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RESOLUCIÓN OIV-OENO 364-2012
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD POLIGALACTURONASA
ENZIMÁTICAS (COMPLEMENTO DE LA RESOLUCIÓN 10-2008)
EN
PREPARACIONES
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2 párrafo 2 IV del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la
Organización Internacional de la Viña y el Vino,
Considerando los trabajos del grupo de expertos “Especificación de los productos
enológicos”,
Considerando la
poligalacturonasa
resolución
OENO
10/2008,
adoptada
en
2008,
relativa
a
la
DECIDE completar la monografía sobre la determinación de la actividad
poligalacturonasa, OENO 10/2008, publicada en el Codex Enológico Internacional con el
siguiente método:
Especificaciones generales
Aunque estas enzimas aparecen por lo general entre otras actividades, dentro de un
complejo enzimático, también pueden encontrarse en su forma pura, ya sea mediante el
uso de pectinasas o directamente obtenidas mediante Microorganismos genéticamente
modificados. A menos que se indique lo contrario, las especificaciones deben cumplir con
lo dictaminado en la resolución Oeno 365 - 2009 relativa a las especificaciones generales
para preparados enzimáticos que se incluye en el Codex Enológico Internacional.
1. Origen
Se hace referencia al punto 5 de la monografía general sobre preparaciones enzimáticas:
“Fuentes de enzimas y medios de fermentación”.
Las preparaciones enzimáticas que contienen tal actividad se producen mediante
fermentaciones controladas de, por ejemplo, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae y
Trichoderma reesei o longibrachiatum.
2. Objetivo / Aplicación
Se hace referencia al Código internacional de las prácticas enológicas, Oeno 11/04;
12/04; 13/04; 14/04 y 15/04.
Estas actividades enzimáticas se utilizan para contribuir a la eficacia de la maceración de
la uva y en la extracción del zumo de uva así como para ayudar en la clarificación de
mostos y vinos, y, finalmente, para mejorar la capacidad de filtración.
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
1
Determinación de la actividad poligalacturonasa con cianoacetamida
1. Ámbito de aplicación
Las poligalacturonasas cortan las cadenas principales de pectinas (zona de
homogalacturonanos) con un bajo grado de metilación. Esta actividad enzimática
conlleva la liberación en el medio de los ácidos galacturónicos y de los oligómeros de
homogalacturonanos. De este modo se liberan también los extremos de reacción
reductora. Este método por ultravioleta con cianoacetamida, basado en la reacción de
KNOEVENAGEL, esto es, la condensación entre un grupo metileno activo y un grupo
carbonilo en un medio altamente alcalino, se emplea para determinar la actividad de
varias enzimas, entre ellas las poligalacturonasa. Fue desarrollado para la determinación
de la degradación enzimática, con mecanismos endo y exo, de polisacáridos que generan
sacarosas reductoras.
2. Equipo y materiales

espectrofotómetro

cubeta de cuarzo (λ=274 nm, camino óptico 1 cm)

balanza analítica

agitador magnético y barra de agitación

baño maría (40°C; 100°C)

cronómetro

matraces graduados (de distintos volúmenes)

vasos de precipitados (de distintos volúmenes)

pipetas de precisión (de distintos volúmenes)

espectrofotómetro

tubos de vidrio (con cierre)

agitador vórtex
3. Productos químicos y reactivos

Ácido poligalacturónico ~95% enzimático (núm. CAS 25990-10-7)

Tampón pH 4,0 Na-citrato/HCl, 1,06 g/cm3, calidad PA

Tampón pH 9,0 H3BO3/KCl/NaOH ≈0.05 M/≈0.05 M/≈0,022M, calidad PA

Cianoacetamida, 98%, purum (núm. CAS 107-91-5)

Ácido D-galacturónico monohidrato 97% (núm. CAS 91510-62-2)
4. Preparación de las soluciones
4.1. Solución madre de ácido D-galacturónico monohidrato (250 µg/mL)
Disuelva 0,025 g de ácido D-galacturónico monohidrato en 100 mL de H2O.
4.2. Solución de cianoacetamida al 1 %
Disuelva 1 g de cianoacetamida en 100 mL de H2O
4.3. Tampón borato (pH 9,0)
Esta solución preelaborada debe diluirse según las especificaciones del fabricante.
4.4. Tampón Na-citrato/HCl (pH 4,0)
Esta solución preelaborada debe diluirse según las especificaciones del fabricante.
4.5. Solución de ácido poligalacturónico
Agitando constantemente, disuelva el ácido poligalacturónico muy lentamente a una
concentración de 5 g/L en tampón Na-citrato/HCl (pH 4,0).
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2
5. Determinación de la actividad enzimática
5.1. Curva de calibración y procedimiento
La gama patrón se obtiene de 0 µg/mL a 250 µg/mL de ácido D-galacturónico. Utilice la
solución madre para la dilución.
Ácido Dgalacturónico
monohidrato en
µg/mL
Ácido Dgalacturónico
monohidrato en
µmol/mL
Solución madre en
µL
H2O en µL
0
25
50
100
150
200
250
0
0,118
0,236
0,471
0,707
0,943
1,178
0
100
200
400
600
800
1000
1000
900
800
600
400
200
0
Ensayo de cianoacetamida: añada 1mL de ácido D-galacturónico y 1 mL de solución de
cianoacetamida al 1 % a 2 mL de tampón borato (pH 9). Tras la incubación en un tubo
de ensayo a 100°C durante 10 min, deje enfriar la solución en un baño de agua fría. Mida
inmediatamente la absorbancia a 274 nm. Debe ajustar el fotómetro a cero con agua.
Para el cálculo, el punto de intersección de la línea de regresión debe estar a cero.
5.2. Hidrólisis enzimática y tratamiento de la muestra
Para la hidrólisis enzimática del ácido poligalacturónico, se calientan 10 mL de solución
de ácido poligalacturónico a 40°C en un tubo de vidrio con cierre. A continuación, se
añaden 0,01 g de la muestra y se incuba la mezcla a 40°C. Transcurridos exactamente 5
min y exactamente 10 min, se retiran 500 µL de la mezcla de reacción y se calientan
directamente hasta 100°C en tubos de ensayo precalentados durante 10 min.
Seguidamente, estos 500 µL se diluyen en agua hasta alcanzar un volumen total de 25
mL.
Para analizar el ensayo en blanco, calentar a 100 °C la misma concentración de enzima
en ácido poligalacturónico durante 10 min (la solución de ácido poligalacturónico debe
calentarse a 100°C antes de añadir la enzima). En caso de turbiedad, centrifugar la
solución a 5000 rpm durante 5 min. A continuación, incubar el ensayo en blanco a 40°C.
Retirar 500 µL de la solución de ensayo en blanco tras 5 min y ponerla al baño maría a
100°C durante 10 min. Seguidamente, estos 500µL se diluyen en agua hasta alcanzar un
volumen total de 25 mL.
Ensayo de cianoacetamida: añadir 1mL de la solución diluida y 1 mL de solución de
cianoacetamida al 1% a 2 mL de tampón borato (4.3.). Tras la incubación en un tubo de
ensayo a 100°C durante 10 min, enfriar la solución en un baño de agua fría. Medir
inmediatamente la absorbancia a 274 nm.
6. Cálculo de la actividad enzimática
La actividad enzimática se calcula relacionando el valor de la absorbancia y la cantidad
de producto formado utilizando un rango de calibración con la fórmula:
Actividad (U/g) = q/(t*c*F)
Actividad (nkat/g) = q/(t*c*F) *(1000/60)
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3
q = cantidad de ácido galacturónico en µmol/mL
t = tiempo en min.
c = concentración de solución enzimática en g/L (= 0,01 g/L) pro 10 mL substrato
F = factor de corrección del volumen (=2)
7. Bibliografía
Bach E. y Schollmeyer E. (1992): An Ultraviolett-Spectrophotometric Method with 2Cyanoacetamide for the Determination of the Enzymatic Degradation of Reducing
Polysaccharides. Anal. Biochem. 203, 335-339
8. Validación intralaboratorio de la
poligalacturonasa con 2-cianoacetamida
determinación
de
la
actividad
El valor medio de la desviación estándar se determinó según 6 enzimas diferentes.
Se analizó cada enzima 6 veces.
El valor medio de la desviación estándar de las diferentes enzimas es = 6,93%
Valor medio
(nkat/g)
Enzima 1
5 min
7583,9
Enzima 2
5 min
3896,4
Enzima 3 Enzima 4 Enzima 5
5 min
5 min
5 min
10445,8 8751,7 16894,4
Enzima 6 Enzima 4 Enzima 5
5 min
10 min
10 min
16153,1 8532,5 11608,9
Enzima 6
10 min
14436,1
Desviación
estándar
(nkat/g)
1195,6
367,1
445,3
420,4
631,4
908,7
246,48
656,3
1012,3
Desviación
estándar %
15,8
9,4
4,3
4,8
3,7
5,6
2,9
5,7
7,0
s (r)
1191221
112292
165238
147264
332227
688096
50628
358948
853983
s ( r)
1091,4
335,1
406,5
383,7
576,4
829,5
225,0
599,1
924,1
Repetibilidad r
(nkat/g)
3088,7
948,3
1150,4
1086,0
1631,2
2347,5
636,8
1695,5
2615,2
2
Certificado conforme
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4
Validación intralaboratorio de la determinación de la actividad poligalacturonasa con 2-cianoacetamida
Enzima
Absorbancia 5
min
Concentración (mg/m)
U/g
nkat/g
Enzima 1; 5 min
Enzima 1
0,1698
0,01
389,2
6487
Valor medio (nkat/g)
7583,9
Enzima 1
0,2278
0,01
593,6
9893
Desviación estándar (nkat/g)
1195,60
(X-MW)^2
1203896,6
5333533,6
Enzima 1
0,1855
0,01
444,5
7408
Desviación estándar %
Enzima 1
0,1815
0,01
430,4
7173
Varianza
Enzima 1
0,1887
0,01
455,9
7598
s (r)
1191221,0
Enzima 1
0,1776
0,01
416,6
6943
s( r)
1091,4
r (nkat/g) repetibilidad
3088,7
Enzima
Absorbancia 5
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 2
0,0898
0,01
215,2
3587
2
15,77
248,5
30819,8
168555,9
208,6
410311,4
total
7147325,9
Enzima 2; 5 min
(X-MW)^2
Valor medio (nkat/g)
3896,4
95927,9
Enzima 2
0,0898
0,01
215,3
3588
Desviación estándar (nkat/g)
367,08
94898,2
Certificado conforme
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El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
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5
Enzima 2
0,0897
0,01
214,5
3575
Desviación estándar %
Enzima 2
0,09
0,01
245,2
4087
Varianza
Enzima 2
0,0954
0,01
245,6
4093
s (r)
112292,05
Enzima 2
0,0971
0,01
266,9
4448
s( r)
335,10
r (nkat/g) repetibilidad
948,33
2
9,42
88,76
Enzima
Absorbancia 5
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 3
0,4077
0,01
613,4
10223
Valor medio (nkat/g)
10445,83
Enzima 3
0,3937
0,01
588,8
9813
Desviación estándar (nkat/g)
445,29
Enzima 3
0,4201
0,01
635,3
10588
Desviación estándar %
Enzima 3
0,4095
0,01
616,6
10277
Varianza
Enzima 3
0,4381
0,01
666,9
11115
Enzima 3
0,4225
0,01
639,5
10658
Enzima
Absorbancia 5
min
103290,8
36205,6
38787,1
304642,7
total
673752,3
Enzima 3; 5 min
(X-MW)^2
2
49506,3
400056,3
4,26
20306,3
18,2
28617,4
s (r)
165237,7
s( r)
406,5
r (nkat/g) repetibilidad
1150,4
447784,0
45156,3
total
991426,4
Enzima 4; 5 min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
(X-MW)^2
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Federico CASTELLUCCI
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6
Enzima 4
0,2032
0,01
530,4
8840
Valor medio (nkat/g)
8751,7
Enzima 4
0,19614
0,01
505,5
8425
Desviación estándar (nkat/g)
420,38
7802,8
106711,1
Enzima 4
Enzima 4
Enzima 4
0,21
0,19188
0,20858
0,01
0,01
0,01
555,9
490,5
549,3
9265
8175
Desviación estándar %
4,80
263511,1
23,1
332544,4
s (r)
147263,9
162677,8
s( r)
383,7
r (nkat/g) repetibilidad
1086,0
Varianza
9155
2
Enzima 4
0,3448
0,01
519
8650
Enzima
Absorbancia 5
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 5
0,35063
0,01
978,1
16302
Valor medio (nkat/g)
16894,4
Enzima 5
0,35329
0,01
987,5
16458
Desviación estándar (nkat/g)
631,40
10336,1
total
883583,3
Enzima 5; 5 min
(X-MW)^2
351385,5
190192,9
Enzima 5
0,3812
0,01
1085,7
18095
Desviación estándar %
Enzima 5
0,35979
0,01
1010,4
16840
Varianza
3,74
14,0
1441333,6
2964,2
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
7
2
Enzima 5
0,35941
0,01
1009,1
16818
s (r)
332226,5
5792,9
Enzima 5
0,4559
0,01
1011,2
16853
s( r)
576,4
1690,1
r (nkat/g) repetibilidad
1631,2
Enzima
Absorbancia 5
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 6
0,30006
0,01
888,5
14808
Valor medio (nkat/g)
16153,1
Enzima 6
0,3108
0,01
926,2
15437
Desviación estándar (nkat/g)
908,69
total
1993359,3
Enzima 6; 5 min
(X-MW)^2
1808277,9
513213,0
Enzima 6
0,3348
0,01
1010,9
16848
Desviación estándar %
Enzima 6
0,3391
0,01
1025,9
17098
Varianza
Enzima 6
0,3195
0,01
957
15950
s (r)
688095,8
Enzima 6
0,5370
0,01
1006,6
16777
s( r)
829,5
r (nkat/g) repetibilidad
2347,5
2
5,63
31,6
Enzima
Absorbancia 10
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 4
0,3355
0,01
498
8300
Valor medio (nkat/g)
8532,5
Enzima 4
0,3569
0,01
535,8
8930
Desviación estándar (nkat/g)
246,48
483411,2
893550,1
41231,6
388890,8
total
4128574,5
Enzima 4; 10 min
(X-MW)^2
54056,3
158006,3
Enzima 4
0,3340
0,01
495,4
8257
Desviación estándar %
2,89
76084,0
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
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8
Enzima 4
0,3420
0,01
509,5
8492
Enzima 4
0,3472
0,01
518,6
8643
Varianza
s (r)
50627,5
Enzima 4
0,3448
0,01
514,4
8573
s( r)
225,0
r (nkat/g) repetibilidad
636,8
8,3
2
Enzima
Absorbancia 10
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 5
0,43542
0,01
638,3
10638
Valor medio (nkat/g)
11608,9
Enzima 5
0,49384
0,01
741,2
12353
Desviación estándar (nkat/g)
656,31
1667,4
12284,0
1667,4
total
303765,3
Enzima 5; 10 min
(X-MW)^2
941978,1
554197,5
Enzima 5
0,4712
0,01
701,4
11690
Desviación estándar %
Enzima 5
0,49213
0,01
738,2
12303
Varianza
Enzima 5
0,46232
0,01
685,7
11428
s (r)
358947,8
Enzima 5
0,4559
0,01
674,4
11240
s( r)
599,1
r (nkat/g) repetibilidad
1695,5
2
5,65
32,0
Enzima
Absorbancia 10
min
Concentración (mg/mL)
U/g
nkat/g
Enzima 6
0,60886
0,01
987,9
16465
Valor medio (nkat/g)
14436,1
Enzima 6
0,5221
0,01
835,1
13918
Desviación estándar (nkat/g)
1012,31
6579,0
482253,1
32600,3
136079,0
total
2153687,0
Enzima 6; 10 min
(X-MW)^2
4116390,1
268093,8
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
9
Enzima 6
0,5180
0,01
828,0
13800
Desviación estándar %
Enzima 6
0,52344
0,01
837,5
13958
Varianza
Enzima 6
0,52895
0,01
847,2
14120
s (r)
853983,0
Enzima 6
0,537
0,01
861,3
14355
s( r)
924,1
r (nkat/g) repetibilidad
2615,2
2
Valor medio de la desviación
estándar %
7,01
49,2
404637,3
228271,6
99926,2
6579,0
total
5123898,1
6,93
Certificado conforme
Izmir, 22 de junio de 2012
El Director General de la OIV
Secretario de la Asamblea general
Federico CASTELLUCCI
© OIV 2012
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