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RESOLUCIÓN OIV-OENO 363-2012
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PECTINMETILESTERASA EN LAS PREPARACIONES
ENZIMÁTICAS (COMPLEMENTO DE LA RESOLUCIÓN 9-2008)
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2, párrafo IV del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la
Organización Internacional de la Viña y el Vino,
Considerando los trabajos del grupo de expertos “Especificación de los productos
enológicos”,
Considerando la resolución
pectinmetilesterasa
OENO
9/2008,
adoptada
en
2008,
relativa
a
la
DECIDE modificar el título de la resolución 9/2008 cambiándolo por “Determinación de la
actividad pectinmetilesterasa en preparaciones enzimáticas” y completar la monografía
sobre la determinación de la actividad pectinmetilesterasa (OENO 9/2008) publicada en
el Codex Enológico Internacional con la siguiente modificación:
DECIDE agregar al método ya existente un título que exprese "Determinación de la
actividad pectinmetilesterasa usando la dosificación del metanol” y volver a numerar los
puntos que se modifiquen.
Determinación de la actividad pectinmetilesterasa en las preparaciones
enzimáticas
Requisitos generales
Estas enzimas generalmente forman parte de una preparación enzimática compleja. A
menos que se disponga lo contrario, deben cumplir con los requisitos de la resolución
OENO 365-2009 referente a las preparaciones enzimáticas, que está incluida en el Codex
Enológico Internacional.
1. Origen
Se hace referencia al punto 5 de la monografía general sobre preparaciones enzimáticas:
“Fuentes de enzimas y medios de fermentación”.
Las preparaciones enzimáticas que contienen esta actividad se producen por
fermentaciones dirigidas de, por ejemplo, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Aspergillus sojae, Aspergillus Tubigensis, Aspergillus Awamori, Rhizopus oryzae y
Trichoderma longibrachiatum (T. reesei).
2. Ámbito de aplicación
Se hace referencia al Código Internacional de Prácticas Enológicas, OENO 11/04; 12/04;
13/04; 14/04 y 15/04.
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
1
Estas actividades enzimáticas se usan para favorecer la maceración de la uva y la
extracción del zumo de uva, así como para contribuir a la clarificación de los mostos y
vinos, y por último, para mejorar su filtrabilidad.
Determinación de la actividad pectinmetilesterasa por titulación ácido-base
1. Fundamento
La actividad de desmetilación de la pectinmetilesterasa provoca la aparición de grupos
carboxílicos libres a nivel de los ácidos galacturónicos que forman las cadenas. Para
determinar la actividad pectinmetilesterasa, los grupos carboxilo pueden titularse durante
la hidrólisis enzimática con una solución de hidróxido de sodio a temperatura y pH
constantes.
2. Equipo y materiales

equipo de titulación (bureta)

placa calorífica con control de temperatura y agitador magnético

pH-metro

cubeta de vidrio llena de agua

cronómetro

matraces graduados (de distintos volúmenes)

vasos de precipitados (preferiblemente de 50 mL)

pipetas de precisión (de distintos volúmenes)

agitador vórtex
3. Productos químicos y reactivos

Pectina: muy esterificada: calidad PA (Sigma P9135-100G); CAS 9000-69-5)

Solución NaOH 0,01 M (Titrisol) calidad PA; CAS 1310-73-2

Gránulos de NaOH calidad PA; CAS 1310-73-2
4. Preparación de las soluciones
4.1. NaOH 1 M
Disuelva 4 g de NaOH en 100 mL de H2O
4.2. Solución de sustrato
Utilice una solución de sustrato de pectina al 1 % en H2O, disolviendo 2,0 g de pectina
muy lentamente en 150 mL de H2O. Luego, ajuste el valor de pH en 4,0 y a 40 ºC con
NaOH 1 M. Complete la solución hasta 200 mL exactamente. En el momento antes de
medir, controle el valor del pH y ajústelo nuevamente a pH 4,0 si fuera necesario.
4.3. Solución enzimática
La solución enzimática está formada aproximadamente de 30 a 50 mg/L de preparación
de enzima comercial diluida en agua fría. Esta solución debe prepararse directamente
antes de su uso.
4.4. NaOH 0,01M
Esta solución pre-elaborada debe diluirse según las especificaciones del fabricante.
5. Ejecución de la determinación de la actividad enzimática
Introduzca 20 mL de solución de sustrato en un vaso de precipitados (con un agitador
magnético) sobre la placa calorífica con control de temperatura, en una cubeta de vidrio
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Federico CASTELLUCCI
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2
llena de agua calentada a 40 °C. Coloque el electrodo de pH en la solución de sustrato.
Es necesario efectuar un control y probablemente un nuevo ajuste del valor de pH a 40
ºC antes de comenzar el análisis. A continuación, añada 0,1 mL de la solución
enzimática. Ponga en marcha el cronómetro exactamente en ese momento. Durante el
análisis, debe medir el valor del pH y la muestra debe titularse hasta pH 4,1 con NaOH
0,01 M durante 10 minutos a 40 °C. Transcurridos 10 min, detenga el análisis y lea el
consumo de NaOH 0,01 M.
El consumo de NaOH 0,01 M debe encontrarse en el rango de valores entre 3,5 mL y 8,5
mL. En caso contrario, se recomienda diluir o concentrar la solución enzimática.
6. Cálculo de la actividad enzimática
La actividad enzimática se calcula utilizando la fórmula siguiente:
Actividad (U/mg) = n / (t*v*c)
Actividad (nkat/g) = (Actividad (U/mg) * 1 000/60) * 1 000
n = consumo de NaOH 0,01 M en µmol
t = tiempo en min (en este caso, 10 min)
v = cantidad de solución enzimática introducida en ml (=0,1 mL)
c = concentración de solución enzimática en g/L
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3
Validación de la
pectinmetilesterasa
titulación
ácido-base
para
determinar
la
actividad
Se determinó el valor medio de la desviación estándar de ocho diferentes enzimas.
Cada enzima se analizó seis veces.
Valor medio de la desviación estándar de ocho diferentes enzimas = 3,91 %
Enzima
1
40
mg/mL
Valor medio
(nkat/g)
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
s2(r)
s (r)
Repetibilidad
r (nkat/g)
Enzima
2
Enzima
3
40 mg/mL 40 mg/mL
Enzima
4
Enzima
5
40
mg/mL
40 mg/mL
Enzima
6
40
mg/mL
Enzima
7
Enzima
8
Enzima
8
30
mg/mL
50
mg/mL
30
mg/mL
14527,7
19291,7
12756,8
9534,7
9444,5
18577,8
31591,7
10888,9
9446,5
282,3
449,5
366,4
227,4
272,3
145,6
540,9
944,4
1096,1
1,9
2,3
2,9
2,4
2,9
0,8
1,7
8,7
11,6
66410
257,7
168402
410,4
111863
334,5
43097
207,6
61786
248,6
17654
132,9
243773
493,7
743210
862,1
1001244
1000,6
729,3
1161,3
946,5
581,5
703,4
376,0
1397,3
2439,7
2831,8
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4
Validación de la titulación ácido-base para determinar la actividad PME
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 1
40 mg/mL
0,89
14833
Enzima 1
40 mg/mL
0,89
14750
Enzima 1
40 mg/mL
0,88
14667
Enzima 1
Enzima 1
Enzima 1
40 mg/mL
40 mg/mL
40 mg/mL
0,85
0,87
0,86
14083
14500
14333
Enzima 1 40 mg/mL
Valor medio
14527,7
(nkat/g)
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
Varianza
2
s (r)
s ( r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 2
40 mg/mL
1,185
19750
Valor medio
(nkat/g)
19250
Desviación
estándar
(nkat/g)
18833
Desviación
estándar %
(X-MW)^2
93228,4
282,30
49432,1
1,9
3,8
66410,6
257,7
729,3
19413,8
197728,4
765,4
37895,1
total
Enzima 2 40 mg/mL
398463,3
(X-MW)^2
19291,7
210069,4
Enzima 2
Enzima 2
40 mg/mL
40 mg/mL
1,155
1,130
2
Enzima 2
Enzima 2
40 mg/mL
40 mg/mL
1,125
1,190
18750
19833
s (r)
s ( r)
Enzima 2
40 mg/mL
1,160
19333
Repetibilidad r
(nkat/g)
449,54
1736,1
2,3
168402,8
410,4
210069,4
293402,8
293402,8
1161,3
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 3
40 mg/mL
0,78
13042
Enzima 3
40 mg/mL
0,79
13208
Enzima 3 40 mg/mL
Valor medio
12756,8
(nkat/g)
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
Enzima 3
40 mg/mL
0,76
12708
Enzima 3
Enzima 3
40 mg/mL
40 mg/mL
0,76
0,77
12583
12833
s (r)
s ( r)
Enzima 3
40 mg/mL
0,73
12167
Repetibilidad r
(nkat/g)
2
(X-MW)^2
81320,0
366,38
203551,4
2,9
111863,1
334,5
2384,7
30218,0
5801,4
946,5
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
1736,1
1010416,7
Enzima 4 40 mg/mL
347903,4
671178,8
(X-MW)^2
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5
Enzima 4
40 mg/mL
0,57
9500
Valor medio
(nkat/g)
9534,67
Enzima 4
40 mg/mL
0,59
9875
Desviación
estándar
(nkat/g)
227,41
Desviación
estándar %
Enzima 4
40 mg/mL
0,56
9333
Enzima 4
40 mg/mL
0,56
9250
Enzima 4
40 mg/mL
0,58
9583
Enzima 4
40 mg/mL
0,58
9667
2
s (r)
s (r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
1201,8
115826,8
2,4
40669,4
43096,9
81035,1
207,6
2336,1
587,5
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 5
40 mg/mL
0,55
9167
Enzima 5
40 mg/mL
0,59
9792
Enzima 5
40 mg/mL
0,55
9083
Enzima 5
40 mg/mL
0,57
9458
Enzima 5
40 mg/mL
0,57
9542
Enzima 5
40 mg/mL
0,58
9625
Enzima 5 40 mg/mL
Valor medio
9444,5
(nkat/g)
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
2
s (r)
s (r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
(X-MW)^2
77006,3
272,29
120756,3
2,9
130682,3
61785,6
182,3
248,6
9506,3
703,4
32580,3
370713,5
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 6
40 mg/mL
1,105
18417
Enzima 6
40 mg/mL
1,118
18633
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
Enzima 6
40 mg/mL
1,125
18750
Enzima 6
40 mg/mL
1,105
18417
Enzima 6
40 mg/mL
1,112
18533
Enzima 6
40 mg/mL
1,123
18717
Enzima 6 40 mg/mL
Valor medio
18577,8
(nkat/g)
2
s (r)
s (r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
(X-MW)^2
25956,8
145,55
3086,4
0,8
29660,5
17654,3
25956,8
132,9
1975,3
376,0
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
17512,1
258581,3
Enzima 7 30 mg/mL
19290,1
105925,9
(X-MW)^2
Certificado conforme
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El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
6
Enzima 7
30 mg/mL
1,920
32000
Valor medio
(nkat/g)
31591,7
Enzima 7
30 mg/mL
1,947
32450
Desviación
estándar
(nkat/g)
540,86
Desviación
estándar %
Enzima 7
30 mg/mL
1,873
31217
Enzima 7
30 mg/mL
1,860
31000
Enzima 7
30 mg/mL
1,893
31550
Enzima 7
30 mg/mL
1,880
31333
2
s (r)
s (r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
166736,1
736736,1
1,7
140625,0
243773,1
350069,4
493,7
1736,1
1397,3
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 8
50 mg/mL
0,578
9633
Enzima 8
50 mg/mL
0,682
11367
Enzima 8
50 mg/mL
0,706
11767
Enzima 8
50 mg/mL
0,712
11867
Enzima 8
50 mg/mL
0,596
9933
Enzima 8
50 mg/mL
0,646
10767
Enzima 8 50 mg/mL
Valor medio
10888,9
(nkat/g)
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
2
s (r)
s (r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
(X-MW)^2
1576419,8
944,38
228271,6
8,7
770493,8
743209,9
956049,4
862,1
913086,4
2439,7
14938,3
4459259,3
total
Enzima
Concentración
U/mg
nkat/g
Enzima 8
30 mg/mL
0,69
11444
Enzima 8
30 mg/mL
0,067
8667
Desviación
estándar
(nkat/g)
Desviación
estándar %
Enzima 8
30 mg/mL
0,063
8889
Enzima 8
30 mg/mL
0,065
8429
Enzima 8
30 mg/mL
0,07
9625
Enzima 8
30 mg/mL
0,067
9625
Enzima 8 30 mg/mL
Valor medio
9446,5
(nkat/g)
2
s (r)
s (r)
Repetibilidad r
(nkat/g)
66736,1
1462638,9
(X-MW)^2
3990006,3
1096,13
607620,3
11,6
310806,3
1001243,9
1035306,3
1000,6
31862,3
2831,8
total
31862,3
6007463,5
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
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© OIV 2012
7
Valor medio
de las
desviaciones
estándar %
3,91
Certificado conforme
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Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
8