-A.
La expresión del VEGF-A en el SV
detectada mediante la técnica de IHC con el anticuerpo anti VEGF-A se observó
igualmente en células del endodermo, endotelio y ectodermo tanto el día 3 como el día 4.
Capas celulares que previamente se había reportado eran positivas a dicha expresión
mediante la técnica de hibridación in situ (Flamme y col., 1995a), pero en el día 2 de
incubación. Sin embargo, en un estudio posterior de Nico y colaboradores (2001) se
encontró que en el día 6 de incubación únicamente células del endodermo y mesodermo
Capítulo 2
95
son positivas a la expresión de VEGF-A. Como se vio más arriba, en este estudio dichas
células en las tres capas (endodermo, mesodermo y ectodermo) también expresaron
HIF-2α. Estos hallazgos están de acuerdo con los diferentes estudios que demuestran
que tanto el HIF como el VEGF llevan cabo sus funciones a través de vías autocrinas y
paracrinas (Nomura y col., 1995; Dias y col., 2001). En el presente estudio se encontró
un mayor número de células positivas a VEGF-A en los embriones incubados en la
altitud, el día 3 pero no el día 4, lo que no se correlaciona muy bien con el hecho de que
se estimó un mayor número de células positivas a HIF-2α en los embriones incubados en
la altitud el día 4 de incubación. Razón por la cual podría decirse que la técnica de IHC
fue bastante útil para la localización de la inmunoexpresión de ambos factores, pero no
para la cuantificación de la inmunoexpresión de la misma; razón por la cual se decidió
realizar la cuantificación de la expresión del mRNA de dichas proteínas.
2.5.4.3 Inmunoexpresión del FLK-1. La expresión del FLK-1 en el SV observada
mediante la técnica de IHC con el anticuerpo anti FLK-1 se detectó en la membrana de
las células endoteliales y en el mesodermo vascular el día 3, lo mismo que el día 4, como
lo previamente reportado por otros investigadores (Flamme y col., 1995a; Nico y col.,
2001); no obstante, en el estudio de Nico y colaboradores la expresión del FLK-1
detectada mediante la técnica de IHC fue también observada en células del ectodermo
del SV en el día 6 de incubación. La restricción en la expresión del FLK-1 en el
mesodermo y endotelio vascular del SV, coincide con lo reportado desde hace mucho de
que el FLK-1 es un marcador de la línea endotelial (Yamaguchi y col., 1993), aunque en
los últimos años algunos autores han reportado que la expresión del FLK-1 podría ser
bastante amplia dentro de las líneas celulares que derivan del mesodermo (Bautch,
2006). Además, en este caso hubo un mayor número de células positivas a FLK-1 en los
embriones incubados en la altitud, tanto el día 3 como el día 4, lo que se asocia a una
mayor proliferación endotelial, puesto que de todos los receptores del VEGF, el FLK-1 es
considerado el principal receptor involucrado en la proliferación endotelial (Ferrara y col.,
2003).
96
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
2.5.5 Expresión relativa del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1
La utilidad de la inmunohistoquímica (IHC) se confina usualmente al análisis cualitativo, y
la mayoría de veces el análisis cuantitativo no se efectúa; y si se efectúa, en el mejor de
los casos lo que se hace es contar el número de células inmunopositivas (como lo
realizado en este estudio) o se registra la inmunointensidad. Pero, aunque se utilicen las
anteriores dos metodologías, no existe una estandarización de las mismas (Goldstein y
col., 2007). La interpretación de la IHC se realiza generalmente de manera manual,
aunque en la actualidad ya existen analizadores automáticos; sin embargo el costo y
asuntos técnicos han restringido su uso, por lo que otras metodologías para la estimación
de la expresión génica han logrado posicionarse mucho más. Tal es el caso de la PCR
cuantitativa (q-PCR) (Walker, 2008). Con respecto a esta investigación, no se encontró
una buen correlación entre la immunoexpresión (el porcentaje de células) de los
marcadores HIF-2α, VEGF-A, con la expresión relativa de los genes de dichos
marcadores. Únicamente la immunoexpresión del marcador FLK-1 se correlacionó con la
expresión relativa del mismo gen. En los tres casos se encontró una mayor expresión
relativa en el SV de embriones incubados en altitud, lo que respalda la teoría apoyada
desde hace mucho tiempo de que se produce un aumento en la expresión del HIF en
condiciones de hipoxia, que a su vez induce un incremento en la expresión del VEGF-A
(Kulshreshtha y col., 2007), y juntas estas dos moléculas inducen la transcripción del
FLK-1 (Elvert y col., 2003; Hervé y col., 2006), que se refleja en el casi el doble de la
expresión relativa de éste último con respecto a la expresión relativa de los dos primeros.
3. Peso embrionario y desarrollo vascular e
inmunoexpresión y expresión relativa del HIF2α, VEGF-A y FLK-1 en la alantoides de pollos
incubados a 355 y 1378msnm el día 6 y 7 de
incubación
3.1 Resumen
Con el objetivo de establecer el posible efecto de dos diferentes alturas en el peso
embrionario y en la vascularización de la membrana corioalantoidea, se incubaron
embriones de pollo a 355 y 1378msnm, y el día 6 y 7 de incubación: se midió el peso del
embrión y de la corioalantoides; se estimó el área vascular media, el porcentaje capilar y
el área capilar media de la corioalantoides; se describió y cuantificó la inmunoexpresión
del HIF-2α, del VEGF-A y de su receptor FLK-1 en las células de la corioalantoides; y se
realizó la cuantificación relativa de la expresión del mRNA de las anteriores proteínas en
la corioalantoides mediante q-PCR. Los resultados de la presente investigación
mostraron que ni el peso del embrión ni el de la corioalantoides presentan diferencia
estadísticamente significativa el día 6 y el día 7 en los embriones incubados en las dos
diferentes alturas; no obstante que si hubo diferencia estadísticamente significativa en el
área vascular media (p:< 0.05), el porcentaje capilar (p: 0.05) y el área capilar media (p:<
0.05); del porcentaje de células positivas a la expresión de HIF-2α (p:< 0.05) y FLK-1 (p:<
0.05); y de la expresión relativa del mRNA del HIF-2α (p:< 0.05) y del FLK-1 (p:< 0.01), el
día 6 de incubación, en los embriones incubados a 1378msnm. Además mediante tinción
inmunohistoquímica se encontraron células positivas a HIF-2α y VEGF-A en el
endodermo, mesodermo, endotelio y ectodermo; y células positivas a FLK-1 en el
mesodermo y en el endotelio de la corioalantoides. De los resultados se concluyó que el
nivel de hipoxia (dada por la altura: 1378msnm) a la cual fueron sometidos los embriones
en esta investigación afecta la expresión tanto del HIF-2α, como del FLK-1 en la
98
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
corioalantoides, el día 6 de incubación. Además, que dicho cambio en la expresión se
refleja en un aumento en la vascularización de la corioalantoides observado en el día 6
de incubación; y que la hipoxia a la cual fueron sometidos los embriones, no afecta el
peso de estos. Además se muestra que el día 7 de incubación del embrión del pollo, es
un tiempo de transición muy importante durante el desarrollo de la corioalantoides, y
como una falla en el crecimiento vascular de dicha membrana en respuesta a la hipoxia
podría conducir a hipometabolismo con la concomitante reducción en el peso del embrión
observada en los diferentes estudios en los que se han sometido embriones de pollo a
hipoxia, y en los que se ha medido el peso del embrión después del día 7 de incubación.
Palabras
clave:
hipoxia
hipobárica,
embrión
del
pollo,
corioalantoides,
vascularización, HIF-2α, VEGF-A, FLK-1.
Abstract
To evaluate the posible effect of two different altitudes on the embryonic weight and in the
chorioallantoic vascularization, chicken embryos were incubated at 355 and 1378masl,
and on day six and seven: the embryonic and chorioallantoic weight were measured; the
vascular media area, capillary percentage and capillary media area of the chorioallantois
were estimated; the immunoexpression of HIF-2α, VEGF-A and its FLK-1 receptor were
described and quantified in the chorioallantois; the quantification of relative mRNA
expression of the above proteins in the chorioallantois was made using q-PCR. The
results showed that neither embryonic weight nor chorioallantoic weight had statistical
significant difference on day six and seven in the embryos incubated at two different
altitudes; nevertheless that there was statistical significant difference in the vascular
media area (p:< 0.05), capillary percentage (p: 0.05) and capillary media area (p:< 0.05);
of the positive cells percentage immunoreactives to HIF-2α (p:< 0.05) and FLK-1 (p:<
0.05); and the relative mRNA expression of HIF-2α (p:< 0.05) and FLK-1 (p:< 0.01) on
day six on the embryos incubated at 1378masl. Moreover, by immunohistochemistry
staining, positive cells immunoreactives to HIF-2α and VEGF-A were found in the
endoderm, mesoderm, endothelium and ectoderm; and positive cells immunoreactives to
Capítulo 3
99
FLK-1 were found in the chorioallantoic mesoderm and endothelium. On the basis of
present results, it was concluded that the hypoxia level at which the embryos were
submitted on this research, affects the expression of HIF-2α and FLK-1 in the
chorioallantoic membrane, on day six of incubation. Furthermore, that those changes in
the gene expression reflect an increase in the vascularization of the chorioallantois seen
on day six; and that the hypoxia at which the embryos were exposed does not affect the
embryonic weight of those. Moreover, on day seven of the incubation seems to be very
important to the development of the chorioallantoic membrane. And it is shown how a
failure in the chorioallantoic vascularization could result in embryo hypometabolism with
the concomitant reduction of its weight, comparable to other studies where it has been
seen that embryos exposed to chronic hypoxia reduce their weight when it is measured
after day seven of incubation.
Key words: hypobaric hypoxia, chicken embryo, chorioallantois, vascularization,
HIF-2α, VEGF-A, FLK-1.
3.2 Introducción
La respiración involucra múltiples y bien establecidos pasos en el transporte del O2. En el
caso del embrión aviar lo primero que ocurre (que sería el equivalente a la ventilación en
el adulto) es la difusión del O2 desde el ambiente al interior del huevo, seguida por la
difusión de éste a los capilares del SV, y finalmente de los capilares al sistema de
respiración mitocondrial. Durante cada paso de la respiración descrito anteriormente,
ocurre una caída en la PO2 y un incremento en la PCO2. En condiciones de altura, la PO2
disminuye, y con ésta también se reduce la diferencia en las presiones de O2 disponibles
para el transporte gaseoso hasta la mitocondria. De tal manera, que dicha disminución en
la PO2 debe ser compensada de alguna forma, bien sea regulando el metabolismo o a
través de modificaciones en los pasos descritos inicialmente (León-Velarde y Monge,
2004). Por la ecuación de Fick (Monge y col., 2000) se sabe que el Flujo de O2 (la
velocidad de transferencia de éste) es proporcional al área superficial de la cáscara (área
de los poros), al coeficiente de difusión de dicho gas y a la diferencia de PO2, y por
último, inversamente proporcional al grosor de la cáscara (Billat, 2001).
100
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Por lo tanto la fórmula se escribe:
Flujo O2 = A * D * (P1 - P2)
T
Donde A es la superficie de la cáscara del huevo (área de los poros), T el grosor de la
cáscara, D el coeficiente de difusión y (P1 - P2) la diferencia de presión parcial entre
ambos lados de la cáscara. Puesto que D es inversamente proporcional a la PB, y dado
que el grosor de la cáscara no varía con dicha altura, la mayoría de la variación en la
conductancia se debe al área total de los poros, dado por el número de los mismos
(Carey, 1986). Se sabe además, que la conductancia de la cáscara del huevo permanece
constante a través de todo el tiempo de incubación (Carey y col., 1983). Se estima que la
diferencia en la presión parcial en el huevo es alrededor de 42 Torr. Y a pesar de que
existe un incremento de D en la altura, la baja en la PO2 fuera del huevo, reduce la PO2
al interior por debajo del valor correspondiente a nivel del mar (Wangensteen y col.,
1974). Adicionalmente, el incremento en la masa del embrión resulta en una disminución
en la concentración del O2 al interior del huevo (Rahn y col., 1974). El continuo aumento
en el consumo de O2 (VO2) produce una reducción en la PO2 al interior del huevo, que
acentúa la diferencia en la PO2 entre el ambiente y el interior del huevo, mejorando de
esta manera la difusión.
El paso del O2 desde la atmósfera hasta los tejidos del embrión del pollo está limitado por
varios factores (externos e internos): el embrión no tiene control sobre la resistencia
externa inerte, que está compuesta por la cáscara y su membrana; sin embargo, la
resistencia interna puede ser controlada en cierto grado ya que ésta incluye al epitelio
coriónico y a la pared de los capilares sanguíneos en la CAM (Wangensteen y Weibel,
1982). En el embrión del pollo se ha establecido un periodo de respiración en el que el
intercambio de gases se da por medio de la CAM, y que comienza alrededor del día 6 de
incubación (Rahn y Paganelli, 1974). Durante este periodo la conductancia a los gases
entre el ambiente y la sangre incrementa notablemente, debido principalmente al
crecimiento de la CAM con su vascularidad, y a la aproximación de ésta a la membrana
interna de la cáscara; además del incremento en el hematocrito y de la afinidad de la Hb
Capítulo 3
101
por el O2 en los glóbulos rojos (Tazawa, 1971). Durante este periodo, el consumo de O2
de la propia CAM, es una gran fracción del total del consumo de O2 de todos los tejidos
del huevo, disminuyendo a la quinta parte después del día 12 de incubación (Pearson y
col., 1991). Como se mencionó antes, dicho porcentaje del total del consumo de O2 por
parte de la CAM se va reduciendo (contrario a lo que ocurre por parte del embrión, que
va aumentando) a partir de la segunda mitad de incubación. Para el final de dicho
periodo, cerca de la mitad del volumen sanguíneo del gasto cardiaco va dirigido a suplir a
la CAM, y un 15% al SV. En la tercera semana de incubación dicha fracción del consumo
del gasto cardiaco por parte de la CAM se mantiene, mientras que el porcentaje del
volumen del gasto cardiaco que se dirige al SV se reduce a favor de los órganos
embrionarios (Mortola, 2009). Se ha encontrado que la vascularización de las
membranas extraembrionarias reacciona a las condiciones de oxigenación del ambiente.
La mayoría de estudios acerca de la vascularización de las membranas embrionarias del
pollo en condiciones de hipoxia se han realizado en la CAM, pero aún son
controversiales; por ejemplo, Wagner-Amos y Seymor (2003) encontraron que hay una
reacción negativa de crecimiento vascular en respuesta a las condiciones de hipoxia
ambiental; mas sin embargo, otros autores como Dusseau y Hutchins (1988) encontraron
que hay una reacción positiva por parte de los lechos vasculares en respuesta a la
hipoxia. Contrastando incluso con otros autores como Burton y Palmer (1992) quienes no
observaron cambios en la vascularización en respuesta a la hipoxia. Lo que si se
reconoce, es que los embriones sometidos a hipoxia, resultan en retardado desarrollo y
pobre incubabilidad (Zhang y col., 2008). En los experimentos de la presente
investigación, se evaluó el efecto de la hipoxia hipobárica en el crecimiento de la CAM y
su desarrollo vascular, en la expresión de algunos genes (el HIF-2α, el VEGF-A, y su
receptor FLK-1), y en la mortalidad embrionaria.
Es importante mencionar algunas de las características morfológicas del desarrollo de la
alantoides. Ésta aparece en el embrión del pollo alrededor de los 3.5 días de incubación
como una evaginación del la pared ventral del endodermo del intestino posterior. Durante
el cuarto día, ésta se extiende hacia afuera (dentro del celoma extraembrionario). La
porción proximal de la alantoides la cual se ubica paralela y caudal al SV, se estrecha,
formando el tallo alantoideo; en cambio la porción distal se ensancha y recibe el nombre
de vesícula alantoidea. La acumulación de líquido distiende poco a poco dicha vesícula.
Es así, como la bolsa alantoidea aumenta de tamaño rápidamente a partir del día cuarto
102
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
hasta el día 10, y durante este proceso, la capa de células mesodérmicas de la
alantoides se fusiona con la capa adyacente de mesodermo del córion para formar la
CAM (creándose por lo tanto, una doble capa de mesodermo en la CAM: el componente
coriónico es mesodermo somático y el componente alantoideo es mesodermo
esplácnico). En esta doble capa de mesodermo se desarrolla una rica red vascular que
se conectará con la circulación embrionaria por medio de la arteria y vena alantoidea.
Inicialmente, los vasos sanguíneos en el mesodermo de la alantoides son inmaduros, es
decir, carecen de una completa lamina basal y células musculares lisas; se encuentran
dispersos dentro del mesodermo y crecen muy rápido hasta el día 8, dando origen a
plexos capilares, los cuales se asocian íntimamente con la capa superior de células
coriónicas y median el intercambio gaseoso con el medio externo (Ausprunk y col., 1974).
Al final la configuración vascular de la CAM es la siguiente: una arteria alantoidea
(umbilical) que emerge de la pared abdominal embrionaria, pasando a lo largo del tallo de
la alantoides hasta la pared interna del saco alantoideo, donde se divide en dos fuertes
ramas, una corriendo en dirección cefálica y la otra corriendo en dirección caudal a los
márgenes del saco alantoideo, donde pasarán a la pared más externa. En dirección
opuesta, la CAM es drenada por una singular vena alantoidea, que es el resultado de la
confluencia de venas alantoideas más pequeñas, que corren en la pared interna y pasan
sobre la CAM. Fuchs y Lindenbaum (1988) describieron seis a 7 generaciones de ramas
desde la arteria alantoidea, Las primeras 4 a 5 se localizan en un plano paralelo al de la
superficie de la CAM y profundo al de las venas, las cuales tienen una distribución
similar. La quinta y sexta generación de vasos sanguíneos cambian de dirección,
pasando casi verticalmente, y en la pared más externa de la CAM las arterias y las venas
se ramifican aún más e interdigitan en las porciones más profundas del mesodermo,
formando entonces una extraordinaria red capilar tan fina como una malla intercalada con
las células ectodérmicas. El análisis tridimensional de la microcirculación de la CAM ha
revelado una arquitectura similar a esta de la microvasculatura pulmonar (Fuchs y
Lindenbaum, 1988).
Una descripción general del desarrollo vascular de la CAM es la siguiente: el día 4 todos
los vasos de la CAM tienen la apariencia de capilares no diferenciados (sus paredes
consisten de una singular capa de células endoteliales que carecen de una lámina basal)
Capítulo 3
103
(Ausprunk y col., 1974). Entre los días 4.5 y 5.0 las células endoteliales microvasculares
son más gruesas y tienen pocas vesículas plasmalemales y grandes vacuolas (Rizzo y
col., 1995a). A partir del día 6, de la red de vasos que se ha formado, únicamente los
vasos de primer y segundo orden aumentan en número. Además, el promedio de la
longitud de
los microvasos de
primer,
segundo
y tercer orden
se
reduce
significativamente; de tal manera, que es la consecutiva ramificación de los vasos
respectivos lo que sirve para incrementar el tamaño de la red, a medida que
simultáneamente la longitud de cada microvaso disminuye (DeFouw y col., 1989). Para el
día 8 la CAM despliega pequeños capilares debajo del epitelio coriónico; dichos capilares
tienen una capa de células mesenquimales rodeando al endotelio y son completamente
tapizados por una lámina basal, y su diámetro luminal varía entre 10 y 15 µm (Ausprunk y
col., 1974). Del día 10 al 12, los capilares se parecen a estos del día 8, pero se
encuentran ahora cerca de la superficie del epitelio. Para este momento los vasos
mesodérmicos son claramente arteriolas y vénulas. En las arteriolas (10-85 µm de
diámetro) en adición al endotelio se encuentra una o dos capas de células
mesenquimales e incrementan la cantidad de tejido conectivo que las rodea. Las vénulas
(con diámetro de 10-115 µm) están rodeadas por una incompleta lámina de células
mesenquimales, y de tejido conectivo que también se ha acumulado en sus paredes.
Gradualmente empiezan a aparecer microfilamentos en las células mesenquimales. En la
pared de las arteriolas también se desarrolla una lámina adventicia que contiene células
parecidas a los fibroblastos (Shumko y col., 1988).
Objetivos:
General
Establecer si existían diferencias en el peso embrionario (PesoE) y en la vascularización
de la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm, los días 6 y 7 de
incubación.
Específicos
• Determinar el PesoE y de la CAM (PesoCAM), de embriones de pollo incubados a
355msnm y 1378msnm, los días 6 y 7 de incubación.
104
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
• Cuantificar el área vascular media (AVM), el porcentaje Capilar (%Capilar), y el área
capilar media (ACM) de la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 6 y 7 de incubación.
• Describir y cuantificar la inmunoexpresión del HIF-2α, del VEGF-A y su receptor FLK-1
en la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y 1378msnm, los días 6 y 7 de
incubación.
• Realizar la cuantificación relativa de la expresión del mRNA del HIF-2α, del VEGF-A y
su receptor FLK-1 en la CAM, de embriones de pollo incubados a 355msnm y
1378msnm, los días 6 y 7 de incubación.
3.3 Materiales y métodos
3.3.1 Incubación
Se obtuvieron 14580 huevos fértiles de la estirpe Cobb, provenientes de la Granja Santa
Inés en Colombia. Los huevos fueron almacenados durante 5 días, y se incubaron en
máquinas comerciales Chick Master® bajo las condiciones estándar de la industria:
Temperatura
37.5ºC; Humedad relativa
50%; y los huevos fueron volteados
automáticamente cada hora. La mitad se incubó a 355msnm (Ricaurte, Cundinamarca,
Colombia: PB: 730mmHg, PO2: 153mmHg, Disponibilidad de O2: 20%); y la otra mitad a
1378msnm (Garagoa, Boyacá, Colombia: PB: 650mmHg, PO2: 136mmHg, Disponibilidad
de O2: 17.7%). Se tomó como día 1, después de transcurridas 24 horas de incubación.
3.3.2 Extracción y exposición
Del total de huevos incubados en cada altura, se colectó una muestra de 15 huevos con
embriones viables, el día 6 y el día 7 de incubación. Los embriones junto con sus CAMs
fueron extraídos de la cáscara y puestos sobre una bandeja, para tomar fotos de los
mismos.
Capítulo 3
105
3.3.3 Fotografías
Cada membrana de la CAM y embrión sobre la bandeja fueron fotografiados a una
distancia de 15cm de la lente de la cámara fotográfica. Se utilizó una cámara fotográfica
Canon PowerShot S5IS® con SuperMacro, y se obtuvo una imagen de la vascularización
que abarcó el área total de dicha membrana junto con su embrión, conservando así las
medidas de las diferentes estructuras.
3.3.4 Pesaje
Los embriones fueron sacrificados por decapitación (todos los procedimientos fueron
aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad Nacional de Colombia, Facultad
de Medicina Veterinaria y de Zootecnia), y se midió la masa húmeda (Peso E) de los
embriones - libre de vitelo; y de la CAM (Peso CAM) - libre de vitelo, con una balanza
analítica.
3.3.5 Fijación y congelación
Se tomaron muestras de la CAM de cada embrión, que fueron fijadas mediante inmersión
en formalina de pH 7.4 al 4%, por espacio de 24 horas. Igualmente, se tomaron muestras
de la CAM que fueron almacenadas en crio tubos y congeladas inmediatamente
sumergiéndolas en nitrógeno líquido.
3.3.6 Tinción
Los tejidos fijados en formalina fueron embebidos en parafina, y usados para cortes
(5µm), para ser teñidos después con hematoxilina-eosina. Las láminas para tinción con
anticuerpos fueron desparafinadas incubándolas a 60ºC y luego pasándolas por xilol.
Posteriormente los cortes fueron hidratados pasándolos por etanol en concentraciones
descendentes. Luego las láminas fueron lavadas con agua destilada. Se adicionó
peróxido de hidrógeno al 3% en metanol y se enjuagaron con agua destilada. Se agregó
la solución de recuperación de antígeno (buffer citrato pH 6), y luego de enfriar y lavar las
láminas con agua destilada se sumergieron en buffer Tris (pH 7). Después se adicionó la
106
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
solución universal Blocking Reagent (Biogenex HK 0.85.5k). Se preparó la dilución del
Anticuerpo anti FLIP en dilución 1/50, el cual fue añadido a las láminas. Se lavaron las
láminas tres veces con buffer Tris, y posteriormente se agregó el reactivo estabilizante
Super Enhancer (Biogenex HK518-YAK), y se volvieron a lavar las láminas con buffer
Tris. Luego se adicionó el complejo de polímero marcado con peroxidasa S.S Label
PolymerHRP (Biogenex HK519-YAK), y se enjuagaron las láminas de nuevo con buffer
Tris. Además, se añadió la solución cromógeno DAB (Biogenex HK520-YAK), y se
observó al microscopio la aparición del color café, y se detuvo la reacción DAB. Para
terminar se contrastaron los cortes con hematoxilina de Harris, realizando el azulamiento
con agua amoniacal; se deshidrataron los tejidos con etanol en concentraciones
ascendentes, y se aclararon las láminas por medio de pases en xilol.
Para los controles positivos se utilizó: cortes de adenocarcinoma de colon.
Para los controles negativos se empleó: cortes de la CAM sin el anticuerpo primario.
3.3.7 Descripción
Se realizó la descripción histológica de los cortes de la CAM teñidos con hematoxilinaeosina, lo mismo que la descripción de la expresión inmunohistoquímica de las laminas
marcadas con anticuerpos, mediante microscopio de luz y objetivo 40X.
3.3.8 Evaluación morfométrica
La estimación del Área Vascular Media (AVMCAM) se hizo mediante la determinación del
área ocupada por los vasos sanguíneos en las fotografías tomadas a las membranas del
CAM (Figura 3-1 a Figura 3-8). El área se cuantificó usando el programa comercial
Adobe Photoshop® CS4 Extended mediante el empleo de la herramienta Measurement
Image Panel (Abrams y col., 2009).
Previamente los vasos fueron completamente
delineados con ayuda del programa comercial CorelDRAW® Graphics Suite X4.
Adicionalmente se cuantificó el área total de la CAM (ÁreaCAM) con el uso de la misma
herramienta de Adobe Photoshop® CS4 Extended.
Capítulo 3
Figura 3-1: Foto embrión y CAM día 6 (355msnm).
Fotografía del embrión y su CAM el día 6 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 3-2: Foto embrión y CAM día 6 (1378msnm).
Fotografía del embrión y su CAM el día 6 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
107
108
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-3: AVMCAM dia 6 (355msnm).
Área vascular media (AVM) de la CAM el día 6 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 3-4: AVMCAM dia 6 (1378msnm).
Área vascular media (AVM) de la CAM el día 6 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
Capítulo 3
Figura 3-5: Foto embrión y CAM día 7 (355msnm).
Fotografía del embrión y su CAM el día 7 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 3-6: Foto embrión y CAM día 7 (1378msnm).
Fotografía del embrión y su CAM el día 7 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
109
110
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-7: AVMCAM dia 7 (355msnm).
Área vascular media (AVM) de la CAM el día 7 de incubación. Huevo incubado a 355msnm.
Figura 3-8: AVMCAM dia 7 (1378msnm).
Área vascular media (AVM) de la CAM el día 7 de incubación. Huevo incubado a 1378msnm.
Capítulo 3
111
El Porcentaje Capilar (%CapilarCAM) se estimó en las láminas teñidas con hematoxilinaeosina. Para tal fin, se uso la metodología empleada por Seidlitz y colaboradores (2004)
(Figura 3-9); en la cual únicamente se tuvieron en cuenta los plexos capilares dentro de
los campos ópticos seleccionados azar. En total se estimó el %CapilarCAM de 5 campos
por lámina, es decir por muestra. Dicho procedimiento se realizó mediante el microscopio
de luz y objetivo 40X.
Figura 3-9: Microfotografía CAM.
A.
B.
Microfotografía de corte de la CAM teñida con HyE. A. Objetivo 10X. B. Objetivo 20X.
112
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-9: (Continuación).
C.
D.
Microfotografía de la CAM. HyE. Objetivo 40X. C. La serie de líneas negras representan la
longitud de cada vaso. D. La línea negra continua representa la superficie total de la CAM en la
fotografía.
Capítulo 3
113
El Área Capilar Media (ACMCAM) se cuantificó restándole al Área SV el AVMSV, y
multiplicándolo por el %CapilarCAM.
Cuantificación de la inmunoexpresión.
Mediante el microscopio de luz y
objetivo 40x, se estimó el número de células que expresaban determinado marcador
(HIF-2α, VEGF.A, FLK-1) como un porcentaje del total de células observadas por campo
(%Cel.HIF-2αCAM, %Cel.VEGF-ACAM, %Cel.FLK-1CAM), en 5 campos ópticos escogidos al
azar por lámina (por muestra).
Cuantificación de la expresión del mRNA.
Extracción del RNA. El RNA total del SV fue extraído con la técnica de Trizol Reagent
(Invitrogen®), de acuerdo con las instrucciones de la casa comercial. La extracción de
mRNA se realizó con el kit Dynabeads® mRNA Direct™. La concentración de mRNA de
cada una de las muestras fue cuantificada en un espectrofotómetro de luz ultravioleta a
una absorbancia de 260/280 nm (Spectronic BioMate 3 UV-Vis Spectrophotometer®).
RT-PCR. La síntesis de cDNA se realizó a partir de 1 μg de mRNA utilizando 200 U
MMLV-reverse transcriptase, 20 U ribonuclease inhibitor RNase-Out y 1 nM Random
Hexamer Primers (Invitrogen®) en un volumen total de 30 μl. Las reacciones de RT
fueron incubadas a 37°C por 45 minutos y 42°C por 15 minutos, y terminadas por
calentamiento a 92°C por 2 minutos. Para verificar la especificidad de los productos
amplificados, se realizaron controles negativos con reacciones de RT sin adición de la
enzima transcriptasa reversa (Figura 3-10).
q-PCR. A partir del cDNA obtenido por RT, se determinó la expresión del mRNA de
HIF2-α, VEGF-A, FLK-1, y de la subunidad ribosomal 18S; con la técnica PCR en tiempo
real usando el termociclador Light Cycler de Roche® y la metodología de detección de
SYBR green PCR core reagents (Roche®). Los anteriores procedimientos se realizaron
de acuerdo con reportes previos (Gómez, 2008) en los que se validó esta técnica y
siguiendo las instrucciones de la casa comercial. La prueba de PCR se realizó usando
iniciadores específicos para cada gen de interés, los cuales fueron diseñados con el
programa Primer3 disponible en la red, a partir de las secuencias de los genes de Gallus
114
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
gallus reportadas en GenBank. El número de acceso, los iniciadores y el tamaño del
producto se muestran en la Tabla 3-1. El volumen final de reacción fue de 20 μl. Todas
las reacciones se llevaron a cabo con las siguientes condiciones: 95°C por 3 minutos, 40
ciclos de 95°C por 5 segundos, 64°C por 15 segundos y 72°C por 15 segundos. En cada
una de las muestras, los niveles de mRNA fueron estandarizados con los niveles de
expresión de S18 (previo cálculo de la eficiencia). Adicionalmente se realizó una
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 %, teñido con bromuro de etidio para su
visualización, con el objetivo de asegurar el tamaño (pares de bases) de los productos
obtenidos (Figura
3-10).
Igualmente
se
verificaron
los amplificados
mediante
secuenciación.
Figura 3-10: Electroforesis de la RT-PCR mRNA genes de interés.
M
S18
RT-
HIF-2α
RT-
VEGF-A
RT-
FLK-1
RT-
Imagen representativa del mRNA de los genes de interés en muestras de CAM de pollos
incubados a 1378msnm. Subunidad ribosomal S18 (265 pb), HIF-2α (180 pb), VEGF-A (80 pb), y
FLK-1 (89 PB). En el experimento se empleó un marcador de peso molecular (M) de 500 pb (línea
más brillante 125 pb. Las demás líneas cada 25 pb). Los productos de PCR se separaron en un
gel de agarosa al 1.5%, teñido con bromuro de etidio, analizado con luz ultravioleta y visualizado
con el Gel Doc System (Bio-Rad®, Hercules, CA). En la figura también se observan los controles
negativos de la transcripción reversa (RT-), en los cuales no se evidencian bandas después de la
amplificación.
Capítulo 3
115
Tabla 3-1: Secuencias iniciadores q-PCR.
Iniciadores
Producto
(5' - 3')
(pb)
Gen
18S
No. GenBank
CTC AAC ACG GGA AAC CTC AC
265
M59389
180
AF129813
80
AB011078
89
AB066660
CGG ACA TCT AAG GGC ATC AC
HIF-2α
ATC AAG TTC CCC CTC AGG AC
TGT TGC AAT GCT TGC TCT TC
VEGF-A
AGA ATG TGT CCC TGT GGA TGT G
GCG CTA TGT GCT GAC TCT GAT G
FLK-1
GGA GTT TCC CAG AGA CCG AC
CAA TCC CAA AGG CAT CAG C
En la tabla se incluyen el par de iniciadores utilizados para la amplificación de cada gen de
interés. Adicionalmente se incluyen los tamaños esperados de los productos del cDNA generado,
expresados en pares de bases (pb), así como el número de identificación de cada gen (disponible
en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
3.3.9 Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de las variables cuantitativas (Peso E, PesoCAM, ÁreaCAM,
AVMCAM, ACMCAM, %CapilarCAM, %Cel.HIF-2αCAM, %Cel.VEGF-ACAM, %Cel.FLK-1CAM),
calculando medidas de tendencia central y de dispersión. En el caso de las variables de
la expresión del mRNA de los diferentes genes, estas primero fueron estandarizadas
mediante el método comparativo ∆CT (∆CTHIF-2αCAM, ∆CTVEGF-ΑCAM, y ∆CTFLK-1CAM)
(Schmittgen y Livak, 2008) antes de calcularse las medidas de tendencia central y de
dispersión. Para todas las variables se efectuó una prueba D'Agostino & Pearson
ómnibus para evaluar la normalidad en la distribución de dichas variables. Después cada
variable en las dos altitudes fueron comparadas entre sí por medio de la prueba t de
Student. Para el caso de las variables ∆CTs, fueron comparadas entre sí mediante la
prueba Pfaffl (Pfaffl, 2001), y dichos resultados fueron contrastados con el modelo 2∆∆CT (Livak y Schmittgen, 2001) y una prueba t de Student de los ∆CTs. En todo caso, la
116
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
significancia en la diferencia estadística es señalada en las gráficas mediante el uso de
asteriscos:
Diferencia estadística con p:≤ 0.05 *
Diferencia estadística con p:≤ 0.01 **
Diferencia estadística con p:≤ 0.001 ***
Diferencia estadística con p:≤ 0.0001 ****
Adicionalmente se analizó la variación y el efecto conjunto de la altitud de incubación y el
tiempo de incubación sobre las diferentes variables mediante análisis de varianza
(ANOVA). Asimismo, se realizó el análisis de correlación de Pearson de las diferentes
variables, y la regresión lineal para las variables con mayor correlación lineal.
Los resultados son expresados como la media, junto con el intervalo de confianza del
95% (IC) (du Prel y col., 2009). En el caso de las pruebas de diferencia se declara el
valor p, seguido del IC de dicha diferencia.
Los datos fueron recolectados en formatos diseñados en Excel.
El análisis de los datos se realizó con el programa GraphPad® Prism 5 (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA), y el programa de análisis de expresión relativa REST®
2009 (Pfaffl y col., 2009).
3.4 Resultados
3.4.1 Condiciones de incubación
En la Figura 3-11 se muestra que las condiciones de incubación en la incubadora en las
dos diferentes alturas (355msnm y 1378msnm) fueron las mismas: Tº bulbo seco (p:
0.7195. IC: -0.117 ; 0.167); y Humedad relativa (p: 0.3200. IC: -1.555 ; 0.531) (Figura
Figura 3-11A). De igual manera, las condiciones de incubación en el embrión: Tº
Capítulo 3
117
embrionaria (p: 0.7615. IC: -0.431 ; 0.581); y Humedad embrionaria, medida como la
pérdida de peso: (p: 0.9908. IC: -1.273 ; 1.289) también fueron las mismas (Figura 311B).
Figura 3-11: Condiciones de incubación del día 6 al 7 de embriones incubados a 355 y 1378msnm.
A.
Condiciones de la incubadora
Cuadro psicrométrico
B.
Condiciones del embrión
Tº incubadora (p: 0.7195)
Humedad relativa (p: 0.3200)
Diámetro del punto = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Valores de condiciones de incubación (media ± IC) de incubadora (A), y embrión (B); expresados como % de humedad relativa y temperatura en
°C (A), y como % de pérdida de peso embrionario y temperatura embrionaria en °C (B).
3.4.2 Peso de la CAM y del embrión
El PesoCAM el día 6 fue, a 355msnm: 0.305 gramos (0.279 ; 0.330), y a 1378msnm: 0.325
gramos (0.305 ; 0.345); y para el día 7 fue, a 355msnm: 0.936 gramos (0.886 ; 0.987), y a
1378msnm: 1.061 gramos (0.877 ; 1.244) (Figura 3-12A).
El PesoE el día 6 fue, a 355msnm: 0.486 gramos (0.451 ; 0.520), y a 1378msnm: 0.502
gramos (0.468 ; 0.537); y para el día 7 fue, a 355msnm: 1.096 gramos (1.033 ; 1.159), y a
1378msnm: 1.002 gramos (0.888 ; 1.116) (Figura 3-12B).
No se encontraró diferencia tanto en el PesoCAM: el día 6 (p: 0.1868. IC: -0.01 ; 0.051), o
el día 7 (p: 0.1804. IC: -0.057 ; 0.306); como en el PesoE: el día 6 (p: 0.4733. IC: -0.03 ;
0.063), o el día 7 (p: 0.1363. IC: -0.218 ; 0.03), a 355msnm y 1378msnm (Figura 3-12). Y
tanto el PesoCAM (p: 0.2685. IC: -0.087 ; 0.293), como el PesoE (p: 0.1024. IC: -0.243 ;
0.023) aumentaron de igual forma del día 6 al día 7 en las dos diferentes alturas (p:<
0.0001) (Figura 3-12).
El análisis de varianza mostró que el PesoCAM y el PesoE están aparentemente afectados
principalmente por el tiempo de incubación en un 79.44 % (p:< 0.0001) en el primer caso,
y en un 82.96 % en el segundo; y no por la altitud de incubación, con un r2: 0.0089 (p:
0.1136) en el primer caso, y un r2: 0.0040 (p: 0.2380) en el segundo (Tabla 3-2).
0.356
0.094
3880
0.310
0.081
3300
0.068
2720
0.055
2140
0.264
120
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
0.218
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
0.172
0.042
expresión
de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
0.029
0.126
0.080
0.016
Día 3
(p: 0.2238)
1560
980
400
Día 4
(p: 0.1566)
Día 3
(p: 0.1362)
Día 4
(p: 0.1207)
Figura 3-12: Peso de la CAM y del embrión los días 6 y 7 de embriones
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
incubados
355
y IC1378msnm.
Barras dea
error
= 95%
A.
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor
Barras de error = 95% IC
Barra
B.
PesoCAM
gramos
1.980
1.798
PesoE
gram os
1.40
355msnm
1378msnm
1.28
1.616
1.16
1.434
1.04
1.252
0.92
1.070
0.80
0.888
0.68
0.706
0.56
0.524
0.44
0.342
0.32
355m snm
1378m snm
0.20
0.160
Día 6
(p: 0.1868)
Día 7
(p: 0.1804)
Día 6
(p: 0.4733)
Día 7
(p: 0.1363)
Valor mínimo, media y máximo representados.
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Barras de error = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Valores del peso de la corioalantoides (CAM) – PesoCAM (A), y del peso del embrión - PesoE (B)
(media ± IC) expresados en gramos, de pollos incubados a 355msnm y 1378msnm, el día 6 y 7 de
incubación.
Evaluación morfométrica.
El ACMCAM el día 6 fue, a 355msnm: 1322.513 mm2
(1117.603 ; 1527.424), y a 1378msnm: 1561.041 mm2 (1412.866 ; 1709.215); y para el
día 7 fue, a 355msnm: 3074.237 mm2 (2625.053 ; 3523.42), y a 1378msnm: 3665.452
mm2 (3076.927 ; 4253.977) (Figura 3-13A).
El AVMCAM el día 6 fue, a 355msnm: 52.390 mm2 (44.527 ; 60.253), y a 1378msnm:
61.589 mm2 (55.825 ; 67.352); y para el día 7 fue, a 355msnm: 97.566 mm2 (86.536 ;
108.596), y a 1378msnm: 112.547 mm2 (98.794 ; 126.301). (Figura 3-13B).
El %CapilarCAM el día 6 fue, a 355msnm: 90.427 % (89.486 ; 91.368), y a 1378msnm:
92.193 % (91.003 ; 93.384); y para el día 7 fue, a 355msnm: 91.444 % (90.133 ; 92.755),
y a 1378msnm: 93.116 % (91.61 ; 94.622). (Figura 3-13C).
El día 6 los valores del ACMCAM (p: 0.0537. IC: -2.981 ; 480.035), del AVMCAM (p: 0.0435.
IC: -0.112 ; 18.509), así como del %CapilarCAM (p: 0.0190. IC: (0.318 ; 3.216), fueron más
Capítulo 3
121
altos a 1378msnm que a 355msnm (Figura 3-13). Por otro lado, el día 7, los valores del
ACMCAM (p: 0.0986. IC: -115.872 ; 1298.303); del
AVMCAM (p: 0.0796.
IC: -1.857 ;
31.820), y del %CapilarCAM (p: 0.0835. IC: (-0.235 ; 3.579), no fueron estadísticamente
diferentes a 355msnm y a 1378msnm (Figura 36). Y tanto el ACMCAM (p: 0.3425. IC: 397.070 ; 1102.400), como el AVMCAM (p: 0.5433. IC: -13.490 ; 25.056) aumentaron de
igual forma del día 6 al día 7 en las dos alturas (p:< 0.0001) (Figura 3-13A y Figura 313B). En cambio %CapilarCAM no aumentó del día 6 al día 7, tanto a 355msnm (p: 0.1882.
IC: -0.524 ; 2.558), como a 1378msnm (p: 0.3119. IC: -0.911 ; 2.756) (Figura 3-13C).
Adicionalmente el análisis de varianza mostró que el ACMCAM y el AVMCAM están
afectados en gran medida por el tiempo de incubación, en un 64.28 % (p:< 0.0001) en el
primer caso, y en un 62.44 % (p:< 0.0001) en el segundo; y en menor medida por la
altitud de incubación con un r2: 0.0298 (p: 0.0268) en el primer caso, y un r2: 0.0395 (p:
0.0127) en el segundo. El ANOVA mostró además, que el %CapilarCAM se ve afectado
por la altitud de incubación, con un r2: 0.1283 (p: 0.0047), y no por el tiempo de
incubación, con un r2: 0.0408 (p: 0.1026) respectivamente (Tabla 3-2).
122
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-13: Evaluación morfométrica de la CAM los días 6 y 7 de embriones
incubados a 355 y 1378msnm.
Valores del área capilar media – ACMCAM (A), y del área vascular media – AVMCAM (B) de la CAM
(media ± IC) expresados en mm2, de pollos incubados a 355msnm y 1378msnm, el día 6 y 7 de
incubación. *p: 0.05 (Si hubo diferencia estadística).
76
73
Capítulo 3
123
70
Día 3
(p: 0.0165)
Día 4
(p: 0.0309)
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Figura 3-13: (Continuación).
Barras de error = 95% IC
C.
%CapilarCAM
100
97
*
94
91
88
85
82
79
76
73
70
Día 6
(p: 0.0190)
355m snm
Día 7
(p: 0.0835)
1378m snm
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Barras de error = 95% IC
Valores del % capilar - %CapilarCAM (C) de la CAM (media ± IC), de pollos incubados a 355msnm
y 1378msnm, el día 6 y 7 de incubación. *p:< 0.05.
3.4.3 Descripción.
3.4.3.1 Histológica. En los cortes coloreados con hematoxilina-eosina (Figura 3-14)
se observa la CAM compuesta por el endodermo (en), el mesénquima (me), y el corion
justamente encima de una rica red de capilares (ca).
124
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-14: Descripción histológica del CAM.
B.
A.
vs
vs
Objetivo 10X. CAM.
Objetivo 20X. SV. Vaso sanguíneo (vs)
C.
vs
me
ca
en
Objetivo 40X. SV. Endodermo (en). Mesenquima (me). Capilar (ca) justamente debajo del Corion.
3.4.3.2 Inmunohistoquímica. La tinción IHC del anticuerpo anti HIF-2α (Figura 3-15)
se observó en el núcleo (n) y citoplasma (c) del: endodermo, mesénquima (me), el
endotelio (e) y el ectodermo (ec). La tinción IHC del anticuerpo anti VEGF-A (Figura 3-16)
se observó en la membrana nuclear (mn), citoplasma (c) y la membrana plasmática (mp)
del: endodermo (en), el mesodermo (me), el endotelio (e) y el ectodermo (ec). La tinción
Capítulo 3
125
IHC del anticuerpo anti FLK-1 (Figura 3-17) se observó en la membrana de las células
mesenquimales (me) y de las células endoteliales (e).
Figura 3-15: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti HIF-2α en la CAM.
A.
B.
n (me)
en
me
e
vs
n (e)
C.
n (ec)
ec
Inmunohistoquímica de la CAM con el anticuerpo anti HIF-2α (A), Control positivo: adenocarcinoma de colon (B), y Control negativo: CAM sin
anticuerpo primario (C). en: endodermo. me: mesodermo. vs: vaso sanguíneo. ec: ectodermo. n(me): núcleo de célula mesenquimal. n(e): núcleo
de célula endotelial. n(ec): núcleo de célula ectodermal.
Capítulo 3
127
Figura 3-16: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti VEGF-A en la CAM.
A.
B.
c (ec)
c (e)
vs
me
C.
c (en)
en
Inmunohistoquímica de la CAM con el anticuerpo anti VEGF-A (A), Control positivo: adenocarcinoma de colon (B), y Control negativo: CAM sin
anticuerpo primario (C). en: endodermo. me: mesodermo. vs: vaso sanguíneo. c(en): citoplasma de célula endodermal. c(e): citoplasma de célula
endotelial. c(ec): citoplasma de célula ectodermal.
128
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-17: Localización de la tinción IHC con el anticuerpo anti FLK-1 en la CAM.
A.
B.
en
me
C.
e
vs
Inmunohistoquímica de la CAM con el anticuerpo anti FLK-1 (A), Control positivo: adenocarcinoma de colon (B), y Control negativo: CAM sin
anticuerpo primario (C). en: endodermo. me: mesodermo. mv: e: endotelio.
Capítulo 3
129
3.4.4 Cuantificación de la inmunoexpresión
El %Cel.HIF-2αCAM el día 6 fue, a 355msnm: 90.431 % (89.432 ; 91.429), y a 1378msnm:
93.960 % (90.773 ; 97.147); y para el día 7 fue, a 355msnm: 92.455 % (88.993 ; 95.917),
y a 1378msnm: 94.148 % (90.859 ; 97.437) (Figura 3-18A).
El %Cel.VEGF-ACAM el día 6 fue, a 355msnm: 89.867 % (83.802 ; 95.931), y a 1378msnm:
95.984 % (93.542 ; 98.426); y para el día 7 fue, a 355msnm: 96.220 % (92.518 ; 99.922),
y a 1378msnm: 96.660 % (93.943 ; 99.377) (Figura 3-18B).
El %Cel.FLK-1CAM el día 6 fue, a 355msnm: 92.876 % (89.643 ; 96.109), y a 1378msnm:
96.364 % (94.949 ; 97.779); y para el día 7 fue, a 355msnm: 94.824 % (92.443 ; 97.205),
y a 1378msnm: 96.444 % (95.618 ; 97.27) (Figura 3-18C).
El día 6, los valores del %Cel.HIF-2αCAM: (p: 0.0370. IC: 0.339 ; 6.719), y del %Cel.FLK1CAM: (p: 0.0443. IC: 0.118 ; 6.858) fueron más altos a 1378msnm que a 355msnm (Figura
3-18). En cambio el día 7, los valores del %Cel.HIF-2αCAM: (p: 0.4533 IC: -2.867 ; 6.254);
del %Cel.VEGF-ACAM: (p: 0.8388. IC: -3.946 ; 4.826), así como del %Cel.FLK-1CAM: (p:
0.1856. IC: (-0.787 ; 4.027) no tuvieron diferencias.
Y dichos valores no difirieron del día 6 al día 7 en ninguna de las dos alturas (Figura 318): el %Cel.HIF-2αCAM: a 355msnm (p: 0.2455. IC: -1.417 ; 5.465), o a 1378msnm (p:
0.9305. IC: -4.186 ; 4.562); el %Cel.VEGF-ACAM: a 355msnm (p: 0.0675. IC: -0.433 ;
13.139), o a 1378msnm (p: 0.6945. IC: -2.813 ; 4.165); y el %Cel.FLK-1CAM: a 355msnm
(p: 0.3077. IC: -1.887 ; 5.783), o a 1378msnm (p: 0.9175. IC: -1.485 ; 1.645).
Además, el análisis de varianza mostró que el %Cel.HIF-2αCAM, el %Cel.VEGF-ACAM, y el
%Cel.FLK-1CAM, están aparentemente afectados de manera similar por la altitud de
incubación en un 6.08 % (p: 0.0597), 4.77 % (p: 0.0838), y 9.93 % (p: 0.0144)
respectivamente; y no por el tiempo de incubación: r2: 0.0109 (p: 0.4190), r2: 0.0548 (p:
0.0643), r2: 0.0157 (p: 0.3202) (Tabla 3-2).
91
91
91
88
88
88
85
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
85
85
82
82
79
79
130
82
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
79
expresión
de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
76
76
73
73
73
Figura
3-18: % de células expresando HIF-2α,
VEGF-A y, FLK-1 en la CAM de
70
70
Día 3
(p: 0.0605)
355m snm
Día 4
(p: 0.0486)
1378m snm
Día 3
(p: 0.0492)
355m snm
embriones incubados a 355 y 1378msnm
Día 4
(p: 0.0566)
1378m snm
70
(
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ín
Barras de error = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Barras de
A.
B.
%Cel.HIF-2αCAM
100
76
*
%Cel.VEGF-ACAM
100
97
97
94
94
91
91
88
88
85
85
82
82
79
79
76
76
73
73
70
70
Día 6
(p: 0.0370)
355m snm
Día 7
(p: 0.4533)
1378m snm
Día 6
(p: 0.0597)
355m snm
Día 7
(p: 0.8388)
1378m snm
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Valor m ínim o, m edia y m áxim o representados.
Barras de error = 95% IC
Barras de error = 95% IC
Capítulo 3
131
Valores del % de células HIF-2α positivas - %Cel.HIF-2αSV (A), del % de células VEGF-A positivas
- %Cel.VEGF-ASV (B), y del % de células FLK-1 positivas - %Cel.FLK-1SV (C) en la CAM (media ±
IC), de pollos incubados a 355msnm y 1378msnm, el día 6 y 7 de incubación. *p:< 0.05.
3.4.5 Cuantificación de la expresión del mRNA (qPCR)
La expresión relativa del HIF-2α el día 6 fue, a 1378msnm: 4.122 veces (p: 0.0449. IC:
0.988 ; 17.201) su expresión a 355msnm (Figura 3-19A); y para el día 7 fue, a 1378msnm:
1.284 veces (p: 0.6781. IC: 0.380 ; 4.339) su expresión a 355msnm (Figura 3-19C).
La expresión relativa del VEGF-A el día 6 fue, a 1378msnm: 3.169 veces (p: 0.0583. IC:
0.963 ; 10.432) su expresión a 355msnm (Figura 3-20A); y para el día 7 fue, a 1378msnm:
1.574 veces (p: 0.3757. IC: 0.565 ; 4.389) su expresión a 355msnm (Figura 3-20C).
La expresión relativa del FLK-1 el día 6 fue, a 1378msnm: 6.385 veces (p: 0.0043. IC:
1.909 ; 21.361) su expresión a 355msnm (Figura 3-21A); y para el día 7 fue, a 1378msnm:
2.214 veces (p: 0.1300. IC: 0.780 ; 6.286) su expresión a 355msnm (Figura 3-21C).
La expresión relativa del HIF-2α a 355msnm fue, el día 7: 0.965 veces (p: 0.9511. IC:
0.302 ; 3.089) su expresión al día 6 (Figura 3-19B); y a 1378msnm fue, para el día 7:
0.301veces (p: 0.1060. IC 0.069 ; 1.313) su expresión al día 6 (Figura 3-19D).
132
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
La expresión relativa del VEGF-A a 355msnm fue, el día 7: 0.713 veces (p: 0.5189. IC:
0.248 ; 2.047) su expresión al día 6 (Figura 3-20B); y a 1378msnm fue, para el día 7:
0.354 veces (p: 0.0798. IC: 0.11 ; 1.136) su expresión al día 6 (Figura 3-20D).
La expresión relativa del FLK-1 a 355msnm fue, el día 7: 0.8790 veces (p: 0.8307. IC:
0.259 ; 2.985) su expresión al día 6 (Figura 3-21B); y a 1378msnm fue, para el día 7:
0.305 veces (p: 0.0250. IC: 0.109 ; 0.850) su expresión al día 6 (Figura 3-21D).
Adicionalmente el análisis de varianza mostró que la expresión relativa de HIF-2α, de
VEGF-A, y del FLK-1 están afectados en buena medida, y de manera similar, por la altitud
de incubación: r2: 0.527 (p: 0.0743), r2: 0.0681 (p: 0.0408), r2: 0.1600 (p: 0.0012)
respectivamente; y no por el tiempo de incubación: r2: 0.0290 (p: 0.1826), r2: 0.0499 (p:
0.0783), r2: 0.0395 (p: 0.0965) (Tabla 3-2).
Capítulo 3
133
Figura 3-19: Expresión relativa del HIF-2α en la CAM el día 6 y 7 de incubación.
A.
C.
Expresión relativa
HIF-2
(Día 7)
Expresión relativa
HIF-2
(Día 6)
27
27
24
24
21
21
18
18
15
15
12
12
E.
9
6
Expresión relativa
HIF-2
(Día 6 - Día 7)
*
*
3
9
6
3
0
0
(p: 0.6781)
(p: 0.0449)
355msnm
1378msnm
Líneas = 95% IC
355msnm
1378msnm
Líneas = 95% IC
B.
D.
Expresión relativa
HIF-2
(355msnm)
Expresión relativa
HIF-2
(1378msnm)
27
27
24
Día 6
(p: 0.0449)
355msnm (p: 0.9511)
21
Día 7
(p: 0.6781)
1378msnm (p: 0.1060)
24
21
18
18
15
15
12
12
9
9
6
6
3
3
0
0
(p: 0.9511)
Día 6
Día 7
Líneas = 95% IC
(p: 0.1060)
Día 6
Día 7
Líneas = 95% IC
Valores del la expresión relativa del HIF-2α en la CAM (media ± IC), de embriones incubados a
1378msnm con respecto a embriones incubados a 355msnm, el día 6 (A) y el día 7 (B); y de
embriones incubados el día 7 con respecto a embriones incubados el día 6, a 355msnm (C) y
1378msnm (D). Figura (E) compilación de la expresión relativa tanto el día 6 como el día 7 a
355msnm y 1378msnm. *p: 0.05.
134
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 3-20: Expresión relativa del VEGF-A en la CAM el día 6 y 7 de incubación.
A.
C.
Expresión relativa
VEGF-A
(Día 6)
Expresión relativa
VEGF-A
(Día 7)
27
27
24
24
21
21
18
18
15
15
E.
12
12
9
9
Expresión relativa
VEGF-A
(Día 6 - Día 7)
6
6
3
3
0
0
(p: 0.0583)
(p: 0.3757)
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
B.
D.
Expresión relativa
VEGF-A
(355msnm)
Expresión relativa
VEGF-A
(1378msnm)
27
27
24
24
21
Día 6
(p: 0.0583)
355m snm (p: 0.5189)
18
Día 7
(p: 0.3757)
1378m snm (p: 0.0798)
21
18
15
15
12
12
9
9
6
6
3
3
0
0
(p: 0.5189)
Día 6
Día 7
Líneas = 95% IC
(p: 0.0798)
Día 6
Día 7
Líneas = 95% IC
Valores expresión relativa del VEGF-A en la CAM (media ± IC), de embriones incubados a
1378msnm con respecto a embriones incubados a 355msnm, el día 6 (A) y el día 7 (B); y de
embriones incubados el día 7 con respecto a embriones incubados el día 6, a 355msnm (C) y
1378msnm (D). En la figura (E) está compilada la expresión relativa tanto el día 6 como el día 7 a
355msnm y 1378msnm.
Capítulo 3
135
Figura 3-21: Expresión relativa del FLK-1 en la CAM el día 6 y 7 de incubación.
A.
C.
Expresión relativa
FLK-1
(Día 6)
Expresión relativa
FLK-1
(Día 7)
27
27
24
24
21
21
18
18
15
15
E.
Expresión relativa
FLK-1
(Día 6 - Día 7)
12
9
**
12
9
*
6
6
**
3
3
0
0
(p: 0.0043)
(p: 0.1300)
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
355m snm
1378m snm
Líneas = 95% IC
B.
D.
Expresión relativa
FLK-1
(355msnm)
Expresión relativa
FLK-1
(1378msnm)
27
27
24
24
21
Día 6
(p: 0.0043)
355m snm (p: 0.8307)
18
Día 7
(p: 0.1300)
1378m snm (p: 0.0250)
21
18
15
15
12
12
9
9
6
6
3
3
0
0
(p: 0.8307)
Día 6
Día 7
Líneas = 95% IC
*
(p: 0.0250)
Día 6
Día 7
Líneas = 95% IC
Valores expresión relativa del FLK-1 en la CAM (media ± IC), de embriones incubados a
1378msnm con respecto a embriones incubados a 355msnm, el día 6 (A) y el día 7 (B); y de
embriones incubados el día 7 con respecto a embriones incubados el día 6, a 355msnm (C) y
1378msnm (D). Figura (E) compila la expresión relativa tanto el día 6 como el día 7 a 355msnm y
1378msnm. *p:< 0.05 **p:< 0.01.
136
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Tabla 3-2: Analisis de Varianza (ANOVA).
Fuente de variación
gl
SC
CM
F
p
r2
PesoCAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
0,08
7,01
0,04
1,70
8,82
0,08
7,01
0,04
0,03
2,5840
231,4000
1,3300
0,1136
< 0.0001
0,2536
0,0089
0,7944
0,0046
PesoE
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
0,02
4,62
0,05
0,88
5,57
0,02
4,62
0,05
0,02
1,4230
293,7000
2,9010
0,2380
< 0.0001
0,0941
0,0040
0,8296
0,0082
ACMCAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
2582000,00
55760000,00
466500,00
27940000,00
86748500,00
2582000,00
55760000,00
466500,00
499000,00
5,1740
111,8000
0,9349
0,0268
< 0.0001
0,3378
0,0298
0,6428
0,0054
AVMCAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
2193,00
34660,00
125,40
18530,00
55508,40
2193,00
34660,00
125,40
330,90
6,6270
104,7000
0,3790
0,0127
< 0.0001
0,5406
0,0395
0,6244
0,0023
%CapilarCAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
44,34
14,11
0,03
287,00
345,48
44,34
14,11
0,03
5,13
8,6510
2,7530
0,0066
0,0047
0,1026
0,9358
0,1283
0,0408
0,0001
Análisis de varianza (ANOVA) del efecto conjunto de la altitud de incubación y el tiempo de
incubación sobre las diferentes variables.
Capítulo 3
137
Tabla 3-2: (Continuación).
2
Fuente de variación
gl
SC
CM
F
p
%Cel.HIF-2αCAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
102,30
18,35
12,64
1550,00
1683,29
102,30
18,35
12,64
27,68
3,6950
0,6629
0,4567
0,0597
0,4190
0,5020
0,0608
0,0109
0,0075
%Cel.VEGF-ACAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
161,20
185,30
120,90
2914,00
3381,40
161,20
185,30
120,90
52,03
3,0990
3,5610
2,3230
0,0838
0,0643
0,1331
0,0477
0,0548
0,0358
%Cel.FLK-1CAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
97,84
15,42
13,09
858,50
984,85
97,84
15,42
13,09
15,33
6,3830
1,0060
0,8536
0,0144
0,3202
0,3595
0,0993
0,0157
0,0133
∆CTHIF-2αCAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
21,67
11,94
10,62
367,00
411,23
21,67
11,94
10,62
6,55
3,3070
1,8210
1,6200
0,0743
0,1826
0,2084
0,0527
0,0290
0,0258
∆CTVEGF-ACAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
20,16
14,78
3,82
257,40
296,16
20,16
14,78
3,82
4,60
4,3870
3,2160
0,8311
0,0408
0,0783
0,3659
0,0681
0,0499
0,0129
∆CTFLK-1CAM
Altitud de incubación
Tiempo de incubación
Interacción
Residuo
Total
1
1
1
56
59
54,76
13,54
8,76
265,30
342,36
54,76
13,54
8,76
4,74
11,5600
2,8570
1,8480
0,0012
0,0965
0,1795
0,1600
0,0395
0,0256
r
Análisis de varianza (ANOVA) del efecto conjunto de la altitud de incubación y el tiempo de
incubación sobre las diferentes variables.
138
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
3.5 Discusión
3.5.1 Condiciones de incubación
El intercambio de gases (O2, CO2) y vapor de agua en el embrión aviar es dependiente, y
limitado por las propiedades de difusión de los gases a través de la resistencia dada por la
cáscara y la membrana de la cáscara (Wangensteen y Rahn, 1970/1971). Se ha mostrado
que bajo condiciones normales la difusión del vapor de agua a través de la cáscara del
huevo se aproxima a las ecuaciones establecidas para los gases ideales (Paganelli y col.,
1971) y que la pérdida de peso del huevo es casi enteramente debida a la difusión del
agua a través de la cáscara (Romanoff y Romanoff, 1949). De tal manera que la medida
de la pérdida de masa del huevo durante la incubación es un estimador para la pérdida
embrionaria de agua (Balemis y col., 2008). En términos generales, la mayoría de huevos
pierden cerca del 10% - 12% de agua durante la incubación (Ar y Rahn, 1980), y se sabe
que se presenta una menor incubabilidad cuando hay una variación de dicha pérdida de
agua. Los resultados de la medición de la pérdida de peso (una medida indirecta de la
pérdida de agua) de este estudio no mostró diferencia estadísticamente significativa en
dicha estimación en ambas alturas. Además, las condiciones de incubación (temperatura
y humedad) tampoco mostraron diferencia estadística, lo cual muestra que el principal
factor que varió en este estudio fue la PB debido a la altitud.
3.5.2 Peso de la CAM y del embrión
Existen varios mecanismos mediante los cuales las aves responden a la hipoxia después
del nacimiento; como por ejemplo, incrementando la ventilación pulmonar y el gasto
cardiaco, o mediante el control autonómico del flujo sanguíneo; no obstante, dichos
mecanismos son no funcionales, o su funcionalidad es mínima en la primera semana del
desarrollo embrionario (Burton y Smith, 1969; Asson-Batres y col., 1989). En corolario, la
principal respuesta para defenderse de la hipoxia en el embrión aviar es la disminución en
el peso corporal; confirmado en diferentes estudios donde se ha encontrado que la
hipoxia durante la incubación disminuye el crecimiento embrionario (Smith y col., 1969;
Capítulo 3
139
Metcalfe y col., 1981; McCutcheon y col., 1982; Adair y col., 1987; Stock y Metcalfe, 1987;
Xu y Mortola, 1989; Asson-Batres y col., 1989; Dzialowski y col., 2002; Azzam y col.,
2007), que se ve reflejado en una disminución en el peso corporal (Tazawa y col., 1971;
Wangensteen y col., 1974). Sin embargo, los resultados en la presente investigación, de
la medición del peso de los embriones de pollo incubados en la altitud, no mostró
diferencia estadísticamente significativa con respecto a los embriones incubados en
tierras bajas; aunque se ha reportado que el efecto de la hipoxia sobre los órganos
internos es heterogéneo (Mortola, 2001), entonces, faltaría ver si el nivel de hipoxia
(disponibilidad de O2 del 17.7%) a la cual fueron sometidos los embriones en el presente
estudio tiene algún efecto en el crecimiento particular de un órgano en específico. A
diferencia de todos los demás órganos, el peso de la CAM incrementa en respuesta a la
hipoxia (Strick y col., 1991; Burton y Palmer, 1992; Wagner-Amos y Seymour, 2003, Chan
y Burggren, 2005); y dicho efecto positivo de la hipoxia sobre la masa de la CAM,
probablemente mejora su capacidad de difusión del O2. Siendo así, tal efecto de la hipoxia
sobre la CAM, podría ser una reminiscencia de los cambios en la estructura de la placenta
vistos en los mamíferos durante la gestación hipóxica (Faridy y col., 1988; Monge y LeónVelarde, 1991). Los resultados de este estudio no mostraron diferencia estadísticamente
significativa en el PesoCAM, de los embriones incubados con una disponibilidad de O2 del
17.7%, con relación a los embriones incubados con una disponibilidad de O2 del 20%; no
obstante, debe tenerse en cuenta que tanto el estudio de Strick y colaboradores (1991),
como el de Burton y Palmer (1992), y el de Wagner-Amos y Seymour (2003), lo mismo
que el de Chan y Burggren (2005), los embriones fueron incubados con una disponibilidad
de O2 por debajo del 15%; lo que podría indicar que el porcentaje de disponibilidad de O2
del 17.7%, parece no tener un efecto en el Peso CAM, aunado al hecho de que dichos
estudios donde se reporta un aumento en el PesoCAM se efectuaron las mediciones
durante la segunda semana de incubación, teniendo en cuenta que la CAM alcanza su
máximo de consumo de O2 cerca del día 12 de incubación, tiempo en el cual el tamaño
embrionario es únicamente el 16% de su tamaño final (Ar y col., 1987), de tal manera que
la demanda de O2 por parte del embrión es baja, e incluso el consumo de O2 de la misma
CAM en el momento de mayor demanda de ésta, no llega a superar 24% de la del
embrión (Rahn y col., 1974).
140
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
3.5.3 Área capilar, área vascular media, y porcentaje capilar
Los estudios en los que se ha tratado de evaluar el efecto de la hipoxia en la
vascularización de la CAM, básicamente han producido tres tipos de resultados: 1) que la
hipoxia no tiene ningún efecto sobre la vascularización de la CAM (Burton y Palmer,
1992); 2) que la hipoxia actúa negativamente sobre la vascularización de la CAM
(Wagner-Amos y Seymour, 2003); y 3) que la hipoxia aumenta la vascularización de la
CAM (Dusseau y Hutchins, 1988, 1989; Strick y col., 1991). En 1988 y 1989, Dusseau y
Hutchins, estudiaron los efectos de la hipoxia en el número de vasos capilares en la CAM,
demostrando que los embriones incubados con disponibilidad de O2 del 15%
incrementaban la densidad vascular en la CAM. En la presente investigación, incubando
los embriones con una disponibilidad de de O2 del 17.7%, se encontró un aumento tanto
de la densidad vascular, del porcentaje capilar, como de la densidad capilar (AVMCAM,
%CapilarCAM, ACMCAM) el día 6 de incubación, pero no así el día 7 de incubación. Hay que
tener en cuenta con respecto a los estudios de Dusseau y Hutchins (1988), que en dichos
estudios se evaluó la vascularización de la CAM después del día 7 de incubación. La
investigación realizada por Strick y colaboradores (1991), donde se estudió el efecto de la
hipoxia en la vascularización de la CAM, mostró que la vascularización de dicha
membrana estaba inversamente relacionada a la disponibilidad de O2 en la cual los
embriones fueron incubados, concluyendo que la hipoxia estimula la vascularización de
una manera dosis dependiente. Dicha investigación también se realizó a partir del día 7
de incubación; sin embargo, los resultados de la presente investigación mostraron un
aumento de la densidad vascular - e incluso de la densidad capilar – únicamente el día 6
de incubación, pero no el día 7, contrastando con los resultados de Strick y colaboradores
(1991) donde se encontró un incremento de la densidad capilar en las condiciones de
hipoxia a partir del día 7 de incubación. Se debe mencionar adicionalmente, que puesto
que el ÁreaCAM no tuvo diferencia estadísticamente significativa el día 6 (p: 0.07),
mostrando que el diámetro de la CAM no incrementó en las condiciones de altitud, y por lo
tanto la extensión de los vasos dentro de la misma tampoco, se estima que el aumento en
la vascularización (representado por la diferencia estadística en el AVMCAM, el ACMCAM y
el %CapilarCAM) se debe a la ramificación de los vasos a través de la angiogénesis por
Capítulo 3
141
brote, como previamente lo reportaron otros investigadores (Schlatter y col., 1997) para
los días 5 a 7 de incubación.
3.5.4 Inmunoexpresión del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1
Corona y Warburton (2000) sugirieron que el incremento en la vascularización en la CAM
en respuesta a la incubación hipóxica, se debía posiblemente a la liberación de factores
angiogénicos localmente; y se sabe además, que la liberación de dichos factores
angiogénicos (y de otra gran variedad de respuestas a la hipoxia) son en gran medida
mediados por factores de transcripción inducibles por la hipoxia – HIF (Guillemin y
Krasnow, 1997); y a través de los HIF se regula la expresión de más de 60 genes entre
los que se encuentran el VEGF y su receptor FLK-1 (involucrados en el proceso de la
angiogénesis) (Koumenis y Maxwell, 2006). Precisamente en el 2006, Nanka y
colaboradores intentaron estudiar el efecto de la hipoxia en la expresión del HIF y del
factor angiogénico VEGF durante el desarrollo embrionario aviar; para lo cual incubaron
embriones de codorniz bajo condición de hipoxia (disponibilidad de O2 del 16%). En dicho
experimento, ellos evaluaron la expresión del HIF y del VEGF mediante hibridación in situ;
encontrando, que era posible ver regiones hipóxicas aún en las condiciones de incubación
normóxica; y que tanto el HIF como el VEGF se expresaban con mayor intensidad en
aquellas regiones hipóxicas (teñidas con Pimonidazole). De manera similar, en el
presente estudio se detectó tanto la expresión del HIF como del VEGF aún en
condiciones de normoxia (en los embriones incubados con disponibilidad de O2 del 20%);
no obstante, únicamente se encontró un aumento de la expresión del HIF (mediante la
cuantificación del número de células positivas a HIF en la IHC) el día 6 de incubación; y el
VEGF no mostró diferencia en el número de células positivas a dicho marcador, el día 6 o
7 de incubación. Entonces para constatar dichos resultados se realizó la cuantificación
relativa del mRNA de los genes HIF y VEGF, a través del uso de la PCR cuantitativa (qPCR).
3.5.4.1 Inmunoexpresión del HIF-2α. La expresión del HIF-2α en la CAM observada
mediante la técnica de IHC con el anticuerpo anti HIF-2α se vio en el mesodermo y
ectodermo, lo mismo que en el endotelio, indicando que dicho factor es de gran
142
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
importancia para normal desarrollo de las membranas extraembrionarias en las aves
(Favier y col., 1999; Nanka y col., 2006). Cabe resaltar, que puesto que la expresión de
dicho factor se observó no solo en el ectodermo, sino también en el mesodermo, existe la
posibilidad de que las células mesenquimales respondan de manera autocrina a su propia
expresión del HIF, para regular su diferenciación angioblástica; y de manera parecida,
puesto que la expresión de dicho factor fue detectada en el endotelio, éste podría también
auto regular su angiogénesis en una vía autocrina, y modular la migración (reclutamiento)
de nuevas células endoteliales en una vía paracrina (Tang y col., 2004).
3.5.4.2 Inmunoexpresión del VEGF-A.
La expresión del VEGF-A en la CAM
detectada mediante la técnica de IHC con el anticuerpo anti VEGF-A se observó en
células del endodermo, mesodermo, endotelio y ectodermo. Y puesto que dichas capas
celulares en la CAM también expresaron el HIF-2α, se induce que la vasculogénesis y
angiogénesis en dicha membrana se regula no solamente de manera local en el
mesodermo, sino que también de manera más general a través de la respuesta y
generación de factores angiogénicos de las capas adyacentes (endodermo y ectodermo)
(Flamme y col., 1995a), y que respaldan los diferentes estudios que demuestran que tanto
el HIF como el VEGF llevan cabo sus funciones a través de vías autocrinas y paracrinas
(Nomura y col., 1995; Dias y col., 2001). Y aunque el día 6 se observó un mayor número
de células positivas a HIF-2α pero no a VEGF-A en los embriones incubados bajo
condiciones de hipoxia, no obstante, hubo una correlación positiva entre el porcentaje de
células que expresaron HIF-2α, y el porcentaje de células que expresaron VEGF-A (pero
con coeficientes de determinación r2 bajos). Dicha correlación también fue observada para
el día 7 de incubación, lo que parece mostrar que la expresión del VEGF-A está asociada
a la expresión del HIF-2α en la CAM.
3.5.4.3 Inmunoexpresión del FLK-1. La expresión del FLK-1 en la CAM observada
mediante la técnica de IHC con el anticuerpo anti VEGF-A se detectó en la membrana de
las células endoteliales y en las células mesenquimales. Esto coincide con lo reportado
desde hace mucho de que el FLK-1 es un marcador de la línea endotelial (Yamaguchi y
col., 1993). Sin embargo, solo se encontró un mayor número de células positivas a FLK-1
Capítulo 3
143
en los embriones incubados en la altitud el día 6 pero no el día 7, lo que en un principio
parecía indicar que las células responden en mayor proporción en respuesta al HIF-2α
que al VEGF-A (puesto que hubo también un aumento en el número de células positivas
al primer marcador pero no al segundo) después fue confirmado al realizarse la
cuantificación relativa de la expresión del mRNA de dichos genes.
De manera similar a lo visto con el VEGF-A, se encontró también una correlación positiva
entre el porcentaje de células que expresaron HIF-2α, las que expresaron VEGF-A, y el
porcentaje de células que expresaron FLK-1, lo que se relaciona muy bien con los
estudios en los que se ha visto que tanto el HIF-2α como el VEGF-A son moduladores de
la expresión del FLK-1 (Elvert y col., 2003; Hervé y col., 2006).
3.5.5 Expresión relativa del HIF-2α, VEGF-A y su receptor FLK-1
Al analizar los resultados de la IHC, mediante la cuantificación de las células que
expresaron los marcadores HIF-2α, VEGF-A y FLK-1, se encontró que existía una
correlación entre el número de células que expresaban cada marcador, sin embargo, no
se pudo constatar de manera verosímil dicho hallazgo puesto que hubo un aumento en el
número de células positivas a HIF-2α y a FLK-1, pero no a VEGF-A. De manera tal, que
se decidió realizar la cuantificación relativa de sus respectivos mRNAs, para verificar
dicha cuestión. En dicha cuantificación relativa de la expresión, se encontró que
definitivamente el aumento en la expresión del HIF-2 α, no coincide con un aumento en la
expresión del VEGF-A, pero si del FLK-1.
Lo que más llama la atención de éstos resultados, es que se presente un ambiente
hipóxico (reflejado indirectamente por la expresión del HIF-2α) en la CAM el día 6, pero no
el 7 de incubación, en los embriones incubados en la altitud, reflejando esto quizás, que la
vascularización en la membrana de la CAM y la demanda metabólica tanto del embrión
como de la misma CAM para el día 7 de incubación crean unas condiciones de
oxigenación en dicha membrana, que son parecidas en ambas altitudes; o por otro lado,
lo que podría estar ocurriendo es que se esté comenzando a presentar una mayor tasa
metabólica en los embriones incubados a 355msnm, o de manera contraria, una menor
144
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y en la
expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
tasa metabólica en los embriones incubados a 1378msnm, que en estadios posteriores
del desarrollo (después de la primera semana del desarrollo) se reflejaría en una
disminución de la masa corporal observada en embriones incubados en condiciones de
hipoxia (Smith y col., 1969; Tazawa y col., 1971; Wangensteen y col., 1974; Metcalfe y
col., 1981; McCutcheon y col., 1982; Adair y col., 1987; Stock y Metcalfe, 1987; Xu y
Mortola, 1989; Asson-Batres y col., 1989; Dzialowski y col., 2002; Azzam y col., 2007).
En todo caso, en el presente estudio se encontró una buena correlación entre la expresión
relativa del mRNA de los genes HIF-2α, VEGF-A, y el FLK-1. Lo que sigue siendo
consistente con lo encontrado desde hace mucho tiempo de que un aumento en la
expresión del HIF conduce a su vez a un incremento en la expresión tanto del VEGF y su
receptor FLK (Elvert y col., 2003; Hervé y col., 2006; Kulshreshtha y col., 2007).
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Discusión general y conclusiones
En el embrión aviar las membranas extraembrionarias vascularizadas incluyen al SV y la
CAM. Se sabe que la vascularización está bajo el control de factores de crecimiento
polipeptídicos y sus receptores. Para el caso de esta investigación, a partir de anteriores
publicaciones y del presente estudio, se intentó describir como el HIF-2α, el VEGF-A y su
receptor FLK-1, se expresan en las diferentes capas germinativas a través el desarrollo
vascular del SV y la CAM durante la primera semana de incubación, y como podría
efectuarse la modulación entre dichas capas celulares en respuesta a la hipoxia:
4.1.1 Modelo de expresión del HIF-2α, VEGF-A y FLK-1 en el SV
Se conoce, que tanto el VEGF-A como el FLK-1, están presentes en el blastodisco
(embrión temprano) aviar, aún desde antes del comienzo de la incubación, y que son
sobreexpresados durante la gastrulación embrionaria al día 1 (Flamme y col., 1995a). Se
ha reportado que el VEGF-A para el día 2 de incubación se expresa de manera ubicua en
las diferentes capas que conforman el SV (pero en su región vascularizada). Para el caso
del FLK-1 los datos de la expresión del mRNA demuestran que para el día 1, inicialmente
éste se presenta en todo el mesodermo, y luego se restringe únicamente a las células
endoteliales (Flamme y col., 1995a). Sin embargo, la posterior expresión del VEGF-A y
su receptor FLK-1 en el SV no fue investigada, hasta que en el 2001, Nico y
colaboradores reportaron el patrón de expresión para dichas moléculas en el SV al día 6
de incubación. Por lo tanto, el presente estudio aporta más datos a la secuencia en la
expresión del VEGF-A y FLK-1 (los días 3 y 4 de incubación), en el que se encontró
mediante la técnica de IHC, que el VEGF-A se expresa en las células del endodermo,
146
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
endotelio y del ectodermo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que de acuerdo con lo
reportado por Nico y colaboradores (2001), para el día 6 de incubación únicamente
células del endodermo y mesodermo son positivas a la expresión de VEGF-A en el SV.
Adicionalmente el presente estudio demuestra que durante los días 3 y 4, el receptor de
dicho factor, el FLK-1, restringe su expresión al mesodermo endotelial. No obstante, que
Nico y colaboradores, reportaron que el día 6, la expresión del FLK-1 se puede observar
también en células del ectodermo del SV. Entoces, no queda claro si el VEGF-A y su
receptor FLK-1 continúan o no expresándose en las células del ectodermo el día 6 de
incubación, y es aún más incierto si la presencia del ectodermo es necesaria para el
adecuado desarrollo vascular, o si en el caso del FLK-1, éste media efectos no
endoteliales durante la organogénesis. Lo que si continua siendo claro, es que durante el
desarrollo del sistema vascular, las células endodermales al expresar VEGF-A
promueven la vasculogénesis y angiogénesis de la capa contigua al estimular
directamente a las células del mesodermo (las cuales expresan FLK-1) y del endotelio.
De otro lado, falta ver si el ectodermo media algún efecto sobre el desarrollo vascular a
través del VEGF-A, o si las otras dos capas median algún efecto particular sobre el
ectodermo vía del FLK-1; o de otra manera, si algunas de las condiciones de la presente
investigación influyeron en la regulación diferencial del VEGF-A y su receptor FLK-1 en el
ectodermo. Adicionalmente, con respecto a la expresión del HIF-2α, Favier y
colaboradores (1999) encontraron, que éste se expresaba en el área extraembrionaria
donde se localizaba principalmente en la capa ectodérmica. Sin embargo, en otro trabajo,
Elvert y colaboradores (1999) vieron que el mRNA del HIF-2α se podía detectar en todas
las tres capas germinativas (endodermo, mesodermo, ectodermo) en el embrión aviar a
partir del día 1 (estado embrionario de surco primitivo); y ya que como se mencionó
anteriormente el endodermo es considerado la principal fuente de VEGF-A durante la
vasculogénesis, la expresión del HIF-2α en dicha capa germinativa, podría ser relevante
para la expresión del VEGF-A; y como lo muestra el análisis de regresión lineal de este
estudio (Figura 4-1 y Figura 4-2), también para la expresión del FLK-1. De tal manera que
los datos del presente trabajo, ponen de manifiesto y dan soporte a la compleja
interrelación de las tres capas germinativas durante el desarrollo de la vascularización del
SV. Debe anotarse, que aunque se sabe (y como lo confirmó la presente investigación) el
HIF-2α se encuentra presente en el endotelio post-circulación, ninguna expresión de
dicho factor se detecta durante el desarrollo pre-circulatorio (las células de los islotes
Conclusiones
147
sanguíneos están desprovistas de dicha expresión antes de que se establezca el arco
circulatorio entre el embrión y el SV) (Ota y col., 2007); más aún, cuando los embriones
son sometidos a hipoxia antes del día 2 (estado HH9-HH10) las células endoteliales no
responden y permanecen negativas a la expresión de HIF-2α. Es así como el presente
estudio, también aporta información adicional en el esquema de la secuencia de
expresión del HIF-2α, demostrando que las células endoteliales en el SV en el día 3 de
incubación ya expresan el HIF-2α; sin embargo, no es posible asegurar si dichas células
responden o no a la hipoxia sobreregulando la expresión del HIF-2α. Lo que si es
definitivo, es que las otras dos capas (endodermo y ectodermo) responderían a la
hipoxia, sobreexpresando VEGF-A en el endodermo - y el ectodermo, en el caso de
esclarecerse la controversia dada por el estudio de Nico y colaboradores (2001); y dicha
sobreexpresión del VEGF-A por parte de las células endodermales promovería la
vasculogénesis y angiogénesis al unirse a su receptor FLK-1 en las células
mesodérmicas y endoteliales. En la presente investigación se da soporte a tal modelo
mediante el analisis de regresión lineal de la expresión del mRNA del FLK-1 con respecto
a la expresión del mRNA del VEGF-A, y este último con respecto a la expresión del
mRNA del HIF-2α (Figura 4-1 a Figura 4-3); no obstante, falta ver en qué grado responde
cada capa epitelial y el endotelio, tanto a la hipoxia, como a los diferentes factores (HIF2α y VEGF-A).
Del presente trabajo se concluye que el nivel de hipoxia (dada por la altura: 1378msnm) a
la cual fueron sometidos los embriones en esta investigación si afecta la expresión tanto
del HIF-2α, como del VEGF-A y de su receptor FLK-1 en el SV, el día 3 y 4 de
incubación. Además, que dicho cambio en la expresión se refleja en un aumento en la
vascularización del SV (expresado como AVMSV y %CapilarSV). Finalmente, que la
hipoxia a la cual fueron sometidos los embriones, no afecta el peso embrionario (aunque
no sabemos si el desarrollo de los órganos por separado lo es), bien sea porque dicho
nivel de hipoxia no fue lo bastante severo para producir hipometabolismo, o bien, porque
el aumento en la vascularización fue suficiente para contrarrestar la hipoxia. Debe
decirse sin embargo, que hubo un mayor porcentaje de mortalidad en los días 3 y 4 de
los embriones incubados a 1378msnm (datos no publicados).
148
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
4.1.2 Modelo de expresión del HIF-2α, VEGF-A y FLK-1 en la CAM
Por otro lado, desde que se introdujo el modelo de la CAM por Folkman en 1974, ésta ha
sido usada para evaluar los efectos de factores angiogénicos in vivo. En un principio, los
factores de crecimiento se aplicaban a CAMs de embriones de 7 a 9 días de incubación.
Posteriormente en los ensayos se utilizó la CAM de embriones de 9 a 10 días de
desarrollo (Folkman, 1985); con el tiempo se realizaron modificaciones a tal modelo de la
CAM, y los factores de crecimiento empezaron a aplicarse a CAMs de embriones
alrededor de los 13 días de incubación (Wilting y col., 1991). A pesar de todos los
trabajos que se han realizado con la CAM, únicamente unos pocos se han enfocado a
describir la expresión endógena de los factores de crecimiento, tal como el VEGF-A y su
receptor FLK-1; a pesar de haberse encontrado, que de todos los factores de crecimiento
estudiados, el VEGF-A es el único factor que induce angiogénesis en la CAM
diferenciada (Wilting y col., 1991, 1992, 1993). De estos resultados se pretendió que el
VEGF-A se unía y activaba su receptor FLK-1 durante la temprana angiogénesis en la
CAM (Wilting y col., 1996); expectativa que fue confirmada posteriormente por DeFouw y
DeFouw en el año 2000, quienes encontraron que la vía de señalización VEGF-A/FLK-1
estaba presente en la CAM al día 5 de incubación. Además de la anterior investigación,
el único estudio publicado acerca del patrón de expresión del VEGF-A y su receptor FLK1 es el de Ribatti y colaboradores en el 2002, quienes por medio de hibridación in situ,
describen la expresión del VEGF y el VEGFR2 (FLK-1) en la vasculatura de la CAM entre
el día 12 y 15 de incubación. Entonces, el presente trabajo aporta información nueva
acerca del patrón de expresión del VEGF-A y su receptor FLK-1 en la CAM los días 6 y 7
de incubación. En el presente estudio se encontró que el VEGF-A era expresado por
células del endodermo, mesodermo, endotelio y ectodermo; mientras que la expresión
del FLK-1 fue observada únicamente en células mesenquimales y endoteliales;
contrastando con los resultados encontrados en la investigación de Ribatti y
colaboradores (2002), ya que ellos observaron la expresión del VEGF en el ectodermo, y
la expresión del FLK-1 tanto en el ectodermo como en las células endoteliales; no
obstante, debe tenerse en cuenta que dicho trabajo fue realizado hacia el final de la
segunda semana de incubación, cuando se estima ha finalizado la angiogénesis por
estimulación endógena en la CAM (Wilting y col., 1992), mientras que la presente
investigación se realizó hacia el final de la primera semana de incubación cuando la
Conclusiones
149
angiogénesis es activa. Estos resultados plantean nuevas perspectivas en cuanto a lo
que podría ser la secuencia en el patrón de expresión del VEGF-A y su receptor FLK-1
en la CAM, lo mismo que en la regulación de la angiogénesis en el mesodermo por parte
de la capa endodérmica y ectodérmica. Dichos resultados manifiestán de nuevo la
importancia del endodermo para la vasculogénesis y angiogénesis en el mesodermo,
como lo que se ha planteado ocurre en el SV. Entonces, siguiendo lo reportado por
DeFouw y DeFouw (2000), en cuyo estudio se demostró que hay expresión tanto del
VEGF-A como del FLK-1 en la CAM al día 5 de incubación, y el estudio anterior de Rizzo
y colaboradores (1995b) en donde se encontró que la microvasculatura de la CAM se
establecía durante los días 4-5, se plantea entonces que durante ésta fase inicial de
establecimiento de la vascularización de la CAM (vasculogénesis) la vía de señalización
VEGF-A/FLK-1 jugaría un papel clave, tal como lo visto en el SV. A partir del día 5 de
incubación continuaría un extenso crecimiento de la red vascular establecida,
esencialmente por medio de la angiogénesis por brote, y en dicha fase al parecer la vía
de señalización VEGF-A/FLK-1 funcionaria apenas basalmente según lo reportado por
Javerzat y colaboradores (2009) en cuyo análisis de significancia de los microarreglos
(SAM) la regulación del VEGF-A no fue significante; sin embargo, debe anotarse que de
acuerdo con lo observado en el presente estudio la expresión del FLK-1 está
estrechamente asociada a la expresión del VEGF-A como lo muestra el análisis de
regresión lineal de la expresión del mRNA del primero con respecto a la expresión del
mRNA del segundo (Figura 4-6). El que no haya habido un cambio importante en la
regulación del VEGF-A en la CAM durante los días 5-7 de incubación en el estudio de
Javerzat y colaboradores (2009) está de acuerdo con la presente investigación, en la cual
mediante q-PCR tampoco se encontró un cambio en la regulación en la expresión tanto
para el VEGF-A como para el FLK-1 del día 6 al día 7 de incubación. Por otro lado, en el
presente estudio se encontró que el HIF-2α se expresa en células del endodermo, el
mesodermo, el endotelio y del ectodermo, contrastando con lo visto por Javerzat y
colaboradores (2009), quienes por medio de hibridación in situ observaron una intensa
expresión del HIF-2α al día 4 de incubación únicamente en el endotelio vascular,
entonces habría que ver si en esta fase inicial del desarrollo de la CAM, el HIF-2α
únicamente se expresa en el endotelio vascular, y después ocurre su expresión por parte
de células presentes en el endodermo y ectodermo, como lo sucedido en el presente
estudio; de tal manera que lo que podría pasar es que durante la primera etapa del
desarrollo de la CAM las células endoteliales que se empiezan a diferenciar del
150
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
mesénquima de la CAM comienzan a expresar el HIF-2α, auto regulándose de manera
autocrina, y poco después las células del endodermo y ectodermo regularían la
vasculogénesis y angiogénesis en el mesodermo en forma paracrina, como lo demuestra
el análisis de regresión lineal de la expresión del mRNA del VEGF-A y del FLK-1 con
respecto a la expresión del mRNA del HIF-2α (Figura 4-4 y Figura 4-5). Se debe resaltar
el hecho de que en el estudio de Javerzat y colaboradores (2009), únicamente se
encontró sobreregulación del HIF-2α a partir del día 7 de incubación, tal como lo
observado en la presente investigación, en donde no se vió un cambio en la regulación
del HIF-2α del día 6 al 7 de incubación en la CAM de embriones de pollo incubados a
355msnm. Es importante además, mencionar que aunque no hay un cambio en la
regulación de la expresión del HIF-2α del día 6 al día 7, si existe una sobreregulación en
la expresión del HIF-2α en la CAM de embriones incubados a 1378msnm con respecto a
los embriones incubados a 355msnm, pero solamente el día 6 de incubación, y no el día
7; lo que hace pensar que posiblemente, las condiciones de oxigenación de la CAM al
día 7, son lo suficientemente adecuadas para mantener las demandas metabólicas de las
células en la CAM y al interior del embrión, como lo hace notar la disminución en la
expresión relativa del FLK-1 en la CAM el día 7 con respecto al día 6 en los embriones
incubados a 1378msnm (Figura 44), mostrando con ello una disminución en la
proliferación celular endotelial en la CAM en los embriones incubados en dicha altura,
para el día 7 de incubación; o desde otro punto de vista, lo que podría estar pasando es
que para este momento (día 7) se haya comenzado a presentar hipometabolismo
embrionario, lo que reduce las demandas por el oxígeno, y que posteriormente se ve
reflejado en una diferencia en el peso al nacimiento de los pollos incubados a 1378msnm
(datos no publicados).
Es así como la presente investigación aporta importante información acerca del patrón de
expresión del HIF-2α, el VEGF-A y de su receptor FLK-1 en la CAM, del día 6 al 7 de
incubación, además configura una posible interrelación entre las diferentes capas
celulares de la CAM durante la vasculogénesis y angiogénesis de dicha membrana en
condiciones de normoxia e hipoxia hipobárica. Además se muestra que el día 7 de
incubación del embrión del pollo, es un tiempo de transición muy importante durante el
desarrollo de la CAM, ya que después de éste día se empieza a producir la angiogénesis
intususceptiva, un proceso mediante el cual se expande notablemente la la red vascular,
Conclusiones
151
y se originan varias generaciones de arterias y venas de los plexos capilares primarios
(Ausprunk y col., 1974; Djonov y col., 2000) y comienzan a ser importantes otros genes
diferentes al VEGF-A y al FLK-1, e inicia la sobreregulación del HIF-2α (Javerzat y col.,
2001).
A partir de los resultados del presente estudio se puede concluir que el nivel de hipoxia
(dada por la altura: 1378msnm) a la cual fueron sometidos los embriones en esta
investigación afecta la expresión tanto del HIF-2α, como del FLK-1 en la CAM, de
manera parecida a lo ocurrido en el SV, el día 6 de incubación, pero no el 7. Además,
que dicho cambio en la expresión se refleja en un aumento en la vascularización de la
CAM (expresado como ACMSV, AVMSV y %CapilarSV) observado en el día 6 de
incubación. Y que la hipoxia a la cual fueron sometidos los embriones, no afecta el peso
de estos; aunque, se espera que a partir de este momento se inicie un retraso en el
crecimiento debido al hipometabolismo embrionario como lo reportado por algunos
investigadores en los embriones expuestos a hipoxia despues de la primera semana de
incubación (Smith y col., 1969; Tazawa y col., 1971; Wangensteen y col., 1974; Metcalfe
y col., 1981; McCutcheon y col., 1982; Adair y col., 1987; Stock y Metcalfe, 1987; Xu y
Mortola, 1989; Asson-Batres y col., 1989; Dzialowski y col., 2002; Azzam y col., 2007); y
como fue visto en la presente investigación, en la cual el peso al nacimiento de los pollos
de embriones incubados a 1378msnm fue menor con respecto a los pesos de los pollos
de embriones incubados a 355msnm (datos no publicados) .
152
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 4-1: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αSV - ∆CTVEGF-ASV
355msnm
(Día 3)
C.
355msnm
(Día 4)
25.0
22.0
24.3
21.5
23.6
21.0
22.9
20.5
CTVEGF-AS V
CTVEGF-AS V
A.
22.2
21.5
20.8
20.0
19.5
19.0
20.1
18.5
19.4
18.0
18.7
17.5
18.0
9.0
9.8
17.0
8.0
10.6 11.4 12.2 13.0 13.8 14.6 15.4 16.2 17.0
8.7
9.4
10.1 10.8 11.5 12.2 12.9 13.6 14.3 15.0
CTHIF-2 SV
CTVEGF-ASV = 11.71+±0.6799
1.163
(C±T0.09745
HIF-2 SV )
r 2: 0.6975
r 2: 0.7892
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
B.
1378msnm
(Día 3)
D.
1378msnm
(Día 4)
22.0
22.0
21.4
21.4
20.8
20.8
20.2
20.2
CTVEGF-AS V
CTVEGF-AS V
CTHIF-2 SV
CTVEGF-ASV = 10.02 +
± 0.8481
2.045
(C±T0.1549
HIF-2 SV )
19.6
19.0
18.4
19.6
19.0
18.4
17.8
17.8
17.2
17.2
16.6
16.6
16.0
9.0
9.5
10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0
16.0
7.0
7.9
8.8
CTHIF-2 SV
9.7
10.6 11.5 12.4 13.3 14.2 15.1 16.0
CTHIF-2 SV
CTVEGF-ASV = 8.785+ ±
0.9180
1.414
(C±THIF-2
0.1306SV )
CTVEGF-ASV = 11.39 +±0.6653
0.7145
(C±T0.07118
HIF-2 SV )
r 2: 0.7917
r 2: 0.8705
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
Regresión lineal del ∆CT de la expresión del VEGF-A con respecto al ∆CT de la expresión del HIF2α en el SV de embriones incubados hasta el día 3 de incubación, a 355msnm (A) y 1378msnm
(B); y hasta el día 4 de incubación, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
Conclusiones
153
Figura 4-2: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αSV - ∆CTFLK-1SV
355msnm
(Día 3)
C.
355msnm
(Día 4)
21.0
19.0
20.3
18.5
19.6
18.0
18.9
17.5
CTFLK-1S V
CTFLK-1S V
A.
18.2
17.5
16.8
17.0
16.5
16.0
16.1
15.5
15.4
15.0
14.7
14.5
14.0
9.0
9.8
14.0
8.0
10.6 11.4 12.2 13.0 13.8 14.6 15.4 16.2 17.0
8.7
9.4
10.1 10.8 11.5 12.2 12.9 13.6 14.3 15.0
CTHIF-2 SV
CTFLK-1SV = 8.260+ ±
0.6787
1.449
(C±T0.1214
HIF-2 SV )
r 2: 0.7439
r 2: 0.7062
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
B.
1378msnm
(Día 3)
D.
1378msnm
(Día 4)
18.0
18.0
17.4
17.3
16.8
16.6
16.2
15.9
CTFLK-1S V
CTFLK-1S V
CTHIF-2 SV
CTFLK-1SV = 5.894+ ±
0.9230
1.983
(C
±T0.1502
HIF-2 SV )
15.6
15.0
14.4
15.2
14.5
13.8
13.8
13.1
13.2
12.4
12.6
11.7
12.0
9.0
9.5
10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0
11.0
7.0
7.9
8.8
CTHIF-2 SV
9.7
10.6 11.5 12.4 13.3 14.2 15.1 16.0
CTHIF-2 SV
CTFLK-1SV = 5.478+ ±
0.8346
1.691
(C±T0.1562
HIF-2 SV )
CTFLK-1SV = 7.413
+ 0.6648
± 0.4094
(C±T0.04079
HIF-2 SV )
r 2: 0.6872
r 2: 0.9533
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
Regresión lineal del ∆CT de la expresión del FLK-1 con respecto al ∆CT de la expresión del HIF-2α
en el SV de embriones incubados hasta el día 3 de incubación, a 355msnm (A) y 1378msnm (B);
y hasta el día 4 de incubación, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
154
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 4-3: Regresión lineal: ∆CTVEGF-ASV - ∆CTFLK-1SV
355msnm
(Día 3)
C.
355msnm
(Día 4)
21.0
19.0
20.3
18.5
19.6
18.0
18.9
17.5
CTFLK-1S V
CTFLK-1S V
A.
18.2
17.5
16.8
17.0
16.5
16.0
16.1
15.5
15.4
15.0
14.7
14.5
14.0
18.0 18.7 19.4 20.1 20.8 21.5 22.2 22.9 23.6 24.3 25.0
14.0
17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0
CTVEGF-ASV
CTFLK-1SV = -0.1981
+ 0.8344
± 3.546
(C
±T0.1792
VEGF-ASV )
r 2: 0.6872
r 2: 0.6251
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
B.
1378msnm
(Día 3)
D.
1378msnm
(Día 4)
18.0
18.0
17.4
17.3
16.8
16.6
16.2
15.9
CTFLK-1S V
CTFLK-1S V
CTVEGF-ASV
CTFLK-1SV = -0.4729
+ 0.8736
± 3.464
(C±T0.1635
VEGF-ASV )
15.6
15.0
14.4
15.2
14.5
13.8
13.8
13.1
13.2
12.4
12.6
11.7
12.0
16.0 16.6 17.2 17.8 18.4 19.0 19.6 20.2 20.8 21.4 22.0
11.0
16.0 16.6 17.2 17.8 18.4 19.0 19.6 20.2 20.8 21.4 22.0
CTVEGF-ASV
CTVEGF-ASV
CTFLK-1SV = -0.3050
+ 0.7910
± 2.964
(C±T0.1585
VEGF-ASV )
CTFLK-1SV = -1.813
+ 0.8789
± 1.860
(C±T0.1035
VEGF-ASV )
r 2: 0.6572
r 2: 0.8472
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
Regresión lineal del ∆CT de la expresión del FLK-1 con respecto al ∆CT de la expresión del VEGFA en el SV de embriones incubados hasta el día 3 de incubación, a 355msnm (A) y 1378msnm
(B); y hasta el día 4 de incubación, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
Conclusiones
155
Figura 4-4: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αCAM - ∆CTVEGF-ACAM
C.
355msnm
(Día 6)
355msnm
(Día 7)
24
22.0
23
21.5
22
21.0
21
20.5
CTVEGF-ACAM
CTVEGF-ACAM
A.
20
19
18
20.0
19.5
19.0
17
18.5
16
18.0
15
17.5
17.0
8.0
14
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
8.7
9.4
10.1 10.8 11.5 12.2 12.9 13.6 14.3 15.0
CTHIF-2 CAM
CTHIF-2 CAM
CTVEGF-ACAM = 9.616
++0.8819
± 1.130
(C±T0.1095
HIF-2 CAM )
CTVEGF-ACAM = 12.47 +±0.6416
0.8618
(C±T0.08492
HIF-2 CAM )
r 2: 0.8332
r 2: 0.8145
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
1378msnm
(Día 6)
D.
1378msnm
(Día 7)
22.0
24.0
21.2
23.1
20.4
22.2
19.6
21.3
CTVEGF-ACAM
CTVEGF-ACAM
B.
18.8
18.0
17.2
20.4
19.5
18.6
16.4
17.7
15.6
16.8
14.8
15.9
14.0
5.0
6.1
7.2
8.3
9.4
10.5 11.6 12.7 13.8 14.9 16.0
15.0
6.0
7.1
8.2
CTHIF-2 CAM
9.3
10.4 11.5 12.6 13.7 14.8 15.9 17.0
CTHIF-2 CAM
CTVEGF-ACAM = 11.54 +±0.6573
0.4300
(C±T0.05134
HIF-2 CAM )
CTVEGF-ACAM = 10.11+±0.8420
0.7035
(C±THIF-2
0.06989
CAM )
r 2: 0.9265
r 2: 0.9178
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
Regresión lineal del ∆CT de la expresión del VEGF-A con respecto al ∆CT de la expresión del HIF2α en la CAM de embriones incubados hasta el día 6 de incubación, a 355msnm (A) y 1378msnm
(B); y hasta el día 7 de incubación, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
156
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
Figura 4-5: Regresión lineal: ∆CTHIF-2αCAM - ∆CTFLK-1CAM
A.
C.
355msnm
(Día 6)
355msnm
(Día 7)
21
21.6
20
20.8
19
20.0
CTFLK-1CAM
CTFLK-1CAM
18
17
16
15
19.2
18.4
17.6
16.8
14
16.0
13
15.2
12
14.4
11
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
8.0
15
8.7
9.4
10.1 10.8 11.5 12.2 12.9 13.6 14.3 15.0
CTHIF-2 CAM
CTHIF-2 CAM
CTFLK-1CAM = 6.300+ ±
0.9909
0.4450
(C±T0.04312
HIF-2 CAM )
CTFLK-1CAM = 5.453+1.089
± 1.265
(C
± 0.1247
THIF-2 CAM )
r 2: 0.9760
r 2: 0.8544
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
1378msnm
(Día 6)
D.
1378msnm
(Día 7)
19.0
21.0
18.2
20.2
17.4
19.4
16.6
18.6
CTFLK-1CAM
CTFLK-1CAM
B.
15.8
15.0
14.2
17.8
17.0
16.2
13.4
15.4
12.6
14.6
11.8
13.8
11.0
5.0
6.1
7.2
8.3
9.4
10.5 11.6 12.7 13.8 14.9 16.0
13.0
6.0
7.1
8.2
CTHIF-2 CAM
9.3
10.4 11.5 12.6 13.7 14.8 15.9 17.0
CTHIF-2 CAM
CTFLK-1CAM = 8.534+ ±
0.6273
0.4659
(C±T0.05562
HIF-2 CAM )
CTFLK-1CAM = 8.499+ ±
0.6958
0.6091
(C±T0.06051
HIF-2 CAM )
r 2: 0.9073
r 2: 0.9105
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
Regresión lineal del ∆CT de la expresión del FLK-1 con respecto al ∆CT de la expresión del HIF-2α
en la CAM de embriones incubados hasta el día 6 de incubación, a 355msnm (A) y 1378msnm
(B); y hasta el día 7 de incubación, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
Conclusiones
157
Figura 4-6: Regresión lineal: ∆CTVEGF-ACAM - ∆CTFLK-1CAM
C.
355msnm
(Día 6)
355msnm
(Día 7)
21
22.0
20
21.2
19
20.4
18
19.6
CTFLK-1CAM
CTFLK-1CAM
A.
17
16
15
18.8
18.0
17.2
14
16.4
13
15.6
12
14.8
11
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
14.0
17.0 17.5 18.0 18.5 19.0 19.5 20.0 20.5 21.0 21.5 22.0
24
CTVEGF-ACAM
CTVEGF-ACAM
CTFLK-1CAM = -0.6415
+ 0.9138
± 2.540
(C±TVEGF-A
0.1366 CAM )
CTFLK-1CAM = -10.29 +1.411
± 4.567
(C
± 0.2412
TVEGF-ACAM )
r 2: 0.7748
r 2: 0.7245
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
1378msnm
(Día 6)
D.
1378msnm
(Día 7)
19.0
21.0
18.2
20.2
17.4
19.4
16.6
18.6
CTFLK-1CAM
CTFLK-1CAM
B.
15.8
15.0
14.2
17.8
17.0
16.2
13.4
15.4
12.6
14.6
11.8
13.8
11.0
14.0 14.8 15.6 16.4 17.2 18.0 18.8 19.6 20.4 21.2 22.0
13.0
15.0 15.9 16.8 17.7 18.6 19.5 20.4 21.3 22.2 23.1 24.0
CTVEGF-ACAM
CTVEGF-ACAM
CTFLK-1CAM = -1.952+±0.9232
1.304
(C±T0.07740
VEGF-ACAM )
CTFLK-1CAM = 1.388+ ±
0.7583
1.720
(C±T0.09341
VEGF-ACAM )
r 2: 0.9163
r 2: 0.8352
Bandas de confianza de 95%
Bandas de confianza de 95%
Regresión lineal del ∆CT de la expresión del FLK-1 con respecto al ∆CT de la expresión del VEGFA en la CAM de embriones incubados hasta el día 6 de incubación, a 355msnm (A) y 1378msnm
(B); y hasta el día 7 de incubación, a 355msnm (C) y 1378msnm (D).
158
Posible efecto de dos presiones parciales de oxígeno en la vascularización
del saco vitelino y la alantoides de embriones de pollo (Gallus domesticus) y
en la expresión de VEGF y su receptor FLK-1 (KDR)
4.2 Recomendaciones
Los resultados de la presente investigación subrayan la importancia de continuar
estudiando la biología del desarrollo de la membrana del saco vitelino y de la
corioalantoides, enfocando los esfuerzos a esclarecer las posibles interrelaciones que se
llevan a cabo entre las diferentes capas germinativas dentro de dichas membranas, y
cómo es la secuencia en la aparición de las varias moléculas implicadas en el desarrollo
de los vasos sanguíneos. En este punto, valdría la pena examinar más a fondo estudios
como el de Javerzat y colaboradores (2009) en los que se exponen la complejidad de la
regulación génica en el desarrollo de la vascularización, y en los que se nombran una
nueva serie de genes que podrían estar implicados en el proceso de la vasculogénesis y
angiogénesis en diferentes momentos a través del tiempo durante la formación de la
intrincada red de vasos sanguíneos en las membranas extraembrionarias. Por otro lado,
vale la pena continuar indagando mucho más acerca de cómo el HIF-2α influye o hace
parte inherente al desarrollo de los vasos sanguíneos, y si es en verdad, el factor sensor
de hipoxia de mayor importancia dentro de las membranas extraembrionarias, y ver como
ocurre su interrelación con las demás moléculas implicadas en la vascularización del
saco vitelino y la alantoides. Además falta realizar más estudios que permitan establecer
de manera definitiva en qué modo la hipoxia afecta el desarrollo embrionario aviar en los
diferentes estadios de la incubación, en especial alrededor del día 7.
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